CN101824464A - miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用。它选择临床上对放射治疗异常敏感和高度耐受的肺癌病人，抽取5ml外周血，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA；然后用MicroRNA表达谱芯片杂交：再进行数据处理，用聚类分析方法分析放疗敏感和不敏感病人MicroRNA表达谱的差异；最后用Real-time PCR方法对结果进行验证。本发明人发现的12个miRNA组成的表达谱可调控一些与肿瘤放射敏感性相关的基因的表达，可用来预测肺癌患者对放疗的敏感性，为肺癌的个体化放射治疗提供前期的实验基础。
Description
技术领域
本发明属于医药生物发明技术领域，涉及预测肿瘤放射敏感性的研究方法，更具体的说是miRNA在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用。
背景技术：
肺癌发生于支气管粘膜上皮亦称支气管肺癌。肺癌一般指的是肺实质部的癌症，通常不包含其他如肋膜起源的中胚层肿瘤(mesothelioma)，或者其他恶性肿瘤如类癌(carcinoid)、恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)，或是转移自其他来源的肿瘤。因此我们所说的肺癌，是指来自于支气管(bronchial)或细支气管(bronchiolar)表皮细胞(epithelial cell)的恶性肿瘤，占了肺实质恶性肿瘤的90-95％。肺癌目前是全世界癌症死因的第一名，1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升。而女性得到肺癌的发生率尤其有上升的趋势。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。根据全国肿瘤防治研究办公室的报告，北京、上海、天津、哈尔滨等城市肺癌的发病率和死亡率为所有恶性肿瘤之首，占全部恶性肿瘤的20％-30％。临床I期和II期肺癌手术治疗5年生存率约为40％。放射治疗是肺癌治疗的主要手段，约70％的病人需接受放射治疗。在肺癌的放射治疗中，目前仍延续应用几十年一贯的治疗模式，2Gy/次，每周5次，总剂量60-70Gy/6-7周。而事实上不同个体对肿瘤的放射敏感性是存在差异的，在相同的治疗剂量下，有的病人有效而有的病人则无效，有的病人可能出现严重的副作用。如果在治疗前可预测病人对放射的敏感性，那么就可能拟订即对肿瘤有最高疗效又对正常组织损伤最低的放射剂量。然而，目前国内外还没有可用于临床预测放疗敏感性的指标。随着人类基因组计划的完成和新技术的发展，设计针对个体更具合理的放疗方案，是医学发展的必然趋势。因此，寻找与放疗敏感性相关的一些生物标志物对改善和指导临床肿瘤放射治疗，增进疗效和降低副作用具有重要的理论意义和实用价值。
研究表明microRNA(miRNA)是一类小的(19-24nt)非编码RNAs，负调控靶基因mRNAs的稳定性或转录效率，在调节细胞增殖、凋亡、发育、分化及代谢等方面发挥重要作用。目前已知541个人类microRNA，最近一项研究预测其数目可能达到1000个。一个microRNA能够调节数百个下游基因，研究预测高达30％的人类基因受microRNA的调节，因此它们是基因组调节分子中最大的一个家族。人类microRNA的加工由Drosha和Dicer完成，其中Drosha在核中将Pri-microRNA加工成具有发卡结构的长约70nt的Pre-microRNA，然后运至胞浆中由Dicer进一步加工成22 nt左右的成熟microRNA。
近几年的发现使microRNA成为分子肿瘤学研究的热点之一。随着microRNA表达谱研究的开始，许多研究工作逐渐将microRNA表达与肿瘤的发生、发展及预后联系起来。microRNA与肿瘤相关的最早证据来自2002年Calin等的研究，他们发现大多数慢性淋巴细胞性白血病患者的miR-15a和miR-16-1表达降低或缺失。2004年，Tadamizawa等首次报道let-7microRNA在肺癌中表达下调。在143例肺癌病人中let-7低表达与术后生存期缩短相关，多变量COX回归分析显示这个预后因素是独立于肿瘤分期的。2005年Iorio等利用芯片技术比较了76例乳腺癌组织和10例正常乳腺组织中microRNA表达差异，其中29个microRNA在肿瘤中表达下调，15个microRNA能将两者正确分开。变异最为明显的microRNA包括miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21，它们的表达与乳腺癌特异的病理参数如ER状态、分期、增殖指数、血管侵润等有关。研究还发现let-7在淋巴结转移或高增殖指数的样品中低表达，提示let-7低表达与不良预后相关，这与肺癌中的报道一致。2006年Yanaihara等采用传统的芯片技术分析104对原发肺癌组织及癌旁组织的microRNA表达，得到一组由42个microRNA构成的组合，能够正确地将肺癌与正常组织分开。通过单变量和多变量分析，发现microRNA表达谱与肺腺癌病人的生存期相关：miR-155的高表达和let-7a-2的低表达与不良预后相关。为了探索microRNA表达谱是否可以用于预测非小细胞肺癌病人的临床结果，2008年Yu等利用Real-timeRT-PCR技术检测了112例非小细胞肺癌病人microRNA的表达情况，得到一个可独立预测肿瘤复发及生存期的microRNA组合(hsa-let-7a，hsa-miR-221，hsa-miR-137，hsa-miR-372，hsa-miR-182)。该组合包括hsa-let-7a，与前两个肺癌研究的结果一致，低表达与生存期缩短相关。2008年1月发表在nature上的一篇文章通过芯片技术比较不同转移潜能的乳腺癌细胞系microRNA表达差异，发现一组microRNA在具有转移潜能的乳腺癌细胞中不表达。将这些microRNA导入癌细胞中，可以抑制肿瘤细胞的肺转移和骨转移。其中导入miR-126后可降低肿瘤的生长和增殖，而导入miR-335后可抑制转移细胞的侵袭，两者均鉴定为人类乳腺癌的转移抑制miRNA。同样在2008年1月，blood杂志报道研究者利用芯片技术分析了122例未处理的急性髓细胞样白血病样品中microRNA的表达，发现miR-191和miR-199a高表达的病人总生存期和无病生存期远远低于低表达的病人。
综上所述，miRNA是细胞内一类重要的调节因子，调控许多基因的表达，与肿瘤关系密切，而且一些microRNA的组合可预测肿瘤病人的预后。通过检测miRNA表达谱能够诊断肿瘤，这种诊断手段比传统的基因表达分析具有更高的准确度。鉴于此，本发明人经过了大量的实验研究发现：特定的miRNA表达谱也可调控一些与肿瘤放射敏感性相关的基因的表达，可用来预测肿瘤病人的放疗敏感性。目前microRNA与肿瘤关系的研究大多集中在与肿瘤发生、发展及预后的关系方面，国内外还未见有miRNA表达谱与肿瘤放疗敏感性关系的研究报导，特别是miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是，针对肿瘤病人特别是肺癌患者在相同的治疗剂量下，有的病人有效而有的病人则无效，有的病人可能出现严重的副作用的情况，在治疗前通过miRNA表达谱预测肺癌病人对放射治疗敏感性，即对肿瘤有最高疗效又对正常组织损伤最低的放射剂量。为达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明公开了miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用。本发明所述的miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用中包括：has-miR-130a 、has-miR-106b、has-miR-19b 、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21、has-miR-126、has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b。其中has-miR-130a、has-miR-106b、has-miR-19b、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21、has-miR-126为低表达；has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b为高表达。
更加优选的是放射敏感和不敏感肺癌病人差异microRNA表达谱，低表达has-miR-130a染色体位置为11q12.1、has-miR-106b染色体位置为7q22.1、has-miR-19b染色体位置为13q31.3、has-miR-22染色体位置为17p13.3、has-miR-15b染色体位置3q26.1、has-miR-17-5p染色体位置13q31.3、has-miR-21染色体位置9q22.3；高表达has-miR-126染色体位置为9q34.3、has-miR-let-7a染色体位置为17q23.1、has-miR-495染色体位置为14q32.3、has-miR-451染色体位置为17q11.2、has-miR-128b染色体位置为3p22.3。
本发明所述的miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性的制备方法在于：
(1)选择临床上对放射治疗异常敏感和高度耐受的肺癌病人各30人(没有接受化学治疗)，抽取5ml外周血，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA。
(2)miRNA表达谱芯片杂交：
RNA标记→杂交→信号检测
(3)数据处理，用聚类分析方法分析放疗敏感和不敏感病人MicroRNA表达谱的差异。
(4)用Real-time PCR方法对结果进行验证。
我们把目标锁定为MicroRNA(miRNA)是因为miRNA是一种近年发现的以序列特异性方式调控基因表达的非编码蛋白质的内源性核苷酸。miRNA是通过对基因表达过程中翻译过程的抑制来实现基因表达调控的。它可以抑制蛋白质翻译、剪切mRNA，是动、植物很重要的基因表达调节分子。越来越多的研究表明，miRNA参与了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑肿瘤及白血病在内的多种肿瘤的发生、发展。因此，阐明miRNA在肿瘤发生过程中的作用机制，对癌症的靶基因治疗有着重要的意义。在本发明研究中，我们选择了30例对放射治疗敏感和耐受的肺癌病人，用miRNA表达普芯片检测了两组病人miRNA的表达差异，并用Real-time PCR技术对芯片结果进行了验证，最终筛选出上述12个表达有显著差异的miRNA。其中has-miR-130a、has-miR-106b、has-miR-19b、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21、has-miR-126为低表达；has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b为高表达。
本发明筛选出的12个miRNA碱基序列如下：
| 序号 | miRNA名称 | 序列 |
| 1 | has-miR-130a | 55-cagugcaauguuaaaagggcau-76 |
| 2 | has-miR-106b | 12-uaaagugcugacagugcagau-32 |
| 3 | has-miR-19b | 54-ugugcaaauccaugcaaaacuga-76 |
| 4 | has-miR-22 | 53-aagcugccaguugaagaacugu-74 |
| 序号 | miRNA名称 | 序列 |
| 5 | has-miR-15b | 20-uagcagcacaucaugguuuaca-41 |
| 6 | has-miR-17-5p | 14-caaagugcuuacagugcagguag-36 |
| 7 | has-miR-21 | 8-uagcuuaucagacugauguuga-29 |
| 8 | has-miR-126 | 52-ucguaccgugaguaauaaugcg-73 |
| 9 | has-miR-let-7a | 6-ugagguaguagguuguauaguu-27 |
| 10 | has-miR-495 | 50-aaacaaacauggugcacuucuu-71 |
| 11 | has-miR-451 | 17-aaaccguuaccauuacugaguu-38 |
| 12 | has-miR-128b | 52-ucacagugaaccggucucuuu-72 |
本发明研究发现的12种MicroRNA(miRNA)与放射治疗敏感性之间的关系在于：对放射治疗不敏感和敏感的肺癌病人其miRNA表达谱存在差异，其中本发明发现的12种miRNA表达差异最显著。与对放射治疗不敏感的肺癌病人相比，7种miRNA，即has-miR-130a、has-miR-106b、has-miR-19b、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21在放射治疗敏感病人中显著低表达，5种miRNA，即has-miR-126；has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b在放射治疗敏感病人中显著高表达。
本发明的积极效果：
本发明公开的miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用所具有的优点和特点在于：
目前国内外还没有可用于临床预测放疗敏感性的指标。本发明通过抽血检测肺癌病人这些miRNA的表达高低能预测肺癌病人对放射治疗的敏感性，从而指导医生进行合理的治疗，最大限度的减少对病人的过度治疗和一些不必要的负作用。而且，检测这些miRNA表达水平的方法比较简单，如用Real-time PCR方法检测；此外，血液标本来源丰富，取材简单，对病人身体没有损伤。所以本发明的临床实用性很强。
附图说明：
图1为放疗敏感和不敏感肺癌病人microRNA表达差异。红色代表高表达，绿色为低表达(敏感病人为实验组，不敏感病人为对照组)；
图2为Real-time PCR结果。
具体实施方式：
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合检测实例对本发明做进一步的说明。
实施例1
病人和标本：从合作医院术后接受放射治疗的肺癌病人中选择对放射治疗敏感和耐受的病人各15例，抽取5ml外周血，抗凝，-80℃低温冰箱保存。
2、外周血淋巴细胞分离及总RNA提取
1)在离心管中加入淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)。
2)取EDTA抗凝静脉血与等量生理盐水充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。
3)离心后管内分为三层，上层为血浆和生理盐水，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
4)用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的生理盐水，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。
5)末次离心后，弃上清，加入lmL Trizonl(Inivtrogen)试剂，反复吹打细胞数次，使细胞裂解。收集细胞裂解液入离心管中。
6)加入800μl氯仿，振荡，1600g，离心10分钟。
7)吸取上清，加入2.4ml(0.6倍体积)异丙醇。
8)上下转动离心管，强烈混匀。
9)置-72℃冰箱一小时。
10)1600g离心20分钟。
11)小心弃去上清，可见管底有白色沉淀，加入75％乙醇4ml。
12)振荡，1600g离心20分钟。
13)小心弃去上清，倒立离心管于吸水纸上，室温下晾干后，加入200μl经DEPC处理的水溶解沉淀。
3、miRNA芯片杂交
采用美国LC公司的mParafloTM miRNA微流体芯片10.1版本，包含541个人类miRNA。该芯片基于mParafloTM微流体技术，使阵列上的样品溶液分布均一，同时促进了杂交反应。每张芯片对同一样品重复4次检测。本研究以对放射治疗敏感的肺癌病人为实验组，以不敏感病人为对照组，分别取10μg总RNA，用YM-100微孔离心滤器(GEMillipore，Billerica，MA)将其片段化，用poly(A)聚合酶加上poly(A)尾，利用miRCURYTM Array Labelling kit(Ambion)标记Cy3和Cy5荧光。然后进行芯片杂交，杂交液为100μL含25％甲醛的6×SSPE缓冲液(0.90M NaCl，60mM Na2HP04，6mM EDTA，pH 6.8)，反应温度34℃。杂交后的芯片用Genepix 4000B进行图像扫描，采用GenepixPro 6.0软件进行数据分析。计算两种荧光信号的比值，用t-test进行差异显著性分析，p＜0.05为有显著性差异。
4、Real-time PCR验证
4.1逆转录
1)取5μg无DNA的总RNA，加水至10μl，加2μl Oligo(dT)或3’primer(50μM)。
2)70℃，10分钟，立即置冰上2分钟。
3)按顺序加入下列溶液：
10×PCR Buffer 2μl
25mM MgCl2 2μl
10mM dNTP 1μl
0.1M DTT 2μl
混匀并离心。
4)37℃保温5分钟，加入1μl Supercript II(200U)，混匀。
5)37℃保温5分钟，42℃继续保温50分钟。
6)70℃，15分钟，灭活逆转录酶，可存于-20℃。
7)加入1μl RNase H，37℃，20分钟。
8)存于-20℃或者-70℃冰箱中。
4.2Real-time PCR反应
4.2.1PCR反应体系
使用的试剂为SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)(Applied Biosystems)配制反应体系。
ddH20 10μl
2×SYBR Premix 12.5μl
ROX Reference Dye I 0.5μl
10mM上游引物 0.5μl
10mM下游引物 0.5μl
模版DNA 1μl
总体积 25μl
4.2.2PCR反应程序
使用ABI 7500型Real-time扩增仪，两步法PCR扩增标准程序：
Stage 1(预变性)： 95 ℃10秒，1 Cycle；
Stage 2(PCR扩增)：95 ℃5秒， 60℃ 34秒，40 Cycles；
Stage 3(溶解曲线分析，监控PCR反应特异性)：95 ℃15秒，60 ℃20秒，95 ℃15秒。
4.2.3结果分析
1)使用SDS 1.2软件，得到Ct值，同一样品重复3次。
2)实验组ΔCt＝ΔCt(target)-ΔCt(GAPDH)；对照组ΔCt＝ΔCt(target)-ΔCt(GAPDH)；ΔΔCt＝ΔCt(实验)-ΔCt(对照)；
3)相对表达量＝2-ΔΔCt
5、结果
发现12个microRNA在放疗敏感和不敏感病人中表达有显著差异，如图1图2和表1所示。
表1放射敏感和不敏感肺癌病人差异表达的microRNA.
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
Claims (5)
1.miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性方面的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其中所述的miRNA表达谱为：has-miR-130a、has-miR-106b、has-miR-19b、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21、has-miR-126、has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述的miRNA表达谱中has-miR-130a、has-miR-106b、has-miR-19b、has-miR-22、has-miR-15b、has-miR-17-5p、has-miR-21、has-miR-126为低表达；has-miR-let-7a、has-miR-495、has-miR-451、has-miR-128b为高表达。
4.如权利要求1所述的应用，其中低表达has-miR-130a染色体位置为11q12.1、has-miR-106b染色体位置为7q22.1、has-miR-19b染色体位置为13q31.3、has-miR-22染色体位置为17p13.3、has-miR-15b染色体位置3q26.1、has-miR-17-5p染色体位置13q31.3、has-miR-21染色体位置9q22.3；高表达has-miR-126染色体位置为9q34.3、has-miR-let-7a染色体位置为17q23.1、has-miR-495染色体位置为14q32.3、has-miR-451染色体位置为17q11.2、has-miR-128b染色体位置为3p22.3。
5.如权利要求1所述的应用，其中所述的miRNA表达谱在预测肺癌病人对放射治疗敏感性的方法在于；
(1)选择临床上对放射治疗异常敏感和高度耐受的肺癌病人，抽取5ml外周血，用TRIZOL试剂盒(Invitrogen)提取总RNA；
(2)MicroRNA表达谱芯片杂交：
(3)数据处理，用聚类分析方法分析放疗敏感和不敏感病人MicroRNA表达谱的差异；
(4)用Real-time PCR方法对结果进行验证。
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