CN105412151A - 针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用 - Google Patents

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李建美
王凤华
陈成
傅晟
李爽
蔡岩
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Abstract

一种针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用，利用Zn2+针对冠状病毒主蛋白酶制备抑制剂，该抑制剂为Zn2+和迈克尔加成抑制剂共同作用的协同双抑制剂，其能够显著提高对FIPV冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。

Description

针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用
技术领域
本发明涉及药学的技术领域，具体说是一种针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用。
背景技术
猫传染性腹膜炎病毒(felineinfectiousperitonitisvirus,FIPV)，主要在猫科动物间传播，可引起猫传染性腹膜炎(felineinfectiousperitonitis,FIP)，致死率极高。在过去的几十年的时间里，Haijema等人尝试开发了减毒性FIPV病毒疫苗，但是却没有成功。另外，科研人员尝试用猫肠内冠状病毒(FECV)、低毒性猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)或亚致死性猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)来治愈猫腹膜炎也均告失败，其原因主要是因为病毒疫苗在猫体内会产生抗体增强作用(antibodyenhancementofthedisease,ADE)和猝死综合症(earlydeathsyndrome,EDS)，反而加重了病情。目前为止，现有技术中并未开发出专门针对FIPV冠状病毒主蛋白酶的药物。
目前已知，FIPV是冠状病毒亚科大家族中的一员，冠状病毒是正链RNA病毒，在目前已知的正链RNA病毒中，它们的基因组是最大的。按照它们的自然宿主、基因序列以及血清型关系，冠状病毒亚科又可以分为4个属(genus)，分别为α冠状病毒(Alphacoronavirus)、β冠状病毒(Betacoronavirus)、γ冠状病毒(Gammacoronavirus)和δ冠状病毒(Deltacoronavirus)。α冠状病毒包括猫传染性腹膜炎病毒(felineinfectiousperitonitisvirus,FIPV)等；β冠状病毒包括鼠肝炎病毒(Murinehepatitisvirus,MHV)等；γ冠状病毒包括禽传染性支气管炎病毒(AvianInfectiousBronchitisVirus,AIBV)等；δ冠状病毒包括猪冠状病毒HKU15(PorcinecoronavirusHKU15)等。
FIPV冠状病毒基因组编码了两个复制多蛋白(replicasepolyproteins)pp1a(486kDa)和pp1ab(790kDa)，而它们只有在病毒编码的蛋白酶切割成独立亚基之后才能使病毒完成正常转录、复制功能，FIPV冠状病毒主要蛋白酶(简称主蛋白酶，mainprotease)在这个过程中起主要作用。如果能够抑制FIPV冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抑制FIPV冠状病毒对猫科动物的侵染，因此，FIPV冠状病毒主蛋白酶是抗FIPV感染的理想靶标。
中国专利CN1763002A公开了一种冠状病毒主蛋白酶的迈克尔加成抑制剂N3，该化合物的结构通式为：
实验证明，该化合物能够抑制FIPV冠状病毒主蛋白酶的活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是:
本发明的针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，抑制剂为包括Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3的协同双抑制剂。
本发明还可以采用以下技术措施：
Zn2+是非竞争性可逆抑制剂。
本发明的Zn2+在FIPV冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。
Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3的制成协同双抑制剂。
Zn2+抑制FIPV冠状病毒主蛋白酶活性的Ki值为1.848μM。
本发明具有的优点和积极效果是:
本发明的针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂及Zn2+的应用中，利用Zn2+针对冠状病毒主蛋白酶制备抑制剂，该抑制剂为Zn2+和迈克尔加成抑制剂共同作用的协同双抑制剂，其能够显著提高对FIPV冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。
附图说明
图1是为不同化合物对FIPVMpro的抑制作用示意图；
图2是Zn2+的动力学常数αKi示意图；
图3是Zn2+的动力学常数Ki示意图；
图4是本发明的针对冠状病毒主蛋白酶制备抑制剂的方法中FIPVMpro-N3-Zn2+复合物的三维空间结构示意图。
具体实施方式
以下通过附图和具体实施例对本发明中的技术方案进行详细说明：
本发明的针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，抑制剂为包括Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3的协同双抑制剂。
Zn2+是非竞争性可逆抑制剂。
本发明的Zn2+在FIPV冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。
Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3的制成协同双抑制剂。
Zn2+抑制FIPV冠状病毒主蛋白酶活性的Ki值为1.848μM。
对FIPV冠状病毒主蛋白酶的表达、纯化和抑制活性测定包括以下步骤：
(1)FIPV主蛋白酶基因由金唯智生物科技有限公司全合成，全合成基因所在载体为PES；
(2)将全基因合成含有FIPV主蛋白酶基因的载体PES转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，并涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上，培养过夜；
(3)从平板上挑取多个单克隆，分别接种于装有约5mL的LB的试管(该LB溶液中加入氨苄青霉素，使其终浓度为100mg/L)中，培养过夜。然后用质粒小题试剂盒(TIANprepMiniPlasmidKit)提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳进行质粒检测，回收条带正确的。提取好的含有FIPV主蛋白酶片段的载体用BamHⅠ与XhoⅠ酶切，然后用琼脂糖凝胶回收900bp左右的目标基因片段；
(4)将目标载体pGEX-6P-1用BamHⅠ与XhoⅠ酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切的片段；
(5)将(3)和(4)获得的片段连接(将酶切回收后的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5:1～10:1的比率混合在16℃下连接10-18h)转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂在LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)上培养过夜。将筛选得到的阳性克隆，用于鉴定和测序。测序结果表明，FIPV冠状病毒主蛋白酶的编码基因已被正确地克隆到pGEX-6P-1载体中；
(6)将得到的含有编码FIPV冠状病毒主蛋白酶基因的pGEX-6P-1载体转化大肠杆菌BL21(DE3)的菌株，并用LB平板(含100mg/L氨苄青霉素)筛选阳性克隆；
(7)在(6)中所述的LB平板上挑取阳性克隆(在含有氨苄青霉素的LB平板上生长出来的单克隆)，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基(含100mg/L氨苄青霉素)，当OD600达到0.6—0.8时，加入1mMIPTG，在16℃培养16—18小时；
(8)5000rpm离心15min收集细胞，然后高压破菌5～6次；破菌液12000rpm离心30min后收集上清液；
(9)将上清液加入悬菌溶液(140mMNaCl2.7mMKCl10mMNa2HPO41.8mMKH2PO4pH7.3向其中补加10％甘油、1mMDTT)预平衡的GST亲和层析柱中，用悬菌溶液冲洗结合目的蛋白的GST亲和介质，至G250检测不变蓝。最后加入400μL1-2mg/mL浓度的人类鼻病毒3C蛋白酶，4℃过夜酶切，之后收集FIPV冠状病毒主蛋白酶；
(10)将上一步骤得到的FIPV冠状病毒主蛋白酶再用HiTrapQ阴离子交换层析和superdex7510/300凝胶过滤层析进行纯化，便可得到纯度较高的FIPV冠状病毒主蛋白酶；
(11)FIPV冠状病毒主蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的；
(12)用于荧光强度测定的仪器为FluoraskanAscent荧光仪(Thermo)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm；
(13)蛋白浓度为1μM，荧光底物浓度为40μM，N3抑制剂浓度为0.5-4(单位μM)，数据处理使用GraphPadPrism软件处理；
(14)测定3组独立实验，每组独立实验含三个重复；
(15)每个底物浓度下的反应数据使用Prism程序进行Kobs的拟合。
(16)不同底物浓度下的Kobs使用1/Kobs＝1/K3+Ki/K3*[1+(S)/Km]*1/[I]来拟合计算Ki和K3，使用上述计算Km和Vmax的方法计算Ki和K3。Ki＝1.819±0.1075μM；K3＝42.91±4.457(10-3S-1)；
(17)进行FIPV主蛋白酶Zn2+Ki的测定时，首先确定抑制剂的类型，即在不同抑制剂浓度下测定主蛋白酶的Km与Vmax数值，根据Km与Vmax数值变化确定抑制剂类型进行Ki值的测定；
(18)设定抑制剂的浓度为0-4μM四个浓度梯度，蛋白浓度为1μM；荧光底物浓度梯度为2.5-50(单位μM)，测定酶活溶液为50mMTris-HClpH7.3；
(19)首先进行一组独立实验，测定0、0.5、1、2、4μM四个抑制剂浓度Km与Vmax数值，确定抑制剂类型为非竞争性抑制剂，Ki的计算方法如下：对不同抑制剂浓度下的Km/Vmax比值进行线性拟合，当y＝0时对应的值即为-ki；对不同抑制剂浓度下的1/Vmax比值进行线性拟合，当y＝0时对应的值即为-αKi；利用上述计算方法得到Ki及α的值；
(20)测定3组独立实验，每组独立实验不同抑制剂浓度下Km与Vmax测定时设置3个副孔；
(21)不同抑制剂浓度下的Km/Vmax、1/Vmax使用Prism程序进行数据拟合，分析得到计算结果：Ki＝1.848μM；αKi＝2.278μM；α＝1.2326839827。
不同化合物对FIPVMpro的抑制作用如图1所示，四条曲线分别代表在没有抑制剂下的参照例，加入2μMZn2+抑制剂下的曲线，加入1μM迈克尔N3抑制剂下的曲线，加入2μMZn2+和1μMN3协同双抑制剂下的曲线。可见，迈克尔N3抑制剂对FIPVMpro具有一定的抑制作用，而Zn2+对FIPVMpro的抑制作用要强于迈克尔N3抑制剂，明显得出2μMZn2+和1μMN3的抑制效果最好。
测定非竞争性抑制剂Zn2+的动力学常数αKi和动力学常数Ki曲线由图2和图3所示。
而Zn2+、N3与FIPVMpro共同生成的复合物的三维空间结构由图4所示。
采用以下步骤进行FIPV冠状病毒主蛋白酶复合物的晶体生长：
(1)按照FIPV冠状病毒主蛋白酶与N3摩尔比1:3到1:5的比例将二者混合，4℃孵育4h。然后将孵育后产物换液至10mMHEPESpH7.5150mMNaCl中用于结晶。24h后在0.2M乙酸锌二水合物(zincacetatedihydrate)，0.1M二甲砷酸钠三水合物(sodiumcacodylatetrihydrate)pH6.5，18％(w/v)聚乙二醇8000(polyethyleneglycol8000)条件下发现晶体。
(2)FIPVMpro-N3复合物只在含有Zn2+的条件下长晶体。根据FIPVMpro-N3-Zn2+复合物的三维空间结构可知Zn2+也可以和N3一样结合在FIPVMpro的活性口袋。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然而，并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内,当然会利用揭示的技术内容作出些许更动或修饰，成为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，其特征在于：抑制剂为包括Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3的协同双抑制剂。
2.根据权利要求1所述的针对冠状病毒主蛋白酶的抑制剂，其特征在于：Zn2+是非竞争性可逆抑制剂。
3.一种Zn2+在FIPV冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的Zn2+的应用，其特征在于：Zn2+和迈克尔加成抑制剂N3构成协同双抑制剂。
5.根据权利要求4所述的Zn2+的应用，其特征在于：Zn2+抑制FIPV冠状病毒主蛋白酶活性的Ki值为1.848μM。
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