CN102102102A

CN102102102A - hsa-miR-185的新用途

Info

Publication number: CN102102102A
Application number: CN 201010577853
Authority: CN
Inventors: 周光明; 苏锋涛; 何进鹏; 徐瑚珊; 丁楠; 朱佳贇; 胡文涛
Original assignee: Institute of Modern Physics of CAS
Current assignee: Institute of Modern Physics of CAS
Priority date: 2010-06-12
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2030-12-02
Also published as: CN102102102B

Abstract

本发明涉及hsa-miR-185的新用途。该新用途为miR-185在如下I、II或III中的应用：I、制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品；II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；III、制备抑制ATR基因激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR基因的产品、和/或制备抑制ATR蛋白的产品。实验证明，miR-185可以直接抑制肿瘤生长和增强细胞对辐射的敏感性。进一步实验证明，miR-185的上述功能是通过抑制细胞内的ATR基因的表达实现的。因此，将miR-185用于制备治疗肿瘤的药物及辐射增敏剂，将对肿瘤的治疗具有重要意义和广阔的应用前景。

Description

hsa-miR-185的新用途

技术领域

本发明涉及hsa-miR-185的新用途。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命健康的常见病、多发病，在许多国家和地区占疾病死亡率的前三位，而且其发病率和病死率仍在逐年增高。目前主要的治疗方法包括手术、放疗和化疗。1998年世界卫生组织(WHO)的资料显示，目前肿瘤的总治愈率约45％，其中80％患者不同程度地接受了放射治疗，但肿瘤的辐射抗性严重地影响了放疗的治疗效果。

放射治疗是非常重要的肿瘤治疗手段之一，但治愈率仍然偏低。另外，目前放射治疗装置主要有γ射线、X射线等。这些常规射线与物质的作用机理决定了其对机体表面的影响要强于对深层的影响，治疗时会对肿瘤周围正常组织造成严重损伤。开发肿瘤组织的靶向辐射增敏剂，可以降低辐照剂量，在提高放疗疗效的同时更好地保护正常组织，因此，具有极其重要的临床应用价值。

同时，肿瘤基因治疗作为新兴治疗手段，引起医学界极大的关注。miRNA作为一类新发现的基因，在肿瘤治疗方面受到关注。miRNA是一类广泛存在于生物体中、长度约21～25nt的非编码小分子RNA。它通过与靶基因mRNA序列互补性结合导致mRNA的降解或抑制其翻译，从而在转录后水平调节基因的表达。

最早发现的miRNA家族成员是Lin-4，是1993年Lee等人在秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)胚胎发育时间控制缺陷性遗传筛选实验中发现的(Lee，et al.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14.Cell，1993，75(5)：843-854)。在短短几年内，不同的研究小组相继在线虫、果蝇、斑马鱼、拟南芥、水稻和人类细胞等多种真核模式生物的细胞中找到上万种miRNAs。依据Sanger miRNA序列数据库(miRBase 14.0版，2009.09.15)，目前共发现miRNA发夹前体序列为10883条，成熟miRNA序列为10581条，涵盖115个物种，其中人源miRNA共721条。

miRNA基因约占人类基因的1％，是最大的基因表达调控家族之一，却调控接近30％基因的表达(Lewis，et al.Prediction of mammalian microRNA targets.Cell，2003，115(7)：787-798)。miRNA表达的时空特性，调控方式的多样性、灵活性，使其成为信使RNA强有力的调节子。miRNA与其靶分子组成一个复杂的精细调控网络，参与调控生物体的生长、发育、细胞分化、细胞凋亡等一系列重要的生命进程。miRNA与肿瘤发生也密切相关，有些miRNA基因具有抑癌基因的功能，例如，let-7参与乳腺癌干细胞的调控，调节原癌基因ras的表达(Yu，et al.let-7 regulates self-renewal and tumorigenicity of breast cancer cells.Cell，2007，131：1109-1123)，有些miRNA又类似于原癌基因(Esquela-Kerscher and Slack.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer，2006，6(4)：259-269)，例如miR-21参与调节抑癌基因PTEN的表达(Meng，et al.MicroRNA-21 regulates expression of the PTEN tumor suppressor gene in human hepatocellular cancer.Gastroenterology，2007，133：647-58)。miRNA基因多位于肿瘤细胞染色体发生缺失、扩增、转位的高发区(Calin et al.Human microRNA genesare frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers.PNAS，2004，101(9)：2999-3004)，表明miRNA在人类癌症的发病机理中发挥着十分重要的作用。

肿瘤放疗中，辐射抗性问题是肿瘤放疗成败的关键。细胞受到辐照后，将启动复杂的应激网络，将细胞周期阻滞在检测点上，启动DNA损伤修复。如损伤无法修复，细胞将进入凋亡程序。ATR基因也是细胞DNA复制的关键监控蛋白。人源的ATR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

miR-185家族仅存在于8种高等哺乳动物中(牛、狗、人、猕猴、蓝鲸、黑猩猩、鼠、猪)，其前体碱基序列存在一定差异性，但成熟碱基序列完全一致，表明miR-185在进化上高度保守。miR-185的成熟核苷酸序列为UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA(SEQ ID NO：1)。人类的miR-185位于人类染色体组的22号染色体20，018，662-20，022，743区域。miR-185的功能尚未明了。

发明内容

本发明的一个目的是提供如下1)、2)、3)、4)或5)所示的物质的新用途。

本发明所提供的如下1)、2)、3)、4)或5)所示的物质的新用途为其在如下I、II或III中的应用：

1)SEQ ID NO：1所示的RNA分子；

2)SEQ ID NO：2所示的RNA分子；

3)编码1)所示分子的DNA或表达1)所示分子的载体；

4)编码2)所示分子的DNA或表达2)所示分子的载体；

5)由Ambion公司制造的产品，产品名称为Pre-miR^TMmiRNAPrecursorhsa-miR-185，产品Cat#：AM17100，产品ID：PM12486，产品规格：5nmol；

I、制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品；

II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；

III、制备抑制ATR基因激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路的产品、制备抑制ATR基因的产品、和/或制备抑制ATR蛋白的产品。

ATR基因作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。

ATR蛋白作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。

ATR基因激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。

ATR蛋白激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用也属于本发明的保护范围。

IV、设计和/或筛选和/或制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；

V、设计和/或筛选和/或制备具有增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品。

上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能为促进辐射后的细胞的凋亡；

上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤为如下1)或2)或3)或4)所示：1)抑制肿瘤的生长；2)抑制肿瘤的成瘤能力；3)抑制肿瘤细胞的生长；4)辅助增强肿瘤的辐射敏感性。

上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品为辐射增敏剂。

上述任一所述应用中，所述辐射为非电离辐射或电离辐射；所述非电离辐射为紫外线，所述电离辐射为X射线；所述紫外线为UVA或UVB。

上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路、抑制ATR基因的表达或抑制ATR蛋白的表达实现的；

上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路、抑制ATR基因的表达或抑制ATR蛋白的表达实现的。

上述任一所述应用中，所述抑制ATR基因激活或介导的信号通路、抑制ATR蛋白激活或介导的信号通路、抑制ATR基因的表达或抑制ATR蛋白的表达是通过如下方式实现的：所述1)、2)、3)、4)或5)所示的物质与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合。

上述任一所述应用中，所述与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合为与NM_001184.3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合或与SEQ ID NO：3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合。

上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌。

上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌。

上述任一所述应用中，所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-O；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌的细胞为HeLa；所述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803。

上述任一所述应用中，所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-O；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌的细胞为HeLa；所述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803。

实验证明，hsa-miR-185(简称：miR-185)可以直接抑制肿瘤生长和增强细胞对辐射的敏感性。进一步实验证明，miR-185的上述功能是通过抑制细胞内ATR基因的表达实现的。因此，将miR-185用于制备治疗肿瘤的药物及辐射增敏剂，将对肿瘤的治疗具有重要意义，有广阔的应用前景。

附图说明

图1：miR-185试剂的转染效率检测及试剂功能有效性检测。

图2：辐照后，miR-185在肾癌组织随着辐照剂量的增加，其表达量逐渐降低。

图3：辐照后，miR-185在不同的组织、细胞系中的表达普遍下调。

图4：miR-185促进辐照后细胞的凋亡。

图5：miR-185抑制辐照后细胞的克隆形成率。

图6：miR-185抑制小鼠体内移植瘤的生长。

图7：miR-185抑制ATR基因的表达。

图8：miR-185与ATR mRNA的3’UTR区域相结合的实验验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的试剂如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

前体发卡型miR-185的序列如SEQ ID NO：2所示。

http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_entry.pl？acc＝MI0000482；

http://mirnamap.mbc.nctu.edu.tw/php/mirna_entry.php？acc＝MI0000482。

hsa-miR-185类似物、抑制剂及hsa-miRNA类似物、抑制剂的阴性对照试剂均购自美国Ambion(ABI)公司，由上海吉泰生物科技有限公司代理出售，具体产品信息如下：

hsa-miR-185类似物试剂(即miR-185类似物)，在ABI的产品名称为：Pre-miR^TMmiRNAPrecursor hsa-miR-185，产品Cat#：AM17100，产品ID：PM12486，产品规格：5nmol。

miR-185类似物是前体发卡型miR-185，是化学修饰的双链RNA分子，其模仿体内成熟的miR-185mRNA，在体内可被加工为成熟的miR-185序列发挥作用(5’-uggagagaaaggcaguuccuga-3’，SEQ ID NO：1)(

Pre-miR^TM miRNA Precursor Molecules are small，chemically modified double-stranded RNA molecules designed to mimic endogenous mature miRNAs)。

miR-185类似物阴性对照是核苷酸序列随机的类miRNA前体序列，在细胞系和组织中的广泛实验验证，其成熟序列没有miRNA功能，仅起到阴性对照作用(Pre-miRNegative Controls are random sequence Pre- miR molecules that have been extensively tested in human cell lines and tissues and validated to

miR-185抑制剂是小单链核酸分子，用于结合、抑制内生的成熟miR-185的表达

Anti-miR^TM miRNA Inhibitors are chemically modified，single stranded nucleic acids designed to specifically bind to and inhibit endogenous microRNA(miRNA)molecules)。hsa-miR-185抑制剂试剂，在ABI的产品名称为：Anti-miR^TM miRNA inhibitor hsa-miR-185，产品Cat#：AM17000，产品ID：AM12486；产品规格：5nmol。

miR-185抑制剂阴性对照是随机的单链核酸序列分子，经广泛的细胞和组织实验验证，该序列不和miR-185结合及抑制其功能，仅起到阴性对照功能。(Anti-miR Negative Control #1 is a random sequence Anti-miR molecule that has been extensively tested in human cell lines and tissues and validated to not produce identifiable effects on known miRNA function)。

Cy3标记的miRNA抑制剂阴性对照，无任何miRNA抑制剂的功能，仅起到阴性对照功能，因该分子标记有Cy3荧光染料，可以在荧光显微镜下观察期miRNA试剂在特定细胞中的转染效率，细胞内的定位情况。Cy^TM3 dye-labeled Anti-miR Negative Controls are also available for monitoring transfection efficiency in transfection experiments using Anti-miR miRNA Inhibitors.The fluorescent label enables direct observation ofthe cellular uptake，distribution，and localization of the control.These dye-labeled controls are labeled at their 5′end and have the same oligonucleotide sequence as unlabeled Negative Control#1.荧光染料Cy3标记的hsa-miRNA抑制剂阴性对照试剂，在ABI的产品名称：Cy^TM3 dye-labeled Anti-miR^TM Negative Control#1；产品Cat#：AM17011，产品规格：5nmol。

人肾透明细胞腺癌细胞786-O，购自中国科学院细胞库；小鼠黑色素瘤B16细胞购自购自中国科学院细胞库。采用Invitrogen公司的lipo2000转染试剂。

实施例1、细胞转染

一、转染miR-185类似物、抑制剂及阴性对照于786-O细胞的制备和验证：

1、铺细胞：将对数生长期的786-O细胞接种于12孔板，数目8×10⁵/well，第二天转染。

2、转染：按照每孔1μL miR-185类似物(或miR-185抑制剂或miR-185类似物阴性对照或miR-185抑制剂阴性对照)(浓度30μM)混于100μL不含血清的opti-MEM培养基，2μL Lipo2000混于100μL不含血清的opti-MEM培养基，室温孵育10min；把上述预混液混匀后于室温孵育15min；弃孔板中细胞培养液，加入不含血清的opti-MEM(Gibico)培养基，每孔加800μL，加入200μL的转染混合物，37℃、5％CO₂细胞培养箱培养；4小时后换1640培养液(10％血清)培养，于不同时间点观察细胞、提取蛋白或RNA样品。

3、转染效率检测(Cy3荧光素标记、荧光显微镜检测)

转染Cy3荧光素标记miRNA抑制剂阴性对照后24小时，荧光显微镜下观察细胞中Cy3荧光染料的情况(图1A)。

4、检测细胞内miR-185的表达量(qRT-PCR检测)

Trizol试剂购自Invitrogen；TaqMan Gene Expression Master Mix、TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit、hsa-miR-185 RT primer、hsa-miR-185 real-time pcrprimer、RNU6B RT primer、RNU6B real-time pcr primer购自ABI。

1)总RNA提取、检测：分别向786-O细胞系中转染miR-185类似物或miR-185抑制剂及阴性对照后24小时，收集样品，用Trizol法提取总RNA并用分光光度计检测RNA样的质量和浓度。

2)miR-185表达量的检测

(1)RT-PCR

(a)试剂置于冰上溶解15-20min。振荡混匀后轻微离心；

(b)按下表配制反转录混合液(RT-Mix)，充分混匀，置于冰上：

(c)按下表配制反转录反应液，充分混匀，置于PCR管中：

(d)RT-PCR条件：

(2)qPCR

(a)试剂置于冰上溶解15-20min。振荡混匀后轻微离心；

(b)按下表配制反转录混合液(RT-Mix)，充分混匀，至于PCR仪器上

(c)qPCR条件

(3)软件分析

采用Bio-Rad Chromo4荧光定量PCR仪自带分析软件MJopticon Monitor Analysis Software分析软件。荧光阈值设置：3-15循环荧光信号标准偏差的10倍。

转染效率检测结果如图1A所示，图1A是转染Cy3标记miRNA抑制剂24小时后，细胞的显微镜照片。对比Cy3转染结果和相差图片可以明显看出，按照上述实验操作方法，可以使miRNA抑制剂的细胞转染效率接近100％。

qRT-PCR检测结果表明，转入的miR-185类似物在细胞内转化成熟的miR-185(序列为5′-uggagagaaaggcaguuccuga-3′)，实际起作用的是成熟的miR-185。

转染后细胞内miR-185的量的检测结果如图1B所示。图1B是转染miR-185类似物、miR-185抑制剂及阴性对照24小时后，通过TaqMan荧光定量PCR实验检测786-O细胞系中成熟miR-185的表达水平。结果表明，与阴性对照组相比较，转染miR-185类似物24小时后，细胞中miR-185的量上调3125倍；转染miR-185抑制剂24小时后，miR-185的量降低至对照的0.02。表明miR-185类似物能很好地转化为miR-185成熟序列，极大地提高了miR-185的表达，miR-185抑制剂能很好地抑制细胞中miR-185的表达水平。

二、转染miR-185类似物的B16细胞、转染miR-185类似物阴性对照的B16细胞、转染miR-185抑制剂的B16细胞、转染miR-185抑制剂阴性对照的B16细胞的制备：与实验一方法相同，不同的是将786-O细胞替换为小鼠黑色素瘤B16细胞。

实施例2、miR-185增强肿瘤细胞对辐照的敏感性

一、辐照后，在肿瘤组织和细胞系中，miR-185的表达水平普遍下调

肾癌组织、肾癌癌旁组织取自兰州大学第二附属医院手术室；胃癌组织、胃癌癌旁组织取自兰州市第一人民医院手术室。

823购自中国典型培养物保藏中心；803购自中科院上海细胞所。

(一)辐照剂量为4Gy

组织的辐照检测实验：X射线辐照装置为兰州军区兰州总医院放射治疗中心电子直线加速器(CL2100，Varian，Germany)产生的8MV的X射线，LET约为2keV/μm，吸收剂量率为4Gy/min，辐照剂量4Gy，辐照后2小时检测miR-185的量。

细胞的辐照检测实验：辐照射线为X射线，吸收剂量率为4Gy/min，辐照剂量4Gy，辐照后2小时检测miR-185的量。

从辐照不同肾癌、胃癌、正常组织及对照组中用Trizol法提取总RNA，采用富能生物公司提供的miRNA two step qRT-PCR试剂盒，按照相关操作说明，进行反转录，和miR-185荧光定量PCR检测，其中，反转录采用的PCR仪器是Biometra T1(thermocycler公司)，荧光定量PCR检测仪器是Bio-Rad Chromo4 System Real-TimePCR Detector(Bio-Rad公司)。

结果，辐照后miR-185在肾癌、胃癌、正常组织、细胞系中表达普遍下调。辐照后miR-185的表达下调具有普遍性(图3)。

如图3A所示，4Gy X-射线辐照2小时后，miR-185在肾癌中显著下调，在3例胃癌中表达下调、1例胃癌中表达升高；图3B显示，4Gy X-射线辐照后2小时，786-O、BGC-823、MGC-803、HeLa细胞系中miR-185的表达均有不同程度的下调。表明miR-185和肿瘤放疗关系密切。

(二)肾癌中miR-185表达量的辐照剂量依赖性

以肾癌组织为实验对象，辐照不同剂量后，检测肾癌组织中miR-185的表达量。检测结果如图2所示，随着辐照剂量(2、4、8Gy)的升高，miR-185的表达呈下降趋势。辐照样品与非辐照样品相比较，辐照后miR-185的表达下降非常显著性(p＝0.0003)。下调表达与辐照剂量正相关。

二、miR-185促进辐照后细胞的凋亡

细胞培养基为：RPMI1640培养基+FBS；UV照射方法：将细胞置于UV灯管下30cm处照射。UVB剂量率：160μW/cm²/min，照射剂量：20J/m²。

miR-185类似物组：以转染miR-185类似物的786-O细胞为实验对象；转染5小时后换培养基，培养24小时后，UV 20J/m²照射，继续培养24小时后检测凋亡。

阴性对照组：以转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞为实验对象，其余实验条件与实验组完全相同。

PI单染色法检测细胞凋亡：

1)细胞固定

(1)收集培养液及细胞(细胞数目约为5X10⁵)；

(2)离心3000rpm，5min，弃上清液；

(3)300μL预冷PBS悬浮；

(4)800μL预冷乙醇，-20℃固定。

2)PI染色

(1)离心3000rpm，5min，弃上清液；

(2)200μL PI染液染色，4℃避光30min。

3)流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波长488nm，发射光波长大于630nm，为红色荧光。

用流式细胞术测定Sub-G1细胞含量，检测细胞凋亡水平。

实验设3次重复，结果如图4所示：A为未照射的对照组细胞凋亡比例，B为miR-185类似物阴性对照组照射后细胞凋亡比例，C为miR-185类似物处理组照射后细胞凋亡比例，D为miR-185处理组和对照组细胞凋亡比率统计做图。辐照后细胞出现明显的凋亡峰(M1，即Sub-G1峰)，miR-185类似物作用组和对照组相比较可以看出，miR-185能显著地提高细胞凋亡率(p＝0.022)，miR-185类似物组与阴性对照组的比值为1.30±0.13。

三、miR-185抑制辐照后细胞的存活率

细胞培养基为：RPMI1640培养基+10％FBS；UV照射方法：将细胞置于UV灯管下30cm处照射，石英玻璃可以过滤185nm的臭氧形成的光谱，从而可以防止产生臭氧。UVB剂量率：160μW/cm²/min，照射剂量：20J/m²。

miR-185类似物组：以转染miR-185类似物的786-O细胞为实验对象；转染后5小时换培养基，培养24小时后，UV 20J/m²照射，细胞胰酶消化，悬浮、计数、并稀释到指定浓度。按预置数(100-3000cells/dish)将细胞悬液接种到

培养皿中，每个剂量点3皿重复。放置于CO₂培养箱中37℃培养，8天后，70％乙醇固定，Giemsa染色，统计多于50个细胞的集落数。细胞存活率(Survival Fraction，简称SF)按下式计算：SF(％)＝(S/S0)×100％，式中S为受照细胞克隆形成率，S0为对照细胞克隆形成率。

miR-185类似物阴性对照组：以转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞为实验对象，其余实验条件与实验组完全相同。

miR-185抑制剂组：以转染miR-185抑制剂的786-O细胞为实验对象，其余实验条件与实验组完全相同。

miR、185抑制剂阴性对照组：以转染miR-185抑制剂阴性对照的786-O细胞为实验对象，其余实验条件与实验组完全相同。

对照组(空白对照)：以未经任何转染的786-O细胞为实验对象，其余实验条件与实验组完全相同。

实验设3次重复。结果取平均数。

图5是向786-O细胞中转染miR-185类似物和抑制剂及阴性对照后24小时，UV20J/m²照射，克隆存活实验结果。图A是UV照射miR-185作用下的786-O细胞的克隆存活实验照片。图A表明，miR-185抑制剂同对照组相比，其细胞克隆斑偏大，克隆存活率高；miR-185类似物同对照组相比较，其细胞克隆斑偏小，克隆存活率降低。图B是三次克隆存活实验的数据分析。图B表明，miR-185抑制剂能显著地提高细胞的克隆存活率，为对照组的1.22±0.06倍(P＜0.05)；miR-185类似物能显著地抑制细胞的克隆存活率，为对照组的0.79±0.04倍(P＝0.0005)。

空白对照组与各阴性对照组的结果无显著差异。

综合上述结果，miR-185对肿瘤细胞具有辐射增敏作用。

实施例3、miR-185抑制了肿瘤生长(小鼠成瘤实验)

(一)786-O在SCID/NOD小鼠中的成瘤能力实验

非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(non-obese diabetes-SCID mice，NOD/SCID)小鼠具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷、NK细胞活性低下、无循环补体、巨噬细胞和抗原提呈细胞功能损害等特性，近年已成为人类肿瘤移植瘤的最佳研究模型。SCID/NOD小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，6周龄，体重18～22g，饲养于甘肃省肿瘤医院药理毒理实验中心SPF级动物饲养室。小鼠随机分成6组，每组3只。皮下腋窝注射，接种细胞数2×10⁵/200μL，每天观察记录肿瘤生长情况，直至肿瘤生长到合适体积，处死，拍照，称瘤重，肿瘤块保存于液氮。实验设3次重复。

1)转染miR-185类似物的786-O细胞、转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞、转染miR-185抑制剂的786-O细胞、转染miR-185抑制剂阴性对照的786-O细胞的制备及相关试剂的转染方法与实施例1中所述一致。

2)设置6组：

miR-185类似物组：右腋窝接种，转染miR-185类似物的786-O细胞。

miR-185类似物阴性对照组：左腋窝接种，转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞。

miR-185抑制剂组：右腋窝接种，转染miR-185抑制剂的786-O细胞。

miR-185抑制剂阴性对照组：左腋窝接种，转染miR-185抑制剂阴性对照的786-O细胞。

Lipo对照组：右腋窝接种，转染lipo2000(Invitrogen)的786-O细胞。

空白对照组(control)：左腋窝接种，未经任何处理的786-O细胞。

3)接种后60天，处死小鼠，取瘤体拍照、称重。

实验设3次重复，结果取平均数。

各组的瘤体重量如下：miR-185类似物组0.11克，miR-185类似物阴性对照组0.21克，miR-185抑制剂组0.15克，miR-185抑制剂阴性对照组0.20克。

统计结果如图6A所示。miR-185类似物组瘤体重量远低于miR-185类似物阴性对照组，仅为miR-185类似物阴性对照组的0.44±0.08。表明，miR-185类似物可以抑制瘤体的生长。

(二)B16细胞在C57小鼠中的成瘤能力实验

C57小鼠购自兰州大学医学实验中心；

以转染不同miRNA的B16细胞、C57小鼠为实验象。

实验中各组的设置与上述实验(一)中所述一致。不同的是将小鼠替换为C57小鼠，将出发细胞替换为B16细胞。

接种9天后，首先在miR-185抑制剂处理组发现可触及的肿块，miR-185类似物组无；miR-185类似物组和miR-185类似物阴性对照组相比较，出现瘤块的先后次序无明显区别。接种后第12天，处死小鼠，取瘤体拍照、称重。

实验设3次重复，结果取平均数。

各组的瘤体平均重量如下：miR-185类似物组0.47克，miR-185类似物阴性对照组0.85克，miR-185抑制剂组0.87克，miR-185抑制剂阴性对照组0.46克。

统计结果如图6B所示，miR-185类似物组瘤体重量远低于其阴性对照组，仅为阴性对照组的0.57±0.10；而miR-185抑制剂组瘤体的重量显著高于阴性对照组，为阴性对照组的1.92±0.13。表明，miR-185类似物可以直接抑制肿瘤生长。

实施例4、miR-185抑制ATR基因的表达

(一)荧光定量PCR实验和Western blot实验检测miR-185对ATR基因表达的抑制

转染miR-185类似物的786-O细胞的制备和验证：与实施例1中所述相同。

转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞的制备和验证：与实施例1中所述相同。

于转染后不同时间点在RNA水平、蛋白水平检测细胞内ATR的表达情况。

实验组：以转染miR-185类似物的786-O细胞为实验对象。

阴性对照组：以转染miR-185类似物阴性对照的786-O细胞为实验对象。

实验设3次重复。

图7A是通过荧光定量PCR实验检测转染miR-185类似物后不同时间点细胞中ATR基因的mRNA表达水平(相对浓度)。结果表明，同阴性对照相比较，miR-185类似物能显著抑制ATR基因的转录，在转染后24小时、48小时、72小时各时间点ATR转录水平均显著下降。

图7B和7C是通过Western-blot实验检测ATR蛋白在不同时间点的表达水平。结果表明，转染miR-185类似物后，ATR蛋白的表达水平降低，在72小时内随着时间延长呈下降趋势。

表明miR-185能显著抑制ATR基因的转录和ATR蛋白的表达。

(二)pMIR-ATR 3’UTR荧光素酶报告基因系统检测miR-185和ATR mRNA的相互作用

为了进一步证明miR-185和ATR的相互作用，构建了pMIR-ATR 3’UTR报告基因系统，检测miR-185和ATR mRNA作用位点。

1、载体构建pMIR-ATR 3’UTR：

根据NCBI公共数据库(网址是：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001184.3)中所提供的人源ATR基因序列(即SEQ ID NO：3)，利用生物信息学软件RNA22预测miR-185和ATR mRNA 3UTR区域的碱基结合位点(图7D)，针对3’UTR区域中mir-34a的作用位点，设计PCR引物：

Sense：CGGACTAGTTGTTCTTGACATTGAGCAG (划线部分为Spe I)

Anti-sense：CCCAAGCTTGAAAGCAGTTTATTTGTT (划线部分为Hind III)

从786-O细胞中提取总基因，经RT-PCR扩增得到所需序列。扩增出的片段用SpeI和Hind III进行酶切，与同样酶切的pMIR-REPORT^TM Luciferase vector(Ambion，AM5795)(图8A)进行连接，得到重组载体，测序验证，结果插入pMIR-REPORTTMLuciferase的Spe I和Hind III酶切位点间的序列如SEQ NO：3中第8165-8186(ATR：NM_001184.3)位核苷酸所示，证明得到的重组载体正确，记作pMIR ATR 3’UTR。SEQ NO：3中第8165-8186位核苷酸所示片段位于ATR基因的3’UTR区域。

2、细胞培养及质粒转染

786-O传代于12孔板中培养24小时(细胞密度为60-70％培养皿底面积)，分别转染miR-185类似物，miR-185抑制剂及各自阴性对照，然后在上述孔板中转染pMIRATR 3’UTR或pMIR-REPORTTM β-gal(阴性对照载体：Ambion，AM5795)，浓度为320ng/well。转染4小时后换培养基，培养。

实验设如下4组：

miR-185类似物+pMIR-ATR-3’UTR+pMIR-REPORTTM β-gal：转染miR-185类似物、pMIR ATR 3’UTR载体及其阴性对照载体pMIR-REPORTTM β-gal；

miR-185类似物阴性对照+pMIR-ATR-3’UTR+pMIR-REPORTTM β-gal：转染miR-185类似物阴性对照、pMIR-ATR-3’UTR及其阴性载体pMIR-REPORTTM β-gal；

miR-185抑制剂+pMIR-ATR-3’UTR+pMIR-REPORTTM β-gal：转染miR-185抑制剂、pMIR-ATR-3’UTR载体及其阴性对照载体pMIR-REPORTTM β-gal；

miR-185抑制剂阴性对照+pMIR-ATR-3’UTR+pMIR-REPORTTM β-gal：转染miR-185抑制剂阴性对照、pMIR-ATR-3’UTR载体及其阴性对照载体pMIR-REPORTTM β-gal。

3读取荧光值

转染后36小时收集细胞，读取Luciferase荧光值。按试剂盒(Promega)说明书操作，弃掉细胞培养基，PBS冲洗细胞1次，加入150μl 1×RLB裂解液，吹打细胞，刮铲收集裂解液，-20℃反复冻融2次。然后分别按说明书分别检测β-半乳糖苷酶、荧光素酶的荧光值。设置pMIR-REPORTTM β-gal，可以通过Luciferase对β-gal比值，消除了组间转染效率不一样等实验环节的误差。图8B的纵坐标是比值。

实验设3次重复。

图8B是细胞共转染后24小时luciferase的相对强度(I为miR-185抑制剂阴性对照组；II为miR-185抑制剂组；III为miR-185类似物阴性对照组；IV为miR-185类似物组)。结果表明，miR-185类似物抑制了载体中Luciferase的表达，是阴性对照的0.79倍，p＝0.0024，差异显著；miR-185抑制剂促进了载体中Luciferase的表达，是阴性对照的1.23倍，差异显著P＝0.0022。究其原因，miR-185通过和ATR mRNA 3’UTR的靶位点结合(图7D)，抑制luciferase的表达；miR-185抑制剂通过和内源性miR-185相互作用，降低与ATR mRNA 3’UTR的靶位点结合的miR-185的量，导致luciferase的表达升高。

上述结果表明，miR-185主要通过和ATR 3’端非转录区域靶位点结合，确切的是与NM_001184.3中是第8165-8186位核苷酸结合(即SEQ NO：3中第8165-8186位核苷酸)，在蛋白水平、RNA水平上抑制ATR基因的表达。miR-185和ATR mRNA3’UTR区域的结合情况如图7D所示。

Claims

1.如下1)、2)、3)或4)或5)所示的物质在如下I、II或III中的应用：

1)SEQ ID NO：1所示的RNA分子；

2)SEQ ID NO：2所示的RNA分子；

3)编码1)所示分子的DNA或表达1)所示分子的载体；

4)编码2)所示分子的DNA或表达2)所示分子的载体；

5)由Ambion公司制造的产品，产品名称为Pre-miR^TM miRNA Precursorhsa-miR-185，产品Cat#：AM17100，产品ID：PM12486，产品规格：5nmol；

II、制备具有治疗和/或预防肿瘤功能产品；

III、制备抑制基因ATR激活或介导的信号通路的产品、制备抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路的产品、制备抑制基因ATR的产品、和/或制备抑制蛋白ATR的产品。

2.基因ATR作为靶点在如下IV或V中的应用；蛋白ATR作为靶点在如下IV或V中的应用；基因ATR激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用；蛋白ATR激活或介导的信号通路作为靶点在如下IV或V中的应用；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能为促进辐射后的细胞的凋亡；

所述治疗和/或预防肿瘤为如下1)或2)或3)或4)所示：1)抑制肿瘤的生长；2)抑制肿瘤的成瘤能力；3)抑制肿瘤细胞的生长；4)辅助增强肿瘤的辐射敏感性。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性功能的产品为辐射增敏剂。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于：所述辐射为非电离辐射或电离辐射；所述非电离辐射为紫外线，所述电离辐射为X射线；所述紫外线为UVA或UVB。

6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制基因ATR激活或介导的信号通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR的表达实现的；

所述治疗和/或预防肿瘤是通过1)、2)、3)、4)或5)所示的物质抑制基因ATR激活或介导的信号通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR的表达实现的。

7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于：所述抑制基因ATR激活或介导的信号通路、抑制蛋白ATR激活或介导的信号通路、抑制基因ATR的表达或抑制蛋白ATR的表达是通过如下方式实现的：所述1)、2)、3)、4)或5)所示的物质与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：所述与所述ATR基因3’端非转录区域靶位点结合为与NM_001184.3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合或与SEQ ID NO：3所示序列中第8165-8186位核苷酸结合。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述细胞为肿瘤细胞；所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌；

所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肿瘤为肾癌、黑色素瘤、宫颈癌或胃癌。

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用，其特征在于：

所述增强细胞和/或组织和/或机体对辐射敏感性中，所述肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-O；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌的细胞为HeLa；所述胃癌的细胞为BGC-823或MGC-803；

所述治疗和/或预防肿瘤中，所述肾癌的细胞为人肾透明细胞腺癌细胞786-O；所述黑色素瘤为小鼠黑色素瘤B16细胞；所述宫颈癌细胞为HeLa；所述胃癌细胞为BGC-823或MGC-803。