CN1763002A - 冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于SARS冠状病毒主蛋白酶的晶体结构所设计的一系列小分子抑制剂，其结构通式如式(I)所示。本发明还提供了所述小分子抑制剂的制备方法，及其在制备用于治疗或者预防各种冠状病毒感染的药物中的用途。

Description

冠状病毒主蛋白酶的小分子抑制剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明提供了基于SARS冠状病毒主蛋白酶晶体结构所设计的一系列小分子抑制剂、制备方法及其在制备用于治疗或者预防各种冠状病毒感染的药物中的用途。
背景技术
一种新型的冠状病毒目前已经被确认是严重急性呼吸系统综合征(Severe Acute Respiratory Sydrome，简称为SARS)的元凶，并被命名为SARS冠状病毒(简称为SARS-CoV)。SARS冠状病毒在种属分类上属于“Nidovirales”目、“Coronaviridae”科、“Coronavirus”属。它是冠状病毒家族中新出现的一个变种，全长29,736bp(Urbani Strain)。SARS是一种对人类具有巨大威胁的烈性传染病，目前尚无特效药及疫苗上市。
根据血清学分类，冠状病毒家族(冠状病毒属)共包括四种类型(Group)。I型包括猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissiblegastroenteritis virus，简称为TGEV)、人冠状病毒(human coronavirus，简称为HCoV)毒株229E、猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectiousperitonitis virus，简称为FIPV)等；II型包括牛冠状病毒(Bovinecoronavirus，简称为BCoV)、鼠肝炎病毒(Murine hepatitis virus，简称为MHV)等；III型目前只包括三种病毒，其中一种被称为禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，简称为AIBV)；SARS-CoV则属于IV型。各类冠状病毒对人、畜的生命健康有巨大威胁。
SARS冠状病毒的基因组编码了两个大的复制酶多蛋白(replicasepolyproteins)ppla(486kDa)和pplab(790kDa)，这两个蛋白是由占冠状病毒2/3到3/4的基因组编码的。这两个蛋白被水解后产生病毒复制复合体的很多功能亚基。在这一水解过程中，SARS冠状病毒的主要蛋白水解酶(main protease，简称为主蛋白酶，缩写为Mpro，分子量33.8kDa，有时也称为3C-Like Protein)起到了非常关键的作用。主蛋白酶也是ppla和pplab中的一段，它的释放是通过自催化水解完成的，自催化水解发生在该蛋白酶旁侧的Gln(Ser，Ala)位点，通过反式剪接(双分子反应)完成。在主蛋白酶的作用下，复制酶多蛋白ppla和pplab被水解成十多个功能肽段，从而进一步发挥作用。如果能够抑制SARS冠状病毒主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御SARS冠状病毒对人体的侵染。因此，SARS冠状病毒主蛋白酶是抗SARS药物设计的理想靶标。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能够有效抑制冠状病毒主蛋白酶活性的小分子抑制剂。
本发明的另一个目的是提供所述小分子抑制剂的制备方法。
本发明的又一个目的是提供所述小分子抑制剂在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物中的用途。
因此，本发明提供了下述通式(I)化合物：
Figure A20041008772100081
其中，
U为 或 ，其中的X为NH或CH2；R1选自由如下基团构成的组：C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、 R2选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、氟代苄基；R3选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基；R4选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基；R5选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基、氟代苯基。
本发明还提供了通式(I)化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式(II)化合物中氨基的保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基；
在缩合试剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)化合物，
Figure A20041008772100092
Figure A20041008772100093
Figure A20041008772100094
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定义与式(I)中的相同。
本发明还提供了通式(I)化合物在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物中的用途。
试验证明，本发明化合物能够显著抑制TGEV、HcoV、FIPV、AIBV、SARS-CoV等冠状病毒主蛋白酶的活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
附图不一定是成比例的，其目的仅仅在于更好地解释本发明，以便于读者理解。将附图与具体实施方式结合在一起考虑，可以更好地理解本发明。
图1是小分子N1与SARS-CoV Mpro单体A结合的表面图；
图2是N1与单体A的活性口袋结合的电子密度图；
图3示出了小分子N1、N2、N3和N4对SARS-CoV Mpro的抑制活性曲线，其中，SARS_3CL代表SARS冠状病毒主蛋白酶，即SARS-CoVMpro；
图4示出了小分子N1对Transmissible Gastroenteritis Viruses(TGEV)主蛋白酶(图中简称为TGEV_3CL)的抑制活性曲线；
图5示出了小分子N1对Human Coronavirus 229E(HCoV)主蛋白酶(图中简称为HCoV_3CL)的抑制活性曲线；
图6示出了小分子N1对Feline Infectious Peritonitis Virus(FIPV)主蛋白酶(图中简称为FIPV_3CL)的抑制活性曲线；
图7示出了小分子N1对Avian Infectious Bronchitis Virus(AIBV)主蛋白酶(图中简称为AIBV_3CL)的抑制活性曲线。
具体实施方式
术语定义
为了叙述上的方便，本文中使用了一些特定的术语，下面逐一对其进行解释。
“N1”、“N2”、“N3”和“N4”是本发明特别优选的小分子抑制剂，其结构式分别为：
                     N1的结构式
Figure A20041008772100112
                     N2的结构式
Figure A20041008772100113
                     N3的结构式
Figure A20041008772100121
                   N4的结构式
本文中所使用的术语“SARS冠状病毒的主要蛋白水解酶”、“SARS-CoV Mpro”、“SARS-CoV 3CLpro”、“SARS冠状病毒主蛋白酶”等，都是指SARS冠状病毒的主要蛋白水解酶。
“C3～C6的烷基”是指碳原子数在3到6之间的直链或带支链的烷基，包括但不限于：正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。
“C1～C4的烷基”是指碳原子数在1到4之间的直链或带支链的烷基，包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等。
“氟代苄基”包括对氟苄基、间氟苄基、邻氟苄基等。
“氟代苯基”包括对氟苯基、间氟苯基、邻氟苯基等。
在部分结构式中，iPr代表异丙基，Et代表乙基，“Bn”代表苄基，“Boc”代表叔丁氧羰基。
“TFA”代表三氟乙酸，“THF”代表四氢呋喃，“DMF”代表N，N-二甲基甲酰胺，“DMSO”代表二甲亚砜，“PhH”代表苯，“iPr2NEt”代表二异丙基乙基胺，“NEt3”代表三乙胺。
“DCC”代表二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide)；
“DIEA”代表二异丙基乙胺(diisopropylethylamine)；
“DMAP”代表4-N，N-dimethylaminopyridine；
“EDCI”代表1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride；
“HATU”代表N-[(dimethylamino)(3H-1，2，3-triazolo(4，5-b)pyridine-3-yloxy)methylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate；
“HBTU”代表O-(benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluroniumhexafluorophosphate；
“HOBt”代表1-hydroxybenzotriazole。
本发明化合物的结构
如前所述，本发明化合物的结构如通式(I)所示。
本发明的某些优选化合物符合下述通式，
本发明的另一些优选化合物符合下述通式，
Figure A20041008772100132
本发明的另一些优选化合物符合下述通式，
Figure A20041008772100133
下面列出了本发明的一些特别优选的具体化合物，
Figure A20041008772100142
Figure A20041008772100143
Figure A20041008772100145
Figure A20041008772100146
Figure A20041008772100148
Figure A20041008772100149
Figure A200410087721001410
本发明化合物的制备方法
本发明所提供的式(I)化合物的制备方法包括如下步骤：
将式(II)化合物中氨基的保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基；
在缩合试剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)化合物，
Figure A20041008772100151
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定义与式(I)中的相同。
式(II)化合物的合成可参考文献：Qingping Tian，Naresh K.Nayyar，Srinivasan Babu，Lijian Chen，Junhua Tao，Steven Lee，Anthony Tibbetts，Terence Moran，Jason Liou，Ming Guo and Timothy P.Kennedy TetrahedronLett.2001，42，6808-6809。式(III)化合物的合成可参考文献：Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou，Qiong Lei and Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004，45，8103-8105。
在本发明的一些优选实施例中，将式(II)化合物在有机溶剂中与酸(例如二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1～4∶1混合液)室温反应1～4小时；抽去溶剂，与式(III)化合物溶于非质子性溶剂中(如CH2Cl2，THF，CHCl3)，加入缩合试剂如HATU，HBTU，EDCI，然后加入有机碱如iPr2NEt，NEt3，在室温下反应8～24小时得到式(I)化合物。
还可以通过衍生化，将式(I)化合物中的R1基团更换为预期的基团R1’，从而得到式(I)化合物的一系列衍生物，其中，R1’选自由如下基团构成的组：C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、
Figure A20041008772100161
所述的衍生化包括如下步骤：将得到的式(I)化合物中的R1脱除；在缩合试剂的存在下，将上一步的产物与羧酸R1’-OH进行缩合，得到衍生化了的式(I)化合物，其中的R1基团被更换为R1’基团；其中R1’选自由如下基团构成的组：C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、
在本发明的一些优选实施例中，将待衍生化的式(I)化合物在有机溶剂中与酸(例如二氯甲烷与三氟乙酸体积比为1～4∶1混合液)室温反应1～4小时；抽去溶剂，与羧酸R1’-OH溶于非质子性溶剂中(如CH2Cl2，THF，CHCl3)，加入缩合试剂如HATU，HBTU，EDCI，然后加入有机碱如iPr2NEt，NEt3，在室温下反应8～24小时得到式(I)化合物的一系列衍生物。
其中，上面所述的酸优选为三氟乙酸或盐酸；优选的有机溶剂选自由如下成员构成的组：CH2Cl2、四氢呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环；优选的非质子性溶剂选自由如下成员构成的组：CH2Cl2、四氢呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、苯；优选的缩合试剂选自由如下成员构成的组：HATU、HBTU、EDCI；优选的有机碱选自由如下成员构成的组：二异丙基乙基胺、三乙胺。
为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的具体实施例。在对这些实施例进行描述时，没有对公知的实验方法、仪器、试剂和材料等进行详细的描述，以避免喧宾夺主、淡化了本发明的主要内容。
                      实施例1
将42mg的
Figure A20041008772100171
溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室温下反应1小时，抽干溶剂。得到的脱Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入40mg的
Figure A20041008772100172
再加入71μl的iPr2NEt，然后加63mg的HATU。在室温下反应12小时，依次用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。过滤，减压蒸去溶剂，快速柱层析，得到52mg的产物 产率80％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(500MHz，CDCl3)0.76(d，3H，J＝6.9Hz)，0.98(d，3H，J＝5.7Hz)，1.30(t，3H，J＝7.3Hz)，1.42(s，9H)，1.74-1.94(m，4H)，2.10-2.40(m，2H)，2.49-2.52(m，1H)，2.67-2.71(m，1H)，2.85-3.00(m，1H)，3.05-3.17(m，1H)，3.23-3.39(m，3H)，4.18(q，2H，J＝7.1Hz)，4.41-4.51(m，1H)，4.58-4.65(m，1H)，5.03-5.10(m，1H)，5.49(t，1H，J＝14.7Hz)，5.98(dd，1H，J＝15.8Hz，4.4Hz)，6.70-7.00(m，3H)，7.12-7.16(m，3H)；
ESI-MS：[M+H+]590.2，HRMS found m/z 612.3062，C31H44N3O7FNarequires 612.3065；
[α]D 24.0(c 0.69，CHCl3)。
                            实施例2
将45mg 溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室温下反应1小时，抽干溶剂。得到的脱Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入12mg的
Figure A20041008772100182
再加入48μl的iPr2NEt，然后加44mg的HATU。在室温下反应12小时，依次用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。过滤，减压蒸去溶剂，快速柱层析，得到34mg的产物
Figure A20041008772100183
产率73％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(300MHz，CDCl3)0.85(d，3H，J＝6.6Hz)，1.03(d，3H，J＝6.9Hz)，1.30(t，3H，J＝7.2Hz)，1.52-1.61(m，1H)，1.71-1.90(m，2H)，2.26-2.42(m，2H)，2.48(s，3H)，2.53-2.73(m，3H)，2.84-2.98(m，2H)，3.13-3.23(m，1H)，3.30-3.42(m，2H)，4.18(q，2H，J＝7.2Hz)，4.41-4.56(m，1H)，4.66-4.76(m，1H)，5.50(d，1H，J＝15.6Hz)，5.91(s，1H)，6.39(s，1H)，6.63(dd，1H，J＝15.3Hz，4.8Hz)，6.94-7.03(m，2H)，7.11-7.35(m，4H)；
ESI-MS：[M+H+]599.3，[M+Na+]621.3，HRMS found m/z 621.2717，C31H44N3O7FNa requires 621.2695；
[α]D 32.8(c 0.51，CHCl3)。
实施例1和实施例2可以用下面的反应式简要概括：
                     实施例3
在对本实施例进行描述时，参考了如下的反应式(其中某些化合物下方的一位或二位阿拉伯数字为其编号)：
Figure A20041008772100201
Figure A20041008772100202
Figure A20041008772100204
Figure A20041008772100205
化合物9的制备
将321mg(1mmol)化合物8溶解在2ml的二氯甲烷中，再加入1ml的三氟乙酸，室温搅拌1小时。将溶剂减压蒸去，油泵抽干。将所得到的产物溶解在4ml的二氯甲烷中，依次加入260mg的化合物
Figure A20041008772100211
0.4ml的二异丙基乙基胺，162mg的HOBt，最后加入247mg的DCC，在室温下搅拌过夜。将反应体系过滤加入10ml的二氯甲烷，依次用1M的HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，快速柱层析得到387mg的化合物9，产率92％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(300MHz，CDCl3)0.90-0.95(m，12H)，1.44(s，9H)，1.45-1.68(m，3H)，2.03-2.15(m，1H)，3.88(dd，1H，J＝6.6Hz，9.3Hz)，4.64-4.72(m，1H)，5.06(d，1H，J＝9.9Hz)，5.16(d，2H，J＝3.3Hz)，6.24(d，1H，J＝10.5Hz)，7.29-7.30(m，5H)。
化合物10的制备
将331mg化合物9溶解在4ml的二氯甲烷中，再加入1ml的三氟乙酸，室温搅拌1小时。将溶剂减压蒸去，油泵抽干。将所得到的产物溶解在4ml的二氯甲烷中，依次加入19mg的化合物 0.3ml的二异丙基乙基胺，128mg的HOBt，最后加入195mg的DCC，在室温下搅拌过夜。将反应体系过滤，加入10ml的二氯甲烷，依次用1M的HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗，无水硫酸钠干燥，过滤，蒸去溶剂，快速柱层析得到357mg化合物10，产率92％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(300MHz，CDCl3)0.89-0.94(m，12H)，1.35(d，3H，J＝7.2Hz)，1.44(s，9H)，1.56-1.69(m，3H)，2.13-2.24(m，1H)，4.09-4.19(m，1H)，4.24(dd，1H，J＝6.6Hz，8.7Hz)，4.92-5.03(m，1H)，4.95(d，2H，J＝5.4Hz)，6.35-6.44(m，1H)，6.69-6.78(m，2H)，7.31-7.42(m，5H)。
化合物11的制备
将310mg的化合物10溶解在5ml的甲醇中，加入62mg的20％的钯碳，常压氢化3小时，过滤掉钯碳，将溶剂蒸去，快速柱层析，得到258mg的化合物11，产率100％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(300MHz，CDCl3)0.91-0.96(m，12H)，1.34(d，3H，J＝6.9Hz)，1.44(s，9H)，1.60-1.75(m，3H)，2.08-2.20(m，1H)，4.18-4.28(m，1H)，4.33(t，1H，J＝9.0Hz)，4.51-4.61(m，1H)，5.27-5.35(m，1H)，7.08-7.17(m，1H)，7.27-7.33(m，1H)。
化合物N2的制备
将50mg的
Figure A20041008772100221
溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室温下反应1小时，抽干溶剂。得到的脱Boc的底物溶解在2ml的CH2Cl2中，加入62mg的化合物11，再加入97μl的iPr2NEt，然后加75mg的HATU。在室温下反应12小时，依次用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。过滤，减压蒸去溶剂，快速柱层析得到76mg的产物N2，产率81％。
谱图数据如下：
ESI-MS：[M+H+]610.4。
化合物N1的制备
将41mg的化合物N2溶解在2ml的CH2Cl2中，加入0.5ml的TFA在室温下反应1小时，抽干溶剂。得到的脱Boc的底物溶解在2ml的THF中，加入10mg的
Figure A20041008772100231
再加入42μl的iPr2NEt，然后加33mg的HATU。在室温下反应12小时，依次用1M HCl、饱和NaHCO3水溶液、饱和食盐水洗，Na2SO4干燥。过滤，减压蒸去溶剂，快速柱层析得到34mg的产物N1，产率82％。
谱图数据如下：
H NMR：δ(300MHz，CDCl3)0.89(s，12H)，1.25-1.29(m，3H)，1.44(d，3H，J＝7.4Hz)，1.50-1.92(m，5H)，2.04-2.17(m，2H)，2.20-2.41(m，3H)，2.47(s，3H)，3.20-3.41(m，2H)，4.18(q，2H，J＝7.2Hz)，4.32-4.43(m，1H)，4.57-4.79(m，2H)，4.85-4.97(m，1H)，5.93-6.00(m，1H)，6.46(s，1H)，6.82-6.92(m，1H)，7.47-7.93(m，3H)；
ESI-MS：[M+H+]619.3。
实施例4  SARS-CoV M pro 与小分子抑制剂的复合物的晶体制备、 数据收集和结构解析
一、材料与方法
1.SARS-CoV Mpro与小分子化合物N1的复合物的晶体制备
将SARS-CoV Mpro在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达后进行进一步分离纯化和结晶(参见：Yang H et al.2003.The Crystal Structures of SARSVirus Main Protease Mpro and Its Complex with an Inhibitor.PNAS，100(23)：13190-13195)。将N1用7.5％PEG6000、6％ DMSO、0.1M MES(pH6.0)的池液制备成10mM的溶液后，等体积加入晶体生长的悬滴中，291K静置2天。
2.SARS-CoV Mpro与小分子化合物N1的复合物的数据收集和结构解析
(1)数据收集和数据处理
用Rigaku CuKα旋转靶X光衍射仪完成，数据收集时的系统参数为电压40KV，电流20mA，波长1.5418，温度100K。晶体在30％PEG400、0.1M MES(pH6.0)的防冻液中浸泡后，用液氮流迅速冷却至100K。晶体的衍射分辨率为1.88。所有的最终衍射数据用HKL2000处理到2.0。
(2)结构解析
复合物的结构解析是通过用SARS-CoV Mpro的母体结构(PDBcode：1UJ1)为起始搜索模型，用分子置换法进行结构解析的。用CNS程序做旋转函数和平移函数搜索，可获得一个对称二体的清晰解。然后在程序O中利用2Fo-Fc和Fo-Fc的差值图进行小分子模型的搭建。经过修正后，Rwork20.0，Rfree23.8。
SARS-CoV Mpro与N2、N3及N4的复合物的晶体制备、数据收集和结构解析所采用的方法与N1基本相同，此处不再赘述。
二、结构分析
1、SARS-CoV Mpro与小分子化合物N1的复合物的结构分析
SARS-CoV Mpro是一个同源二体结构，在一个不对称单位中含有两个单体A和B，由于小分子化合物N1与A、B两个单体的结合基本类似，现在仅分析N1和A的结合模式。
在单体A的2Fo-Fc差值图(countered at 1σ)中，可以清楚地观察到N1结合到了酶的底物结合口袋中。其中N1中的Cβ与A145-Cys的Sγ形成了一根键长为1.8的共价键。N1酯基中的羰基氧与A145-Cys主碳链上的氨基形成3.1的氢键；酯中的乙基与A27-Leu，His-A41和Thr-A25的侧链形成疏水相互作用。在P1位点，内酰胺五元环中的氧与His-163的NE2形成2.6氢键。在内酰胺环附近的一个水分子能与N1的内酰胺环上的N，His-172的NE2以及140-Phe和Ser-B1的羰基氧分别形成2.6，3.2，2.6和2.7的氢键，使得内酰胺环牢固的结合在了S1口袋中。由于整个冠状病毒家族的主蛋白酶的P1位点非常保守，并总是以Q的形式出现，因此，占据相应的底物结合口袋S1是抑制蛋白酶活性的一个关键。对于N1的P2位点而言，小分子的Leu侧链很容易地插入His-41，Met-49和Phe-181侧链，以及Gln-189和Asp-187的侧链的烷基部分组成的疏水口袋中。His-164中的羰基氧与N1中的靠近酯基一侧的肽键中的N形成2.9的氢键，N1中的Val的羰基氧与Glu-A166中的N形成2.9氢键，Val肽键中的N与Glu-A166羰基氧形成3.0的氢键，N1中Ala肽键中的N与Thr-190的羰基氧形成3.2的氢键。Ala的侧链插入Phe-185，Glu-192，Leu-167，Met-165侧链组成的疏水口袋中。N1中末端的杂环与Pro-168的五元环之间有疏水作用。所有这些共价键，氢键和疏水相互作用使得抑制剂化合物N1牢固的结合在酶的底物活性口袋，从而造成了酶的失活。
2、N2和N3的结合和N1基本类似，这里不再赘述。
实施例5小分子化合物N1、N2、N3和N4对来源于各种 不同冠状病毒的主蛋白酶的抑制活性
一、材料与方法
(1)N1、N2、N3和N4对SARS-CoV Mpro的抑制活性的测定在缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入1μM(终浓度)的SARS-CoV Mpro，100μM(终浓度)的化合物N1，298K放置10分钟后，迅速加入5μM的荧光标记底物(MCA-AVLQ↓SGFRL(DNP)L-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为330nm和395nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。
N2、N3和N4的抑制活性的测定方法与N1基本相同。
对照：不加入抑制剂，其余条件相同。结果示于图3中。
(2)N1对传染性胃肠炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Viruses，TGEV)主蛋白酶的抑制活性的测定。
在缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分钟后，迅速加入5μM的荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为330nm和395nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。然后改变抑制剂浓度，分别在10nM，1μM下测定抑制活性。对照：不加入抑制剂，其余条件相同。结果示于图4中。
(3)N1对人冠状病毒(Human Coronavirus，HCoV)229E主蛋白酶的抑制活性的测定
在缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入0.1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分钟后，迅速加入5μM的荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为330nm和395nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。对照：不加入抑制剂，其余条件相同。结果示于图5中。
(4)N1对猫传染性腹膜炎病毒(Feline Infectious Peritonitis Virus，FIPV)的主蛋白酶的抑制活性的测定
方法同(3)，结果示于图6中。
(5)N1对禽传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus，AIBV)的主蛋白酶的抑制活性的测定
在缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.0，1mM DTT)中，加入0.1μM的所述蛋白酶，100μM的化合物N1，298K放置10分钟后，迅速加入5μM的荧光标记底物(MCA-AVLQSGFRL(DNP)L-NH2)。激发波波长和发射波波长分别为330nm和395nm，温度保持298K，每2秒钟记录一次荧光读数。对照：不加入抑制剂，其余条件相同。结果示于图7中。
FIPV、HCoV、TGEV的表达纯化参考文献：Conservation of substratespecificities among coronavirus main proteases.J Gen Virol.2002；83(Pt 3)：595-9.
二、结果与分析
1、N1、N2、N3和N4对SARS-CoV Mpro的抑制活性
由图3中可以看出，N1、N2、N3和N4对SARS-CoV Mpro都有抑制活性，而且N1的抑制活性最强。
2、N1对其他冠状病毒主蛋白酶的抑制活性
从N1对其他冠状病毒主蛋白酶的抑制活性测定(即图4-图7)中可知，N1对TGEV、HcoV、FIPV和AIBV的主蛋白酶都有抑制活性，其中对TGEV的主蛋白酶的抑制活性最强，在10nM的条件下，N1对TGEV主蛋白酶仍然有抑制活性。
由于TGEV、HcoV、FIPV属于冠状病毒科的I型(血清型)，AIBV属于III型，SARS-CoV属于IV型，因此，可以推断N1对整个冠状病毒家族的主蛋白酶都有抑制活性。
本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
本文中所涉及的各种实验用品(包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等)之中，对于那些特殊的或不易获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式(例如购买、自行制备等)很方便地获得。
应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。

Claims (13)

1.下述通式(I)化合物：
Figure A2004100877210002C1
其中，
U为
Figure A2004100877210002C2
或
Figure A2004100877210002C3
其中的X为NH或CH2；
R1选自由如下基团构成的组：C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、
Figure A2004100877210002C5
R2选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、氟代苄基；
R3选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基；
R4选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基；
R5选自由如下基团构成的组：C1～C4的烷基、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苄基、氟代苯基。
2.权利要求1所述的化合物，其中：
R1选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、异噁唑基羰基、三氟甲基羰基、
Figure A2004100877210003C1
R2为甲基或异丙基；
R3为甲基或异丙基；
R4为乙基或苄基；
R5选自由如下基团构成的组：异丁基、对氟苄基、苯基、氟代苯基。
3.权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物选自由如下成员构成的组：
其中，Boc为叔丁氧羰基，Ph为苯基，Et为乙基，Bn为苄基。
4.权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物的结构式为：
Figure A2004100877210004C1
5.权利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的结构式符合如下通式：
6.权利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的结构式符合如下通式：
Figure A2004100877210004C3
7.权利要求1或2所述的化合物，其中，所述化合物的结构式符合如下通式：
8.权利要求1所述的化合物的制备方法，包括如下步骤：
将式(II)化合物中氨基的保护基R6脱除，其中的R6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基；
在缩合试剂的存在下，将上一步的产物与式(III)化合物进行缩合，得到式(I)化合物，
其中，式(II)和式(III)中的R1、R2、R4、U的定义与式(I)中的相同。
9.权利要求8所述的方法，包括如下步骤：
在有机溶剂中，使式(II)化合物与酸在室温下反应1～4小时，脱去氨基的保护基R6，抽去溶剂；
将产物与式(III)化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合试剂和有机碱，在室温下反应8～24小时，得到式(I)化合物。
10.权利要求8所述的方法，还包括对得到的式(I)化合物进行进一步的衍生化，以将其中的R1基团更换为预期的基团R1’，其中R1’选自由如下基团构成的组：C3～C6的烷基羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、三氟甲基羰基、
所述的衍生化包括如下步骤：
将权利要求8的方法中得到的式(I)化合物中的R1脱除；
在缩合试剂的存在下，将上一步的产物与羧酸R1’-OH进行缩合，得到衍生化了的式(I)化合物，其中的R1基团被更换为R1’基团。
11.权利要求8-10之一所述的方法，其中，
所述的酸为三氟乙酸或盐酸；
所述的有机溶剂选自由如下成员构成的组：CH2Cl2、四氢呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二氧六环；
所述的非质子性溶剂选自由如下成员构成的组：CH2Cl2、四氢呋喃、CHCl3、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、苯；
所述的缩合试剂选自由如下成员构成的组：HATU、HBTU、EDCI；
所述的有机碱选自由如下成员构成的组：二异丙基乙基胺、三乙胺。
12.权利要求1-7的化合物在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物中的用途。
13.根据权利要求12的用途，其中所述冠状病毒为SARS冠状病毒、猪的传染性胃肠炎病毒、人冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒或者禽传染性支气管炎病毒。
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