CN117126298B - Fipv蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，在GFP中插入FIPV的3CL蛋白酶相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达FIPV 3CL蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成FIPV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用FIPV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL‑1级实验室即可满足实验要求，高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于FIPV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法。
背景技术
猫传染性腹膜炎（FIP）在猫的每个年龄段都有可能发生，其中3个月到3岁之间多发，主要原因是母源抗体的失效。而10岁以上的老年猫也多发FIP，这与免疫功能不佳有关。FIP潜伏期几周至几年不等，不易察觉。统计发现，一般在家庭中饲养的猫有25%~40%为冠状病毒阳性。而在大型猫舍或是繁殖猫舍中，阳性的几率达到80%~100%。FIP通常根据胸腹腔是否有渗出液可分为湿性和干性两种类型，其临床症状主要为持续性发烧、食欲减退、嗜睡、体重下降等。病程发展到2周甚至3个月后，患病猫多数死亡。
猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）主要由猫冠状病毒（FCoV）变异而来。FCoV是冠状病毒科冠状病毒亚科α冠状病毒属成员，为单股正链RNA病毒，是猫科动物主要传染性病原之一。猫冠状病毒（FCoV）可根据其致病性分为猫肠道冠状病毒（FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（FIPV），FECV感染通常呈隐性感染，而FIPV感染几乎都以猫的死亡终结。FCoV螺旋核衣壳由N蛋白包裹多个RNA拷贝而组成，病毒基因组约29 kb，11个开放性阅读框，其中编码4种结构蛋白：棘突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。ORF1a和ORF1b编码两个大的多聚蛋白pp1a和pp1ab。这两个多聚蛋白随后被切割成16个非结构蛋白（NSP1到NSP16），它们组装成一个膜锚定的复制机制进行转录和复制。多聚蛋白的裂解由两种蛋白酶调控：主要蛋白酶（3CLpro，也称为Mpro或NSP5）和木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）。PLpro将pp1a/pp1ab的N端加工成NSP1、NSP2和NSP3，3CLpro在11个位点上切割多蛋白，包括NSP4到NSP16。
3CLpro在病毒生命周期中发挥的重要作用，以及动物基因组中细胞同源物的缺乏，使其成为药物设计的一个有吸引力的重要靶点。时至今日，FIP仍然无批准使用的治疗药物。药物的研发需要大量的筛选，以活病毒的增殖作为药物评价指标不能满足高通量的要求，并且对实验室等级要求较高。因此，开发一种简洁、安全、高通量和可重复性的蛋白酶抑制剂筛选和活性检测平台十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法和抑制效果评价方法，无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行FIPV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
（1）构建共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列而成；
（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。
本发明在绿色荧光蛋白（GFP）中插入FIPV的3CL蛋白酶（3CLpro）相关裂解位点的序列，形成改造后的荧光蛋白报告蛋白，在该荧光蛋白报告蛋白质粒上，克隆表达FIPV 3CL蛋白酶，可用于筛选蛋白酶抑制剂以及对蛋白酶抑制剂活性的评价，最终形成FIPV蛋白酶抑制剂筛选及药效评价平台。本发明能够避免使用FIPV活病毒引发的安全性顾虑，对生物安全等级要求低，BSL-1级实验室即可满足实验要求，是高效、准确、稳定、高通量、可重复的用于FIPV蛋白酶抑制剂药物筛选及药效评价平台。
FIPV 3CL蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点A和位点C；
位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；
所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示。
本发明中，位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸，或与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上对应的氨基酸区域；对应的氨基酸区域指的是与野生型GFP氨基酸序列相比具有99%以上序列一致性的氨基酸序列上与野生型GFP氨基酸序列的第158~159位氨基酸相对应的位置。其它类似表述的地方参考本处释义。
发明人研究发现，在上述两个特定位点（位点A、位点C）插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列后，改造的GFP荧光蛋白仍然可以检测到激发荧光。
FIPV 3CL蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为STLQSGLR，cut2氨基酸序列为VNLQSGKV。FIPV 3CL蛋白酶切割序列cut1或cut2能准确地被FIPV 3CL蛋白酶识别和切割，切割后则会破坏荧光蛋白发光功能，导致荧光淬灭。
位点A上插入的FIPV 3CL蛋白酶切割序列为cut1或cut2；位点C上插入的FIPV3CL蛋白酶切割序列为 cut1。
一种表达改造的GFP质粒，改造的GFP表达后，仍然可以检测到激发荧光。
改造的GFP质粒的制备方法为：
将野生型GFP的基因序列通过同源重组方式克隆到表达质粒载体的多克隆位点之间构建表达野生型GFP的质粒；
通过同源重组方式，在表达野生型GFP的质粒上的GFP基因序列中插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列对应的核苷酸序列，构建表达改造的GFP质粒。
一种共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，所述质粒包括表达FIPV 3CL蛋白酶的编码基因序列和改造的GFP的编码基因序列；所述改造的GFP为在野生型GFP上插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列而成。改造的GFP荧光蛋白和FIPV 3CL蛋白酶共表达后，FIPV 3CL蛋白酶可以切割改造的GFP荧光蛋白中的cut1或cut2序列，使GFP蛋白被切割，导致荧光淬灭。若存在有效的蛋白酶抑制剂的情况下，则蛋白酶功能被抑制，无法发挥切割作用，使得荧光蛋白的发光功能得以保留，这便是本发明筛选蛋白酶抑制剂的原理。
一种FIPV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，包括以下步骤：
（1）构建共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列cut1或cut2而成；
（2）评价：将待转染细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和FIPV3CL蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。
本发明的有益效果是：无需使用活病毒，安全性好，能够高效、准确、稳定、高通量的进行FIPV蛋白酶抑制剂的筛选和抑制效果评价。
附图说明
图1是FIPV 3CL蛋白酶切割序列插入野生型GFP相应位点后的荧光图以及共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的荧光图， GFP15-3CLcut1代表在GFP的site15位置插入FIPV3CL蛋白酶切割序列cut1: STLQSGLR所形成的改造的GFP，依此类推；pGFP15-3CLcut1为表达GFP15-3CLcut1的质粒，依此类推；pGFP15-3CLcut1-P2A-3CL为共表达GFP15-3CLcut1和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，依此类推。
图2是本发明共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒示意图。
图3是添加抑制剂48h后的细胞荧光图片。
图4是高通量检测荧光表达情况；01表示pGFP24-3CLcut1转染细胞后的三个重复的平均荧光值，02表示pGFP24-3CLcut1-P2A-3CL转染细胞后三个重复的平均荧光值，03表示pGFP24-3CLcut1-P2A-5Xstop-3CL转染细胞后的三个重复的平均荧光值。
实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
病毒名称
猫传染性腹膜炎病毒（FeLine Infectious Peritonitis Virus）；蛋白酶名称：Protease 3CL；蛋白酶大小302 aa；切割序列大小：8aa。
实施例1：
质粒的构建
（1）构建表达改造的GFP质粒， 改造的GFP为FIPV 3CL蛋白酶切割序列插入野生型GFP氨基酸序列所形成，改造的GFP荧光蛋白仍然具有激发发光功能；
首先按照Primer Star酶（Takara）说明书对野生型GFP的编码基因和pcDNA3.1(+)载体（市售）进行PCR扩增。将野生型GFP基因序列（SEQ ID No.4）通过同源重组方式（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）克隆到pcDNA3.1(+)载体的多克隆位点（MCS）之间构建pGFP质粒，作为后续的模板。
通过同源重组技术（Uniclone One Step Seamless Cloning Kit试剂盒）在野生型GFP氨基酸序列的不同位置（位点A：site15 158~159aa，位点C：site 24 159~160aa）中插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列cut1: STLQSGLR（SEQ ID No.2）和cut2: VNLQSGKV（SEQ IDNo.3），cut1和cut2对应的核苷酸序列为tcaacactgcagtccggattgaga（SEQ ID No.5）和gttaatcttcagagtggtaaagtg（SEQ ID No.6），构建质粒pGFP15/24-3CLcut1/2（备注：GFP15/24以及cut1/2中的“/”代表“或”的意思，下同）。
其中，GFP15- 3CLcut1为FIPV蛋白酶切割序列3CLcut1插入在野生型GFP氨基酸序列158~159aa之间（即氨基酸MADKQ和KNG之间）所形成的改造后的荧光蛋白，pGFP15-3CLcut1为表达改造后的荧光蛋白GFP15- 3CLcut1的质粒，依此类推。
其中，GFP24- 3CLcut1为猫传染性腹膜炎病毒蛋白酶切割序列3CLcut1插入在野生型GFP氨基酸序列159~160aa之间（即氨基酸ADKQK和NGIK之间）所形成的改造后的荧光蛋白，pGFP15-3CLcut1为表达改造后的荧光蛋白GFP15- 3CLcut1的质粒，依此类推。
准备生长良好的293T细胞，向293T细胞中加入10%FBS DMEM培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养。待293T细胞生长到70%~80%密度时进行转染实验， 6孔板质粒转染量为2μg。转染后每隔24 h观察细胞状态，48h后进行荧光拍照（图1），并检测荧光强度。
荧光强度检测时，将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5ug质粒，做三个重复孔，4-6h后换液；37℃ 5%CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值。
（2）构建共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒（图2）；
在质粒pGFP15/24-3CLcut1/2基础上，通过同源重组方式，将FIPV 3CL蛋白酶的编码基因序列（SEQ ID No.7）与GFP15/24-3CLcut1/2编码基因序列（改造的GFP）通过2A肽编码基因连接，构建pGFP15/24-3CLcut1/cut2-P2A-3CL质粒并转染293T细胞。转染后每隔24h观察细胞状态及荧光拍照（图1），并检测荧光强度。
由图1可知，质粒pGFP15-3CL-cut1，pGFP15-3CLcut2，pGFP24-3CL-cut1在转染细胞后，均可以观测到不同强度的激发绿色荧光。表明FIPV 3CL蛋白酶切割序列在野生型GFP以上特定位点插入后所形成的改造的GFP仍然具有激发光功能。同时，在转染pGFP15-3CLcut1-P2A-3CL，pGFP15-3CLcut2-P2A-3CL，pGFP24-3CLcut1-P2A-3CL质粒后，随着3CL蛋白酶的表达，共表达改造的GFP和3CL蛋白酶的细胞均表现出荧光的消失。这表明， 3CL蛋白酶的表达可以切割改造后的GFP，导致荧光淬灭。
实施例2：
一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法，包括以下步骤：
（1）构建共表达改造后GFP和3CL蛋白酶的质粒，即pGFP15-3CLcut1 /cut2-P2A-3CL、pGFP24-3CL cut1-P2A-3CL（具体构建方法参考实施例1）。
（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板（96孔板）中，然后加入pGFP15-3CLcut1 /cut2-P2A-3CL、pGFP24-3CL cut1-P2A-3CL质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强。
FIPV 3CL蛋白酶的编码基因序列（SEQ ID No.7）：
tccggattgagaaaaatggcacagcctagtggtgttgtggaaccctgtattgtaagggtggcttatggcaataatgttcttaatggtttgtggcttggagatgaagtcatctgccctagacacgtcattgctagtgatacatcgcgagtgatcaattatgagaatgagttgtctagtgtgcgtttacataacttttctatagccaaaaataatgcgtttttgggtgttgtgtctgccaaatataagggtgtaaatcttgtgcttaaagtgaatcaggtaaaccctaacacaccagaacataaatttaaatccgtgaggccaggtgagagttttaacattcttgcttgttatgaaggctgtcccggtagtgtctacggtgttaacatgagaagtcagggtactatcaaaggttcatttattgctggtacctgtgggtcagtaggttatgtattagaaaatggaacgctctatttcgtgtacatgcaccacttggaattaggtaatggttctcatgttggttcaaatcttgaaggggaaatgtatggcggttatgaagatcagcctagcatgcaattggagggtactaatgtcatgtcatcagataatgtagttgcatttttgtatgctgctcttattaatggtgagagatggtttgttacaaacacatcaatgacgttagaatcttacaatgcatgggccaaaaccaatagttttacggaaattgtgtcaactgatgcttttaatatgttggctgcaaaaactggttatagtgttgaaaagttgcttgagtgtattgttagactcaataaaggttttggaggacgtactatactgtcttatggctctctgtgtgacgaattcacgcctactgaagtcataaggcaaatgtatggtgttaatcttcag（SEQ ID No.7）。
GFP的氨基酸序列：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*（SEQ ID No.1）。
GFP基因序列：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA（SEQ ID NO.4）。
实施例3：
一种FIPV蛋白酶抑制剂的抑制效果评价方法，步骤（1）同实施例2，不同之处在于步骤（2）评价：将待转染293T细胞铺于细胞培养皿中，然后加入共表达改造的GFP和FIPV3CL蛋白酶的质粒转染细胞，对转染后的细胞进行培养，同时向细胞培养皿中添加抑制剂，以不添加抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；荧光强度正向反映抑制剂的抑制效果，荧光强度越高则代表抑制剂的抑制效果越强。
本实施例中，添加的抑制剂为市售产品GC376（溶剂为DMSO），以不添加抑制剂的DMSO（用量10 μL）为对照，由图3可知，添加抑制剂1µM GC376之后，在48h还观测不到明显的激发荧光，当抑制剂浓度达到10µM及以上时，随着抑制剂浓度的提升，荧光强度越高，其中，pGFP15-3CLcut2-P2A-3CL实验组对抑制剂的反应最为灵敏。由此可见，本发明共表达改造的GFP和FIPV蛋白酶的质粒是一种细胞水平评价FIPV蛋白酶抑制剂的抑制效果的极为简洁方便的产品。
实施例4：
模拟FIPV 3CL蛋白酶失活，在pGFP15/24-3CLcut1/cut2-P2A-3CL质粒基础上将3CL进行破坏构建质粒，以定量的方式验证改造后的GFP荧光恢复情况：
具体操作为利用PCR扩增（Primer Star）及同源重组技术（Uniclone One StepSeamless Cloning Kit试剂盒）在P2A后加入5个连续的终止密码子TGA；对构建好的pGFP15/24- 3CLcut1/cut2-P2A-5×STOP -3CL 质粒进行转染。具体操作如下：将293T细胞铺于96孔板中，37℃ 5% CO2培养箱中培养过夜；每孔转染0.5μg质粒，每组处理做三个重复孔取平均值，4-6h后换液；37℃ 5% CO2培养箱中培养48h后，于多功能酶标仪（帝肯贸易有限公司）读取荧光值，使用T检验进行显著性差异分析（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）（图4）。
由图4可知，在细胞中转染共表达3CL蛋白酶和GFP15-3CLcut1或GFP15-3CLcut2或GFP24-3CLcut1的质粒后（02处理组），荧光强度相比单表达改造的GFP（01处理组）的质粒显著降低，当破坏3CL蛋白酶的功能表达后，激发荧光显著恢复（03处理组）。
可见，本发明评价蛋白酶抑制剂抗病毒药物的活性灵敏度高，可用于高通量的筛选FIPV蛋白酶抑制剂以及高通量的检测FIPV蛋白酶抑制剂抗病毒活性，具有开发优秀的抗病毒药物筛选平台及相应蛋白酶抑制剂活性检测产品的广泛前景。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (2)
1.一种FIPV蛋白酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）构建共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，所述改造的GFP为在野生型GFP上插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列而成；
（2）筛选：将待转染细胞铺于多孔板中，然后加入共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒进行转染，对转染后的细胞进行培养，同时向多孔板中添加不同组的待筛选抑制剂，以不添加待筛选抑制剂的为对照，观察细胞状态及荧光拍照，并检测荧光强度；若与对照相比荧光强度增加，则表示待筛选抑制剂具有抑制效果，荧光强度增加越多则代表待筛选抑制剂的抑制效果越强；
FIPV 3CL蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点A和位点C；
位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸；
位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸；
所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示；FIPV 3CL蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为STLQSGLR，cut2氨基酸序列为VNLQSGKV；
位点A上插入的FIPV 3CL蛋白酶切割序列为cut1或cut2；位点C上插入的FIPV 3CL蛋白酶切割序列为 cut1。
2.一种共表达改造的GFP和FIPV 3CL蛋白酶的质粒，其特征在于，所述质粒包括表达FIPV 3CL蛋白酶的编码基因序列以及表达改造的GFP的编码基因序列；所述改造的GFP为在野生型GFP上插入FIPV 3CL蛋白酶切割序列而成；
FIPV 3CL蛋白酶切割序列在野生型GFP氨基酸序列上的插入位点包括位点A和位点C；
位点A为野生型GFP氨基酸序列第158~159位氨基酸；
位点C为野生型GFP氨基酸序列第159~160位氨基酸；
所述野生型GFP氨基酸序列见SEQ ID No.1所示；
FIPV 3CL蛋白酶切割序列包括cut1、cut2，cut1氨基酸序列为STLQSGLR，cut2氨基酸序列为VNLQSGKV；位点A上插入的FIPV 3CL蛋白酶切割序列为cut1或cut2；位点C上插入的FIPV 3CL蛋白酶切割序列为 cut1。
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