CN103044338A

CN103044338A - miR-21小分子抑制剂及应用

Info

Publication number: CN103044338A
Application number: CN2012105357590A
Authority: CN
Inventors: 康春生; 张军霞; 史振东; 韩磊; 浦佩玉
Original assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Current assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2012-12-12
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2032-12-12
Also published as: CN103044338B

Abstract

本发明涉及一种miR-21小分子抑制剂及应用。本发明药物是能特异性抑制miR-21表达，进而促进多种肿瘤细胞凋亡的化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈。2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈与miR-21接位结合能力Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol。其制备包括：将化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈溶于去离子水中配成母液，后按一定比例加入肿瘤细胞（胶质瘤、胃癌和乳腺癌）培养体系，能特异性的抑制miR-21表达，而基本不影响其他miRNA表达。同时细胞周期出现G0/G1期阻滞，细胞凋亡百分比例明显增加，对肿瘤实现更有效的抑制。

Description

miR-21小分子抑制剂及应用

技术领域

微小RNA(microRNA或miRNA)是指长度约21～25nt的某些特殊的小型非编码RNA组成的家族,这些miRNA能够识别特定的目标mRNA,并在转录后水平通过促进靶mRNA的降解和/或抑制翻译过程而发挥负调控基因表达的过程,并与个体发育、干细胞分化和疾病发生密切相关。miRNA最初的转录结构是一个发夹结构的pri-miRNA，经过Drosha酶加工后得到pre-miRNA，通过依赖RanGTP/exportin5(Exp5)的转运机制完成pre-miRNA转运出核，经过Dicer酶切后pre-miRNA降解成约22nt的单链RNA形成成熟的miRNA；成熟的miRNA在RISC中能够识别特定的目标mRNA的3`UTR区域。每个miRNA具有数十种到甚至更多的蛋白表达调控靶点,而每一种蛋白表达有可能同时受到多个miRNA的调控。miRNA在大小、结构和功能方面存在着高度的保守性，组成了物种进化过程中细胞高度复杂的RNA表达调控网络。目前研究发现，miRNA在肿瘤、心脑血管疾病、免疫系统疾病等中存在着特异性的表达谱。因此，miRNA在以上相关疾病的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗策略的研究中意义重大。

背景技术

miR-21是较早发现的人类miRNA之一，与许多种肿瘤和心脑血管疾病关系密切。以胶质瘤为例，Ciafrè等人通过对胶质瘤手术标本以及胶质母细胞瘤细胞系的miRNA表达谱的分析，证实miR-21作为表达上调的miRNA代表，在胶质瘤组织中的表达水平是瘤周“正常组织”表达水平的1.8~9.3倍；而在胶质母细胞瘤细胞系中，其表达水平比正常脑组织表达水平要高1.6倍。反义miR-21下调miR-21表达水平，可以使胶质瘤细胞增殖侵袭能力下降，肿瘤细胞凋亡增加，肿瘤体内生长受到抑制。因此，如能有效调控miR-21水平，则极其有助于推动肿瘤和心脑血管疾病的治疗发展。目前，下调miRNA表达水平的方法，主要有化学合成寡核苷酸和构建载体2个方法。化学合成寡核苷酸采用反义miRNA来阻断特定miRNA的活性。对于载体而言，主要是构建质粒或者病毒系统来表达与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA。但这些方法因为价格较昂贵，目前大多处于实验室阶段，还无法真正用于临床治疗。因此，发现新的手段来下调miRNA水平，成为极为迫切的研究领域。

发明内容

本发明目的是解决目前下调miR-21方法价格昂贵且未真正应用于临床的问题，提供一种下调miR-21新方法即miR-21小分子抑制剂。

本发明的一种miR-21小分子抑制剂为2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈，化学式为C5H11N5，分子量为141.17434g/mol，是一种六元杂环有机化合物，其碳氮环结构类似于嘧啶，1、3位含有两个氮原子，2、4、5、6号位置上均为碳原子，各原子均由单键连接。2、4号位置上分别连有一个氨基取代基，5号位置上则连有一个腈基取代基。

化学结构式为：

2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈与miR-21接位结合能力Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol。在筛选的候选化合物中结合能力最强。

miR-21小分子抑制剂2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈抑制剂应用，下调miR-21小分子，抑制肿瘤细胞生长。应用于抑制肿瘤细胞的药物。

miR-21的小分子抑制剂是从美国癌症研究院（NIH）的癌症治疗计划（DTP）中筛选获得。该项目成立于1955年，到目前超过40种美国许可的化学治疗药物是在该项目中获得完成，其中包括最常见的化疗药紫杉醇（Paclitaxel），并且市场上超过70%的抗癌药物的研发也均与该项目有关。此项目数据库目前已拥有超过20万中化学小分子的2D或3D化学结构，提供原药供科研使用。我们利用计算机结构模拟miR-21前体的3D结构，从DTP数据库中筛选与之结合位点匹配度最高的化合物，并经体内外实验进一步验证，确定了化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈为最优的miR-21抑制剂。目前该抑制剂没有商品化，但可以从DTP免费获得。MC-Fold/MC-Sym pipeline是一种常用的RNA二级及三级结构预测的软件。将RNA相关序列输入MC-Fold中可以得到RNA的二级机构，而进一步将此二级结构输入MC-Sym中则会产生对应的三级结构。具体筛选过程如下：

1.Has-miR-21的前体序列我们从miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中获得(5’UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA3’)，我们将其输入MC-Fold软件中得到其对应的二级结构(http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_entry.pl?acc=MI0000077)，然后选取二级结构中的茎环结构序列(5’UGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACA3’)，输入/MC-Sympipeline软件中得到了其三级机构。

2.我们进一步对此三级结构利用MC-FOLD|MC-SYMpipeline构建3D模型。

3.3D模型进一步利用TINKER Molecular Modeling Package(http://dasher.wustl.edu/tinker/)进行了能量优化。

4.优化后的模型又进一步使用pmol2q工具加氢，加电荷，输出mol2格式文(http://www.sourcefiles.org/Scientific/Biology/Proteins/pmol2q_2.3.0.tar.gz)，然后使用AutoDockTools(ADT)将文件转换为AutoDock4识别的文件类型*.pdbqt。

4.配体小分子库我们使用的是：经过筛选，具有成药潜能的有约2000个化合物的NCIDiversitySet(http://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/diversity_explanation.html)。筛选过程请参阅原网站内容或NCI_Diversity_Set_ref.pdf。

6.分子对接。AutoGrid4和AutoDock4（http://autodock.scripps.edu/）被用于生成栅格和执行分子对接。受体对接位点选在Dicer酶切位点附近。对接后Estimated InhibitionConstant在nM级别的小分子有48个。而其中的化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈具有最强的结合能力(Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol).该分子与miR-21最佳对接位点。

miR-21小分子抑制剂的应用说明，取42mg化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈，溶于3ml的二甲基亚砜(DMSO)中得到浓度为0.1M的母液，6孔板中接种肿瘤细胞，细胞数量为10-15万，使用中皿则接种为20-30万；用10%FBS的DMEM培养24h后，加入2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈母液使终浓度分别为1.5、7.5、15、30、75μM，培养24h后结果发现，在胶质瘤U87和LN229细胞系，乳腺癌MCF-7细胞系，胃癌SGC7901细胞系中，miR-21表达水平呈浓度依赖性显著降低(图3a)。并且miR-21表达水平随处理时间增加而表达降低(图3b)。

以U87和LN229胶质瘤细胞，SCG7901胃癌细胞，MCF-7乳腺癌细胞为模型，考察化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈处理后对其他miRNA表达水平的影响。当化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞6小时后，其他miRNA均基本不变；24小时后，4个细胞系的miR-23b、miR-566、miR-27b、miR-222、miR-524-5p表达下降，而let-7i、miR-218、miR-1280、miR-200a表达则上升；另外，miR-181d表达在胶质瘤(图3a,3b)和乳腺癌细胞(图3c)中上调，在胃癌细胞(图3d)中下调。miR-23b表达水平在U87，LN229，MCF-7和SGC7901中分别下降到0.42(图4a),0.48(图4b),0.46(图4c),和0.44(图4d)；miR-566表达水平分别下降到0.49(图4a),0.22(图4b),0.65(图4c)和0.56(图4d)；miR-27表达水平分别下降到0.73(图4a),0.52(图4b),0.69(图4c),和0.65(图4d)；miR-222表达水平分别下降到0.39(图4a),0.51(图4b),0.63(图4c),和0.60(图4d)；miR-524-5P表达水平分别下降到0.50(图4a),0.68(图4b),0.63(图4c),和0.69(图4d)；而let-7i表达水平在U87，LN229，MCF-7和SGC7901中分别上调到1.93(图4a)，2.09(图4b),1.13(图4c)和2.45(图4d);miR-218分别上调到2.51(图4a),1.75(图4b),1.65(图4c),和1.70(图4d);miR-1280分别上调到4.46(图4a),4.41(图4b),1.57(图4c),和2.66(图4d)；miR-200a分别上调到3.22(图4a),1.67(图4b),2.30(图4b),和3.40(图4d)。

以U87和LN229胶质瘤细胞，SCG7901胃癌细胞，MCF-7乳腺癌细胞为模型，考察化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈治疗后，化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞48小时后，细胞周期出现G0/G1期抑制。在U87中，小分子抑制剂处理组与对照组相比G0/G1期（%）由53.31%延长到74.63%(图5a)，LN229中由51.9%延长到70.02%(图5b)，MCF-7中由49.93%延长到64.06%(图5c)，SGC7901由45.32%到67.31%(图5d)。

以U87和LN229胶质瘤细胞，SCG7901胃癌细胞，MCF-7乳腺癌细胞为模型，考察化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈治疗后，化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞48小时后，细胞凋亡比例增加。在U87中，小分子抑制剂处理组与对照组相比凋亡数由2.5%上升到13.16%，在LN229中，凋亡数由2.80%上升到16.30%，在MCF-7中凋亡数由1.84%上升到11.81%，在SGC7901中由3.11%上升到15.00%。如图6所示。

本发明提供的miR-21小分子抑制剂，能特异性抑制miR-21表达，起到抗肿瘤作用。化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈，能较好地并特异性的下调miR-21水平，能有效诱导多种肿瘤细胞凋亡，和细胞周期G0/G1期阻滞，具有潜在的抗肿瘤效果。

附图说明

图1：小分子的筛选流程。

图2：与Dicer酶切位点对接后示意图。

图3：化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈对miR-21表达的影响。

化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞后，其抑制miR-21表达的效果呈现浓度依赖性和时间依赖性。

图4：化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈对其他miRNA表达的影响。

化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈（30μM）处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞6小时后，其他miRNA均基本不变。24小时后，4个细胞系的miR-23b、miR-566、miR-27b、miR-222、miR-524-5p表达下降，而let-7i、miR-218、miR-1280、miR-200a表达则上升；另外，miR-181d表达在胶质瘤和乳腺癌细胞中上调，在胃癌细胞中下调。

图5：化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈对细胞周期的影响

化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈（30μM）处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞48小时后，细胞周期出现G0/G1期抑制。

图6：化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈对细胞凋亡的影响

化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈（30μM）处理胶质瘤、乳腺癌和胃癌细胞48小时后，细胞凋亡比例增加。

其中：30μM是一浓度单位，即30微摩尔。

具体实施方式

实施例1：miR-21小分子抑制剂抑制胶质瘤细胞

取42mg化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈,溶于3ml的DMSO中得到浓度为0.1M的母液。6孔板中分别接种U87和LN229胶质瘤细胞，细胞数量大约为10-15万，含10%FBS的DMEM培养24h后，加入2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈母液使终浓度分别为1.5、7.5、15、30、75μM，培养0.5、1、2、6、24、48h后，real-timePCR检测miR-21和其他miRNA表达，并行细胞周期及细胞凋亡检测。real-time PCR具体方法：使用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，采用AMV逆转录酶进行逆转录。利用SYBR Green荧光染料掺入法进行Real-time PCR,以U6为内参，miR-21及U6引物合自上海吉玛公司。反应条件为95℃3min，95℃12s，62℃40s，读板，从第二步开始循环39次。绘溶解曲线，从69℃到96℃，每0.2s升高0.2℃。2-△△CT法分析数据。细胞周期：收集单细胞悬液，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次；75%乙醇1ml重新悬浮细胞后，置于4°C冰箱中固定大于18h。4°C以1000rpm离心5min去除乙醇；PBS(0.01M，pH7.2)洗涤细胞，4°C以1000rpm离心5min两次；200μl Ranse A(1mg/ml)、37°C孵育30min；800μl PI染色液混匀后4°C避光染色30min。用流式细胞仪检测。细胞凋亡：离心收集悬浮细胞，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次，用400ul1XBinding Buffer悬浮细胞，加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟，加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。用流式细胞仪检测。

实施例2：miR-21小分子抑制剂抑制乳腺癌细胞

取42mg化合物(指miR-21的小分子抑制剂)2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈,溶于3ml的DMSO中得到浓度为0.1M的母液。6孔板中分别接种MCF-7乳腺癌细胞，细胞数量大约为10-15万，含10%FBS的DMEM培养24h后，加入2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈母液使终浓度分别为1.5、7.5、15、30、75μM，培养0.5、1、2、6、24、48h后，real-time PCR检测miR-21和其他miRNA表达，并行细胞周期及细胞凋亡检测。real-time PCR具体方法：使用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，采用AMV逆转录酶进行逆转录。利用SYBR Green荧光染料掺入法进行Real-time PCR,以U6为内参，miR-21及U6引物合自上海吉玛公司。反应条件为95℃3min，95℃12s，62℃40s，读板，从第二步开始循环39次。绘溶解曲线，从69℃到96℃，每0.2s升高0.2℃。2-△△CT法分析数据。细胞周期：收集单细胞悬液，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次；75%乙醇1ml重新悬浮细胞后，置于4°C冰箱中固定大于18h。4°C以1000rpm离心5min去除乙醇；PBS(0.01M，pH7.2)洗涤细胞，4°C以1000rpm离心5min两次；200μl Ranse A(1mg/ml)、37°C孵育30min；800μl PI染色液混匀后4°C避光染色30min。用流式细胞仪检测。细胞凋亡：离心收集悬浮细胞，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次，用400ul1X Binding Buffer悬浮细胞，加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟，加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。用流式细胞仪检测。

实施例3：miR-21小分子抑制剂抑制胃癌细胞

取42mg化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈,溶于3ml的DMSO中得到浓度为0.1M的母液。6孔板中分别接种SCG7901胃癌细胞，细胞数量大约为10-15万，含10%FBS的DMEM培养24h后，加入2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈母液使终浓度分别为1.5、7.5、15、30、75μM，培养0.5、1、2、6、24、48h后，real-time PCR检测miR-21和其他miRNA表达，并行细胞周期及细胞凋亡检测。real-time PCR具体方法：使用RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，采用AMV逆转录酶进行逆转录。利用SYBRGreen荧光染料掺入法进行Real-time PCR,以U6为内参，miR-21及U6引物合自上海吉玛公司。反应条件为95℃3min，95℃12s，62℃40s，读板，从第二步开始循环39次。绘溶解曲线，从69℃到96℃，每0.2s升高0.2℃。2-△△CT法分析数据。细胞周期：收集单细胞悬液，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次；75%乙醇1ml重新悬浮细胞后，置于4°C冰箱中固定大于18h。4°C以1000rpm离心5min去除乙醇；PBS(0.01M，pH7.2)洗涤细胞，4°C以1000rpm离心5min两次；200μl Ranse A(1mg/ml)、37°C孵育30min；800μl PI染色液混匀后4°C避光染色30min。用流式细胞仪检测。细胞凋亡：离心收集悬浮细胞，弃培养基，用冷PBS洗涤细胞两次，用400ul1X Binding Buffer悬浮细胞，加入5ul Annexin V-FITC，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟，加入10ul PI后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育5分钟。用流式细胞仪检测。

关于软件的简介：

MC-Fold/MC-Sym pipeline是一种常用的RNA二级及三级结构预测的软件。将RNA相关序列输入MC-Fold中可以得到RNA的二级机构，而进一步将此二级结构输入MC-Sym中则会产生对应的三级结构。Pre-miR-21的序列我们从miRBase database(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中获得，并从中选取了Pre-miR-21发卡部分的序列，输入MC-Fold/MC-Sym pipeline软件中得到了其3D机构。我们进一步对此3D结构利用TINKER Molecular Modeling Package(http://dasher.wustl.edu/tinker/)进行了能量优化，并使用pmol2q工具加氢，加电荷，输出mol2格式文件（http://www.sourcefiles.org/Scientific/Biology/Proteins/pmol2q_2.3.0.tar.gz），然后使用AutoDockTools(ADT)将文件转换为AutoDock4识别的文件类型*.pdbqt。配体小分子库我们使用NCIDiversitySet（http://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/diversity_explanation.html）。经过筛选，具有成药潜能的有约1990个化合物。AutoGrid4和AutoDock4（http://autodock.scripps.edu/）被用于生成栅格和执行分子对接。受体对接位点选在Dicer酶切位点附近。对接后Estimated Inhibition Constant在nM级别的小分子有48个。而其中的化合物2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈具有最强的结合能力(Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol).该分子与miR-21最佳对接位点。

Claims

1.一种miR-21小分子抑制剂，其特征是抑制剂为2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈，

化学结构式为：

2.如权利要求1所述的抑制剂，其特征是2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈与miR-21接位结合能力Ki=1.49nM,deltaG=-12.04kcal/mol。

3.miR-21小分子抑制剂2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈抑制剂应用，下调miR-21小分子，抑制肿瘤细胞生长。

4.miR-21小分子抑制剂2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈应用于抑制肿瘤细胞的药物。

5.miR-21小分子抑制剂2，4-二氨基代-1,3-二氮杂己环-5-腈应用于胶质瘤U87、LN229细胞系、乳腺癌MCF-7细胞系或胃癌SGC7901细胞的药物。