CN105254690A

CN105254690A - 糖基吡喃腈类化合物及其用途

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Publication number: CN105254690A
Application number: CN201510611817.7A
Authority: CN
Inventors: 贺晓鹏; 李佳; 姬丁坤; 陈国荣
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2015-09-23
Filing date: 2015-09-23
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-09-23
Also published as: CN105254690B

Abstract

本发明涉及一种糖基吡喃腈类化合物及其用途，其为式I所述化合物、或其异构体。本发明提供的糖基吡喃腈类化合物可与MoS₂薄层材料复合后用于癌症的诊断。式I中，R₁为C₁～C₄直链或支链烷基，R₂为式Ⅱ所示基团：其中，R₃～R₅分别独立选自：H、-OH、中一种。

Description

糖基吡喃腈类化合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种糖基吡喃腈类化合物及其用途，具体地说，涉及一种经三氮唑链接糖基的吡喃腈类化合物及其在癌症诊断中的应用。

背景技术

癌症作为一类世界性的医学难题是当今威胁人类生命的重大疾病之一。对于癌细胞的早期发现可促成癌症的早期诊断及治愈，并大幅改善癌患病人的预后。研究表明癌细胞表面含有可与特定糖类物质结合的特异糖蛋白受体，而这些糖—受体间的相互识别作用诱发了癌细胞随后一系列的生理学发展如细胞发育和分化、细胞黏附与运动，尤其是癌细胞的转移。对于特种癌细胞表面糖受体蛋白的灵敏检测可达到癌症早期诊断的目的。

然而目前对于此类癌细胞糖生物探针的制备鲜有文献报道，同时，研究糖-受体间作用的技术手段具有一定的局限性。例如近期发展的“糖微阵列”技术需要将被研究的糖类分子修饰到特定固体材料表面并应用荧光标记的蛋白、细胞或病原体来检测其相互作用。这类手段除需要大量的耗材、实验工作外，还需要专业技术人员进行生物样品标记，而对于样品的修饰可导致对其原有生物特性的损害。

因此，对于靶向癌细胞表面跨膜糖识别受体蛋白的简易、经济、高效探测是当今学术界面临的一项重要难题。

发明内容

本发明的发明人经广泛及深入的研究，设计并应用高效的“点击化学”手段，以廉价、高生物相容度并具备长激发波的吡喃腈衍生物(DCM)为荧光染料合成了系列经三氮唑连接糖基的DCM化合物。将这些化合物与二硫化钼进行自组装，形成基于某些光学机制而使荧光淬灭的糖基DCM—二硫化钼荧光生物传感平台，其可用于表面含有特异糖识别受体癌细胞及肿瘤组织的“荧光增强式”检测。

本发明一个目的在于，提供一种结构新颖的糖基吡喃腈类化合物。

本发明所述糖基吡喃腈类化合物，其为式I所述化合物、或其异构体，

式I中，R₁为C₁～C₄直链或支链烷基，R₂为式Ⅱ所示基团：

其中，R₃～R₅分别独立选自：氢(H)、羟基(-OH)、乙酰基取代的氨基中一种。

本发明另一个目的在于，揭示上述糖基吡喃腈类化合物的一种用途，即式I所述化合物、或其异构体在制备检测凝集素、癌细胞表面糖受体蛋白和肿瘤组织的荧光生物传感器(或称荧光“关开式”生物传感器)中应用。

此外，本发明还有一个目的在于，提供一种制备式I所述化合物的方法，所述方法的主要步骤是：在有硫酸铜和抗坏血酸钠存在、15℃～35℃和搅拌条件下，由式III所示化合物与式IV所示化合物反应，得到目标化合物(式I所述化合物)。

附图说明

图1.用于细胞检测的薄层二硫化钼的透射电镜图；

图2.薄层MoS₂与化合物IA、IB和IC复合材料的细胞标记图；

图3.薄层MoS₂与化合物IA复合材料的选择性组织切片标记图。

具体实施方式

在本发明一个优选的技术方案中，R₁为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或叔丁基等。

在本发明另一个优选的技术方案中，R₂为式Ⅱ所示基团，其中，R₃为H，R₄和R₅分别独立选自：-OH、中一种；

在更优选的技术方案中，R₃为H，R₄为-OH或R₅为-OH或

在更进一步的技术方案中，R₂为下列基团中一种：

其中，AcHN为的简记式。

在本发明又一个优选的技术方案中，本发明提供了一种用于检测凝集素、癌细胞表面糖蛋白受体和肿瘤组织的荧光生物传感器(或称荧光“关开式”生物传感器)的构建方法。所述的荧光生物传感器主要由本发明提供的糖基吡喃腈类化合物(式I所示化合物，或其异构体)通过范德瓦尔兹力吸附于薄层二硫化钼上，发生自组装行为而得到。

其中，所述薄层二硫化钼的水分散液由主要步骤如下的方法制得：

将适量二硫化钼粉末置于乙醇/水的混合液中，室温下，超声3小时，离心，取离心管上层液体，得到薄层二硫化钼的乙醇/水分散液，减压蒸馏除去乙醇后，放入烘箱烘干，制得薄层二硫化钼粉末，将粉末置于超纯水(电阻率大于18MΩcm^-1的水)中，超声10分钟，即得薄层二硫化钼的水分散液。

此外，前文所述制备方法中所涉及的式III所示化合物与式IV所示化合物，其制备方法，请分别参见：Gan,Z.-H&Roy,R.Can.J.Chem.2002,80,908-916；Shaikh,N.etal.Mol.Divers.2011,15,341-345；和vanKasteren,S.I.etal.Nature2007,446,1105-1109。

下面通过实施例对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。

实施例1

式IA所示化合物(简记为化合物IA，下同)的制备：

将化合物IVA(141mg，0.65mmol)和化合物IIIA(285mg，0.71mmol)置于10mL叔丁醇中，再依次加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)(2mL)、水(2mL)和CuSO₄·5H₂0(325mg，1.3mmol)，抗坏血酸钠(VcNa)(509mg，2.6mmol)，氩气保护下，室温搅拌过夜。薄板层析(TLC)跟踪反应，至原料点消失，所得混合液经浓缩至浆状，加入5mL乙醇，再浓缩至浆状，如此反复三次。残余物经硅胶柱层析分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝15:1，V/V)，得到341mg黑红色固体(化合物IA)，得率为85％。

¹HNMR(400MHz,MeOD)δ7.95(s,1H),7.49(s,1H),7.46(s,1H),7.41(d,J＝15.9Hz,1H),6.76(d,J＝15.9Hz,1H),6.67(s,1H),6.65(d,J＝2.0Hz,2H),6.51(d,J＝2.0Hz,1H),5.49(s,1H),4.75(d,J＝12.7Hz,1H),4.64(t,J＝5.9Hz,2H),4.20(d,J＝7.7Hz,1H),3.93(t,J＝5.8Hz,2H),3.78(d,J＝2.5Hz,1H),3.77–3.73(m,1H),3.69(dd,J＝11.4,5.0Hz,1H),3.51(dd,J＝9.7,7.7Hz,1H),3.46–3.43(m,1H),3.43–3.37(m,1H),2.89(s,3H),1.40(s,9H)；¹³CNMR(400MHz,MeOD)δ173.9,162.3,158.6,151.8,146.0,139.9,131.1,126.2,124.6,116.7,116.6,114.5,113.1,106.4,103.9,103.1,76.8,74.9,72.5,70.3,62.8,62.6,57.4,53.2,38.6,37.7,30.8,28.4.

HR-ESI-MS(m/z):理论值(calcdfor)C₃₂H₃₉N₆O₇619.2880，实验值(found)619.2884。

实施例2

化合物IB的制备：

将化合物IVB(150mg，0.58mmol)和化合物IIIB(228mg，0.64mmol)置于10mL叔丁醇中，依次加入DMF(2mL)、水(2mL)和CuSO₄·5H₂0(290mg，1.16mmol)，VcNa(455mg，2.32mmol)，氩气保护下，室温搅拌过夜。TLC跟踪反应，至原料点消失，所得混合液经浓缩至浆状，加入5mL乙醇，再浓缩至浆状，如此反复三次。残余物经硅胶柱层析分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝10:1，V/V)，得到283mg黑红色固体(化合物IB)，得率79％。

¹HNMR(400MHz,MeOD)δ8.10(d,J＝8.2Hz,0.5H),7.89(s,1H),7.44(t,J＝12.0Hz,3H),6.73(d,J＝15.9Hz,1H),6.66(d,J＝8.8Hz,2H),6.63(d,J＝2.0Hz,1H),6.51(s,1H),4.88(d,J＝4.8Hz,1H),4.77(d,J＝12.7Hz,1H),4.66(t,J＝5.7Hz,2H),4.62(d,J＝12.7Hz,1H),4.31(dd,J＝9.2,4.3Hz,1H),4.23–4.16(m,1H),3.95(t,J＝5.8Hz,2H),3.79(dd,J＝7.4,4.5Hz,2H),3.69–3.51(m,4H),3.37(s,2H),2.91(s,3H),2.43(s,3H),1.99(s,3H)；¹³CNMR(400MHz,MeOD)δ173.9,164.6,162.5,158.4,151.6,145.7,139.9,131.1,126.0,124.6,116.9,114.2,113.0,106.9,106.5,100.9,84.3,74.6,74.0,64.2,61.3,60.3,56.5,53.2,38.7,22.7,20.0.

HR-ESI-MS(m/z):calcdforC₃₁H₃₆N₇O₇618.2676,found618.2674.

实施例3

化合物IC的制备：

将化合物IVC(150mg，0.39mmol)和化合物IIIB(155mg，0.43mmol)置于10mL叔丁醇中，依次加入DMF(2mL)、水(2mL)和CuSO₄·5H₂0(195mg，0.78mmol)，VcNa(306mg，1.56mmol)，氩气保护下，室温搅拌过夜。TLC跟踪反应，至原料点消失，所得混合液经浓缩至浆状，加入5mL乙醇，再浓缩至浆状，如此反复三次。残余物经硅胶柱层析分离提纯(二氯甲烷：甲醇＝6:1，V/V)，得到288mg黑红色固体(化合物IC)，得率78％。

¹HNMR(400MHz,DMSO-D₆+D₂O)δ8.06(s,1H),7.47(d,J＝8.9Hz,2H),7.42(d,J＝15.9Hz,1H),6.88(d,J＝15.9Hz,1H),6.68(d,J＝2.1Hz,1H),6.63(d,J＝9.0Hz,2H),6.52(d,J＝1.3Hz,1H),4.76(d,J＝12.4Hz,1H),4.59(d,J＝12.4Hz,1H),4.53(t,J＝5.5Hz,2H),4.26(d,J＝7.9Hz,1H),4.20–4.14(m,1H),3.83(d,J＝5.8Hz,2H),3.76(d,J＝16.0Hz,1H),3.49(dd,J＝5.9,2.0Hz,2H),3.44(d,J＝6.1Hz,1H),3.34–3.22(m,6H),3.02(dd,J＝11.0,5.3Hz,1H),2.74(s,3H),2.38(s,3H)；¹³CNMR(400MHz,DMSO-D₆+D₂O)δ163.7,160.9,156.6,149.9,143.8,138.4,129.8,124.8,122.5,115.9,112.8,111.6,105.3,105.0,103.5,101.4,80.1,75.3,74.7,74.6,72.8,72.8,70.4,68.0,61.3,60.3,60.1,53.8,51.4,47.0,37.8,19.3.

HR-ESI-MS(m/z):calcdforC₃₅H₄₃N₆O₁₂739.2939,found739.2949.

实施例4

薄层二硫化钼水分散液的制备

本发明中运用超声剥离法，以天然二硫化钼粉末为原料，将一定比例的超纯水与乙醇混合溶液为分散液，通过控制超声时间，超声功率，超声温度，可得到纳米二硫化钼水/乙醇悬浮液，经过高速离心，吸取上层军绿色溶液，经过减压蒸馏,烘箱干燥，即得纳米二硫化钼粉末，将粉末溶于超纯水中，超声10分钟，即得薄层二硫化钼的水分散液。

实施例5

化合物IA-MoS₂复合材料的制备

将一定量的化合物IA溶液(10^-3M)与二硫化钼水分散液(2mg/mL)混合，以0.02M的Tris-HCl缓冲液(pH值为7.4)定容，制成化合物IA-MoS₂复合物的水分散液，使化合物IA的终浓度为1×10^-6M、MoS₂的终浓度为0-50μg/mL不等，超声形成均一体系后室温下静置5分钟，得到化合物IA-MoS₂复合材料，备用。

实施例6

MoS₂生物传感平台在对肿瘤细胞的检测

该发明中的生物传感平台，可以实现对肝癌细胞HepG2的荧光增强式灵敏检测。具体实验步骤：取传代两天后的HepG2细胞，技术后，稀释到150000cells/mL。在96孔上铺板，100μL15000cells/孔，用HG-DMEM培养。过夜贴壁后，观察细胞状态良好，加入化合物IA-MoS₂的复合材料，用PBS洗二次后，用80μL的4％多聚甲醛固定10分钟，再用100μL的Hoechst(5μg/mL)室温下染核5分钟，PBS洗2遍。使用HCS拍摄，激发波长为560nm，发射波长为585nm，得荧光照片和荧光强度结果。每组实验重复三遍。

当仅有化合物IA存在时，化合物IA与HepG2细胞上ASGPR蛋白产生特异性的结合作用，细胞显示出微弱的荧光；当向细胞中加入化合物IA-MoS₂复合材料后，荧光有了显著的增强，结果表明，相比化合物IA本身，化合物IA-MoS₂复合材料对肝癌细胞显示了显著增强的荧光标记效果(化合物IB和化合物IC也有类似现象)，详见图2。

实施例7

荧光生物传感平台对肿瘤组织的检测

本发明不仅可以实现对肿瘤细胞的检测，而且实现了对肿瘤组织的灵敏检测。具体实验步骤：解剖取得小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，做成切片，PBS清洗不同的组织后，加入等量的化合物IA-MoS₂复合材料，避光孵育15分钟，PBS洗3次，吸干，用甘油封片，用荧光显微镜拍照得到，荧光照片和荧光强度结果，结果见图3。

由图3可知：所以用化合物IA-MoS₂复合材料对不同组织进行标记时，肝癌及肝组织显现强的荧光，而心、脾、肺组织切片显示微弱荧光，结果表明，该复合材料能有效标记肝癌及肝组织，而对心、脾、肺组织几乎不产生标记效果。

化合物IB-MoS₂复合材料和化合物IC-MoS₂复合材料具有类似的检测效果，在此不再赘述。

Claims

1.一种糖基吡喃腈类化合物，其为式I所述化合物、或其异构体：

其中，R₃～R₅分别独立选自：H、-OH、或中一种。

2.如权利要求1所述的糖基吡喃腈类化合物，其特征在于，其中R₁为甲基或叔丁基。

3.如权利要求1或2所述的糖基吡喃腈类化合物，其特征在于，其中R₂为式Ⅱ所示基团，其中，R₃为H，R₄和R₅分别独立选自：-OH、或中一种。

4.如权利要求3所述的糖基吡喃腈类化合物，其特征在于，其中R₂为式Ⅱ所示基团，其中R₃为H，R₄为-OH或R₅为-OH或

5.如权利要求4所述的糖基吡喃腈类化合物，其特征在于，其中R₂为下列基团中一种：

6.如权利要求1～5中任意一项所述的糖基吡喃腈类化合物在制备检测凝集素、癌细胞表面糖受体蛋白和肿瘤组织的荧光生物传感器中应用。