CN103819486A - 标记血清糖原磷酸化酶浓度水平的光亲和标记探针分子、其制备方法及医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类光亲和标记的探针分子，其制备方法及医药用途。本发明所涉及到的探针分子可在血清中选择性标记糖原磷酸化酶，从而使得糖原磷酸化酶被定性定量检测，因此可用于心肌梗死、心绞痛、心律失常、缺血性心脏骤停，冠心病疾病发生时生化标志物糖原磷酸化酶的标记检测。

Description

标记血清糖原磷酸化酶浓度水平的光亲和标记探针分子、其制备方法及医药用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一类光亲和标记的探针分子，其制备方法及医药用途。本发明所涉及到的探针分子可在血清中选择性标记糖原磷酸化酶，从而使得糖原磷酸化酶被定性定量检测，因此可用于心肌梗死、心绞痛、心律失常、缺血性心脏骤停，冠心病疾病发生时生化标志物糖原磷酸化酶的标记检测。 
背景技术
糖原磷酸化酶是糖原分解的关键酶，有3种同工酶，分别是脑型同工酶(GPBB)、肌型同工酶(GPMM)和肝型同工酶(GPLL)，其中GPBB是在人脑和心肌中占优势的同工酶。GPBB最早在实验室因心肌缺血而被检测到。目前，GPBB成为最具潜质的心肌损伤生物标记，其在胸痛开始的1～4h内浓度开始增加，并且释放本质上依赖于心肌缺血损伤。对比其他已知心肌标志物，GPBB对于诊断心肌梗死、心绞痛、心律失常、缺血性心脏骤停，冠心病等心肌缺血损伤具有高度敏感性和特异性(Clin.Chem.1995，41，966)。 
GPBB的测定方法目前有三种：第一种是基于化学方法测定糖原分解时释放出的无机磷酸盐，第二种是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，第三种是酶联免疫吸附测定法。前两种方法敏感性较低，心肌缺血损伤发生时难以从血清中检出GPBB(Lab Delo.1991，1，17)。酶联免疫吸附测定法相对灵敏，检测下限可达10μg/L，但正常人血清中检测不到GPBB。该法可初步实现对酶的半定量，并可应用全血、血清和血浆样本进行分析，为目前科研工作中常用的检测方法。但是该方法是利用抗体-抗原间的特异性分子识别机制，存在着抗体本身稳定性差、对温度敏感等缺点，在一定程度上制约了其临床应用(Clin.Chem.1996，42，S129)。 
光亲和标记技术是在复杂生物样品中检测蛋白质功能状态水平的核心工具之一，是新的蛋白质检测方法学。迄今为止，国外学者已经成功地运用该技术对一些重要的蛋白酶进行了研究，如金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸水解酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶等。该技术运用合成的光亲和小分子化合物作为工具探针，经特定波长的光照射分解产生高活性的中间体，与其受体活性部位形成特异性的不可逆的共价结合，从而可以使得蛋白质被定性定量检测，标记效率和检测灵敏度均较高。此外，小分子探针易于合成和纯化，可在体外批量合成，化学稳定性高，可避免目前酶联免疫吸附法稳定性差等缺点(Nature Chem.Bio.2006，2，274；Bioorg.Med.Chem.Lett2008，18，3646；Mol.Cell.Proteomics.2008，7，1241)。 
探针分子包括三个功能部位；活性基团、光亲和标记基团、报告基团，以及他们之间的连接部位。活性基团的作用是将探针分子导向受体蛋白的活性中心。光亲和标记基团的作用是在探针分子被导向受体蛋白的活性中心之后经特定波长的紫外光照射分解产生高活性的卡宾或氮宾中间体，将探针分子共价修饰在受体蛋白的活性中心。报告基团的作用主要是方便蛋白标记以后的分离、纯化、检测等操作，最常用的报告基团有荧光基团、生物素和放射性标签。由于报告基团的存在，经常造成探针的分子量较大，所以近年来探针分子设计中引入了潜在的报告基团的概念。潜在的报告基团一般为分子量较小的叠氮基团，在探针分子共价 标记了靶蛋白后，再与带炔基的生物素或荧光基团发生Huisgen1，3-偶极环加成反应引入生物素或荧光基团等报告基团，方便以后的分离、纯化、检测等操作。其中β羰基叠氮是一个很特殊的结构，它与普通的烷基叠氮或芳基叠氮不同，在紫外光照射下具有很好的稳定性，经查作为潜在的报告基团使用。 
发明内容
本发明的一个目的是提供一种光亲和标记的探针分子，具有式(I)所示的结构： 
Figure BSA0000100899390000021
该类探针分子由活性基团、光亲和标记基团、报告基团或潜在的报告基团及连接基团组成。 
其中： 
R代表生物素、丹磺酰基、β羰基叠氮、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)； 
X代表N、O、CH2； 
n代表0-10。 
上述化合物中优选的化合物为： 
R代表生物素、丹磺酰基、β羰基叠氮、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)； 
X代表O、CH2； 
n代表1-5。 
本发明的又一个目的是提供式(1)代表的光亲和标记分子探针的制备方法，所述的化合物可采用已报道的工艺方法制备，也可以采用下述方法制备得到： 
a.活性基团的合成路线： 
上述路线中，R1代表各种氨基保护基，包括叔丁氧羰基(Boc)和芴甲氧羰基(Fmoc)，R2代表各种羟基保护基，包括叔丁基二甲基氯硅烷基、三甲基氯硅烷基、α-四氢吡喃基、乙酰基，n的定义如前所述。 
a)在碱催化下，氨基端保护的4-氟苯丙氨酸，与制备好的含不同连接基团的4-取代哌啶溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂进行缩合反应，反应1-72小时，温度为0℃至150℃。溶剂一般选择惰性溶剂，特别是非质子性溶剂，包括乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或、N，N-二甲基甲酰胺。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T3P)。所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺； 
b)将a产物溶解在有机溶剂中，加入脱保护试剂脱去保护基，温度为0℃至回流。在碱催化下，5-氯吲哚-2-甲酸与脱掉保护基的a产物反应，反应1-72小时，温度为0℃至150℃。溶剂一般选择惰性溶剂，特别是非质子性溶剂，包括乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或、N，N-二甲基甲酰胺。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T3P)。所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氯钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用 的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺； 
c)在碱催化下，b产物与甲磺酰氯反应。所采用的碱包括三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠和氢氧化钾，优先采用三乙胺、吡啶。所采用的溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、四氯呋喃和二氧六环，或者用这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺。反应温度可控制在0度至150度，优先采用室温至80度作为反应温度； 
d)将c产物溶解在有机溶剂中，加入叠氮化钠，反应1-48小时，温度为0℃至回流。所采用的溶剂可以是N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯和二氧六环，或者用这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、乙腈、四氢呋喃作为溶剂。 
b.报告基团或潜在的报告基团与光亲和标记基团的合成路线： 
Figure BSA0000100899390000041
上式中，R3代表生物素、丹磺酰基、β碳基叠氮、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)。 
按照常规的酰胺化方法，(S)-6-氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯与特定的酰氯或羧酸反应，得到报告基团或潜在的报告基团与光亲和标记基团。 
c.探针分子的合成路线： 
Figure BSA0000100899390000051
按照常规的点击化学的方法，将含有叠氮基的活性基团部分和含有炔基的报告基团或潜在的报告基团与光亲和标记基团部分在有机溶剂中混合，加入CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，反应1-48小时，温度为0℃至回流，所采用的溶剂可以是二氯甲烷、甲醇、乙醇、叔丁醇、水，或者是这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用二氯甲烷/水、甲醇/水、乙醇/水、叔丁醇/水的混合溶剂作为溶剂。 
本发明的再一个目的是提供式(1)中所示的光亲和标记探针分子在标记检测心肌缺血损伤发生时血清生化标志物糖原磷酸化酶中的应用。本发明中光亲和标记探针的活性基团是糖原磷酸化酶强效抑制剂，能特异性识别糖原磷酸化酶。探针分子制备方法简单、稳定性好。 
利用本发明提供的光亲和标记探针分子标记检测心肌缺血损伤发生时血清生化标志物糖原磷酸化酶通过以下步骤实现： 
正常SD大鼠和急性心肌缺血模型大鼠腹主动脉取血，4℃，3000转离心，取血清备用。取4份正常大鼠(500ul)血清，分别加入糖原磷酸酶b，使终浓度分别为100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，0ng/ml，混匀后加入探针分子，使探针分子终浓度为10uM，4℃孵育过夜。另取急性心肌缺血模型大鼠血清，加入探针分子，使探针分子终浓度为10uM，4℃孵育过夜。365nm紫外光灯照射，总能量为8焦耳(约35分钟)。将照射后的血清加入透析管中，透析液为PBS，12小时换液一次，透析48小时。BCA法定量血清蛋白含量，取30ug总蛋白上样，page胶分离蛋白后，转PVDF膜，在image上扫描荧光，通过光密度值的大小，间接定量模型组中GPb的含量。计算方法：利用光密度值和蛋白浓度成正比，用点线图拟合标准曲线。通过探针分子结合的GPb的条带光密度值带入拟合公式计算蛋白浓度。 
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。 
图1是表示本发明中不同浓度的化合物13在大鼠急性心肌缺血模型血清中的结合蛋白。 
图2是表示本发明中化合物13半定量标记正常SD大鼠和急性心肌缺血模型大鼠糖原磷酸化酶的过程。 
具体实施方式：
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实例是为了更好的闸 述本发明，并不是用来限制本发明的范围。 
以下通过实施例进一步说明本发明的实施 
实施例1 
Figure BSA0000100899390000061
2-(2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-四氢-2H-吡喃(2) 
将四甘醇(8.90mL，0.052mmol)和三乙胺(16.70mL，0.12mol)溶解于二氯甲烷50mL中，冰水浴冷却下缓慢滴入甲磺酰氯(8.05mL，0.104mol)，滴完后于室温搅拌4h。减压蒸干溶剂，残渣用乙酸乙酯稀释后依次以水、1N盐酸、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后蒸去溶剂，减压浓缩得2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇(8.70g，62.1％)，产品无需进一步纯化直接用于下一步反应。将上述2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙醇(8.70g，31.97mmol)溶解于无水二氯甲烷(100mL)，向其中加入对甲苯磺酸吡啶盐(PPTS，0.80g，3.20mmol)并滴加二氢吡喃(DHP，4.38mL，47.96mmol)，室温搅拌3小时。反应结束后，粗品以乙酸乙酯稀释，水洗三次，饱和食盐水洗，用无水Na2SO4干燥。蒸去溶剂，所得残留物经快速硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯：50/1，V/V)得透明油状物(2.50g，21.9％)。 
1H-NMR(400MHz，CD3Cl)：1.50-1.64(m，4H)，1.69-1.76(m，1H)，1.79-1.86(m，1H)，3.09(s，3H)，3.48-3.53(m，1H)，3.58-3.63(m，1H)，3.66-3.68(m，10H)，3.76-3.78(m，2H)，3.84-3.89(m，2H)，4.37-4.40(m，2H)，4.63(t，J＝3.2Hz，1H). 
Figure BSA0000100899390000062
4-[2-(2-{2-[2-(四氢-2H-吡喃-2-氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]哌啶(3) 
将4-羟基哌啶(0.59g，5.85mmol)溶解于DMF(30mL)，向其中加入NaH(1.56g，60％，39.02mmol)，冰浴下搅拌半小时，缓慢加入2-(2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)-四氢-2H-吡喃(2.50g，7.02mmol)，升温至60℃搅拌4h。向反应液中加入30mL水破坏过量的NaH，得到的混合物以乙酸乙酯提取3次，合并有机层，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥。蒸去溶剂，所得残留物经快速硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯：40/1，V/V)得透明油状物(0.80g，38.1％)。 
ESI-MS m/z：362.2(M+H)+. 
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：1.51-1.65(m，8H)，1.69-1.76(m，2H)，3.11-3.17(m，4H)，3.50-3.54(m，2H)，3.58-3.63(m，1H)，3.67-3.69(m，10H)，3.73-3.75(m，4H)，3.85-3.93(m，2H)，466(t，J＝4.0Hz，1H). 
Figure BSA0000100899390000071
(S)-1-{4-[2-(2-{2-[2-(四氢-2H-吡喃-2-氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]哌啶-1-基}-2-叔丁氧羰基氨基-3-(4-氟苯基)-1-丙酮(4) 
将BOC-4-氟-L-苯丙氨酸(0.52g，1，84mmol)溶于无水二氯甲烷(25mL)中，冰浴下加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.84g，2.21mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.39mL，2.21mmol)，室温搅拌10分钟，再加入4-[2-(2-{2-[2-(四氢-2H-吡喃-2-氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]哌啶(0.80g，2.21mmol)，室温搅拌过夜。反应液以饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得白色固体(0.50g，43.5％)，产品无需进一步纯化直接用于下一步反应。 
Figure BSA0000100899390000072
N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(5) 
将(S)-1-{4-[2-(2-{2-[2-(四氢-2H-吡喃-2-氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]哌啶-1-基}-2-叔丁氧羰基胺基-3-(4-氟苯基)-1-丙酮(0.50g，0.80mmol)溶于二氯甲烷(10mL)，冰浴下，缓慢滴加新鲜制备的氯化氢的二氯甲烷溶液(2N，2mL)，室温搅拌过夜。次日，反应液减压浓缩得(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-2-氨基-3-(4-氟苯基)-1-丙酮盐酸盐(0.38g，99.3％)。将5-氯吲哚-2-羧酸(0.13g，0.66mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)中，冰浴下加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，0.30g，0.79mmo1)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA，0.28mL，1.58mmol)，室温搅拌10分钟，再加入(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-2-氨基-3-(4-氟苯基)-1-丙酮盐酸盐(0.38g，0.79mmol)，室温搅拌过夜。反应液以饱和食盐水洗，无水Na2SO4干燥。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯：1/4，V/V)，得白色固体(0.30g，73.4％)。 
ESI-MS m/Z：620.1(M+H)+. 
1H-NMR(400MHz，CD3Cl)：1.59-1.64(m，2H)，1.67-1.85(m，2H)，3.17-3.23(m，4H)，3.25-3.40(m，2H)，3.52-3.55(m，1H)，3.62-3.69(m，16H)，5.30-5.38(m，1H)，6.27(br s，1H)，6.91(d，J＝11.6Hz，1H)，6.99(t，J＝7.6Hz，2H)，7.16-7.23(m，2H)，7.25(dt，J＝8.8，1.6Hz，1H)，7.34-7.40(m，1H)，7.63(s，1H). 
Figure BSA0000100899390000081
N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(6) 
将N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-羟基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.40g，0.65mmol)和三乙胺(0.91mL，6.50mmol)溶解于二氯甲烷15mL中，冰水浴冷却下缓慢滴入甲磺酰氯(0.25mL，3.25mmol)，滴完后于室温搅拌4h。减压蒸干溶剂，残渣用乙酸乙酯稀释后依次以水、1N盐酸、饱和NaHCO3溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥后蒸去溶剂，得N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.45g，99.3％)。将N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-甲磺酰氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.45g，0.65mmol)溶于DMF(10mL)中，加入NaN3(65.65mg，1.01mmol)，60℃下搅拌3.5h。反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，有机相以饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯：2∶1，V/V)，得白色固体(0.30g，71.4％)。 
ESI-MS m/z：644.8(M+H)+. 
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：1.58-1.69(m，2H)，1.81-1.91(m，2H)，3.07-3.19(m，4H)，3.39-3.42(m，2H)，3.51-3.55(m，1H)，3.56-3.71(m，16H)，5.30(t，J＝7.2Hz，1H)，7.00-7.05(m，2H)，7.12-7.15(m，1H)，7.20(dt，J＝8.8，1.2Hz，1H)，7.30-7.34(m，2H)，7.42-7.46(m，1H)，7.61-7.64(m，1H)，8.0(s，1H). 
(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-己酸甲酯(8) 
将N-Boc-L-赖氨酸甲酯盐酸盐(7，197mg，0.664mmol)溶于DMF(20mL)中，分批加入4-苯甲酰基苯甲酸(150mg，0.664mmol)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI，153mg，0.80mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP，97mg，0.79mmol)，和N-甲基吗啉(NMM，0.26mL，2.36mmol)，室温搅拌过夜。反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，有机相以饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯：4∶1，V/V)，得透明固体(0.27g，87％)。 
ESI-MS m/z：491.2(M+Na)+. 
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.40(s，9H)，1.51-1.54(m，4H)，1.82-1.87(m，1H)，1.95-2.04(m，1H)，3.11-3.12(m，2H)，3.78(s，3H)，4.70(br s，1H)，4.80-4.81(m，1H)，7.08(d，J＝6.8Hz，1H)，7.49(t，J＝7.6Hz，2H)，7.61(t，J＝7.2Hz，1H)，7.78(d，J＝4.0Hz，2H)，7.79(d，J＝4.0Hz，2H)，7.92(d，J＝3.6Hz，2H). 
(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸(9) 
将(S)-6-叔丁氧羰基氨-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-己酸甲酯(0.50g，1.07mmol)溶于MeOH(10.0mL)中，冰浴下，滴加2N氢氧化钠水溶液(10.0mL)，滴毕室温搅拌3小时。减压蒸干溶剂，残渣用水稀释，以1N盐酸水溶液酸化至pH＝2，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥过滤除去干燥剂，浓缩，得白色固体(0.37g，76％yield)，此粗品无需纯化可直接进行下一步反应。 
(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基(10) 
将(S)-6-叔于氧羰基氨-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸(10g，22mmol)和K2CO3(6.07g，44mmol)置于无水DMF(120mL)中，缓慢加入溴丙炔的甲苯溶液(80％，3.97g，26.7mmol)，室温搅拌过夜。过滤除去碳酸钾，母液倾倒入水中，乙酸乙酯萃取，依次以1N盐酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯：4∶1，V/V)，得白色固体(9.70g，90％)。 
ESI-MS m/z：515.2(M+Na)+. 
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.41(s，9H)，1.49-1.56(m，4H)，1.88-1.92(m，1H)，1.99-2.06(m，1H)，2.54(t，J＝2.4Hz，1H)，3.12-3.13(m，2H)，4.72-4.87(m，3H)，7.02(d，J＝6.4Hz，1H)，7.51(t，J＝7.6Hz，2H)，7.63(t，J＝7.2Hz，1H)，7.80(d，J＝8.0Hz，2H)，7.82(d，J＝8.0Hz，2H)，7.93(d，J＝7.6Hz，2H). 
Figure BSA0000100899390000102
(S)-6-氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(11) 
将(S)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(15g，30.5mmol)溶于二氯甲烷(150mL)，冰浴下于20分钟内滴加三氟醋酸(26ml，0.31mol)，滴毕维持此温度搅拌2小时。减压蒸除反应液，残渣以乙酸乙酯稀释，依次以饱和碳酸氢钠水溶液、1N盐酸水溶液和饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，浓缩，得白色粘稠固体，此粗品无需纯化可直接进行下一步反应。 
(S)-6-丹磺酰氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(12) 
将(S)-6-氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(100mg，0.255mmol)溶于干燥的CH2Cl2和CH3OH(1∶1，v/v)(20mL)的混合溶剂中，加入三乙胺(0.05mL，0.36mmol)，冷却至0℃。冰浴下，缓慢分批加入丹磺酰氯(96.30mg，0.36mmol)，然后室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残余物用二氯甲烷稀释，然后以饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸去溶剂。快速柱层析(二氯甲烷洗脱)，得淡黄色固体(0.13g，81％)。 
ESI-MS m/z：648.2(M+Na)+. 
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.43-1.56(m，4H)，1.73-1.82(m，1H)，1.85-1.92(m，1H)，2.52(t，J＝6.4Hz，1H)，2.88(s，6H)，2.91-2.94(m，2H)，4.69-4.83(m，3H)，5.05(br t，J＝6.0Hz，1H)，6.97(d，J＝7.6Hz，1H)，7.16(d，J＝7.2Hz，1H)，7.46-7.52(m，4H)，7.60(tt，J＝7.6，1.2Hz，1H)，7.77-7.83(m，4H)，7.93-7.95(m，2H)，8.20(dd，J＝7.2，0.8Hz，1H)，8.28(d，J＝8.4Hz，1H)，8.54(d，J＝8.4Hz，1H). 
Figure BSA0000100899390000112
N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-{4-[(S)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰胺基)-6-(丹磺酰胺基)己酰氧甲基]-1H-1，2，3-三氮唑-1-基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(13) 
将N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.40g，0.62mmol)和(S)-6-丹磺酰氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(0.46g，0.74mmol)溶于CH2Cl2(2mL)和H2O(2mL)的混合溶剂中，加入CuSO4.5H2O(0.03g，0.12mmol)和Vc-Na(0.05g，0.25mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残渣以乙酸乙酯稀释，水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩，残渣经反相HPLC分离，得到透明油状物(0.09g，11.4％)。 
ESI-MS m/Z：1271.0(M+H)+. 
1H-NMR(400MHz，CD3OD)：1.40-1.61(m，6H)，1.72-1.90(m，4H)，2.92-2.99(m，8H)，3.07-3.24(m，3H)，3.59-3.63(m，14H)，3.81-3.94(m，4H)，4.58-4.62(m，3H)，5.33-5.38(m，3H)，7.02(t，J＝11.2Hz，2H)，7.13(s，1H)，7.20-7.33(m，4H)，7.44(d，J＝11.6Hz，1H)，7.55-7.62(m，5H)，7.71(t，J＝11.2Hz，1H)，7.82-7.88(m，4H)，8.01-8.04(m，2H)，8.10(d，J＝12.0Hz，1H)，8.23(d，J＝9.6Hz，1H)，8.41(d，J＝11.2Hz，1H)，8.57(d，J＝10.8Hz，1H)，8.73(d，J＝10.0Hz，1H). 
实施例2 
(S)-6-(2-氯乙酰氨基)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(14) 
将上述(S)-6-氨基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-内炔基酯粗品(5.00g，12.75mmol)溶于干燥二氯甲烷(300mL)中，加入三乙胺(12.44mL，89.25mmol)，冷却至0℃。冰浴下，将氯乙酰氯(5.76mL，76.49mmol)于30min内缓慢滴加至此溶液中，然后室温搅拌12小时。减压蒸除溶剂，残余物用二氯甲烷稀释，然后依次以饱和碳酸氢钠溶液和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后蒸去溶剂。快速柱层析(石油醚/乙酸乙酯：8/1，V/V)，得白色固体(5.10g，86％)。 
ESI-MS m/z：491.1(M+Na)+. 
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：1.49-1.66(m，4H)，1.85-2.05(m，2H)，2.54(t，J＝2.4Hz，1H)，3.32-3.38(m，2H)，4.01(dd，J＝21.6，15.2Hz，2H)，4.73-4.86(m，3H)，6.72(br s，1H)，7.09(d，J＝7.6Hz，1H)，7.51(t，J＝7.6Hz，2H)，7.63(t，J＝7.6Hz，1H)，7.80(d，J＝7.6Hz，2H)，7.85(d，J＝7.6Hz，2H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H). 
Figure BSA0000100899390000131
N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-{4-[(S)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰胺基)-6-(2-氯乙酰氨基)己酰氧甲基]-1H-1，2，3-三氮唑-1-基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(15) 
将N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.50g，0.78mmol)和(S)-6-(2-氯乙酰氨基)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯(0.44g，0.94mmol)溶于CH2Cl2(2mL)和H2O(2mL)的混合溶剂中，加入CuSO4.5H2O(37.50mg，0.15mmol)和Vc-Na(61.40mg，0.31mmol)，室温搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残渣以乙酸乙酯稀释，水洗，无水Na2SO4干燥，浓缩，残渣经反相HPLC分离，得到白色固体(0.50g，57.6％)。 
ESI-MSm/z：1114.0(M+H)+
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)：1.23-1.48(m，6H)，1.65-1.84(m，4H)，2.93-3.10(m，5H)，3.21-3.30(m，1H)，3.43-3.49(m，13H)，3.65-3.74(m，1H)，3.78-3.82(m，2H)，3.96-4.00(m，1H)，4.02(s，2H)，4.42-4.47(m，1H)，4.51-4.55(m，2H)，5.09-5.15(m，1H)，5.20(s，2H)，7.06(t，J＝8.8Hz，2H)，7.17(d，J＝8.8Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.34(t，J＝6.8Hz，2H)，7.39(d，J＝8.8Hz，1H)，7.59(t，J＝7.6Hz，2H)，7.71(t，J＝7.6Hz，2H)，7.77(d，J＝7.2Hz，2H)，7.82(d，J＝8.4Hz，2H)，8.04(d，J＝8.0Hz，2H)，8.13(d，J＝5.6Hz，1H)，8.22(t，J＝5.2Hz，1H)，8.91-8.97(m，2H)，11.74(d，J＝9.6Hz，1H). 
Figure BSA0000100899390000141
N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-{4-[(S)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰胺基)-6-(2-叠氮乙酰氨基)己酰氧甲基]-1H-1，2，3-三氮唑-1-基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(16) 
将N-{(S)-1-[4-(2-{2-[2-(2-{4-[(S)-2-(4-苯甲酰基苯甲酰胺基)-6-(2-氯乙酰氨基)己酰氧甲基]-1H-1，2，3-三氮唑-1-基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)哌啶-1-基]-3-(4-氟苯基)-1-氧代丙烷-2-基}-5-氯-1H-吲哚-2-甲酰胺(0.40g，0.36mmol)溶于DMF(10mL)中，加入NaN3(36.40mg，0.56mmol)，然后在60℃下搅拌3.5h。反应液倾入冰水中，乙酸乙酯萃取，有机相以饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤，浓缩，残渣经反相HPLC分离，得到白色固体(0.20g，49.6％)。 
ESI-MS m/z：1121.0(M+H)+. 
1H-NMR(400MHz，d6-DMSO)：1.23-1.43(m，6H)，1.65-1.83(m，4H)，2.99-3.13(m，5H)，3.17-3.31(m，1H)，3.45-3.49(m，13H)，3.66-3.73(m，1H)，3.79-3.83(m，4H)，3.97-4.00(m，1H)，4.43-4.49(m，1H)，4.52-4.54(m，2H)，5.08-5.14(m，1H)，5.21(s，2H)，7.06(t，J＝8.8Hz，2H)，7.18(d，J＝8.4Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.34(t，J＝6.8Hz，2H)，7.40(d，J＝8.8Hz，1H)，7.59(t，J＝7.6Hz，2H)，7.71(t，，J＝6.8Hz，2H)，7.77(d，J＝7.6Hz，2H)，783(d，J＝8.0Hz，2H)，8.05(d，J＝8.0Hz，2H)，8.10(t，J＝5.6Hz，1H)，8.13(d，J＝5.2Hz，1H)，8.91-8.97(m，2H)，11.74(d，J＝9.6Hz，1H). 
检测不同浓度的化合物13在大鼠急性心肌缺血模型血清中的结合蛋白： 
急性心肌缺血模型大鼠腹主动脉取血，4℃，3000转离心，取血清备用。取六份(500ul)血清，加入化合物13，使化合物18的终浓度分别为30nM，100nM，300nM，1mM，3mM，10mM，4℃孵育过夜。365nm紫外光灯照射，总能量为8焦耳(约35分钟)。将照射后的血清加入透析管中，透析液为PBS，12小时换液一次，透析48小时。各取50ul透析后的血 清，在多功能酶标仪下读取荧光值。 
利用化合物13标记血清中的糖原磷酸化酶浓度水平： 
正常SD大鼠和急性心肌缺血模型大鼠腹主动脉取血，4℃，3000转离心，取血清备用。取4份正常大鼠(500ul)血清，分别加入糖原磷酸酶b，使终浓度分别为100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，0ng/ml，混匀后加入化合物13，使化合物13终浓度为10uM，4℃孵育过夜。另取急性心肌缺血模型大鼠血清，加入化合物13，使化合物13终浓度为10uM，4℃孵育过夜。365nm紫外光灯照射，总能量为8焦耳(约35分钟)。将照射后的血清加入透析管中，透析液为PBS，12小时换液一次，透析48小时。BCA法定量血清蛋白含量，取30ug总蛋白上样，page胶分离蛋白后，转PVDF膜，在image上扫描荧光，通过光密度值的大小，间接定量模型组中GPb的含量。计算方法：利用光密度值和蛋白浓度成正比，用点线图拟合标准曲线。通过化合物13结合的GPb的条带光密度值带入拟合公式计算蛋白浓度。 
从图1中观察，Lane1为可视型Western marker，Lane2，3，4，5，6，7为急性心肌缺血模型大鼠血清中分别加入了30nM，100nM，300nM，1mM，3mM，10mM的化合物13。除Lane1外，其余Lane均进行了紫外照射。作用结果可见，30nM，100nM，300nM，1mM，3mM，10mM的化合物13可以很好地标记血清中的分子量为94kD的蛋白，随着逐渐增加的探针分子浓度，化合物13标记的条带逐渐明显。 
从图2中观察，Lane1为可视型Western marker，Lane2为急性心肌缺血模型大鼠血清，Lane3，4，5，6，7为正常SD大鼠血清中分别加入糖原磷酸酶b，使终浓度分别为100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，0ng/ml。除Lane1外，其余Lane均加入10μM探针并进行了紫外照射。作用结果可见，10μM探针可以很好地标记血清中的糖原磷酸化酶，随着逐渐增加的外源性糖原磷酸化酶的加入，探针标记条带逐渐明显。利用光密度值和蛋白浓度成正比的特点拟合标准曲线后，可以对急性心肌缺血模型大鼠血清中的糖原磷酸化酶实现半定量。探针对急性心肌缺血模型大鼠血清糖原磷酸化酶的标记明显高于正常SD大鼠血清，表明在急性心肌缺血早期生化标志物糖原磷酸化酶血清浓度明显增高，并可以被10μM探针显著标记。经过半定量的计算，可得出Lane2中糖原磷酸酶b终浓度为45.2ng/ml，符合急性心肌缺血损伤发生时血清糖原磷酸酶b浓度范围，可以初步判断动物发生了急性心肌缺血损伤。 

Claims (6)

1.一类结构式如通式(I)所示的光亲和标记探针分子：
Figure FSA0000100899380000011
该类探针分子包括由活性基团、光亲和标记基团、报告基团或潜在的报告基团及连接基团组成。
其中：
R代表生物素、丹磺酰基、β羰基叠氮、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)；
X代表N、O、CH2；
n代表0-10。
2.权利要求1的光亲和标记的化学小分子探针，其特征在于：
R代表生物素、丹磺酰基、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)；
X代表O、CH2；
n代表1-5。
3.权利要求1、2的化合物的制备方法，包括：
a.活性基团的合成路线：
Figure FSA0000100899380000012
Figure FSA0000100899380000021
上述路线中，R1代表各种氨基保护基，如叔丁氧羰基(Boc)或芴甲氧羰基(Fmoc)，R2代表各种羟基保护基，如叔丁基二甲基氯硅烷基、三甲基氯硅烷基、α-四氢吡喃基、乙酰基，n的定义如前所述。
a)在碱催化下，经偶联试剂缩合，氨基端保护的4-氟苯丙氨酸，与制备好的含不同连接基团的哌啶溶解在有机溶剂中，加入偶联试剂进行缩合反应，反应1-72小时，温度为0℃至45℃。溶剂一般选择惰性溶剂，特别是非质子性溶剂，包括乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或、N，N-二甲基甲酰胺。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯和1-羟基苯并三氮唑(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T3P)。所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺；
b)将a产物溶解在有机溶剂中，加入脱保护试剂脱去保护基，温度为0℃至回流。在碱催化下，经偶联试剂缩合，5-氯吲哚-2-甲酸与脱掉保护基的a产物反应。溶剂一般选择惰性溶剂，特别是非质子性溶剂，包括乙腈、氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺、甲苯、正己烷、环己烷、四氢呋喃、叔丁基甲基醚或上述溶剂的混合溶剂，优先采用二氯甲烷、1，2-二氯乙烷或、N，N-二甲基甲酰胺。偶联试剂可以采用常规的缩合试剂，如1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)、O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲匹氟硼酸(TBTU)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯和1-羟基苯并三氮唑(HATU)、1-丙基磷酸三环酸酐(T3P)。所采用的无机碱为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾，所采用的有机碱为N，N-二异丙基乙胺或三乙胺；
c)在碱催化下，b产物先与甲磺酰氯反应。所采用的碱包括三乙胺、吡啶、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠和氢氧化钾，优先采用三乙胺。所采用的溶剂包括二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、四氢呋喃和二氧六环，或者用这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用二.氯甲烷、1，2-二氯乙烷、吡啶、N，N-二甲基甲酰胺。反应温度可控制在0度至150度，优先采用室温至80度作为反应温度；
d)将c产物溶解在有机溶剂中，加入叠氮化钠，反应1-48小时，温度为0℃至回流。所采用的溶剂可以是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、四氢呋喃、吡啶、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、甲苯和二氧六环，或者用这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、乙腈、四氢呋喃作方溶剂。
b.光亲和标记基团和报告基团的合成路线：
上式中，R3代表生物素、荧光素、丹磺酰基、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)。按照常规的酰胺化方法，(S)-6-氮基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)己酸-2-丙炔基酯与特定的酰氯或羧酸反应，得到光亲和标记基团和报告基团。
c.探针分子的合成路线：
Figure FSA0000100899380000032
按照常规的点击化学的方法，将含有叠氮基的活性基团部分和含有炔基的报告基团部分在有机溶剂中混合，加入CuSO4·5H2O和抗坏血酸钠，反应1-48小时，温度为0℃至回流，所采用的溶剂可以是二氯甲烷、甲醇、乙醇、叔丁醇、水，或者是这些溶剂任选组成的混合溶剂，优先采用二氯甲烷/水、甲醇/水、乙醇/水、叔丁醇/水的混合溶剂作为溶剂。
4.本发明的再一个目的是提供式(I)中所示的光亲和标记分子探针在标记检测心肌缺血损伤发生时血清生化标志物糖原磷酸化酶中的应用。利用本发明提供的光亲和标记分子探针标记检测心肌缺血损伤发生时血清生化标志物糖原磷酸化酶通过以下步骤实现：
正常SD大鼠和急性心肌缺血模型大鼠腹主动脉取血，4℃，3000转离心，取血清备用。取4份正常大鼠(500ul)血清，分别加入100ng，50ng，25ng，12.5ng，0ng糖原磷酸酶b(100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml和0)，混匀后加入探针分子，终浓度为10uM，4℃孵育过夜。另取急性心肌缺血模型大鼠血清，加入探针分子，终浓度为10uM，4℃孵育过夜。365nm紫外光灯照射，总能量为8焦耳(约35分钟)。将照射后的血清加入透析管中，透析液为PBS，12小时换液一次，透析48小时。BCA法定量血清蛋白含量，取30ug总蛋白上样，page胶分离蛋白后，转PVDF膜，在image上扫描荧光，通过光密度值的大小，间接定量模型组中GPb的含量。计算方法：利用光密度值和蛋白浓度成正比，用点线图拟合标准曲线。通过探针分子结合的GPb的条带光密度值带入拟合公式计算蛋白浓度。
5.权利要求1至2的化合物，其特征在于：这些化合物是光亲和标记的化学小分子探针。
6.权利要求5的用途，其特征在于：光亲和标记的化学小分子探针可用于心肌梗死、心绞痛、心律失常、缺血性心脏骤停，冠心病疾病发生时生化标志物糖原磷酸化酶的标记检测。
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