CN103146689B - 短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用 - Google Patents

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一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点,来源于序列表中SEQ ID NO:1所述的人c2orf68基因,其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:3。一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA,由人工设计合成,其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述。实验表明,将所述shRNA转染入人直肠癌细胞,shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖,因此,所述短发夹shRNA可在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

Description

短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域,涉及一种短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
背景技术
近年来, 恶性肿瘤对人类的威胁日益突出,肿瘤已成为死亡常见原因之一,严重影响着人类的健康。人结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤,现在已经发现部分癌基因(如set、survivin、c-myc、Bcl-2等)和抑癌基因(如p53、DCC、nm23、APC、PTEN 、PP2A等)与人结直肠癌的发生、发展有密切关系,但是至今还有许多与人结直肠癌发病相关的致癌基因、抑癌基因尚未发现。
RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。该技术已被用于疾病基因治疗领域,例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面,帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法,肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。该技术比其它治疗手段的毒副作用会更低,因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的短发夹shRNA,并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。
人c2orf68基因已在GenBank注册,注册号NM-001013649.3,定位于2p11.2,全长4283bp,编码166个氨基酸,其核苷酸序列为序列表中SEQID NO:1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示:该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。
本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO:1所述的人c2orf68基因,是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段,其核苷酸序列见序列表中SEQID NO:3。
本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成,其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述。
实验表明,将所述shRNA转染入人直肠癌细胞,shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖,因此,本发明所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明为制备治疗人结直肠癌的药物提供了一种新方法,可促进人结直肠癌新药的开发。
2、本发明所述shRNA片段不仅可应用于制备治疗人结直肠癌的药物,而且可用于人c2orf68基因在结直肠癌发病中的作用和机理研究。
附图说明
图1 是荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。
图2 是荧光定量PCR实验中内参gapah基因引物的标准曲线图。
图3 是人结直肠癌细胞株SW480的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)、阴性对照组SW480-NC、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480)中人c2orf68基因表达的柱状图。
图4 是人结直肠癌细胞株SW620的siRNA组(转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)、阴性对照组SW620-NC、空白对照组(未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620)中人c2orf68基因表达的柱状图。
图5是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA、阴性对照细胞株SW480-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡图。
图6是流式细胞仪检测SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的细胞凋亡率柱状图。
图7是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA、阴性对照细胞株SW620-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡图。
图8是流式细胞仪检测SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的细胞凋亡率柱状图。
图9是MTT实验中SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的生长曲线图。
图10是MTT实验中SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例,对本发明作进一步说明。下述实施例中,凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件,例如Sambrook, Russell的分子克隆;实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1:RNA干扰靶点的确定及shRNA的设计与合成
以人c2orf68基因的mRNA序列作为基础,采用siRNA在线设计软件(http://www.ambion.com)设计短发夹shRNA,siRNA在线设计软件显示RNA干扰靶点的核苷酸序列是SEQ ID NO:1中第327位至345位的核苷酸序列,其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO:3。根据所述靶序列设计了一对短发夹shRNA,其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述。shRNA通过化学合成方法制备,委托有关专业公司合成(广州锐博生物科技有限公司)。
实施例2:短发夹shRNA的干扰效率实验
1、细胞培养
用胎牛血清的体积比为10%的 DMEM高糖培养基(从HyClone公司购买)于37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养人结直肠癌SW480细胞株和SW620细胞株(SW480、SW620从美国ATCC公司购买)至铺满培养瓶。
2、shRNA 转染SW480细胞和SW620细胞
2.1  分别取培养瓶中1/6人结直肠癌SW480细胞和SW620细胞接种于6孔细胞培养板的每一孔中;
2.2  24h后细胞培养板覆盖率约达 70%~80%,丢弃原培养基。将6孔板中的细胞用2ml DMEM高糖培养基(无血清,无抗生素)培养4h;
2.3  于EP管内配制A液:5μl(20μmol/L)shRNA+250ul DMEM培养基(无血清,无抗生素),混合均匀;
于EP管内配制B液:Lipofectamine 2000(invitrogen公司)+250ulDMEM培养基(无血清,无抗生素),混合均匀;室温静置5min;
于EP管内配制C液:A液+B液,混合均匀,室温静置25min;
2.4弃细胞培养板内原有的培养基,每孔各加入新鲜的1.5ml DMEM高糖培养基 (无血清,无抗生素);
2.5将C液逐滴逐滴的加入到培养板中,每孔各500μl;
2.6 将转染shRNA的SW480细胞和SW620细胞放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育;实验设置3个组,分别为实验组、空白对照组、阴性对照组;
2.7 6h后,弃细胞培养板内原有的培养基,每孔各加入2ml含胎牛血清的DMEM高糖培养基;放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育。
3、总RNA的提取
3.1 取转染shRNA片段48h后的结直肠癌SW480细胞和SW620细胞,加入TRIzol试剂(invitrogen公司)1ml,然后转移到1.5ml的Eppendorf管中,室温静置5min;
3. 2 加入0.2ml的氯仿,盖紧盖子,摇匀15秒左右,室温静置2-3min ,4℃离心机中离心(12000r/min,15min);
3.3 将上清转移至新管(1.5ml的Eppendorf管)中,加入0.5ml的异丙醇,充分混匀,室温静置10min,4℃离心机中离心(12000g/min,15min),弃上清,在管底部可见乳白色小沉淀物,即为RNA;
3.4 加入1ml 质量浓度75%的乙醇,混合震荡,4℃离心机中离心(7500g/min) 5min,弃上清,通风,室温中干燥5min,让乙醇挥发;然后加入50μl质量浓度0.1%的DEPC处理水溶解RNA;
3.5凝胶电泳和分光光度计检测浓度和纯度,保证每个样本的OD260/OD280的值在1.8~2.0之间,并通过琼脂糖电泳检测每个样本的28S及18S条带的灰度值来进一步严格控制RNA质量,并且每个样本的RNA均使用DNA酶进行处理以去除基因组污染。
4、cDNA第一链的合成
取总RNA样品1μg, Oligo dT 1μl入PCR反应管, 再加质量浓度0.1%的DEPC处理水至总体积12μl,65℃,反应5分钟,反应结束后取出置于冰上孵育2min,再加入缓冲液(Buffer )4μl,RNA抑制剂1μl,,浓度10mmol/L 的dNTP 2μl, 逆转录酶1μl至总体积达到20μl,将混合液置于37℃反应60分钟,再于70℃反应5分钟,之后冰上冷却终止反应,-20℃保存。
5、荧光定量PCR试验
5.1 荧光定量PCR引物设计
根据人c2orf68基因全长cDNA的开放读码框(Open Reading Frame,ORF)序列,设计荧光定量PCR所需引物。所用软件为Primer Premier 5.0及Olig6。保证PCR产物长度在100bp~250bp。引物设计好后,进一步在NCBI上通过BLAST比对验证引物的特异性是否良好。采用人gapdh(核苷酸序列见NCBI数据库)作为内参,引物序列见下表。
表1  定量PCR 引物
5.2荧光定量PCR扩增
采用SYBR GREEN染料法来进行荧光定量PCR扩增,并根据荧光定量PCR试剂盒操作说明书(TakaRa company)控制实验规范性。依次取2μl的步骤4合成的cDNA模板、25μl的SYBR MIX(定量PCR试剂盒)、21μl的去核酸水、1μl的上游引物、1μl的下游引物,反应总体积50μl,然后放入eppendorf荧光定量PCR仪进行扩增,内参gapdh扩增斜率为-3.329,Y轴截距为25.38,扩增效率为1.00,相关系数为0.999。目的基因c2orf68扩增斜率为-3.397,Y轴截距为26.17,扩增效率为0.97,相关系数为0.999。分别检测实验组、空白对照组、阴性对照组c2orf68基因的mRNA的表达水平。
反应完毕后对实验结果进行分析,c2orf68的基因引物标准曲线图见图1,gapah的基因引物标准曲线图见图2。实验结果表明,结直肠癌SW480细胞RNA干扰后, c2orf68基因表达水平比空白对照组下降71.6%(见图3);结直肠癌SW620细胞RNA干扰后c2orf68基因表达水平比空白对照组下降65.2%(见图4)。
实施例3:shRNA对人结直肠癌细胞株SW480和SW620凋亡与增殖的影响
1、流式细胞仪检测细胞凋亡
采用流式细胞术来检测SW480和SW620细胞的凋亡情况。收集生长指数期的SW480及SW620细胞株,于6孔板中培养,24 h后细胞培养板覆盖率约达 70%~80%,然后进行转染,步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组(转染时只加脂质体Lipofectamine 2000)。转染24h后,收集细胞,在离心机上以2000RPM离心5分钟,弃培养基,调整细胞浓度为 3×105 个/管。PBS洗涤细胞两次,用400μl结合缓冲液(凯基生物)重悬细胞,加入5μl Annexin V-FITC(凯基生物),混匀 ,室温反应 10 min,然后加入5μl Propidium iodide(PI)(凯基生物),4℃避光孵育30min。用流式细胞仪(BD FACSAriaⅡ Cell Sorter,美 国))检测分析,每个样本收集10000个荧光信号。检测结果见图5、图6、图7、图8,转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA,阴性对照细胞株SW480-NC, 未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡率分别为21.42%,11.69%,11.05%,通过T检验发现实验组的凋亡率显著高于阴性对照组及空白对照组(P=0.021,P=0.026),而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无明显差异(P=0.229);转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA,阴性对照细胞株SW620-NC,未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡率分别为17.78%,8.76%,8.68%,通过T检验发现实验组的凋亡率显著高于阴性对照组及空白对照组(P=0.025,P=0.043),而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无明显差异(P=0.247)。实验结果表明,抑制c2orf68基因的表达能够明显促进结直肠癌细胞SW480和SW620的凋亡。
2、MTT实验
采用MTT实验来检测结直肠癌细胞SW480和SW620的增殖情况。收集生长指数期的SW480及SW620细胞株,并与96孔板中培养,调整细胞浓度为4×103 个/孔,24 h后细胞培养板覆盖率约达 70%~80%,然后进行转染,步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine 2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组(转染时只加脂质体Lipofectamine 2000),每组设6个孔。分别于转染后6h,12h,24h,36h,48h 在每个反应孔加入15ulMTT (5mg/ml,用PBS配制,过滤除菌),继续孵育4h。吸弃原液,加入150ul DMSO。37℃孵育15min后用酶标仪检测各孔 490nm波长处的吸光值(OD),用各组吸光值的均值表示细胞的增殖情况。检测结果见图9和图10。
MTT实验显示:干扰24小时以后,与空白对照组及阴性对照组相比,实验组的SW480及SW620细胞株出现明显的增殖抑制,在SW480中抑制率为22.7%(P=0.003),在SW620中抑制率为21.2%(P=0.002),说明抑制c2orf68基因的表达能够明显抑制结直肠癌细胞SW480和SW620的增殖。

Claims (2)

1.一种作用于在人结直肠癌细胞中表达的RNA干扰靶点的shRNA,其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:2所述,所述在人结直肠癌细胞中表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO:1所述的人c2orf68基因,是SEQ ID NO:1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段,其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:3所述。
2.权利要求1所述shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
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