CN104592349A - 冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用 - Google Patents

冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用 Download PDF

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CN104592349A CN201510079787.XA CN201510079787A CN104592349A CN 104592349 A CN104592349 A CN 104592349A CN 201510079787 A CN201510079787 A CN 201510079787A CN 104592349 A CN104592349 A CN 104592349A
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饶子和
杨海涛
傅晟
杨诚
王喆
蔡岩
李爽
郭宇
刘贺
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Abstract

本发明提供了一种冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂，其结构通式如式(I)所示。本发明还提供了所述该小分子抑制剂的合成方法，及其在制备用于治疗或者预防各种冠状病毒感染的药物中的用途。本发明的小分子抑制剂能够显著抑制SARS-CoV、MERS、MHV等冠状病毒主蛋白酶的活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。

Description

冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及药物化学的技术领域，具体说是一种基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构设计的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用。
背景技术
非典型肺炎病毒已经被确认是严重急性呼吸系统综合征(SevereAcute Respiratory Sydrome，简称为SARS)的元凶，并被命名为SARS冠状病毒(简称为SARS-CoV)。它是冠状病毒家族中新出现的一个变种，全长29736bp(Urbani Strain)。SARS是一种对人类具有巨大威胁的烈性传染病，2003年在全球范围内的大爆发，造成了8000余例的感染病例和774例的死亡病例，造成了社会的极大恐慌，以及人类生命健康和经济的巨大损失。2012年9月至2013年7月，全球共向世界卫生组织通报了80例感染新型冠状病毒实验室确诊病例，症状类似非典型肺炎，能导致急性肾衰竭，其中45例死亡，病死率超过50％。2013年5月23日，世卫组织将这种新型冠状病毒感染命名为“中东呼吸综合征”(Middle East Respiratory Syndrome，MERS)，目前对于这两类冠状病毒尚无特效药及疫苗上市。
SARS冠状病毒的基因组编码了两个大的复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla(486kDa)和pplab(790kDa)，这两个蛋白是由占冠状病毒2/3到3/4的基因组编码的。这两个蛋白被水解后产生病毒复制复合体的很多功能亚基。在这一水解过程中，SARS冠状病毒的主要蛋白水解酶(main protease，简称为主蛋白酶，缩写为Mpro，分子量33.8KDa(有时也被称为3C-like Protein)，起到了非常关键的作用。主蛋白酶也是ppla和pplab中的一段，它的释放是通过自催化水解完成的，自催化水解发生在该蛋白酶旁侧的Gln(Ser，Ala)位点，通过反式剪接(双分子反应)完成。在主蛋白酶的作用下，复制酶多蛋白ppla和pplab被水解成十多个功能肽段，从而进一步发挥作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒主蛋白酶是抗SARS药物设计的理想靶标。
中国专利CN1763002A公开了一种冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂，该化合物的结构通式为：
实验证明，该化合物能够抑制TGEV、HCoV-229E、FIPV、IBV、SARS-CoV等冠状病毒主蛋白酶的活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构设计的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用。
本发明为解决公知技术中存在的技术问题所采取的技术方案是：
本发明的由式(I)所示的化合物，结构式如下：
其中U为或者
R1选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
R2选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R3选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R4选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R5选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基。
本发明还可以采用以下技术措施：
所述的R1选自如下基团构成的组：叔丁氧羰基、异噁唑基羰基、氟甲基羰基、苯甲酰基、
R2为甲基、乙基、环丙基；
R3为苄基、苯基；
R4为环丙基、环戊基、环己基、氢原子；
R5为异丁基、苯基、苄基、对甲基苯基。
所述的化合物选自如下成员构成的组：
所述的化合物，其结构式为：
所述的化合物，其结构式为：
所述的化合物，其结构式为：
所述的化合物的结构式符合如下通式：
本发明的式(I)化合物的制备方法，包括以下步骤：
将式(II)化合物中的氨基保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基。
在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)，
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R3、U的定义与式(I)中的相同。
所述的式(I)化合物的制备方法，在有机溶剂中，使式(II)化合物与酸或碱在室温下反应2～8小时，脱去氨基的保护基R6，抽去溶剂；将产物与式(III)化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试剂和有机碱，在室温下反应16～24小时，得到式(I)化合物。
所述的式(I)化合物的制备方法中，还包括对得到的式(I)化合物进行进一步的衍生化，以将其中的R1基团更换为预期的基团R1′，其中R1′选自由如下基团构成的组：
C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
所述衍生化的步骤如下：
将式(I)化合物中的R1进行缩合，得到衍生化的式(I)化合物，其中R1基团被更换为R1′基团。
所述的式(I)化合物的制备方法中：
所述的酸为三氟乙酸或盐酸；
所述的碱为氢氧化钠或甲醇钠；
所述有机溶剂选自如下成员构成的组：CH2Cl2、THF、DMF、二氧六环；
所述的非质子性溶剂选自如下成员构成的组：CH2Cl2、THF、DMF、二氧六环、二甲亚砜、苯；
所述的缩合剂选自如下成员构成的组：HATU、HBTU、EDCI、HOBT；
所述的有机碱选自如下成员构成的组：LDA、三乙胺、DIEA。
本发明的药物组合物，该组合物包含治疗有效量的权利要求1至7中任一项的式(I)化合物。
该药物组合物是冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂。
式(I)化合物在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物组合物中的用途。
式(I)化合物的用途中，所述冠状病毒为SARS冠状病毒、鼠肝炎病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。
本发明具有的优点和积极效果是：
试验证明，本发明的化合物能够显著抑制SARS-CoV、MERS、MHV等冠状病毒主蛋白酶的活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
附图不一定是成比例的，其目的仅仅在于更好地解释本发明，以便于读者理解。将附图与具体实施方式结合在一起考虑，可以更好地理解本发明。
图1是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在10μM终浓度下对SARS-CoV主蛋白酶的抑制活性曲线(其中SARS-CoVMpro代表SARS冠状病毒主蛋白酶)；
图2是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在100μM终浓度下对SARS-CoV Mpro的抑制活性曲线；
图3是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在10μM终浓度下对MERSMpro的抑制活性曲线(MERSMpro代表中东呼吸综合征冠状病毒主蛋白酶)；
图4是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在100μM终浓度下对MERSMpro的抑制活性曲线；
图5是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在10μM终浓度下对MHV主蛋白酶的抑制活性曲线(MHV为murinehepatitis virus鼠肝炎病毒)；
图6是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂M1、M2、M3在100μM终浓度下对MHV主蛋白酶的抑制活性曲线；
图7是本发明的冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂通式。
具体实施方式
术语定义：为了叙述上的方便，本文中使用了一些特定的术语，下面逐一对其进行解释。
“M1”、“M2”、“M3”是本发明特别优选的小分子抑制剂，其结构式分别为：
本文中所使用的术语“SARS冠状病毒主蛋白水解酶”、“SARS-CoV”“SARS冠状病毒主蛋白酶”等，都是指SARS冠状病毒的主要蛋白水解酶。
“C1～C6的烷基”是指碳原子数在1到6之间的直链、支链或环烷基，包括但是不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、正己基、异己基、环己基等。“氟代苄基”包括对氟苄基、间氟苄基、邻氟苄基等。
在部分结构式中，LDA代表二异丙基氨基锂，Et代表乙基，“Bn”代表苄基，“Boc”代表叔丁氧羰基。
“叔丁氧”代表三氟乙酸，“THF”代表四氢呋喃，“DMF”代表N，N-二甲基甲酰胺，“DMSO”代表二甲基亚砜，“Et3N代表三乙胺，“DIEA”代表N，N-二异丙基乙胺，“EDCI”代表N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimidehydrochloride，“HATU”代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯，“HBTU为2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate，“HOBT代表1-羟基苯并三唑。
本发明化合物的结构如通式(I)所示：
其中U为或者
R1选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
R2选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R3选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R4选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R5选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基。
本发明的某些优选化合物符合下述通式，
下面列出了本发明的一些特别优选的具体化合物，
本发明化合物的制备方法
本发明所提供的式(I)化合物的制备方法包括如下步骤：
将式(II)化合物中的氨基的保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)，
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R3、U的定义与式(I)中的相同。
式(II)化合物的合成可参考文献：Qingping Tian，NareshK.Nayyar，Srinivasan Babu，Lijian Chen，Junhua Tao，StevenLee，Anthony Tibbetts，Terence Moran，Jason Liou，Ming Guo andTimothy P.Kennedy Tetrahedron Lett.2001，42，6808-6809。式(III)化合物合成可参考文献：Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou，Qiong leiand Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004，45，8103-8105。
在本发明的一些优选实施例中，将式(II)化合物在有机溶剂中与酸(例如二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1～6∶1混合液)室温反应4～6小时；抽去溶剂，与式(III)化合物溶于非质子性溶剂中(如CH2C12，THF)，加入缩合剂如HATU，HBTU，DIEA，EDCI，然后加入有机碱如Et3N，在室温下反应12～24小时得到式(I)化合物。
还可以通过衍生化，将式(I)化合物中的R1基团更换为预期的基团R1′，从而得到式(I)化合物的一系列衍生物，其中，R1′选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
所述的衍生化包括如下步骤：将式(I)化合物中的R1脱除；在缩合剂的存在下，将上一步的产物与羧酸R1′-OH进行缩合，得到衍生化了的式(I)化合物，其中R1基团跟换位预期的基团R1′基团。
在本发明的一些优选实施例中将待衍生话的式(I)化合物在有机溶剂中与酸(例如二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1～6∶1)室温反应4～6小时；抽去溶剂，与羧酸R1′-OH溶于非质子性溶剂中(如CH2C12，THF)加入缩合剂如HATU，HBTU，EDCI，DIEA，然后加入有机碱如三乙胺、二导丙基乙胺，在室温下反应12～24小时得到式(I)化合物的一系列衍生物。
其中，上面所述的酸优选为三氟乙酸或盐酸；优选的有机溶剂选自由下成员构成的组：CH2C12、THF、N，N-二甲基甲酰胺、DMSO、苯；优选的缩合试剂选自如下成员构成的组：HATU、HBTU、EDCI、DIEA；优选的有机碱选自如下成员构成的组：二异丙基乙基胺、三乙胺。
为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给本发明的具体实施例。在对这些实施例进行描述时，公知的实验方法、仪器、试剂和材料等都未进行详细的描述。
实施例1：
将30mg的溶解在1mL CH2Cl2中，加入21μL的Et3N，之后加入12μL的溴化苄，室温下反应8～12小时，快速硅胶柱层析，得到37mg苄基保护产物将得到的产物溶于1mL的CH2Cl2，加入58μL的TFA，室温搅拌反应2小时，抽干溶剂得到脱除Boc保护的产物，之后将其溶解在2mL的CH2Cl2中，加入41mg的以及77μL的DIEA，之后加入32mg的HATU。体系于室温下反应12小时，依次用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗涤，之后收集有机相，通过无水Na2SO4干燥，将Na2SO4过滤出去，有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析，得到51mg产物M1
产率80％。
产物氢谱以及质谱数据如下：
1H NMR(400MHz，DMSO)：δ8.51-8.64(m，1H)，8.20(t，J＝9.4Hz，1H)，8.02-8.11(m，1H)，7.88-7.99(m，1H)，7.61(d，J＝21.3Hz，1H)，7.32-7.42(m，5H)，6.91(dd，J＝15.8，4.9Hz，1H)，6.55(s，1H)，5.92(dd，J＝24.4，15.9Hz，1H)，5.08-5.18(m，2H)，4.44-4.64(m，2H)，4.10-4.32(m，2H)，2.99-3.19(m，2H，2.46(s，3H)，2.23-2.37(m，1H)，1.93-2.21(m，2H)，1.76-1.93(m，1H)，1.39-1.73(m，14H)，1.36(d，J＝5.3Hz，1H)，1.29(d，J＝7.0Hz，3H)，0.89(d，J＝6.5Hz，3H)，0.81(d，J＝6.5Hz，3H)；ESI-MS：[M+Na+]：743.8.
实施例1可以用下面的反应式简要概括：
实施例2：
在对本实施例进行描述时，参考了如下的反应式(其中某些化合物下方的一位或二位阿拉伯数字为其编号)：
化合物2的制备：
将1g氢氧化钠溶于10mL水中，加入5mL 1，4-二氧六环，在冰浴下冷却后，加入1g化合物1，然后加入1.83g(Boc)2O，室温下搅拌8～12小时，用1M盐酸调节pH4-5，之后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯得1.67g化合物2，产率95％。
化合物3的制备：
将1.67g化合物2溶于25mL DMF，加入2g无水碳酸钾，反应体系置于冰浴下冷却，然后加入1mL溴化苄，室温搅拌8～12小时，然后加入少量水，室温搅拌30分钟，将反应体系过滤，收集滤液，将体系用二氯甲烷稀释，水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得2.09g化合物3，产率90％。
化合物5的制备：
将2.044g化合物3溶于20ml二氯甲烷，然后加入5mL TFA室温搅拌2～4小时，将溶剂减压蒸去，油泵抽干，得到的油状物溶于20mL二氯甲烷中，反应体系置于冰浴中，冷却后加入5mL三乙胺，然后加入2.28g1.0g HOBT以及1.46g EDCI，室温搅拌反应过夜。将反应体系依次用1M盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得到2.64g化合物5，产率90％。
化合物7的制备：
将0.61g化合物5溶于5mL二氯甲烷中，加入1mL TFA，室温搅拌2～4小时，减压蒸去溶剂，油泵抽干，得到的油状物用5mL二氯甲烷溶解，之后加入1.1mL三乙胺以及0.25g之后加入0.21g HOBT和0.3g EDCI，体系于室温下搅拌过夜反应。反应完毕后依次用1M的盐酸、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，收集有机相蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得0.58g化合物7，产率83％。
化合物9的制备：
将470mg化合物7溶于2ml二氯甲烷中，加入0.7mL TFA，室温搅拌2～4小时，反应完全之后，将溶剂减压蒸去，油泵抽干，将得到的油状物溶于2mL二氯甲烷中，之后依次加入0.8mL三乙胺、0.11g0.14g HOBT以及0.2g EDCI，体系于室温下搅拌反应8～12小时，反应完全之后，依次用1M盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，之后将硫酸钠过滤除去，收集有机相减压蒸去溶剂，快速硅胶柱层析得到0.41g化合物9，产率85％。
化合物10的制备：
将100mg化合物9溶于1mL THF中，加入9.3mg氢氧化锂，加入2ml水，之后体系搅拌过夜反应，反应完全后，加入1M盐酸酸化，调节pH4-5，之后减压蒸去溶剂，得到的白色固体用水洗涤一次，收集固体，真空干燥得100mg化合物10，产率100％。
化合物M1的制备：
将30mg化合物13溶于1mL二氯甲烷中，加入60mgDIEA，然后加入35mg化合物10，之后加入32mgHATU，体系于室温下搅拌过夜，反应结束后除去溶剂，快速硅胶柱层析得到46mg化合物M1，产率86％。
化合物M2的制备：
在对本实施例进行合成时，参考了如下的反应式(其中某些化合物下方的一位或二位阿拉伯数字为其编号)：
化合物M3的制备：
在对本实施例进行合成时，参考了如下的反应式(其中某些化合物下方的一位或二位阿拉伯数字为其编号)：
以下针对小分子抑制剂对SARS-CoV Mpro、MERS Mpro、MHV Mpro的活性抑制效果进行分析：
一、材料与方法
(1)M1、M2、M3对SARS-CoV Mpro的抑制活性测定
①在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的SARS-CoV Mpro和10μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图1中。
②在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的SARS-CoV Mpro，100μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图2中。
(2)M1、M2、M3对MERS Mpro的抑制活性测定
①在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的MERS Mpro，10μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图3中。
②在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的MERS Mpro，100μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图4中。
(3)M1、M2、M3对MHV Mpro的抑制活性测定
①在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的MHV Mpro，10μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图5中。
②在缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.3)，1mM EDTA(不含DTT)中，加入1μM(终浓度)的MHV Mpro，100μM(终浓度)的化合物M1，迅速加入5μM(终浓度)的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFR-Lys(DNP)-Lys-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为320nm和405nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。M2、M3的抑制活性的测定方法与M1基本相同。
对照：不加抑制剂，加入DMSO，保证体系是100μl，其余条件相同。结果示于图6中。
二、结果与分析
1、M1、M2、M3对SARS-CoV主蛋白酶的抑制活性
由图1中可以看出，M1、M2、M3对SARS-CoV主蛋白酶都有抑制活性，且M1抑制活性最强。
2、M1对其他冠状病毒主蛋白酶的抑制活性
从M1对其他冠状病毒主蛋白酶的抑制活性测定(即图1、图3、图5)中可知，M1对SARS-CoV、MERS、MHV的主蛋白酶都有抑制活性，其中对MHV的抑制活性最强。在1μM的条件下，M1对MHV主蛋白酶仍然有抑制活性。
本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。
应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种式(I)所示的化合物，结构式如下：
其中U为或者
R1选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
R2选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R3选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R4选自如下基团构成的组：C1～C6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；
R5选自如下基团构成的组：C1～C5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基。
2.根据权利要求1中所述的化合物，其特征在于：
R1选自如下基团构成的组：叔丁氧羰基、异噁唑基羰基、氟甲基羰基、苯甲酰基、
R2为甲基、乙基、环丙基；
R3为苄基、苯基；
R4为环丙基、环戊基、环己基、氢原子；
R5为异丁基、苯基、苄基、对甲基苯基。
3.根据权利要求1中所述的式(I)化合物，其特征在于：化合物选自如下成员构成的组：
4.根据权利要求1中所述的式(I)化合物，其特征在于：其结构式为：
5.根据权利要求1中所述的式(I)化合物，其特征在于：其结构式为：
6.根据权利要求1中所述的式(I)化合物，其特征在于：其结构式为：
7.根据权利要求1或2中所述的式(I)化合物，其特征在于：化合物的结构式符合如下通式：
8.权利要求1中式(I)化合物的制备方法，包括以下步骤：
将式(II)化合物中的氨基保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基。
在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)，
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R3、U的定义与式(I)中的相同。
9.根据权利要求8中所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于：在有机溶剂中，使式(II)化合物与酸或碱在室温下反应2～8小时，脱去氨基的保护基R6，抽去溶剂；将产物与式(III)化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试剂和有机碱，在室温下反应16～24小时，得到式(I)化合物。
10.根据权利要求8中所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于：还包括对得到的式(I)化合物进行进一步的衍生化，以将其中的R1基团更换为预期的基团R1′，其中R1′选自由如下基团构成的组：
C1～C6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、
所述衍生化的步骤如下：
将式(I)化合物中的R1进行缩合，得到衍生化的式(I)化合物，其中R1基团被更换为R1′基团。
11.根据权利要求8、9或10中所述的式(I)化合物的制备方法，其特征在于：
所述的酸为三氟乙酸或盐酸；
所述的碱为氢氧化钠或甲醇钠；
所述有机溶剂选自如下成员构成的组：CH2Cl2、THF、DMF、二氧六环；
所述的非质子性溶剂选自如下成员构成的组：CH2Cl2、THF、DMF、二氧六环、二甲亚砜、苯；
所述的缩合剂选自如下成员构成的组：HATU、HBTU、EDCI、HOBT；
所述的有机碱选自如下成员构成的组：LDA、三乙胺、DIEA。
12.一种药物组合物，其特征在于：该组合物包含治疗有效量的权利要求1至7中任一项的式(I)化合物。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于：该药物组合物是冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂。
14.权利要求1至7中任一项的式(I)化合物在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物组合物中的用途。
15.根据权利要求14所述式(I)化合物的用途，其特征在于：该药物组合物为冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂。
16.根据权利要求14所述式(I)化合物的用途，其特征在于：所述冠状病毒为SARS冠状病毒、鼠肝炎病毒、中东呼吸综合征冠状病毒。
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