KR102304074B1

KR102304074B1 - 리보스위치를 이용한 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102304074B1
Application number: KR1020200009783A
Authority: KR
Inventors: 정규열; 장성호; 장성연
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2021-09-23
Also published as: WO2020159182A1; KR20200094102A

Abstract

본 발명은 카프로락탐(caprolactam) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치 및 카프로락탐 고생산균을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리보스위치 및 이를 이용한 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법을 이용하면 카프로락탐에 특이적인 압타머에 의해 카프로락탐을 특이적이고 민감하게 인지할 수 있는바, 카프로락탐을 고농도로 생산하는 균주를 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 카프로락탐 생산의 가격 경쟁력을 높일 수 있다.

Description

리보스위치를 이용한 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법 {Method for screening microorganism with high caprolactam productivity using riboswitch}

본 발명은 카프로락탐(caprolactam) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치 및 카프로락탐 고생산균을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

미생물을 통한 기질 대사를 이용한 바이오 기반의 생산은 석유 기반 화합물 생산을 대체할 수 있는 새로운 방법으로 여겨지고 있다. 이러한 생산 방식의 주요한 분야 중 하나가 단위체(monomer) 생산인데, 카프로락탐은 나일론-6의 생산에 주로 사용되는 6-아미노카프로산(6-aminocaproic acid) 의 고리형 아마이드이다. 카프로락탐은 경제적 가치가 크기 때문에, 카프로락탐 또는 이의 전구체를 생산할 수 있는 미생물을 개발하는 연구들이 진행되어 왔다. 그러나 여전히 수율이나 생산량이 낮아 추가적인 균주 개량이 필요한 실정이다.

유전자 회로 기반의 바이오센서는 각 세포 안에서 대사산물의 농도에 따라 특정 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 이러한 바이오센서는 FACS(Fluorescence activated cell sorter)나 인공진화와 같은 고처리능 대사산물 스크리닝을 가능하게 한다. 이때, 세포 내에는 목적 대사산물과 구조적으로 비슷한 화합물들이 포함되어 있기 때문에 바이오센서는 목적 물질에 대해 높은 특이성을 가져야한다. 예를 들어, 카프로락탐을 생산하는 대장균 균주에서는 카프로락탐과 탄소 1개 차이만을 가지는 발레로락탐(valerolactam)을 동시에 생산하기도 한다.

최근, 전사인자(transcription factor) 기반의 락탐 바이오센서가 개발된 바 있지만, 해당 센서는 발레로락탐과 카프로락탐을 구분할 수 없다는 단점이 있다.

한편, 단백질 기반 센서 개발의 문제점들과 비교했을 때, RNA 기반의 센서는 개발과 활용 과정에서 다양한 장점이 있다. 특정 화학물질에 특이적으로 반응하는 RNA 압타머를 개발하는 과정은 트랜스포메이션이 관여되지 않는 생체 외(in vitro) 반응을 통해 진행되기 때문에 단백질의 경우보다 훨씬 큰 라이브러리로부터 특이적인 압타머를 발굴할 수 있다. 또한 RNA 기반의 센서는 목적 물질과 직접적으로 반응하며 추가적인 단백질 발현이 관여되지 않기 때문에 세포에 불필요한 대사 부담을 줄일 수 있다는 장점이 있다.

이에 본 발명자들은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고 카프로락탐을 고농도로 생산하는 균주를 스크리닝하기 위하여 연구를 계속한 결과, 리보스위치를 이용하여 카프로락탐 고생산 균주를 스크리닝할 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은, 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는, 카프로락탐(caprolactam) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치 및 이를 이용한 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는, 카프로락탐 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치를 제공한다.

또한 본 발명은 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는 리보스위치가 도입된 변이균주 라이브러리를 구축하는 단계; 상기 변이균주 라이브러리를 각각 배양시키는 단계; 및 상기 배양된 변이균주 라이브러리 중에서 생존률이 높은 변이균주를 카프로락탐 고생산균 변이균주로 선택하는 단계;를 포함하는 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 리보스위치 및 이를 이용한 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법을 이용하면 카프로락탐에 특이적인 압타머에 의해 카프로락탐을 특이적이고 민감하게 인지할 수 있는바, 카프로락탐을 고농도로 생산하는 균주를 빠르고 쉽게 선별할 수 있으며, 이를 이용하여 미생물을 이용한 카프로락탐 생산의 가격 경쟁력을 높일 수 있다.

도 1은 전체적인 카프로락탐 리보스위치 개발에 대한 소개를 도식화한 도이다.
도 2는 셀렉스(SELEX)를 통한 카프로락탐 압타머 진화 과정의 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 카프로락탐 리보스위치 라이브러리를 도식화한 도이다.
도 4는 구축한 카프로락탐 리소브위치 라이브러리의 진화과정을 통해 얻어진 10 개의 콜로니들의 카프로락탐-특이적 반응성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 선택된 카프로락탐-특이적 리보스위치와 카프로락탐 및 이의 전구체인 6-아미노카프로산과의 반응성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 카프로락탐 리보스위치의 카프로락탐-용량반응 곡선을 생체 외의 카프로락탐 농도에 따라 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 카프로락탐 리보스위치의 카프로락탐-용량반응 곡선을 생체 내의 카프로락탐 농도에 따라 나타낸 도이다.
도 8은 탄소 수의 차이가 있는 다른 락탐과의 반응성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (C4 = 부티로락탐, C5 = 발레로락탐, C6= 카프로락탐)
도 9는 카프로락탐과 발레로락탐이 혼합된 배지에서 카프로락탐 퍼센트 농도에 따른 형광값을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명에 따른 카프로락탐 리보스위치의 세포 생장 조절 가능성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 카프로락탐(caprolactam) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치를 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 본 발명은 카프로락탐을 특이적으로 인지하여 하류에 위치한 유전자의 발현량을 조절하는 RNA 리보스위치에 대한 것이다. 카프로락탐에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머를 이용하여 스위치가 될 가능성이 있는 군의 염기서열을 라이브러리로 제작하였다. 상기 라이브러리로부터 카프로락탐에 특이적이며 실제로 작동하는 리보스위치를 선별하였다. 상기 리보스위치는 카프로락탐에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 압타머를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, “압타머(Aptamer)”는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)이다. 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 처음 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 표적분자에 결합할 수 있는 많은 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 표적분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 압타머는 카프로락탐에 특이적으로 결합하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 압타머 일 수 있다. 또한 상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 가진 핵산서열일 수 있으며, 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 가진 핵산서열일 수 있으며, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가진 핵산서열일 수 있다. 본 발명에 있어서, "상동성을 가지는 핵산서열"이란 일 내지 수개의 뉴클레오티드가 추가, 결실 또는 치환되어 서열에 공통성이 있는 것으로 카프로락탐에 결합능을 보이는 유사한 핵산서열을 의미한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 리보스위치는 링커 및 선택 표지 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 리보스위치는 하기 구조식 1의 형태로 배열되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

[구조식 1]

카프로락탐 압타머-링커-선택 표지 유전자

본 발명에 있어서, “선택 표지 유전자”는 유전자 재조합 실험 등에서 목적하는 유전자를 클론화한 세포를 선택하는 데 사용하는 유전자를 의미한다. 선택표지 유전자로서 표현형(유전자형)이 뚜렷한 돌연변이 유전자를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 항생물질에 내성을 갖게 된 돌연변이 유전자 등이 이용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 선택 표지 유전자는 항생제 내성 유전자 또는 형광 단백질, 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항생제 내성 유전자의 예로는 클로람페니콜 아세틸트렌스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II, 아미노글리고사이드 아데닐트랜스퍼라제, 베타-락타마아제 및 tetA가 있으며, 상기 형광 단백질의 예로는 GFP(green fluorescent protein), CFP(cyan fluorescent protein), BFP(blue fluorescent protein), YFP(yellow fluorescent protein) 및 RFP(red fluorescent protein)가 있다.

본 발명에 있어서, “링커”는 유전자 또는 단백질 간의 간격을 유지하기 위한 서열로서, 링커의 길이 조절을 통해 타겟 물질과의 반응성 등을 조절할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 링커는 무작위 서열로 이루어진 8 내지 12 개의 염기인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 무작위 서열로 이루어진 10 개의 염기인 것, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 10 개의 염기이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체예에서, 리보스위치는 서열번호 4의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 리보스위치일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는 리보스위치가 도입된 변이균주 라이브러리를 구축하는 단계; 상기 변이균주 라이브러리를 각각 배양시키는 단계; 및 상기 배양된 변이균주 라이브러리 중에서 생존률이 높은 변이균주를 카프로락탐 고생산균 변이균주로 선택하는 단계;를 포함하는 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법에서 사용하는 리보스위치는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 압타머를 포함할 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 리보스위치일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 카프로락탐 압타머 다양화 모음을 위한 셀렉스(SELEX)

1.1 카프로락탐 결합 매트릭스의 제조

제조사의 지시에 따라 아미노카프로락탐을 ECH 세파로오스 4B에 고정시켰다. 이때 아미노카프로락탐은 카프로락탐에 1차 아민기가 추가되어 있어, 해당 매트릭스와 고정이 가능하였다. 해당 고정 반응은 낮은 pH를 필요로 하는바, 상기 커플링 반응을 위해 매트릭스와 아미노카프로락탐을 pH 4.5의 증류수에 넣고, EDC(N-ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)을 최종 농도가 0.1 M이 되도록 첨가하였다. 그 후, 혼합용액을 부드럽게 흔들어주면서 상온에서 16 시간 동안 배양하였다. 반응 후에는 20% 에탄올에 넣어 냉장 보관하였다.

1.2 카프로락탐 RNA 압타머의 선택

가능한 다양한 서열을 가진 압타머가 포함할 수 있도록 만들기 위하여 양 끝에 특정 프라이머 결합 부위를 가지는 셀렉스 주형 가닥을 기반으로 하여 많은 양의 PCR과 생체 외 전사를 수행하였다. 구체적으로, Phusion DNA 중합 효소(New England Biolabs, Ipswich, MA) 및 1.5 nmol의 SELEX_Template 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR 증폭을 위한 SELEX_F 및 SELEX_R 프라이머로 DNA 주형을 제조하였다. 증폭된 DNA 풀은 T7 RNA 중합 효소(New England Biolabs)를 사용하였다. RNA는 DNase I(Takara Bio Inc., Nojihigashi, Japan)로 처리한 후 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동으로 정제하였다. RNA 풀 3 nmol을 1 mL 선택 완충액(50 mM Tris-HCl 및 100 mM KCl, pH 7.4)에 녹인 후, 95℃에서 10 분 동안 열로 변성시켜 리폴딩시킨 후, 20 분 동안 실온으로 냉각시켰다. MgCl₂를 RNA 용액에 최종 농도 10 mM이 되도록 첨가하고, 용액을 실온에서 15분 동안 안정화시켰다. RNA 풀을 폴리프로필렌 컬럼(Qiagen, Hilden, Germany)에서 1 mL의 카프로락탐-커플링된 매트릭스와 혼합하고 회전하면서 실온에서 밤새 배양하였다. 음성 선택을 위해 카프로락탐이 결합되지 않은 매트릭스를 4 회차 라운드에서 사용하였다. RNA-매트릭스 혼합물을 폴리프로필렌 컬럼의 인-컬럼 필터를 통해 여과하고, 나머지 컬럼을 10 컬럼 부피의 세척 완충액(50 mM Tris-HCl, 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, pH 7.4)을 이용하여 세척하였다. 그 후, 매트릭스를 용출 완충액(25 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA, 4 M urea, pH 7.4) 2 mL와 혼합하고 95℃로 가열하여 RNA를 용출시켰다. 용출단계로부터의 flow-through는 에탄올을 사용하여 침전시키고, RNA 농도는 UV-1700 분광광도계(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 260 nm에서 흡광도를 측정하였다. 용출된 RNA를 SuperScriptIII 및 SELEX_R을 사용하여 역전사시켰다. cDNA를 프라이머로서 SELEX_RT_T7 및 SELEX_R 을 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭된 DNA는 다음 압타머 선택을 위한 라운드에서 RNA를 준비하기 위한 주형으로 사용하였다. 4회차 라운드에서 세척된 분획을 라운드 5의 용출 분획 대신 사용하였다. 본 실시예에서 사용한 프라이머의 염기서열을 표 1에 나타내었으며, 본 실험의 전체적인 과정을 도식화하여 도 1에 나타내었고, 본 실험의 결과를 도 2에 나타내었다.

이름	서열(5′ - 3′)
SELEX_Template(서열번호 5)	tcagctggacgtcttcgaat(N)60tgtcaggagctcgaattccctatagtgagtcgtatta
SELEX_F(서열번호 6)	taatacgactcactataggga
SELEX_R(서열번호 7)	tcagctggacgtcttcgaat
SELEX_RT_T7(서열번호 8)	taatacgactcactatagggaattcgagctcctgaca

도 2에 나타낸 바와 같이, 최종적으로 10 회 차에 회수한 RNA 압타머 풀의 3.34%가 카프로락탐에 반응하였다.

실시예 2. 카프로락탐 리보스위치 라이브러리 구축

리보스위치 플라스미드 라이브러리는 실시예 1로부터 수득한 RNA 풀을 백본 플라스미드 pRibo_NC에 클로닝하여 구성하였다. 벡터 플라스미드(pRibo_NC)를 5 '말단에서 인산화되고 BsaI 제한효소 부위가 포함된 CapApt_N10_R(5'-gtcactggtctcgcctt(N)10tcagctggacgtcttcgaat-3', 서열번호 9) 및 CapApt_F(5'-ggtcactggtctcgagcgggaattcgagctcctgaca-3', 서열번호 10)의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭으로 생산하였다. Quick Ligation 키트(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 사용하여 PCR 생성물을 연결하여 대장균 Mach1-T1R 세포로 형질전환시켰다. 상기 실시예 1로부터 수득한 RNA 풀을 10 회차 라운드 후 역전사하고, 상기 역전사한 시퀀스를 NCapApt_N10_R 및 CapApt_F 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 상기 증폭시킨 RNA 풀을 BsaI 제한효소 영역을 사용하여 절단하였다. 이를 Quick Ligation 키트를 사용하여 백본 플라스미드에 연결하였다. 이렇게 만들어진 리보스위치 라이브러리를 E. coli DH10B 수용 세포로 형질전환한 후 다시 회수하였고, 회수한 라이브러리를 E. coli W3110 수용 세포로 형질전환하였다.

실시예 3. 카프로락탐 리보스위치 라이브러리의 제조 및 선택

3.1 카프로락탐 리보스위치 라이브러리의 제조

상기 실시예 2에서 구축한 리보스위치 라이브러리를 테트라사이클린 저항성 유전자(tetA)의 특성을 이용해 제조하였다.

카프로락탐 리보스위치는 백본 플라스미드에서 2개의 선택적 마커 유전자를 포함한 tetA-sgfp의 업스트림 압타머 풀에 의해 제조되었으며, 이를 도 3에 나타내었다.

3.2 카프로락탐 리보스위치 라이브러리 최적의 군의 선택

최적의 라이브러리 선택 과정은 낮은(Low), 중간(Mid) 및 높은(High) 카프로락탐 농도를 갖는 배지에서 선택을 각각 진행하였는데, '낮은(Low)' 및 '중간(Mid)' 배지에서는 음성선택으로, '높은(High)' 배지에서는 양성선택으로 진행하였다. 이때 하부 유전자인 tetA 유전자의 특성에 따라 음성선택으로 니켈 클로라이드, 양성선택으로 테트라사이클린을 이용하여 라이브러리의 선별을 진행하였다.

카프로락탐-의존적 유전자의 활성을 확인하기 위하여 리포터 유전자인 tetA-sgfp를 이용하여 실험을 수행하였다. 각 군의 라이브러리의 선별을 위하여, 모든 리보스위치 라이브러리를 E. coli W3110 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 E. coli W3110 세포를 34 μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 M9 최소배지에서 OD₆₀₀ 값이 0.2가 되도록 계산하여 배양하였다. 상기 배양액의 OD₆₀₀ 값이 1이 되었을 때, 최종 OD₆₀₀ 값이 0.2가 되도록 형질전환된 E. coli W3110 세포를 접종하였다. 이때, 사용된 배지를 이하 CM9로 명명하였다. 모든 배양은 37℃, 200 rpm 에서 진행하였다. 접종된 배양액의 OD₆₀₀ 값이 1이 되었을 때, 이 배양액을 최종 OD₆₀₀ 값이 0.01이 되도록 10 μM NiCl₂가 포함된 CM9 배지에 접종하였으며, OD₆₀₀ 값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 이것은 카프로락탐이 없는 배지에서 처음으로 수행되는 음성선택의 라이브러리의 선별이며, 배양 이후 배양액을 세척한 후, 카프로락탐을 10 mg/L 포함하는 새로운 M9 최소배지에 최종 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 옮겨 배양하였다. 이는 카프로락탐이 10 mg/L의 농도로 있는 배지에 적응시키기 위함이다. 해당 배양액의 최종 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되면, 혼합배지에 최종 OD₆₀₀ 값이 0.01이 되도록 형질전환된 E. coli W3110 세포를 옮겼다. 상기 혼합배지는 카프로락탐을 10 mg/L 포함하는 새로운 CM9 최소배지에 CM9 배지(10 μM 의 NiCl₂를 포함함)를 첨가한 것이다. 접종된 형질전환된 E. coli W3110 세포를 음성선택하여, 라이브러리를 선별하였다.

상기와 같은 방식으로, 이번에는 배양액을 세척한 후 카프로락탐을 100 mg/L 포함하는 새로운 CM9 최소배지에 최종 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 옮겨 배양시켜 주었다. 해당 배양액의 최종 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되면, 혼합배지에 최종 OD₆₀₀ 값이 0.01이 되도록 형질전환된 E. coli W3110 세포를 옮겼다. 상기 혼합배지는 카프로락탐을 100 mg/L 포함하는 새로운 CM9 최소배지에 추가로 CM9 배지(10 μM의 NiCl₂를 포함함)를 첨가한 것이다. 접종된 세포를 음성선택하여 라이브러리를 선별하였다.

마지막으로, 배양액을 세척한 후 카프로락탐을 1000 mg/L 포함하는 새로운 CM9 최소배지에 최종 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 옮겨 배양하였다. 해당 배양액의 최종 OD₆₀₀ 값이 0.5가 되면, 카프로락탐을 1000 mg/L 포함하는 새로운 CM9 최소배지에 추가로 50 μg/ml의 테트라사이클린을 포함시킨 후, 최종 OD₆₀₀ 값이 0.01가 되도록 옮겨 양성선택 과정을 거쳐 라이브러리를 선별하도록 하였다.

모든 선별과정이 끝난 후, 34 μg/ml의 클로람페니콜이 포함된 LB 고체 배지에 희석하여 도말하였다. 도말된 각 고체 배지를 37℃에서 밤새도록 배양하고 각각의 개별 콜로니로 형성되어 카프로락탐이 10 mM의 농도로 포함된 CM9 배지나, 전혀 존재하지 않는 CM9 배지에서 배양하였다. 배양 이후에 배양액을 세척한 후 형광을 측정하고 같은 양의 OD₆₀₀ 값을 측정하여 나눠 실제 형광값을 정규화하였다.

모든 선별 과정 동안 각각의 E. coli 세포들의 OD₆₀₀ 값은 UV-1700 분광광도계를 사용하여 측정하였고, 각각의 개별 콜로니의 배양은 BioscreenC MBR을 사용하였다. 형광 세기의 측정은 VICTOR3 1420 Multilabel Counter를 사용하였고, 형광 측정은 486 nm 여기 필터와 535 nm 방출 필터로 1 초 동안 측정하였다. 상기 결과는 도 4에 나타내었다. 또한 선택된 대장균 콜로니의 카프로락탐 리보스위치 라이브러리의 모식도는 도 3에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 대장균 균주의 콜로니 중 fold 활성 값이 가장 높은 7번 콜로니를 선택하였다. 선택된 7번 콜로니는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 카프로락탐 압타머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 링커 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 선택 표지 유전자를 포함한다. 리보스위치의 전체서열은 '카프로락탐 압타머-링커-선택 표지 유전자'의 순서로 배열되며, 서열번호 4의 염기서열로 표시된다. 상기 선택 표지 유전자는 5'-UTR 및 tetA 유전자의 30 nt를 포함한다.

실시예 4. 선택된 카프로락탐 리보스위치의 특이성 검증

4.1 전구체인 6-아미노카프로산과의 반응성 확인

카프로락탐 생산 균주에서 전구체로 알려진 6-아미노카프로산에 대한 카프로락탐 리보스위치의 반응성을 확인하였다. 구체적으로, 해당 실험은 CM9 배지에서 진행되었으며, 6-아미노카프로산이 첨가된 배지 또는 카프로락탐이 첨가된 배지에서 카프로락탐 리보스위치를 포함하고 있는 대장균을 배양했다. 먼저, 카프로락탐 리보스위치를 포함하는 대장균을 CM9 배지에서 24 시간 배양한 뒤, CM9 배지에 1/100의 비율로 희석하여 재접종한 후 8 시간 동안 배양하고, 다시 CM9 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 접종하였다. 이후 6-아미노카프로산 또는 카프로락탐을 배지에 첨가하여 8 시간 동안 배양한 뒤 배양액의 OD₆₀₀ 값과 형광을 측정하여 하부유전자의 발현량을 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 카프로락탐이 추가된 배지에서 카프로락탐-특이적 리보스위치를 포함하는 대장균은 유전자 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이와는 반대로, 6-아미노카프로산을 처리한 배지에서는 유전자 발현이 증가되지 않았다.

4.2 리보스위치의 하부 유전자 발현 정도 확인 및 다른 락탐과의 반응성 확인

해당 카프로락탐 리보스위치의 하부 유전자 발현 정도를 확인하기 위하여 다양한 농도의 카프로락탐을 포함하는 CM9 배지에서 OD₆₀₀ 값과 형광을 측정하였다. 이때 생체 외부의 카프로락탐 농도에 따른 용량반응곡선을 도 6에, 생체 내부의 카프로락탐 농도에 따른 용량반응곡선을 도 7에 나타내었다.

부티로락탐(Butyrolactam) 및 발레로락탐(Valerolactam)과 같이 탄소 수의 차이가 있는 물질과 선택된 리보스위치 사이의 반응성을 확인하였다. 해당 실험은 CM9 배지에서 진행되었으며, 실험군으로는 탄소 수의 차이가 있는 부티로락탐(Butyrolactam) 및 발레로락탐(Valerolactam)이 각각 첨가된 배지와 카프로락탐이 첨가된 배지에서 카프로락탐 리보스위치를 포함하고 있는 대장균을 배양하는 방식으로 진행하였다.

먼저, 카프로락탐 리보스위치를 포함하는 대장균을 CM9 배지에서 24 시간 배양한 후, CM9 배지에 1/100의 비율로 희석하여 재접종한 후 8 시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 대장균을 CM9 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 접종하였다. 이후 부티로락탐, 발레로락탐 및 카프로락탐을 배지에 첨가하여 8 시간 동안 배양한 후 배양액의 OD₆₀₀ 값과 형광을 측정하여 하부유전자의 발현량을 측정하였다. 이때 각 발현량은 생체 내부의 각종 락탐 농도에 대하여 측정하였고, 이 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 먼저 생체 내부의 각종 락탐 농도의 차이가 크지 않음을 보아 세포가 각종 락탐을 받아들이는 데에 큰 차이가 없음을 확인하였고, 이때 카프로락탐에만 특이적으로 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 실시예 3에서 제조한 리보스위치가 카프로락탐이 존재할 경우 다른 락탐이 존재할 경우보다 최소 2 배 이상 더 강하게 유전자를 발현시킨다는 것을 의미한다.

추가적으로, 실제 카프로락탐 생산 균주를 제작할 시 동시에 생산될 수 있는 발레로락탐에 대한 특이성을 확인해 보았다. 전과 마찬가지로, 카프로락탐 리보스위치를 포함하는 대장균을 CM9 배지에서 24 시간 배양한 후, CM9 배지에 1/100의 비율로 희석하여 재접종한 후 8 시간 동안 배양하였다. 그 후 상기 대장균을 CM9 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 접종하였다. 이후 카프로락탐과 발레로락탐이 각각 (0:100), (25:75), (50:50), (75:25), (100:0) 의 비율로 첨가된 배지에서 8 시간 동안 배양한 후 배양액의 OD₆₀₀ 값과 형광을 측정하여 하부유전자의 발현량을 측정하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 카프로락탐의 비율이 높아짐에 따라 선형적으로 하부유전자의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다. 따라서 카프로락탐 생산 균주에서 해당 유전자 발현량은 카프로락탐 생산량을 반영할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 카프로락탐 리보스위치의 세포 생장 조절 가능성의 확인

카프로락탐-특이적 리보스위치는 카프로락탐에 의해 조절되고, 하부 유전자 중에는 tetA 유전자가 포함되어 있기 때문에 실제로 인공 진화 도구로 활용될 수 있는지를 확인하였다. 구체적으로, 서로 다른 농도의 카프로락탐이 첨가된 배지에 서로 다른 농도의 테트라사이클린을 첨가된 CM9 배지에 카프로락탐 리보스위치를 포함하고 있는 대장균을 배양하였다. 카프로락탐 리보스위치를 포함하는 대장균을 CM9 배지에서 24 시간 동안 배양한 뒤, CM9 배지에 1/100의 비율로 희석하여 재접종한 후 8 시간 동안 배양하고, 다시 CM9 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.05가 되도록 접종하였다. 이후 다양한 농도의 카프로락탐 및 테트라사이클린을 배지에 첨가하여 8 시간 동안 배양하였다 배양 중 배양액의 OD₆₀₀ 값을 측정하여 각 조건에서 균주의 성장 속도를 계산하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 테트라사이클린이 첨가되지 않은 배지에서 카프로락탐 자체의 독성 때문에 카프로락탐의 양이 증가함에 따라 세포의 성장 속도가 다소 줄어드는 것을 확인하였다. 하지만 테트라사이클린이 첨가된 배지에서는 높은 농도의 카프로락탐이 첨가되었을 때 성장 속도가 높게 나타났다. 특히, 선택되는 카프로락탐의 농도는 테트라사이클린 농도의 변화에 따라 조절되었다. 테트라사이클린이 80 μg/ml 존재할 때는 카프로락탐이 없는 배지에서만 세포가 성장하지 못하는 반면, 테트라사이클린을 보다 높은 농도(150, 300 μg/ml)로 첨가하면 성장을 위한 최소 카프로락탐 농도가 점차 증가하였다. 결과적으로, 실시예 3에서 제조한 리보스위치는 다양한 카프로락탐 생산 균주 라이브러리에 진화 도구로 사용될 때, 단순히 테트라사이클린의 농도를 변화시켜주어 선택 농도를 조절할 수 있을 것이다.

종합적으로 본 발명자들은 카프로락탐 리보스위치를 제조하고, 상기 리보스위치가 카프로락탐을 특이적이고 민감하게 인지할 수 있음을 확인하였다. 이는 상기 리보스위치를 이용하여 카프로락탐 고생산균을 스크리닝할 수 있음을 의미한다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

<110> POSTECH ACADEMY INDUSTRY FOUNDATION <120> Method for screening microorganism with high caprolactam productivity using riboswitch <130> Postech1.69P-1 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> caprolactam aptamer <400> 1 gggaattcga gctcctgaca gcacaatttg cctacagcgt taagacacga aaaagcacaa 60 ttagacactt acatgtgtgg attcgaagac gtccagctga 100 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 2 actagccgga 10 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Selectable marker gene <400> 3 aaggagcatc tatgaaatct aacaatgcgc tcatcgtcat c 41 <210> 4 <211> 151 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> riboswitch <400> 4 gggaattcga gctcctgaca gcacaatttg cctacagcgt taagacacga aaaagcacaa 60 ttagacactt acatgtgtgg attcgaagac gtccagctga actagccgga aaggagcatc 120 tatgaaatct aacaatgcgc tcatcgtcat c 151 <210> 5 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX_Template <400> 5 tcagctggac gtcttcgaat ntgtcaggag ctcgaattcc ctatagtgag tcgtatta 58 <210> 6 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX_F <400> 6 taatacgact cactataggg aattcgagct cctgaca 37 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX_R <400> 7 tcagctggac gtcttcgaat 20 <210> 8 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SELEX_RT_T7 <400> 8 taatacgact cactataggg aattcgagct cctgaca 37 <210> 9 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CapApt_N10_R <400> 9 gtcactggtc tcgccttntc agctggacgt cttcgaat 38 <210> 10 <211> 37 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CapApt_F <400> 10 ggtcactggt ctcgagcggg aattcgagct cctgaca 37

Claims

서열번호 1의 염기서열로 표시되는 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는, 카프로락탐(caprolactam) 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
삭제
제1항에 있어서,
상기 선택 표지 유전자는 tetA 유전자인, 카프로락탐 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
제1항에 있어서,
상기 리보스위치는 구조식 1의 형태로 배열되는 것인, 카프로락탐 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
[구조식 1]
카프로락탐 압타머-링커-선택 표지 유전자
제1항에 있어서,
상기 리보스위치는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인, 카프로락탐 고생산균 스크리닝을 위한 리보스위치.
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 카프로락탐 압타머, 링커 및 선택 표지 유전자를 포함하는 리보스위치가 도입된 변이균주 라이브러리를 구축하는 단계;
(b) 상기 변이균주 라이브러리를 각각 배양시키는 단계; 및
(c) 상기 배양된 변이균주 라이브러리 중에서 생존률이 높은 변이균주를 카프로락탐 고생산균 변이균주로 선택하는 단계;를 포함하는 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법.
삭제
제6항에 있어서,
상기 리보스위치는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것인, 카프로락탐 고생산균 스크리닝 방법.