CN107099586B - 检测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法、芯片及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法、芯片及用途。通过选择对放射治疗异常敏感和耐受的肺癌细胞，用microRNA表达谱芯片检测两组细胞中microRNA的表达差异，并用Real‑time PCR技术对芯片结果进行了验证，最终筛选出11个表达有显著差异的microRNA。本发明可用于预测肺癌细胞对放射治疗的敏感性。

Description

检测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法、芯片及用途
技术领域
本发明涉及利用miRNA检测肺癌细胞对放射治疗敏感性的方法、芯片及应用。
背景技术
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。根据全国肿瘤防治研究办公室的报告，北京、上海、天津、哈尔滨等城市肺癌的发病率和死亡率为所有恶性肿瘤之首，占全部恶性肿瘤的20％～30％。临床Ⅰ期和Ⅱ期肺癌手术治疗5年生存率约为40％。放射治疗是肺癌治疗的主要手段，约70％的病人需接受放射治疗。在肺癌的放射治疗中，目前仍延续应用几十年一贯的治疗模式，2Gy/次，每周5次，总剂量60～70Gy/6～7周。而事实上不同个体对放射敏感性是存在差异的，在相同的治疗剂量下，有的病人有效、有的病人则无效，有的病人可能出现严重的副作用。如果在治疗前可预测病人对放射的敏感性，那么就可能拟定既对肿瘤有最高疗效又对正常组织损伤最低的放射剂量。然而，目前国内外还没有可用于临床预测放疗敏感性的指标。因此，寻找与放疗敏感性相关的一些生物标志物对改善和指导临床肿瘤放射治疗，增进疗效和降低副作用具有重要的理论意义和实用价值。
microRNA是一类小的(19～24nt)非编码RNAs，负责调控靶基因mRNAs的稳定性或转录效率，在调节细胞增殖、凋亡、发育、分化及代谢等方面发挥重要作用。目前已知541种人类microRNA，最近一项研究预测其数目可能达到1000种。一种microRNA能够调节数百个下游基因，研究预测高达30％的人类基因受microRNA的调节，因此，它们是基因组调节分子中最大的一个家族。人类microRNA的加工由Drosha和Dicer完成，其中Drosha在核中将Pri-microRNA加工成具有发卡结构的长约70nt的Pre-microRNA，然后运至胞浆中由Dicer进一步加工成22nt左右的成熟microRNA。
近几年的发现使microRNA成为分子肿瘤学研究的热点之一。随着microRNA表达谱研究的开始，许多研究工作逐渐将microRNA表达与肿瘤的发生、发展及预后联系起来。microRNA与肿瘤相关的最早证据来自2002年Calin等的研究，他们发现大多数慢性淋巴细胞性白血病患者的miR-15a和miR-16-1表达降低或缺失。2004年，Tadamizawa等首次报道let-7microRNA在肺癌中表达下调。在143例肺癌病人中let-7低表达与术后生存期缩短相关，多变量COX回归分析显示这个预后因素是独立于肿瘤分期的。2005年Iorio等利用芯片技术比较了76例乳腺癌组织和10例正常乳腺组织中microRNA表达差异，其中29个microRNA在肿瘤中表达下调，15个microRNA能将两者正确分开。变异最为明显的microRNA包括miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21，它们的表达与乳腺癌特异的病理参数如ER状态、分期、增殖指数、血管侵润等有关。研究还发现let-7在淋巴结转移或高增殖指数的样品中低表达，提示let-7低表达与不良预后相关，这与肺癌中的报道一致。2006年Yanaihara等采用传统的芯片技术分析104对原发肺癌组织及癌旁组织的microRNA表达，得到一组由42个microRNA构成的组合，能够正确地将肺癌与正常组织分开。通过单变量和多变量分析，发现microRNA表达谱与肺腺癌病人的生存期相关：miR-155的高表达和let-7a-2的低表达与不良预后相关。为了探索microRNA表达谱是否可以用于预测非小细胞肺癌病人的临床结果，2008年Yu等利用Real-time RT-PCR技术检测了112例非小细胞肺癌病人microRNA的表达情况，得到一个可独立预测肿瘤复发及生存期的microRNA组合(hsa-let-7a、hsa-miR-221、hsa-miR-137、hsa-miR-372、hsa-miR-182)。该组合包括hsa-let-7a，与前两个肺癌研究的结果一致，低表达与生存期缩短相关。2008年1月发表在nature上的一篇文章通过芯片技术比较不同转移潜能的乳腺癌细胞系microRNA表达差异，发现一组microRNA在具有转移潜能的乳腺癌细胞中不表达。将这些microRNA导入癌细胞中，可以抑制肿瘤细胞的肺转移和骨转移。导入miR-126后可降低肿瘤的生长和增殖，而导入miR-335后可抑制转移细胞的侵袭，两者均鉴定为人类乳腺癌的转移抑制microRNA。2008年1月blood杂志报道研究者利用芯片技术分析了122例未处理的急性髓细胞样白血病样品中microRNA的表达，发现miR-191和miR-199a高表达的病人总生存期和无病生存期远远低于低表达的病人。
综上所述，microRNA是细胞内一类重要的调节因子，调控许多基因的表达，与肿瘤关系密切，而且一些microRNA的组合可预测肿瘤病人的预后。鉴于此，我们推测microRNA很可能也调控一些与肿瘤放射敏感性相关的基因的表达，可能用来预测肿瘤病人的放疗敏感性。目前microRNA与肿瘤关系的研究大多集中在与肿瘤发生、发展及预后的关系方面，国内外还未见有microRNA与肿瘤放疗敏感性关系的研究报导。
发明内容
在本发明中，发明人通过选择对放射治疗异常敏感和耐受的肺癌细胞，用microRNA表达谱芯片检测了两组细胞microRNA的表达差异，并用Real-time PCR技术对芯片结果进行了验证，最终筛选出11个表达有显著差异的microRNA。基于至少上述内容完成了本发明。
具体地，本发明包括以下几方面。
本发明的一方面，提供检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的非诊断性方法，其包括测量所述待测肺癌细胞中miRNA表达谱的步骤，
其中所述miRNA表达谱由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，(1)所述miRNA表达谱包括has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低；和/或
(2)所述miRNA表达谱包括has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法进一步包括从待测肺癌细胞中提取总RNA的步骤。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法进一步包括将待测肺癌细胞中的miRNA表达谱与标准miRNA表达谱比较的步骤。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，标准miRNA表达谱来自放疗不敏感的肺癌细胞。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，(1)当has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151各自的表达水平小于所述标准miRNA表达谱中对应miRNA的表达水平时为表达变低；和/或
(2)当has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192各自的表达水平大于所述标准miRNA表达谱中对应miRNA的表达水平时为表达变高。
本发明的另一方面，提供判断待测肺癌细胞对x射线放射敏感性发生变化的非诊断性方法，其包括：
测量所述待测肺癌细胞在不同时间点的miRNA表达谱，获得在先miRNA表达谱和在后miRNA表达谱，所述在先miRNA表达谱和所述在后miRNA表达谱各自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，当满足以下条件中的一个或两个时，判断所述待测肺癌细胞对x射线放射的敏感性变强：
(1)与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低，
(2)与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高。
根据本发明的非诊断性方法，优选地，当满足以下条件中的一个或两个时，判断所述待测肺癌细胞对x射线放射的敏感性变弱：
(1’)当与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变高，
(2’)当与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变低。
本发明的其它方面，提供鉴定引起肺癌细胞对x射线放射敏感性发生变化的物质的方法，其包括：
测量在待测物质施用到所述肺癌细胞前后的miRNA表达谱，获得施用前后两种miRNA表达谱，其中所述施用前后两种miRNA表达谱各自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成；
当满足以下条件中的一个或两个时，将所述物质鉴定为引起所述肺癌细胞对x射线放射的敏感性变强的物质：
(1)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低，
(2)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高；
当满足以下条件中的一个或两个时，将所述物质鉴定为引起所述肺癌细胞对x射线放射的敏感性变弱的物质：
(1’)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变高，
(2’)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变低。
本发明的再一方面，提供检测miRNA表达谱的试剂在制备用于预测肺癌细胞对x射线放射敏感性的诊断剂中的用途，其中所述miRNA表达谱由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
本发明的又一方面，提供芯片，所述引物组的各个引物特异性结合选自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成的组中的至少一种；所述探针组的各个探针特异性结合选自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成的组中的至少一种。
本发明的检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的非诊断性方法可用于可预测肺癌细胞对放射治疗的敏感性。通过预测不同肺癌细胞对放射治疗的敏感性，从而为肺癌的个体化放射治疗提供前期的实验基础。本发明的方法可用于治疗前预判对细胞进行x射线放射治疗的有效性。在相同的治疗剂量下，有的病人有效而有的病人则无效，有的病人可能出现严重的副作用。如果在治疗前可预测病人对放射的敏感性，那么就可能拟订即对肿瘤有最高疗效又对正常组织损伤最低的放射剂量。本发明可用于鉴定或筛选引起肺癌细胞对x射线放射敏感性变化的物质，并进一步将其开发为例如用于使肺癌病人脱敏的药物，从而辅助对肺癌病人的x射线放射治疗。本发明可用于判断在治疗过程中个体对x射线放射敏感性是否发生变化，从而能够及时调整治疗方案，避免因个体敏感性发生变化，而使x射线放射治疗无效或使x射线放射治疗恶化的风险。测量miRNA表达水平的方法简单易行，如用Real-time PCR方法检测，所以实用性很强。
附图说明
图1、放疗敏感和不敏感肺癌细胞microRNA表达差异。深色代表高表达，浅色为低表达。其中11个miRNA表达差异有显著意义(敏感细胞为实验组，不敏感细胞为对照组)。
图2、Real-time PCR结果。
图3、x射线照射后细胞增殖能力的变化。
图4、x射线照射后细胞辐射敏感性的变化。
图5、miR-126高表达对辐射诱导的SK-MES-1细胞凋亡的影响(parental位于左侧；vector+miR-126位于右侧)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
如本发明所用术语“miRNA表达谱”，有时也称作“microRNA表达谱”，是指以多种microRNA的表达为特征的指标，其中miRNA表达谱包括多种microRNA的表达以及表达量。miRNA表达谱中的miRNA在对x射线放射敏感的细胞和不敏感的细胞中表达有差异。其中所述差异包括表达的有无，以及表达量的增加或降低。所述差异优选通过统计学计算的显著差异，例如用t-test进行分析时，p<0.05，优选p<0.001，更优选p<0.0008。
根据本发明的一个实施方式，miRNA表达谱由例如表1所示的microRNA组成。
表1
Figure BDA0001278162960000081
Figure BDA0001278162960000091
如本发明所用术语“x射线放射”是指用于疾病例如肿瘤(特别是肺癌)治疗的x射线放射。x射线放射的治疗方式包括目前已知或可推知的任何方式，包括例如2Gy/次，每周5次，总剂量60～70Gy/6～7周。需要说明的是，不同个体之间或相同个体在不同时间段内可存在差异。
在本发明中，检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法包括测量所述待测肺癌细胞中miRNA表达谱的步骤，其可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限于采用MicroRNA表达谱芯片的方法，和Real-time PCR技术等。
作为测量miRNA水平的实例包括与选择性探针的杂交(如，使用RNA印迹法、基于珠的流式细胞仪、寡核苷酸微芯片[微阵列]或溶液杂交试验如AmbionmirVanamiRNA检测试剂盒)、基于聚合酶链式反应(PCR)的检测(如，茎-环反转录-聚合酶链式反应[RT-PCR]、基于定量RT-PCR的阵列法[qPCR-阵列])或通过下一代测序技术之一的直接测序法。
在本发明中，在定量前纯化miRNA。可通过各种方法从样品分离并纯化miRNA，包括使用商品化试剂盒(如，miRNeasy试剂盒[Qiagen]、MirVanaRNA分离试剂盒[Ambion/ABI]、miRACLE[Agilent]、高纯miRNA分离试剂盒[Roche]和miRNA纯化试剂盒[NorgenBiotekCorp])、Trizol提取(参见下述实施例)、基于阴离子交换剂的浓缩和纯化、由RNA结合底物覆盖的磁珠或基于互补寡核苷酸的某一miRNA的吸附。
在本发明中，减少或消除样品中和/或miRNA纯化期间的miRNA降解。用于减少或消除miRNA降解的方法，包括，但不限于，添加RNase抑制剂，使用氯化胍、异硫氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)或其组合。当在miRNA纯化前需要样品储运时减少样品中miRNA的降解特别重要。
需要说明的是，不同的提取纯化方法对于MicroRNA表达谱的测量结果可能略有差异，但并不影响最终的结论。为了消除不同方法产生的此类差异，在同一试验或方法涉及多次测量MicroRNA表达谱的步骤时，优选采用相同的提取或纯化方法。
在本发明中，检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的方法可进一步包括将待测肺癌细胞中的miRNA表达谱与标准miRNA表达谱比较的步骤。优选地，标准miRNA表达谱来自放疗不敏感的肺癌细胞(N-A549)。
在本发明中，标准miRNA表达谱由表1中所示的11种miRNA及其表达量组成。待测肺癌细胞的miRNA表达谱中每一种miRNA的表达量与标准miRNA中对应miRNA的表达量进行比较，并根据比较结果判断对x射线放射敏感性。优选地，has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151各自的表达水平变低时，或者has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192各自的表达水平变高时，认定待测肺癌细胞对x射线放射敏感或者变为敏感。更优选地，当has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151各自的表达水平变低，且has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192各自的表达水平变高时，认定待测肺癌细胞对x射线放射敏感或者变为敏感。
本发明的检测miRNA表达谱的试剂包括用于检测miRNA表达的引物、探针以及提供引物延伸和扩增反应的试剂。其中提供引物延伸和扩增反应的试剂包括逆转录酶、DNA聚合酶(诸如热稳定性DNA聚合酶等)、聚合酶链式反应缓冲液、逆转录缓冲液和脱氧核苷三磷酸(dNTP)。可选地(或另外地)，可包括用于进行杂交分析的试剂。检测试剂可包括核苷酸类似物和/或标记部分，如直接可检测部分如荧光团(荧光染料)或放射性同位素，或者间接可检测部分，如结合对的成员例如生物素，或能够催化非可溶性比色或发光反应的酶。另外，可进一步包括包含用于核酸电泳检测的试剂，此类试剂包括直接检测核酸的那些，如荧光嵌合剂或银染试剂，或用于检测标记的核酸的那些试剂，例如但不限于ECL试剂。在本发明中，可进一步包括miRNA分离或纯化手段以及阳性和阴性对照。
在本发明中，本发明的试剂可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。在超过一种试剂的情况下，各试剂可以单独或混合状态存在。
在本发明中，本发明的试剂还可包括保持或维持DNA或RNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。其可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。
本发明的芯片中包括引物组和/或探针组，所述引物组和/或探针组中的各引物和/或探针特异性结合选自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成的组中的至少一种。
在本发明中，芯片上设置有一系列多重(例如，上千)的微小的寡核苷酸点阵列，这些寡核苷酸点各自包含与本发明所述11种miRNA互补的特异序列(探针或引物)。在高严格条件下探针-靶标杂交后，所得杂交体通常通过定量荧光团、银或化学发光标记的靶标来检测和定量。在本发明中，定制和商购可得的miRNA阵列均可使用。
本发明的鉴定引起肺癌细胞对x射线放射敏感性发生变化的物质的方法中包括测量在待测物质施用到肺癌细胞前后的miRNA表达谱，获得在施用前后两种miRNA表达谱，其中施用前后两种miRNA表达谱各自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
在本发明中，如果与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中，has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低；和/或has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高，则将所述物质鉴定为引起肺癌细胞对x射线放射的敏感性变强的物质。
在本发明中，如果与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中，has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变高；和/或has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变低，则将所述物质鉴定为引起肺癌细胞对x射线放射的敏感性变弱的物质。
实施例1
本实施例中可采用本领域技术内的常规的分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术完整解释于文献中。参见，例如，Sambrook，Fritsch&Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港，NY：冷泉港实验室出版社，1989；DNA克隆：实用方法，第I和II卷(D.N.Glover编辑，1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984)；核酸杂交[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；转录和翻译[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1984)]；B.Perbal，分子克隆实用指南(1984)；Ausubel,F.M.等(编辑)；分子生物学现有操作手册，JohnWiley&Sons,Inc.，1994。
1、标本：选择对放射治疗敏感(S-A549)和放射治疗不敏感的肺癌细胞系(N-A549)，-80℃低温冰箱保存。
2、总RNA提取
1)加入1mL Trizonl(Inivtrogen)试剂，反复吹打细胞数次，使细胞裂解。收集细胞裂解液入离心管中。
2)加入800μl氯仿，振荡，1600g，离心10分钟。
3)吸取上清，加入2.4ml(0.6倍体积)异丙醇。
4)上下转动离心管，强烈混匀。
5)置-72℃冰箱一小时。
6)1600g离心20分钟。
7)小心弃去上清，可见管底有白色沉淀，加入75％乙醇4ml。
8)振荡，1600g离心20分钟。
9)小心弃去上清，倒立离心管于吸水纸上，室温下晾干后，加入200μl经DEPC处理的水溶解沉淀。
3、miRNA芯片杂交
采用美国LC公司的mParafloTM miRNA微流体芯片10.1版本，包含2000个人类miRNA。该芯片基于mParafloTM微流体技术，使阵列上的样品溶液分布均一，同时促进了杂交反应。每张芯片对同一样品重复4次检测。以对放射治疗敏感的肺癌细胞为实验组，以不敏感细胞为对照组，分别取10μg总RNA，用YM-100微孔离心滤器(GE Millipore,Billerica,MA)将其片段化，用poly(A)聚合酶加上poly(A)尾，利用miRCURYTM Array Labelling kit(Ambion)标记Cy3和Cy5荧光。然后进行芯片杂交，杂交液为100μL含25％甲醛的6×SSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HPO4，6mM EDTA，pH 6.8)，反应温度34℃。杂交后的芯片用Genepix 4000B进行图像扫描，采用Genepix Pro 6.0软件进行数据分析。计算两种荧光信号的比值，用t-test进行差异显著性分析，p<0.05为有显著性差异。其中在数据处理时，使用聚类分析方法分析放疗敏感和不敏感细胞MicroRNA表达谱的差异。
4、Real-time PCR验证
4.1 逆转录
取5μg无DNA的总RNA，加水至10μl，加2μl Oligo(dT)或3’primer(50μM)。
70℃，10分钟，立即置冰上2分钟。
按顺序加入下列溶液：
10×PCR Buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTP 1μl
0.1M DTT 2μl
混匀并离心。
37℃保温5分钟，加入1μl Supercript II(200U)，混匀。
37℃保温5分钟，42℃继续保温50分钟。
70℃，15分钟，灭活逆转录酶，可存于-20℃。
加入1μl RNase H，37℃，20分钟。
存于-20℃或者-70℃冰箱中。
4.2 Real-time PCR反应
4.2.1 PCR反应体系
使用的试剂为SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(AppliedBiosystems)配制反应体系。
Figure BDA0001278162960000141
Figure BDA0001278162960000151
4.2.2 PCR反应程序
使用ABI 7500型Real-time扩增仪，两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1(预变性)：95℃10秒，1Cycle；
Stage 2(PCR扩增)：95℃5秒，60℃34秒，40Cycles；
Stage 3(溶解曲线分析，监控PCR反应特异性)：95℃15秒，60℃20秒，95℃15秒。
4.2.3 结果分析
使用SDS 1.2软件，得到Ct值,同一样品重复3次。
实验组ΔCt＝ΔCt(target)-ΔCt(GAPDH)；对照组ΔCt＝ΔCt(target)-ΔCt(GAPDH)；ΔΔCt＝ΔCt(实验)-ΔCt(对照)；
相对表达量＝2-ΔΔCt
5、结果
发现11个microRNA在放疗敏感和不敏感细胞中表达有显著差异，如表2所示。
表2 放射敏感和不敏感肺癌细胞差异表达的microRNA
Figure BDA0001278162960000152
Figure BDA0001278162960000161
实施例2
1、构建miR-126(亦即miRNA-126)的过表达载体，转染SK-MES-1肺癌细胞，以空载和母系作为参照，用MTT实验检测了5Gyx射线照射后细胞增殖能力的变化，发现miR-126高表达显著抑制SK-MES-1细胞的增殖能力(参见图3)。
用克隆形成实验检测0、2、4、8Gy x射线照射后细胞辐射敏感性的变化，发现miR-126高表达显著增加SK-MES-1细胞的辐射敏感性(参见图4)。
随后，检测miR-126高表达对辐射诱导的SK-MES-1细胞凋亡的影响。我们发现，miR-126过表达可以显著促进4Gy和8Gy x射线照射诱导的肺癌细胞的凋亡(P<0.05)(参见图5)。
以上实验表明，miR-126高表达可以增加肿瘤肺癌细胞的辐射敏感性。
2、取对辐射敏感性未知的A549细胞，以与实施例1中类似的方法测量11种miRNA的表达情况，筛选出与上述N-A549细胞相比，has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低以及has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高的A549细胞作为待测细胞。
分别用0Gy、2Gy、4Gy和8Gy x射线照射诱导所述待测细胞、和N-A549，其细胞凋亡(P<0.05)结果如下表3所示。
表3
Figure BDA0001278162960000171
由表3可以看出，通过11种miRNA的表达量的变化可以检测细胞对x射线放射敏感性。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。

Claims (9)

1.一种检测待测肺癌细胞对x射线放射敏感性的非诊断性方法，其特征在于，所述方法包括测量所述待测肺癌细胞中miRNA表达谱的步骤，
其中，所述miRNA表达谱由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
2.根据权利要求1所述的非诊断性方法，其特征在于：
(1)所述miRNA表达谱包括has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低；和/或
(2)所述miRNA表达谱包括has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高。
3.根据权利要求2所述的非诊断性方法，其特征在于，所述方法进一步包括将所述待测肺癌细胞中的miRNA表达谱与标准miRNA表达谱比较的步骤。
4.根据权利要求3所述的非诊断性方法，其特征在于，所述标准miRNA表达谱来自放疗不敏感的肺癌细胞。
5.根据权利要求3或4所述的非诊断性方法，其特征在于：
(1)当has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151各自的表达水平小于所述标准miRNA表达谱中对应miRNA的表达水平时为表达变低；和/或
(2)当has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192各自的表达水平大于所述标准miRNA表达谱中对应miRNA的表达水平时为表达变高。
6.一种判断待测肺癌细胞对x射线放射敏感性发生变化的非诊断性方法，其包括：
测量所述待测肺癌细胞在不同时间点的miRNA表达谱，获得在先miRNA表达谱和在后miRNA表达谱，所述在先miRNA表达谱和所述在后miRNA表达谱各自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
7.根据权利要求6所述的非诊断性方法，其特征在于，当满足以下条件中的一个或两个时，判断所述待测肺癌细胞对x射线放射的敏感性变强：
(1)与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低，
(2)与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高；
当满足以下条件中的一个或两个时，判断所述待测肺癌细胞对x射线放射的敏感性变弱：
(1’)当与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变高，
(2’)当与所述在先miRNA表达谱相比，所述在后miRNA表达谱中的has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变低。
8.一种鉴定引起肺癌细胞对x射线放射敏感性发生变化的物质的方法，其特征在于，所述方法包括：
测量在待测物质施用到所述肺癌细胞前后的miRNA表达谱，获得施用前后两种miRNA表达谱，其中所述施用前后两种miRNA表达谱各自由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成；
当满足以下条件中的一个或两个时，将所述物质鉴定为引起所述肺癌细胞对x射线放射的敏感性变强的物质：
(1)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变低，
(2)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变高；
当满足以下条件中的一个或两个时，将所述物质鉴定为引起所述肺癌细胞对x射线放射的敏感性变弱的物质：
(1’)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22和has-miR-151的表达变高，
(2’)当与施用前的miRNA表达谱相比，施用后的miRNA表达谱中has-miR-126、has-miR96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192的表达变低。
9.一种用于检测miRNA表达谱的试剂在制备用于预测肺癌细胞对x射线放射敏感性的诊断剂中的用途，其特征在于，所述miRNA表达谱由has-miR-130a、has-miR-29a、has-miR-543、has-miR-22、has-miR-151、has-miR-126、has-miR-96、has-miR-let7a、has-miR-216a、has-miR-451和has-miR-192组成。
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