CN105709239A - 一种非小细胞肺癌放疗相关的HIF-1α的抑制剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种非小细胞肺癌放疗相关的HIF?1α的抑制剂，内容包括：miRNA?21抑制剂在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF?1α水平的药物中的应用，其中miRNA?21的核苷酸序列为5’?UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA?3’，如SEQ ID NO.1所示。当使用本发明所述的miRNA抑制剂，可以降低具有放疗抵抗性的非小细胞肺癌细胞中HIF?1α含量，从而使得非小细胞肺癌细胞的放射增敏性增高，更有有利于非小细胞肺癌的放射治疗的疗效。

Description

一种非小细胞肺癌放疗相关的HIF-1α的抑制剂

技术领域

本发明涉及医学药物领域，具体涉及一种miRNA-21抑制剂在制备用于降低非小细胞肺癌中HIF-1α水平的药物的应用。

背景技术

miRNAs是功能性非编码RNAs，20-24个核苷酸，在控制目的miRNAs的稳定性和转录效率中起重要作用。成熟的miRNA通过对包括目的基因互补序列及包括3’端非转录区域在内诱导已转录的基因不表达。因此，miRNA异常表达可能影响目的基因的转录，同时进一步影响与癌症相关的信号通路，涉及到细胞周期调控、细胞凋亡、变异、迁移和新陈代谢。肿瘤组织通常表现出功能性miRNA量减少；然而，已有文献显示miRNA-21在癌症发生中发挥作用(oncomiR)，其高度表达与多种癌症相关，包括胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌、颅脑肿瘤、食管癌和前列腺癌。此外，一项早期研究显示：miRNA-21在卵巢癌细胞中可以调节紫杉醇的敏感性，表明miRNA-21在药物耐受性中起着重要作用。

放射治疗广泛用于各种癌症的治疗。尽管放射治疗广泛应用，使许多肿瘤得以缓解，但放射治疗失败的突出表现是肿瘤复发，肿瘤复发大多与肿瘤细胞获得了辐射耐受有关。目前，人类癌细胞放疗抵抗性的详细机制仍不清楚。有报道说磷脂酰肌醇3-激酶/AKT升高可能代表人类肝癌和宫颈癌出现放疗抵抗的发生。此外，一个早期报道显示miRNA-21高表达可能导致乳腺癌细胞放疗抵抗性，因此建议目标基因miRNA-21可以作为攻克放疗抵抗的一种治疗策略。

大多数癌细胞通过无氧糖酵解进行能量供应，这被称为“瓦博格效应”，然而，与线粒体呼吸相比无氧糖酵解产生ATP是低效率的。结果，癌细胞吸收过量的葡萄糖并形成大量的乳酸，这是一个公认的糖降解异常的表现。早期的研究已经表明代谢途径与药物耐药相关，显示癌细胞的代谢失衡可能是开发一种肿瘤治疗的新途径。

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是广泛存在于哺乳动物及人体内的一种转录因子，由α和β两个亚基构成的异二聚体蛋白聚合物，通常情况下，HIF-1β为结构性表达，其水平基本稳定，而HIF-1α受氧浓度的调节并在整个转录过程中起关键作用。缺氧是实体肿瘤微环境特征之一，当氧浓度过低时，HIF-1α表达增加，并通过调控多种靶基因的表达，以适应低氧环境，在肿瘤生长、浸润和转移过程中具有重要作用。研究表明HIF-1α的表达水平升高可导致放疗疗效降低，然而也有部分文献认为HIF-1α并不影响肿瘤细胞的放射敏感性。

目前虽然关于肺癌细胞放射增敏性的报道较多，但是在放疗抵抗的非小细胞肺癌细胞中miRNA-21是如何控制的尚不清楚。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，研究验证了miRNA-21在放疗抵抗中起到的作用并发现糖酵解和放疗抵抗的相关性，提供了相应证据表明非小细胞肺癌细胞中miRNA-21调节放疗抵抗的机制。

本发明采用的技术方案是：

本发明的第一个方面，miRNA-21抑制剂在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF-1α水平的药物中的应用，其中miRNA-21的核苷酸序列为

5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’，如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个方面，一种包含miRNA-21抑制剂的组合物在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF-1α水平的药物中的应用。

优选的，所述非小细胞肺癌细胞具有高HIF-1α水平。

优选的，所述非小细胞肺癌细胞具有辐射耐受性/放疗抵抗性或者所述非小细胞肺癌细胞放射敏感性低。

优选的，所述药物进一步包含药学上可接受的载体。

miRNA-21抑制剂是指降低miRNA-21的细胞内表达或活性的药物。也就是，药物直接作用于miRNA-21或间接作用于miRNA-21的上调物，以在转录水平降低miRNA-21的表达、促进表达的miRNA-21的降解或破坏miRNA-21的活性，从而减少miRNA-21的表达水平或活性。

miRNA-21抑制剂通常为生物分子、化合物或植物、动物中的提取物，它们可以使用本领域的标准技术应用于细胞，比如核酸或者多肽。用于本发明的miRNA-21抑制剂的实例包括与miRNA-21碱基序列互补的反义核酸分子，其核苷酸序列为：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，如SEQ ID NO.2所示。与miRNA-21碱基序列互补的反义核酸分子互补地结合于细胞中miRNA-21的单链片段，以降低miRNA-21的加工效率，从而抑制miRNA-21的表达以及抑制miRNA-21的活性。本发明的miRNA-21的碱基序列互补的反义核酸分子可以使用例如化学合成物或重组的标准分子生物学技术分离或制备物，或者通过商业获得。

本发明的反义核酸分子导入细胞引起具有放疗抵抗的非小细胞肺癌细胞中HIF-1α含量降低。“导入”的含义是将外源DNA或RNA通过转染或转导输送进入非小细胞肺癌细胞。

优选的，所述药物可以进一步包含药学上可接受的载体(vehicle)和用药学上可接受的载体进行配制。只要其确保使本发明的组合物或者miRNA-21抑制剂到达特定的组织，可以采用任意途径给药。例如，本发明的miRNA-21抑制剂可以口服、直肠、局部及外用、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、透皮、鼻内、胸内、眼内或皮内给药。

本发明的有益效果是：

由于肿瘤的异质性，并且不同肿瘤处在不同的生存环境，同一肿瘤细胞中分泌的各种蛋白的调控机理完全不同，多种肿瘤细胞分泌的一种蛋白的调控机理也不完全相同。

本发明经过研究发现，非小细胞肺癌中的miR-21的过度表达激活HIF-1α，从而刺激糖酵解酶的表达。当使用本发明所述的miRNA抑制剂，可以降低具有放疗抵抗的非小细胞肺癌细胞中HIF-1α的含量，从而使得非小细胞肺癌细胞的放射增敏性增高，提高非小细胞肺癌的放射治疗的疗效。

miR-21抑制剂使具有放疗抵抗的癌细胞恢复放疗敏感性，可通过抑制糖酵解介导HIF-1α，根据本发明的应用，为探讨miR–21调节HIF-1α详细机制奠定了良好的基础，更有利于提高肺癌的疗效。

附图说明

图1A～图1C：miR-21在辐射耐受癌细胞中上调，并且与放疗抵抗性呈正相关。图1A：来源于A549肺癌细胞中的辐射耐受细胞的产生，为了产生放疗抵抗癌细胞，在常规细胞培养条件下，对亲代细胞逐渐增加放射剂量，剂量条件：辐射剂量为0,2,4,6,8和10Gy，剂量速率为2Gy/min，检测每个剂量下放疗抵抗克隆情况，放疗抵抗性*P＜0.05和*P＜0.01。图1B：A549亲代细胞和放疗抵抗细胞中的miR-21表达水平，辐射敏感性***P＜0.001。图1C：转染miR-21前体的A549亲代细胞经过48h，随后在0、1、5和10Gy作辐射处理，剂量速率为2Gy/min，然后做细胞生存分析，对照组*P<0.05和**P<0.01。计算数据为平均值±标准误差。

图2A～图2C：辐射耐受细胞具有上调糖酵解的作用。图2A：检测A549亲代细胞和辐射耐受细胞中的葡萄糖消耗量和乳糖生成量；图2B：放疗抵抗性细胞和亲代细胞采用免疫印迹检测己糖激酶(HK)II、丙酮酸激酶(PK)M2和乳酸脱氢酶(LDH)A的上调蛋白质的表达，β-肌动蛋白作为对照组。图2C：在A549亲代细胞和放疗抵抗性细胞中，采用定量逆转录-聚合酶链式反应检测HKII、PDK1和LDHA的mRNA表达水平。数据作为三个独立实验的平均值±标准误差。放射敏感性***P＜0.001。

图3A～图3D：miR-21通过调控HIF-1α来上调糖酵解过程。图3A：A549细胞转染miR-21，48h，收集细胞然后采用免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为对照组。图3B：转染miR-21后，检测A549细胞和对照组的细胞中的葡萄糖的消耗量和乳酸产生量，对照组***P＜0.001。图3C：采用免疫印迹检测，随着小干扰RNA对转染细胞中的HIF-1α的干扰，HIF-1α在转染miR-21的细胞和对照细胞的表达水平下调，β-肌动蛋白作为对照组。图3D：葡萄糖的消耗量和乳酸的生成量的检测，对照组miR、前体miR-21或者是前体miR-21加siHIF-1α，计算数据为平均值±标准误差，***P＜0.001，HKⅡ：己糖激酶2、PKM2、丙酮酸激酶M2，LDHA：乳糖酸脱氢酶。

图4A～图4D：miR-21的抑制剂抑制糖酵解和增强A549细胞的放射敏感性。图4A：转染对照组miRNA或反义的miR-21，测其在A549细胞的表达水平；图4B：葡萄糖消耗量和图4C：乳酸生成量，在转染对照组miRNA或反义的miR-21的细胞中，对照组*P<0.05，**P<0.01和***P<0.001；图4D：转染对照组miRNA或反义的miR-21的A549亲代细胞，转染时间48h，然后进行照射处理，剂量：0,0.5,1,2,4 and 6Gy，剂量速率2Gy/min，然后显示细胞生存分析。反义miR-21*P<0.05，计算数据为平均值±标准误差。

图5A～图5D：复敏的放疗抵抗性细胞通过抑制miR-21来调控HIF-1α。图5A：miR-21在转染了对照miRNA或反义miRNA-21的A549放疗抵抗性细胞的表达水平，对照***P<0.001。图5B：转染对照组miR或反义的miR-21的A549放疗抵抗性细胞，转染时间48h，然后进行照射处理，剂量：0,0.5,1,2,4 and 6Gy，剂量速率2Gy/min，然后显示细胞生存分析。对照*P<0.05,**P<0.01。图5C：HIF-1α、己糖激酶(HK)Ⅱ、丙酮酸激酶(PK)M2和乳酸脱氢酶(LDH)A的蛋白质的表达，在转染了反义的miR-21的HIF-1α过表达，检测方法：免疫印迹检测，β-肌动蛋白作为对照组；图5D：转染反义的miR-21或反义的miR-21加HIF-1α的A549放疗抵抗性细胞，转染时间48h，然后进行照射处理，剂量：0,0.5,1,2,4 and 6Gy，剂量速率2Gy/min，然后显示细胞生存分析。反义的miR-21*P<0.05,**P<0.01。

具体实施方式

实施例1

1.材料与方法

1.1 细胞培养及放疗处理

A549肺癌细胞从美国标准菌库获得(Manassas，VA，USA)，在RPMI-1640培养基中培养(Gibco；热费希尔科学公司，沃尔瑟姆，MA，USA)补充10％牛胎儿血清(热费希尔科学公司)和抗生素(Gibco抗生素-抗真菌包含两性霉素B，青霉素和链霉素；Gibco；热费希尔科学公司)，放于含5％CO₂的恒湿培养箱。当细胞浓度达到5×10⁵时，暴露不同剂量进行照射(0,0.5,1,2,4,5,6,8 and 10Gy)，使用Cs-137照射装置(HWM D-2000；西门子，Waltershausen，德国)，剂量率为2Gy/min。射线照射控制室温，细胞随后在37℃下培养，用于随后的实验。

1.2 抗体

下面的抗体用于本研究：己糖激酶抗体2(HKⅡ)(cat.no.2867)，丙酮酸激酶抗体(PK)M2(cat.no.4053)，乳酸脱氢酶抗体(LDH)A(cat.no.2012),β-actin抗体(cat.no.4967)(细胞信号技术,Inc.,丹弗斯,MA,USA)，缺氧诱导因子抗体(HIF)1α(cat.no.sc-10790；圣克鲁斯生物技术有限公司、达拉斯、TX,USA)。

1.3 小干扰RNA(si)和质粒DNA转染

HIF-1α小干扰RNA(si)序列(cat.no.106498)，阴性对照组的核小干扰RNA(si)从Ambion购买(热费希尔科学有限公司)。细胞按1×10⁵cells/well接种在6孔培养基培养。包含野生型HIF-1α质粒载体从Addgene(坎布里奇，MA，USA)购买。转染了使用2000和Opti–MEM I低蛋白血清培养基(英杰公司；热费希尔科学有限公司)，根据制造商的操作规范使用。转染是37℃条件下进行，小干扰RNA(si)或载体的体积和Lipofectamine使用100nM RNA(si)或载体和5μl Lipofectamine，每个单独转染。转染48小时后，细胞用于进一步分析。

1.4 miRNA转染

miRNA-21启动子和反义序列由GenePharma有限公司(Shanghai,China)化学合成。1×10⁵细胞接种在6孔细胞培养，过夜。细胞使用200nM pre-miR-21转染，抑制剂或阴性对照，使用2000和Opti-MEM I降低培养基中血清，按照生产厂家的要求操作。转染后48小时，细胞用于进一步的分析。

1.5 细胞活性检测

上述细胞控制含量为5×10³接种到96孔平板培养基。随着细胞粘附，细胞暴露在不同剂量下进行照射。照射后，20μl 5mg/ml的溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑(MTT；西格玛奥德里奇，圣路易斯，MO，USA)添加到每个孔中。随后在37℃下培养4小时，培养基少量通气并采用150μl二甲基亚砜替代。每个孔的吸光度使用Elx800分光光度计(美国博腾仪器有限公司，Winooski,VT,USA)在570nm条件下测定吸光值。本实验进行三次重复试验。

1.6 RNA提取和反转录-定量PCR(RT-qPCR)

细胞中提出的全部RNA都是使用Absolutely RNA RT-PCR试剂盒(安捷伦科技有限公司，Santa Clara,CA,USA)，并严格按照厂家使用规范进行操作。全部RNA浓度使用NanoDrop 2000分光光度计(热费希尔科学有限公司)调整为2ng/μl。全部RNA(1μg)使用高通量的cDNA反转录试剂盒(美国应用系统生物公司；热费希尔科学有限公司)。得到的cDNA随后按1:10稀释后作为RT-qPCR的模板。PCR扩增在最终的反应体积为10μl：5.5μl TaqMan Universal PCR Master mix(美国应用系统生物公司)，0.5μl引物和探针混合物及4.5μlcDNA。循环条件如下：一个循环为50℃、2min，一个循环为95℃、10min，随后是进行40个周期的变性(95℃、15sec)，最终60℃、1min完成退火。所有的反应都使用theStep One Plus Real-Time PCR Systems Thermocycler(美国应用系统生物公司)。所有的qPCR反应均进行三次实验，并进行了至少2次重复。mRNA表达量ΔCquantification(ΔCq)以18S核糖核苷酸量Cq来计算。mRNA相对表达量采用公式来计算。用于qPCR的引物如下：LDHA(乳酸脱氢酶)，正向：ATC TTG ACC TAC GTG GCT TGGA,如SEQ ID NO.3所示，反向：CCA TAC AGG CAC ACT GGA ATCTC,如SEQ ID NO.4所示；HKII,正向：CAA AGTGAC AGT GGG TGTGG，如SEQ ID NO.5所示，反向：GCC AGG TCC TTC ACT GTCTC，如SEQ ID NO.6所示；PKM2,正向：GAG GCC TCC TTC AAG TGCT，如SEQ ID NO.7所示，反向：CCA GAC TTG GTG AGG ACGAT，如SEQ ID NO.8所示。RT-qPCR定量测定使用TaqMan-miRNA assay(美国应用系统生物公司)，用来测定miR-21(cat.no.4427975；assay ID 000397)表达水平，测定过程使用前文中所述循环条件。qPCR过程按照厂家操作流程使用the Step One Plus Real-Time PCR Systems Thermocycler(美国应用系统生物公司)。具体miRNA相对表达量的值使用方法来算，标准miRNA(GAPDH:正向：5'-AAT CCC ATCACC ATC TTCCA-3'，如SEQ ID NO.9所示，反向：5'-TGG ACT CCA CGA CGT ACTCA-3',如SEQ ID NO.10所示)。所有的反应都至少进行两次重复。

1.7 葡萄糖降解和乳酸生成的测量

细胞在6孔平板上，按5×10⁵cells/well浓度接种在3ml的培养基中。培养液和蒸馏水按1:20比例混合(培养液：蒸馏水)。稀释后培养液中葡萄糖浓度使用the Glucose Assay kit(Sigma-Aldrich)试剂盒按照厂家使用规范进行测定。葡萄糖的消耗通过新鲜细胞培养基中的浓度减去培养24h后培养基中剩余葡萄糖量计算。乳酸浓度的测定通过a Lactate Assay kit(BioVision,Mountain View,CA,USA)试剂盒测定，操作过程按照厂家规范进行。在96孔平板中准备乳酸和乳酸标准样品与乳酸测定缓冲液。随后，每个孔中加入50μl乳酸混合酶，在室温下反应30min。使用酶标仪在570nm波长下测定光密度值(SpectraMax M2e；MolecularDevices,LLC,Sunnyvale,CA,USA)。标准的总量蛋白与控制细胞进行对比。

1.8 蛋白质免疫印迹分析

收集细胞，然后采用冰磷酸缓冲液(PBS)进行洗涤。通过细胞的再悬浮在放射免疫反应检测缓冲液(10mM Tris(pH 7.4),150mM NaCl,1％Triton X-100,1％脱氧胆酸钠(卡诺化工有限公司,日本东京)和5mLEDTA补充蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich)得到细胞溶解产物。溶解细胞中的蛋白质的浓度通过Bradford检测采用Bradford试剂盒((碧云天生物技术研究所上海，中国)，Bradford试剂盒采用10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出相等数量的蛋白质(1μg/μl)，然后将该蛋白质转移至聚乙二烯氟化物膜(由Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA提供)。采用5％的脱脂牛奶将该膜封闭，加入羊抗多隆抗体(1:1000稀释)，4℃孵化过夜，然后采用PBS缓冲液和Tween20的混合液冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G二级抗体(1:3000，cat.no.,7074，购自Nichirei Biosciences,Inc.,Tokyo,Japan)后，在室温下孵化1h，采用Chemi-Lumi One L蛋白免疫印迹基质显示蛋白条带。

1.9 统计学处理

计量数据以表示，采用SPSS11.5.0(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA,USA)统计软件进行t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 miR-21在耐辐射的肺癌细胞中的表达水平更高

根据一项研究，经过研究miR-21与和辐射敏感性的关系，使用A549作为亲代细胞，具有放疗抵抗性的非小细胞肺癌细胞产生。为了产生抗辐射细胞，这些细胞增加辐射剂量治疗4个月。这些克隆的细胞不断地发展和汇集。为了确认这些细胞是具有放疗抵抗性的，将A549亲代细胞和辐射耐受细胞通过不同剂量的照射。采用MTT分析，照射72h后的细胞增殖情况如图1A所示。具有放疗抵抗性的细胞可以忍受高强度的射线照射。此外，相比于放射敏感性的细胞，在放疗抵抗性细胞中的miR-21的表达水平显著提高，如图1B所示。因此，认为在非小肺癌细胞中，miR-21可能导致放疗抵抗性。为了确认以上观点，将A549细胞转染miR-21使miR-21过表达。测量上述没有和将其采用指定剂量后而过表达的放射敏感性的A549细胞的情况。如图1C显示，在转染了miR-21后A549细胞的生存能力提高，这些数据证明，miR-21和肺癌细胞的放射敏感性之间具有非常密切的关系，所以认为miR-21可能是攻克肿瘤放疗抵抗性的一个新途径。

2.2 辐射耐受的肺癌细胞可以上调糖酵解的过程

在癌症中，无氧糖酵解的增强和放疗抵抗性同时存在。为了确定miR-21促进肿瘤细胞放疗抵抗性的机制，分别检测放射敏感性和抵抗性的A548细胞的糖酵解速率，测定葡萄糖的消耗量和乳酸的产生量。图2A显示，在放疗抵抗性细胞中具有葡糖糖消耗和乳酸产生的现象，从而表明无氧糖酵解的发生与放疗抵抗性具有一定的联系。此外，本发明还对糖酵解的相关酶进行了检测。如图2B和图2C所示，在放疗抵抗性细胞中HKII、PKM2和LDHA的酶和mRNA的表达水平被调节。这些结果表明，在转录水平上调节相关的糖酵解的酶介导miR-21引起的糖酵解的增强。

2.3 通过调节HIF-1α使miR-21促进糖酵解

本发明进一步探索放疗抵抗性细胞中miR-21介导的转录调节糖酵解的关键酶的机制，经过检索文献，HIF-1α是由缺氧生长因子和致癌基因诱导的杂合转录因子。之前就有报道称，在缺氧条件下可以激活HIF-1α，刺激随后的靶基因的转录，包括LDHA和HKII。在本发明的研究中，在放疗抵抗性细胞中HIF-1α被激活，并且在促进下游糖酵解酶的表达中发挥重要作用。探究miR-21是否影响HIF-1α的表达，A549放射性敏感细胞和放疗抵抗性细胞分别被miR-21转染或控制在两种细胞的表达量，然后检测HIF-1α和糖酵解关键酶的含量，并同时检测葡萄糖的消耗量和乳酸的产生量。按照假设，miR-21过量表达会显著增高HIF-1α的表达水平和糖酵解的关键酶，如图3A所示。与上述结论相一致，随着转染miR-21，葡糖糖的消耗和乳酸的生成也是显著升高的，如图3B所示。为了确定，miR-21是通过调节HIF-1α来促进非小肺癌细胞的糖酵解的过程，在转染miR-21和核小RNA中HIF-1α表达沉默，如图3C所示。随着HIF-1α的抑制，葡糖糖的消耗量和乳酸的产生量也下调，如图3D所示。这些结果显示，在肿瘤细胞放疗抵抗性的机制上，miR-21和HIF-1α具有一定的联系。

2.4 通过抑制放射敏感肺癌细胞miR-21来抑制糖酵解的过程

为了确定miR-21抑制剂是否能够提高非小细胞肺癌细胞的放疗敏感性，将A549细胞转染反义寡核苷酸目标miR-21或者错义miRNA对照组(图4A)。在转染48h之后，检测糖酵解过程。miR-21的抑制剂抑制糖酵解过程，这个过程检测的是葡糖糖消耗量和乳酸的生成量(图4B和图4C)。此外，A549细胞转染反义miR-21或者对照miRNA进行照射处理，照射剂量：0、0.5、1、2、4和6Gy)，剂量速度：2Gy/min，然后进行细胞生存分析。于对照组相比较(图4D)，转染反义miR-21的细胞生存数量明显降低。这些数据表明，miR-21的表达与γ辐射A549细胞的敏感性之间具有密切联系。

通过调节HIF-1α抑制miR-21使肺癌细胞对辐射恢复敏感性。进一步研究miR-21是否能够调节非小细胞肺癌细胞的辐射敏感性，A549放疗抵抗性细胞转染miR–21抑制或阴性对照(图5A～图5B)。与阴性对照组转染细胞对比，抑制miR-21明显增加了放疗抵抗性的细胞对辐射的敏感性，而负调控转染细胞。抗miR-21转染A549细胞的最大抑制浓度(IC50)一半出现在2Gy，这低于IC50阴性对照组的转染细胞A549细胞，阴性对照组的转染细胞出现在15Gy(图5B)。为确定HIF-1α和反-miR-21诱导敏感性的相关性，为了恢复它的功能，反-miR-21转染A549细胞暂时转染一种含野生型HIF-1α超表达载体。随着HIF-1α的恢复，糖酵解的关键酶的表达水平恢复(图5A～图5B)。此外，确定了在不同剂量的射线照射下HIF-1α-转染放疗抵抗性细胞的敏感性。如图5D所示，HIF-1α-转染的A549放疗抵抗性细胞恢复了辐射敏感性。这些结果表明，通过负调控HIF-1α，抑制miR-21调节的A549细胞由放疗抵抗性转变成敏感性。

3.结论

本研究表明在非小细胞肺癌细胞获得放疗抵抗性过程中，miR-21增强了细胞的糖酵解。癌细胞利用无氧糖酵解维持其生长，并积极抑制氧化磷酸化，这是由于异常的糖酵解酶调节的结果。本研究表明，放疗抵抗性的癌细胞中糖酵解受到了调节，这表明特定的抑制糖酵解可能有助于攻克细胞的抗辐射性。之前就有报道称，电离辐射和各种化疗药物在目标细胞中会诱导氧化应激，导致基因组不稳定性和脂质过氧化。此外，有研究显示癌细胞通过糖酵解产生的过多乳酸作为一种抗氧化剂起作用。

miR-21逆转录增强已经在人类多种癌症中检测到。有报道显示与正常组织相比肺癌的血清样本中miR-21表达更高，血清中高miR-21含量与肺癌关系密切。此外，miR-21与药物耐药性和辐射抵抗性有关。一项研究表明射线照射后，在人类肝癌细胞中miR-21含量上升(26)。有研究显示在人类卵巢癌细胞中miR-21调节紫杉醇活性。本研究揭示了miR-21在放疗敏感的和放疗抵抗的非小细胞肺癌细胞暴露于γ-射线后的表达。结果表明非小细胞肺癌在抗辐射过程中miR-21含量上升，抑制miR-21可以使放疗抵抗性细胞复敏，与早期报道一致。这些资料显示miR-21不仅与肿瘤的发生有关，还可以作为放疗抵抗的miRNA，这可以认为是一种抗癌药物开发的新方向。

公认的靶标miR-21得以甄别，HIF-1α作为潜在的攻克方向得以证明。HIF-1α是一个多功能的转录因子，证明可以以生长因子依赖的方式调节葡萄糖代谢。本研究显示HIF-1α可能导致细胞形成放疗抵抗性。HIF-1α是糖酵解的前期信号分子，HIF-1α升高促进糖酵解。本研究显示HIF-1α升高受miR–21调控，进一步导致促进糖酵解的关键酶升高。通过小干扰siRNA抑制糖酵解从而抑制HIF-1α，癌细胞对辐射复敏，从而表明miR-21通过上调HIF-1α诱导放疗抵抗性。然而，miR–21调节HIF-1α详细机制尚不清楚。我们的下一个项目是研究这种表型，并确定miR–21调节HIF-1α的过程。

总之,目前的研究发现miR-21的升高和放疗抵抗性的非小细胞肺癌细胞之间有很强的相关性。此外，miR-21的过度表达激活HIF-1α，从而刺激糖酵解酶的表达。值得注意的是,通过抑制糖酵解介导HIF-1α，从而抑制miR-21，使具有放疗抵抗性的癌细胞恢复放疗敏感性。目前的研究显示使放疗抵抗的癌细胞恢复放疗敏感性是与miR-21相关的。

Claims (6)

1.miRNA-21抑制剂在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF-1α水平的药物中的应用，其中，miRNA-21的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述非小细胞肺癌细胞具有高HIF-1α水平。

3.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述非小细胞肺癌细胞具有放疗抵抗性。

4.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述miRNA-21抑制剂为SEQ ID NO.2所示的寡核苷酸。

5.如权利要求1所述的应用，其特征是：所述药物进一步包含药学上可接受的载体。

6.一种包含权利要求1～5中任一项所述的miRNA-21抑制剂的组合物在制备用于降低非小细胞肺癌细胞中HIF-1α水平的药物中的应用。