CN103146689B - 短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点，来源于序列表中SEQ ID NO：1所述的人c2orf68基因，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO：3。一种在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA，由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，所述短发夹shRNA可在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种短发夹shRNA及其在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
背景技术
近年来, 恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因（如set、survivin、c-myc、Bcl-2等）和抑癌基因（如p53、DCC、nm23、APC、PTEN 、PP2A等）与人结直肠癌的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多与人结直肠癌发病相关的致癌基因、抑癌基因尚未发现。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的技术。该技术已被用于疾病基因治疗领域，例如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法，肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。该技术比其它治疗手段的毒副作用会更低，因此开发更多的针对癌症的RNA干扰片段具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的短发夹shRNA，并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。
人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM-001013649.3，定位于2p11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQID NO：1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示：该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。
本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO：1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO：1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列见序列表中SEQID NO：3。
本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。
实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，本发明所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明为制备治疗人结直肠癌的药物提供了一种新方法，可促进人结直肠癌新药的开发。
2、本发明所述shRNA片段不仅可应用于制备治疗人结直肠癌的药物，而且可用于人c2orf68基因在结直肠癌发病中的作用和机理研究。
附图说明
图1 是荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。
图2 是荧光定量PCR实验中内参gapah基因引物的标准曲线图。
图3 是人结直肠癌细胞株SW480的siRNA组（转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）、阴性对照组SW480-NC、空白对照组（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）中人c2orf68基因表达的柱状图。
图4 是人结直肠癌细胞株SW620的siRNA组（转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）、阴性对照组SW620-NC、空白对照组（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）中人c2orf68基因表达的柱状图。
图5是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA、阴性对照细胞株SW480-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡图。
图6是流式细胞仪检测SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的细胞凋亡率柱状图。
图7是流式细胞仪检测转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA、阴性对照细胞株SW620-NC和未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡图。
图8是流式细胞仪检测SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的细胞凋亡率柱状图。
图9是MTT实验中SW480-siRNA、SW480-NC、SW480细胞株的生长曲线图。
图10是MTT实验中SW620-siRNA、SW620-NC、SW620细胞株的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook, Russell的分子克隆；实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：RNA干扰靶点的确定及shRNA的设计与合成
以人c2orf68基因的mRNA序列作为基础，采用siRNA在线设计软件（http://www.ambion.com）设计短发夹shRNA，siRNA在线设计软件显示RNA干扰靶点的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中第327位至345位的核苷酸序列，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO：3。根据所述靶序列设计了一对短发夹shRNA，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。shRNA通过化学合成方法制备，委托有关专业公司合成（广州锐博生物科技有限公司）。
实施例2：短发夹shRNA的干扰效率实验
1、细胞培养
用胎牛血清的体积比为10%的 DMEM高糖培养基(从HyClone公司购买)于37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养人结直肠癌SW480细胞株和SW620细胞株（SW480、SW620从美国ATCC公司购买）至铺满培养瓶。
2、shRNA 转染SW480细胞和SW620细胞
2.1 分别取培养瓶中1/6人结直肠癌SW480细胞和SW620细胞接种于6孔细胞培养板的每一孔中；
2.2 24h后细胞培养板覆盖率约达 70％～80%，丢弃原培养基。将6孔板中的细胞用2ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)培养4h；
2.3 于EP管内配制A液：5μl（20μmol/L）shRNA+250ul DMEM培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；
于EP管内配制B液：Lipofectamine 2000(invitrogen公司)+250ulDMEM培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；室温静置5min；
于EP管内配制C液：A液+B液,混合均匀，室温静置25min；
2.4弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入新鲜的1.5ml DMEM高糖培养基 (无血清，无抗生素)；
2.5将C液逐滴逐滴的加入到培养板中，每孔各500μl；
2.6 将转染shRNA的SW480细胞和SW620细胞放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育；实验设置3个组，分别为实验组、空白对照组、阴性对照组；
2.7 6h后，弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入2ml含胎牛血清的DMEM高糖培养基；放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育。
3、总RNA的提取
3.1 取转染shRNA片段48h后的结直肠癌SW480细胞和SW620细胞，加入TRIzol试剂（invitrogen公司）1ml，然后转移到1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min；
3. 2 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，摇匀15秒左右，室温静置2-3min ，4℃离心机中离心(12000r/min，15min)；
3.3 将上清转移至新管（1.5ml的Eppendorf管）中，加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，室温静置10min，4℃离心机中离心(12000g/min，15min)，弃上清，在管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA；
3.4 加入1ml 质量浓度75%的乙醇，混合震荡，4℃离心机中离心(7500g/min) 5min，弃上清，通风，室温中干燥5min，让乙醇挥发；然后加入50μl质量浓度0.1%的DEPC处理水溶解RNA；
3.5凝胶电泳和分光光度计检测浓度和纯度，保证每个样本的OD260/OD280的值在1.8~2.0之间，并通过琼脂糖电泳检测每个样本的28S及18S条带的灰度值来进一步严格控制RNA质量，并且每个样本的RNA均使用DNA酶进行处理以去除基因组污染。
4、cDNA第一链的合成
取总RNA样品1μg， Oligo dT 1μl入PCR反应管, 再加质量浓度0.1%的DEPC处理水至总体积12μl，65℃，反应5分钟，反应结束后取出置于冰上孵育2min，再加入缓冲液（Buffer ）4μl，RNA抑制剂1μl,，浓度10mmol/L 的dNTP 2μl, 逆转录酶1μl至总体积达到20μl，将混合液置于37℃反应60分钟，再于70℃反应5分钟，之后冰上冷却终止反应，-20℃保存。
5、荧光定量PCR试验
5.1 荧光定量PCR引物设计
根据人c2orf68基因全长cDNA的开放读码框（Open Reading Frame,ORF）序列，设计荧光定量PCR所需引物。所用软件为Primer Premier 5.0及Olig6。保证PCR产物长度在100bp~250bp。引物设计好后，进一步在NCBI上通过BLAST比对验证引物的特异性是否良好。采用人gapdh（核苷酸序列见NCBI数据库）作为内参，引物序列见下表。
表1 定量PCR 引物
5.2荧光定量PCR扩增
采用SYBR GREEN染料法来进行荧光定量PCR扩增，并根据荧光定量PCR试剂盒操作说明书（TakaRa company）控制实验规范性。依次取2μl的步骤4合成的cDNA模板、25μl的SYBR MIX（定量PCR试剂盒）、21μl的去核酸水、1μl的上游引物、1μl的下游引物，反应总体积50μl，然后放入eppendorf荧光定量PCR仪进行扩增，内参gapdh扩增斜率为-3.329，Y轴截距为25.38，扩增效率为1.00，相关系数为0.999。目的基因c2orf68扩增斜率为-3.397，Y轴截距为26.17，扩增效率为0.97，相关系数为0.999。分别检测实验组、空白对照组、阴性对照组c2orf68基因的mRNA的表达水平。
反应完毕后对实验结果进行分析，c2orf68的基因引物标准曲线图见图1，gapah的基因引物标准曲线图见图2。实验结果表明，结直肠癌SW480细胞RNA干扰后， c2orf68基因表达水平比空白对照组下降71.6%（见图3）；结直肠癌SW620细胞RNA干扰后c2orf68基因表达水平比空白对照组下降65.2%（见图4）。
实施例3：shRNA对人结直肠癌细胞株SW480和SW620凋亡与增殖的影响
1、流式细胞仪检测细胞凋亡
采用流式细胞术来检测SW480和SW620细胞的凋亡情况。收集生长指数期的SW480及SW620细胞株，于6孔板中培养，24 h后细胞培养板覆盖率约达 70％～80%，然后进行转染，步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组（转染时只加脂质体Lipofectamine 2000)。转染24h后，收集细胞，在离心机上以2000RPM离心5分钟，弃培养基，调整细胞浓度为 3×105 个／管。PBS洗涤细胞两次，用400μl结合缓冲液（凯基生物）重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC（凯基生物），混匀 ，室温反应 10 min，然后加入5μl Propidium iodide（PI）（凯基生物），4℃避光孵育30min。用流式细胞仪（BD FACSAriaⅡ Cell Sorter，美 国)）检测分析，每个样本收集10000个荧光信号。检测结果见图5、图6、图7、图8，转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480-siRNA，阴性对照细胞株SW480-NC, 未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480的细胞凋亡率分别为21.42%,11.69%,11.05%，通过T检验发现实验组的凋亡率显著高于阴性对照组及空白对照组（P=0.021，P=0.026），而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无明显差异(P=0.229）；转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620-siRNA，阴性对照细胞株SW620-NC,未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620的细胞凋亡率分别为17.78%,8.76%,8.68%，通过T检验发现实验组的凋亡率显著高于阴性对照组及空白对照组（P=0.025，P=0.043），而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无明显差异(P=0.247）。实验结果表明，抑制c2orf68基因的表达能够明显促进结直肠癌细胞SW480和SW620的凋亡。
2、MTT实验
采用MTT实验来检测结直肠癌细胞SW480和SW620的增殖情况。收集生长指数期的SW480及SW620细胞株，并与96孔板中培养，调整细胞浓度为4×103 个／孔，24 h后细胞培养板覆盖率约达 70％～80%，然后进行转染，步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine 2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组（转染时只加脂质体Lipofectamine 2000)，每组设6个孔。分别于转染后6h,12h,24h,36h,48h 在每个反应孔加入15ulMTT (5mg/ml,用PBS配制，过滤除菌)，继续孵育4h。吸弃原液，加入150ul DMSO。37℃孵育15min后用酶标仪检测各孔 490nm波长处的吸光值（OD），用各组吸光值的均值表示细胞的增殖情况。检测结果见图9和图10。
MTT实验显示：干扰24小时以后，与空白对照组及阴性对照组相比，实验组的SW480及SW620细胞株出现明显的增殖抑制，在SW480中抑制率为22.7%（P=0.003），在SW620中抑制率为21.2%(P=0.002)，说明抑制c2orf68基因的表达能够明显抑制结直肠癌细胞SW480和SW620的增殖。
Claims (2)
1.一种作用于在人结直肠癌细胞中表达的RNA干扰靶点的shRNA，其特征在于它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述，所述在人结直肠癌细胞中表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO：1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO：1中第327位至345位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所述。
2.权利要求1所述shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。
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