CN117106101B - 质粒及asfv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检测平台，在GFP中插入非洲猪瘟病毒的S273R蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的GFP报告蛋白质粒，在上述改造后的GFP报告蛋白质粒上，克隆表达非洲猪瘟病毒蛋白酶，可用于检测S273R蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能有效克服其它蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用非洲猪瘟病毒活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL‑1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗病毒药物筛选方法，尤其涉及一种非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检测平台。
背景技术
绿色荧光蛋白（GFP）最初是在维多利亚多管发光水母（Aequorea victoria）中发现的，它在没有任何外源底物的情况下吸收蓝光并发出绿色荧光。在过去的二十年中，设计了几种改进荧光光谱的绿色荧光蛋白变体，包括增强型绿色荧光蛋白EGFP、YFP、Venus等。
基于GFP的诸多优点，譬如广谱性、稳定性、易于载体构建与检测、无毒害，GFP在细胞筛选、基因表达、细胞标记、遗传跟踪等领域被广泛应用。GFP作为一种活体报告蛋白同时它的荧光强度很高，易于活体观测和用仪器进行定量检测。GFP主要由11股β链组成的桶状结构和其中的发色团组成，而发色团通过大量氢键稳定在中间位置。其三级结构对于荧光的产生是十分重要的，蛋白质变性及分离的发色团都无法产生荧光。通常情况下，为了不破坏GFP的三级结构，均是在其N端和C端进行多种蛋白质的融合。
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，以下简称“ASFV”）引发的一种烈性传染疾病,病死率高达100%。
ASFV属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是一种双链DNA病毒。世界动物卫生组织将ASFV分为一个血清型，24种基因型。其基因组长度因基因型的不同有所差异，在170至194 kb之间相对应包含了151至167个ORF。其中有110个ORF是高度保守的。
ASFV基因组编码约50个结构蛋白占总蛋白的三分之一到四分之一。这些结构蛋白包括pP220，pP62，P72，P30，CD2V蛋白等。ASFV颗粒主要由结构蛋白组成，结构蛋白是ASFV的主要框架。结构蛋白在ASFV侵入宿主到复制繁衍的各个感染阶段起着不可替代的作用。其中pP220和pP62多聚蛋白是ASFV多个重要的结构蛋白前体。多个成熟的病毒粒子蛋白是由pP220和pP62蛋白被S273R蛋白酶水解产生的。这些被切割出的成熟蛋白约占病毒结构蛋白总量的32％，是病毒核心的主要成分。故S273R蛋白酶是非洲猪瘟抗病毒药物研发的重要靶点。迄今为止，尚没有治疗非洲猪瘟的特效药物。
大多数高传染性病毒的细胞抗病毒实验需要在BSL-2或者更高等级的实验室进行，然而这种实验室的资源相当短缺。目前，ASFV-S273R蛋白酶抑制剂的活性评价方法主要为荧光共振能量转移法或者利用活病毒进行检测。荧光共振能量转移法是目前应用较为广泛的高通量筛选方法，具有快捷、灵敏、可定量和重复性好等优点，但荧光剂易受小分子化合物影响而导致假阳性问题，同时，许多体外活性良好的抑制剂因为其细胞膜通透性或者特异性不好，在细胞内没有活性或活性很弱。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶活性和蛋白酶抑制剂筛选及活性检测平台十分必要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂药物筛选与活性检测平台，首先提供了可用于检测ASFV蛋白酶抑制剂活性的质粒，本发明在GFP中插入ASFV的的S273R蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的GFP报告蛋白质粒，在上述改造后的GFP报告蛋白质粒上，克隆表达ASFV蛋白酶，可用于检测S273R蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能有效克服上述蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用ASFV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明首先提供了一种可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，所述质粒包含改造的GFP荧光蛋白的编码核苷酸序列以及非洲猪瘟病毒蛋白酶的编码核苷酸序列；
所述的改造的GFP荧光蛋白内部包含可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列；
所述可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列插入于野生型GFP荧光蛋白的位置包括site1或site2，site1位于如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的KQ和KN之间，site2位于如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的QK和NG之间；所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶为S273R。
作为本发明的一种优选方案，所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述蛋白酶切割序列包括：cut1如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列、cut2如SEQID NO.2所示的氨基酸序列、cut3的氨基酸序列为GGG或cut4的氨基酸序列为GGN。
作为本发明的一种优选方案，所述的野生型GFP荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示。
本发明第二方面提供了上述的质粒的构建方法，所述构建方法为通过P2A编码基因序列连接改造的GFP荧光蛋白编码核苷酸序列和非洲猪瘟病毒蛋白酶S273R的编码核苷酸序列，并将连接有改造的GFP荧光蛋白编码核苷酸序列和非洲猪瘟病毒蛋白酶S273R的编码核苷酸序列克隆到表达载体上，构建可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒。
本发明中所述的表达载体可以是DNA也可以是RNA，优选地，本发明的表达载体为pcDNA3.1(+)。
本发明第三方面提供了一种检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，所述方法包括以下步骤：
1）将上述的质粒进行细胞转染，获得转染后的细胞；
2）添加非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂至上述转染后的细胞，观察是否可激发荧光产生以及检测荧光强度；
3）有激发荧光产生，则表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂起作用，反之表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂未起作用；检测荧光强度，荧光越亮，则表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越好，反之表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越差。
本发明第四方面提供了上述的质粒在检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性中的应用，可正向评价非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂的活性。
本发明最后提供了非洲猪瘟病毒S273R蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选与活性检测平台，采用上述的检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，通过荧光强度正向反映非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂的抑制效果以筛选有效的抗病毒药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1）本发明开发了基于荧光蛋白GFP与非洲猪瘟病毒蛋白酶活性的改造后的质粒系统，可用于检测ASFV蛋白酶相关抑制剂活性，借助本发明的质粒系统，蛋白酶相关抑制剂的活性与荧光强度呈正相关，可以在细胞水平非常便捷、直观的判断抑制剂的活性。
2）本发明构建了基于上述质粒的抗病毒药物筛选平台，能有效克服蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用ASFV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。
附图说明
图1是GFP中site1插入S273Rcut1，S273Rcut2，S273Rcut3与S273Rcut4，以及site2插入S273Rcut1后所形成的改造的GFP的绿色荧光表达情况以及共表达含蛋白酶切割序列的GFP和ASFV蛋白酶后的绿色荧光表达情况。
图2是高通量检测荧光表达情况。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围：可用于检测ASFV蛋白酶抑制剂活性的质粒，检测ASFV蛋白酶抑制剂活性的方法和ASFV蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选与活性检测平台。
本发明提供的检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，本发明在GFP中插入ASFV的S273R蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的GFP报告蛋白质粒，在上述含GFP报告蛋白质粒上，克隆表达ASFV蛋白酶，可用于检测S273R蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能有效克服上述蛋白酶抑制剂筛选及活性评价方法的缺点，同时能够避免使用ASFV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。
本发明的应用方向是：非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选与活性检测平台，在GFP中插入ASFV的S273R蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的GFP报告蛋白，在上述含GFP报告蛋白质粒上，克隆表达ASFV蛋白酶，可用于检测S273R蛋白酶活性以及蛋白酶相关抑制剂活性，最终形成ASFV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。
本发明实施例中，ASFV蛋白酶与GFP的氨基酸序列与编码核苷酸序列如下：
ASFV 蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：
MSILEKITSSPSECAEHLTNKDSCLSKKIQKELTSFLEKKETLGCDSESCVITHPAVKAYAQQKGLDLSKELETRFKAPGPRNNTGLLTNFNIDETLQRWAIKYTKFFNCPFSMMDFERVHYKFNQVDMVKVYKGEELQYVEGKVVKRPCNTFGCVLNTDFSTGTGKHWVAIFVDMRGDCWSIEYFNSTGNSPPGPVIRWMERVKQQLLKIHHTVKTLAVTNIRHQRSQTECGPYSLFYIRARLDNVSYAHFISARITDEDMYKFRTHLFRIA。
ASFV 蛋白酶的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：
atgtctatattagaaaaaattacgtcaagtccctctgaatgcgcagagcatcttacaaacaaagatagctgtttaagtaaaaaaatacaaaaagagctcacctcttttttggaaaaaaaagagacactcggttgcgattcggagtcctgcgtaattacccaccccgccgtgaaggcctatgcgcaacaaaagggactggacctctccaaagaactggagactcggtttaaagcgccaggacccagaaacaacacgggtcttcttacaaacttcaatattgatgaaacgctgcagaggtgggccataaaatacaccaagtttttcaactgtcctttttccatgatggactttgagagggtccattataaatttaatcaagtggatatggtaaaggtatataagggagaagagctacaatatgtagaaggcaaagtggtcaagcgtccttgtaacaccttcggatgcgttttaaacacggacttttcaacgggcactggaaaacactgggtagccatctttgtggatatgcggggcgactgctggagcatcgaatattttaattcgacgggaaattctcctccaggtcccgttattcgttggatggaacgggtcaaacagcagctattaaaaatacaccacaccgtgaaaacgcttgcagttaccaacattcgtcaccaacggtcgcagaccgagtgcggcccctacagcctgttttacatcagggcacgcctcgacaacgtgtcatacgcccattttatatccgctaggattaccgacgaagacatgtataagtttagaacccatctgtttcgcatcgca。
荧光蛋白GFP的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLASFVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGASFVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK。
荧光蛋白GFP的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag。
ASFV S273R蛋白酶切割序列包括：cut1如SEQ ID NO.1：GYFNGGGDK所示的氨基酸序列（编码核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：ggatattttaatggcgggggggacaaa），cut2如SEQID NO.2：EEKVGGNET所示的氨基酸序列（编码核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：gaagaaaaggtaggggggaatgaaacc），cut3的氨基酸序列为GGG（编码核苷酸序列为ggtgggggg）或cut4的氨基酸序列为GGN（编码核苷酸序列为ggggggaat）。
本发明实施例中所使用到的材料、试剂、仪器来源分别为：293T细胞由申请人公司保存。细胞培养板购自康宁公司。Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒购自金沙生物。Primer Star酶购自Takara公司。无内毒素质粒小提中量试剂盒购自天根生化科技有限公司。引物均由擎科生物有限公司合成。二氧化碳细胞培养箱购自Thermo Fisher公司。荧光显微镜购自OLYMPUS 公司，型号CKX53。多功能酶标仪，帝肯贸易有限公司。
实施例1
构建改造后的GFP荧光报告蛋白：
按照Primer Star酶说明书对GFP和常用表达载体进行PCR扩增，常用表达载体包括pcDNA3 .1，pCMV等，本发明实施例以pcDNA3.1(+)载体为例。将GFP基因序列通过同源重组方式（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）克隆到pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点（MCS）之间构建pGFP质粒，作为后续的模板。
随后通过PCR及同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在GFP的site1/2中插入ASFV S273R蛋白酶的切割序列cut1如SEQ ID NO.1：GYFNGGGDK所示的氨基酸序列，cut2如SEQ ID NO.2：EEKVGGNET所示的氨基酸序列，cut3的氨基酸序列为GGG或cut4的氨基酸序列为GGN，构建表达改造GFP的质粒pGFP1-S273Rcut1/2/3/4与pGFP2-S273Rcut1 (备注：cut1/2/3/4中的“/”代表“或”的意思，下同)。其中，GFP1-S273Rcut1代表在表1（表1中，↓表示插入位置）中对应的site1位置（site1所在的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.5所示，位点位置158~159aa，即KQ和KN之间）插入S273R蛋白酶的cut1切割序列后，所形成的含有蛋白酶切割序列的荧光蛋白，依次类推；pGFP1-S273Rcut1代表在GFP的site1位置（site1所在的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.5所示，位点位置158~159aa，即KQ和KN之间）氨基酸之间插入ASFV S273R蛋白酶的切割序列cut1（SEQ ID NO.1）所形成的质粒，pGFP1- S273Rcut2代表在GFP的site1位置（site1所在的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.5所示，158~159aa，即KQ和KN之间）氨基酸之间插入ASFV S273R蛋白酶的切割序列cut2（SEQ ID NO.2），pGFP2-S273Rcut1代表在GFP的site2位置（site2所在的氨基酸片段序列如SEQ ID NO.7所示，159~160aa，即QK和NG之间）氨基酸之间插入ASFV S273R蛋白酶的切割序列cut1（SEQ ID NO.1）所形成的质粒，依次类推。
对构建好的pGFP1-S273Rcut1/2/3/4与pGFP2-S273Rcut1质粒进行转染。准备生长良好的293T细胞，向293T细胞中加入10%FBS DMEM培养基，置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。待293T细胞生长到70%~80%密度时进行转染实验， 6孔板质粒转染量为2μg。转染后每隔24 h观察细胞状态，48h后进行荧光拍照。
实施例2
改造后的GFP在共表达ASFV S273R蛋白酶时的荧光效果
为了验证ASFV S273R蛋白酶可以切割含有蛋白酶切割序列的GFP，在质粒pGFP1-S273Rcut1/2/3/4和pGFP2-S273Rcut1基础上，利用2A肽连接表达ASFV S273R蛋白，构建pGFP1-S273Rcut1/2/3/4-P2A-S273R质粒和pGFP2-S273Rcut1-P2A-S273R质粒并转染293T细胞。转染后每隔24 h观察细胞状态,48h后荧光拍照。
由图1可知，改造后的GFP荧光蛋白质粒pGFP1-S273Rcut1, pGFP1-S273Rcut2，pGFP1-S273Rcut3，pGFP1-S273Rcut4以及 pGFP2-S273Rcut1均可观测到不同强度的激发荧光产生。同时，除质粒pGFP1-S273Rcut1-P2A-S273R ，pGFP1-S273Rcut3-P2A-S273R和质粒pGFP1-S273Rcut2-P2A-S273R外，转染可以表达改造后的GFP荧光蛋白和蛋白酶S273R的质粒后，在细胞中可以观测到激发荧光的消失（pGFP1-S273Rcut4-P2A-S273R和pGFP2-S273Rcut1-P2A-S273R）。可见，S273R蛋白酶可以切割改造后GFP荧光蛋白，使得荧光淬灭。选择pGFP1-S273Rcut4-P2A-S273R和pGFP2-S273Rcut1-P2A-S273R进行进一步研究。
实施例3
高通量模拟检测ASFV蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选平台效果
为了进一步验证抑制上述系统蛋白酶活性，发明人在pGFP1-S273Rcut4 -P2A-S273R和pGFP2-S273Rcut1-P2A-S273R质粒的基础上，在P2A后加入5个连续的终止密码子TGA，分别形成pGFP1-S273Rcut4 -P2A-5×Stop-S273R和pGFP2-S273Rcut1-P2A-5×Stop-S273R以破坏S273R蛋白的表达。同时，利用高通量的方法检测荧光强度。实验操作如下：将293T细胞铺于96孔板中，37℃，5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5μg质粒，每组处理做三个重复孔取平均值，4-6h后换液；37℃ 5% CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值，使用One-way ANOVA方法进行显著性差异分析（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，**** p<0.0001）。
实验结果如下：
参见图2，图2（a）表示的是在野生型GFP的158~159aa（site1）位置氨基酸之间插入S273Rcut4，其中，01为pGFP1-S273Rcut4转染细胞后的荧光值，02表示pGFP1-S273Rcut4-P2A-S273R转染细胞后的荧光值，03表示pGFP1-S273Rcut4-P2A-5Xstop-S273R转染细胞后48h的荧光值，荧光值取三个重复的平均数。
图2（b）表示的是在野生型GFP的159~160aa（Site2）位置氨基酸之间插入S273Rcut1，其中，01为pGFP2-S273Rcut1转染细胞后的荧光值，02为pGFP2-S273Rcut1-P2A-S273R转染细胞后的荧光值，03为pGFP2-S273Rcut1-P2A-5Xstop-S273R转染细胞后48h的荧光值，荧光值取三个重复的平均数。
由图2可知，与实施例2荧光结果相一致，实验组02处理荧光强度相比实验组01处理荧光强度均显著或极显著降低，实验组03处理荧光强度相比实验组02处理荧光强度均显著或极显著增强，由此可见，在转染共表达改造后的GFP荧光蛋白和S273R蛋白酶的质粒后，S273R蛋白酶将改造后的GFP荧光蛋白切割，推测S273R蛋白酶对改造后的GFP荧光蛋白具有不同的切割能力，因此荧光强度下降程度有所区别。当使用终止密码子插入表达质粒P2A序列下游时，相当于抑制了S273R蛋白酶的活性，可以检测到荧光恢复。因此，本发明所用到的质粒及方法，可以应用于ASFV蛋白酶抑制剂抗病毒药物的高通量筛选及ASFV蛋白酶抑制剂抗病毒药物的活性评价。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (5)
1.一种可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒，其特征在于，所述质粒包含改造的GFP荧光蛋白的编码核苷酸序列以及非洲猪瘟病毒蛋白酶的编码核苷酸序列；
所述的改造的GFP荧光蛋白内部包含可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列；
所述可被非洲猪瘟病毒蛋白酶裂解的蛋白酶切割序列插入于野生型GFP荧光蛋白的位置包括site1或site2，site1位于如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的KQ和KN之间，site2位于如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的QK和NG之间；所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶为S273R；
所述的非洲猪瘟病毒蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述蛋白酶切割序列包括：cut1如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或cut4的氨基酸序列为GGN；
所述cut4插入于所述site1，所述cut1插入于所述 site2；
所述的野生型GFP荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种如权利要求1所述的可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法为通过P2A的编码核苷酸序列连接改造的GFP荧光蛋白编码核苷酸序列和非洲猪瘟病毒蛋白酶S273R的编码核苷酸序列，并将连接有改造的GFP荧光蛋白编码核苷酸序列和非洲猪瘟病毒蛋白酶S273R的编码核苷酸序列克隆到表达载体上，构建可用于检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的质粒。
3.一种检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1）将如权利要求1所述的质粒进行细胞转染，获得转染后的细胞；
2）添加非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂至上述转染后的细胞，观察是否可激发荧光产生以及检测荧光强度；
3）有激发荧光产生，则表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂起作用，反之表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂未起作用；检测荧光强度，荧光越亮，则表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越好，反之表示非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂抑制效果越差。
4.如权利要求1所述的质粒在检测非洲猪瘟病毒S273R蛋白酶抑制剂活性中的应用，其特征在于，所述的应用可正向评价非洲猪瘟病毒S273R蛋白酶抑制剂的活性。
5.一种非洲猪瘟病毒S273R蛋白酶抑制剂抗病毒药物筛选与非洲猪瘟病毒S273R蛋白酶抑制剂抗病毒药物活性检测方法，其特征在于，采用权利要求3所述的检测非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂活性的方法，通过荧光强度正向反映非洲猪瘟病毒蛋白酶抑制剂的抑制效果以筛选有效的抗病毒药物。
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