CN112063716A - 一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，通过评估肺癌耐药和转移高风险miRNAs来评估化疗过程中发生耐药和转移风险的检测试剂盒。本发明中揭示了肺癌体内的一些特异性高表达的MicroRNAs（miRNAs）对肺癌化疗耐药的影响，由此可以通过检测这些miRNAs的表达水平来监测化疗用药效果情况，适时调整用药，延长化疗维持的时间，进而提高生存率。本发明旨在为评估肺癌化疗中耐药和转移发生风险提供一种新的监测方法，不仅能够对肺癌化疗效果进行检测，而且还可对预后进行评估，同时也为抗癌药物的研发提供重要的miRNAs靶点，有效改善肺癌的生存质量。

Description

一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒。
背景技术
肺癌是一个重大的全球健康问题，目前仍是全世界最常见癌症致死原因之一，非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的一种，其五年生存率低于15％。尽管在手术、放疗、化疗和靶向治疗等治疗方面取得了较大进展，但由于大多数在之后化疗过程中出现耐药和转移，导致很难进一步维持治疗下去，预后仍然很差。因此，需要一些指标来衡量和预估化疗过程中的有效程度，而在化疗的过程中体内的miRNAs水平通常会发生改变，已有很多研究证明，miRNAs的变化与肿瘤化疗耐药和肿瘤转移息息相关，这提示我们在临床可以对miRNAs进行监测，从而指导化疗用药。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由18-25个核苷酸组成的小RNA，其不编码蛋白质，而对基因的转录与翻译起重要的调控作用。miRNAs的序列具有高度的物种保守性，其表达具有独特的时间特异性和空间特异性。已经证明，miRNAs在胚胎发育、组织分化、细胞代谢、信号通路控制等生理过程中发挥巨大的调控作用，特别是部分miRNAs被发现具有肿瘤抑制因子或原癌基因的功能，在癌症及其他疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用。因此，miRNAs作为非编码RNA的代表，是当今分子生物学和表观遗传学研究的热门方向之一。而我们发现在肺癌体内某些miRNAs的高表达，与肿瘤转移和化疗耐药密切相关。
目前化疗依然是肺癌基础治疗的主要手段，而化疗过程中耐药和转移的发生和进展往往是阻碍其疗效的最大障碍，但是现如今并没有有效控制耐药和转移发生的方法，只能早发现，适时调整用药或联合用药来改善治疗效果，但很多时候临床上不能很好的判断耐药和转移的发生，使得肿瘤的发展有了进一步发展的机会。本发明综合考虑实用性和有效性，利用对临床miRNAs含量长期的监测分析，发现了一些在肺癌耐药及转移病人体内高表达的miRNAs，称为耐药高风险miRNAs，从而开发出了检测分析高风险miRNAs组合的检测试剂盒，方便实时监测评估受检者的耐药情况。
本发明针对在肺癌耐药和转移特异性高表达的一些miRNAs(称为耐药高风险miRNAs)，制造出一种可以检测这些miRNAs在肺癌体内表达情况的试剂盒，用于监测肺癌化疗过程中出现耐药及转移的风险，并可对预后进行评估。试剂盒主要包括三部分：针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒、针对外周血液的实时荧光PCR检测试剂盒和一个特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序。主要检测的高风险miRNAs如下：miR-324-5p、miR-210-3p、miR-421、miR-21、miR-661、miR-106a、miR-27a、miR-346及miR-423-3p。通过对肺癌瘤组织和外周血检测的双重检测手段和多种高风险miRNAs组合的信息支持及分级定性程序来评估耐药和转移发生的风险。
发明内容
本发明提供一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，解决现有技术中的临床上不能很好的判断耐药和转移的发生等技术问题。
本发明采用以下技术方案：一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，包括三部分：
针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒、针对外周血液的实时荧光PCR检测试剂盒和一个特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序；所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒检测的高风险miRNAs如下：miR-324-5p、miR-210-3p、miR-421、miR-21、miR-661、miR-106a、miR-27a、miR-346及miR-423-3p。
一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步，针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒：组织称重，加1ml TRizol/50mg试剂，混匀，冰上放置裂解5min；
第二步：加氯仿200μl/ml TRizol，剧烈摇匀，使其呈乳浊液，静置5min；
第三步：12000g，4度离心，15min；
第四步：吸取上清至另一EP管，加入等体积预冷异丙醇，混匀；
第五步：2000g，4度离心，15min；
第六步：弃上清，加1ml 75％乙醇，洗涤沉淀，7500g，4度离心，10min；
第七步：吸净上清，晾干酒精；
第八步：加RNase-free water溶解RNA；
第九步：测定总RNA浓度；
第十步：取1μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十一步，针对外周血液的实时荧光定量PCR检测试剂盒：取新鲜的全血200-800ul，加入10倍体积的TRIzol，充分吹打混匀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
第十二步：每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿，静置3min，离心12000g，4℃，15min；
第十三步：将上层水相转移到1.5ml EP管中，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，离心12000g，4℃，10min，弃上清；
第十四步：加入1ml的75％乙醇，上下颠倒10次，离心7500g，4℃，10min，弃上清；
第十五步：室温下干燥5-10min(充分干燥不好溶解)，加入40ul的RNase-free-water充分溶解RNA，可在60℃水浴锅中促溶10min；
第十六步：测定总RNA浓度；
第十七步：取1μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十八步：上述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测；
第十九步：特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序分析。
作为本发明的一种优选技术方案：所述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测。
作为本发明的一种优选技术方案：所述上机检测，以内参的循环数作为对照，计算2∧-△ΔCT，再进行统计学分析。
作为本发明的一种优选技术方案：所述特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序为根据对已有数据的临床前瞻性研究，依据统计数据中ROC曲线的曲线下面积(AreaUnder the Curve，AUC)以及P值对高危miRNAs进行分级。
作为本发明的一种优选技术方案：所述AUC越大，提示指标的诊断能力越好，而p值主要用于衡量一次错误发生的指标。
作为本发明的一种优选技术方案：所述检测肿瘤组织内高危miRNAs的表达情况来预测受检者对目前化疗用药是否产生耐药或预测该受检者是否易产生耐药，步骤为检测肺癌患者肺癌组织中9种高危miRNA对比正常人的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的耐药评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则改患者仍旧耐药评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于3；反之耐药评分为0。
作为本发明的一种优选技术方案：所述检测外周血液内高危miRNAs的表达情况来预测受检者在化疗过程中是否易发生耐药，步骤为检测肺癌患者外周血中9种高危miRNA对比正常人外周血的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的转移评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则改患者仍旧转移评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于3；反之转移评分为0。
作为本发明的一种优选技术方案：所述检测结果综合分析以评估耐药风险及预后的流程为计算患者耐药评分和转移评分之和，若总分大于10，则说明患者预后差，转移和耐药风险高；若总分大于3小于等于10之间，则说明患者耐药和转移风险适中，需要考虑调整用药；若总分小于等于3，则说明耐药及转移风险小，预后好。
有益效果：
本发明所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
1、一种通过检测肺癌体内的耐药高风险miRNAs来评估耐药及转移的情况的方法，填补了目前针对肺癌耐药及转移缺乏有效的监测方法的空白；
2、且主要依托于miRNAs的检测，是一种相对便捷的方式；
3、在兼顾了准确率的同时考虑到操作的可行性；
4、独创性地采用了回顾式研究的方法发现了发生耐药或转移的乳腺癌体内的高危miRNAs；
5、对比正常体内表达水平进行分级以便评估的方法。
6、同时制定了基于临床前瞻性的预测性程序兼顾了检测的稳定性和均一性。
附图说明
图1是本申请中miR-661在肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异图。
图2是本申请中miR-421在正常人和肺癌病人血清中的表达图。
图3是本申请肿瘤组织内miRNA含量确定耐药评分的程序图。
图4是本申请外周血液内miRNA含量确定转移评分的程序图。
图5是本申请综合两种检测结果进行评估的程序图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明作进一步的描述，实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利要求范围内。。
实施例1：
一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，包括三部分：针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒、针对外周血液的实时荧光PCR检测试剂盒和一个特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序；所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒检测的高风险miRNAs如下：miR-324-5p、miR-210-3p、miR-421、miR-21、miR-661、miR-106a、miR-27a、miR-346及miR-423-3p。
取临床肺癌瘤组织和外周血用试剂盒进行分析，综合两者结果对化疗过程中耐药和转移及预后风险进行评估。
通过检测受试者体内高风险miRNAs组合对比正常体内的水平，从而对受检者耐药风险进行评估。对高风险miRNAs组合的选取主要是基于前期肺癌癌组织、癌旁组织、外周血液样本和正常人血液样本的回顾性研究，从而制定出判断的具体评估指南。
所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，步骤为：
第一步，针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒：组织称重，加1ml TRizol/50mg试剂，混匀，冰上放置裂解5min；
第二步：加氯仿200μl/ml TRizol，剧烈摇匀，使其呈乳浊液，静置5min；
第三步：12000g，4度离心，15min；
第四步：吸取上清至另一EP管，加入等体积预冷异丙醇，混匀；
第五步：2000g，4度离心，15min；
第六步：弃上清，加1ml 75％乙醇，洗涤沉淀，7500g，4度离心，10min；
第七步：吸净上清，晾干酒精；
第八步：加RNase-free water溶解RNA；
第九步：测定总RNA浓度；
第十步：取1μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十一步，针对外周血液的实时荧光定量PCR检测试剂盒：取新鲜的全血200-800ul，加入10倍体积的TRIzol，充分吹打混匀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
第十二步：每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿，静置3min，离心12000g，4℃，15min；
第十三步：将上层水相转移到1.5ml EP管中，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，离心12000g，4℃，10min，弃上清；
第十四步：加入1ml的75％乙醇，上下颠倒10次，离心7500g，4℃，10min，弃上清；
第十五步：室温下干燥5-10min(充分干燥不好溶解)，加入40ul的RNase-free-water充分溶解RNA，可在60℃水浴锅中促溶10min；
第十六步：测定总RNA浓度；
第十七步：取1μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十八步：上述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测；以内参的循环数作为对照，计算2∧-ΔΔCT，再进行统计学分析。引物序列如下：
表1：扩增引物序列
Figure BDA0002673271050000071
Figure BDA0002673271050000081
第十九步：特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序分析：
根据对已有数据的临床前瞻性研究，依据统计数据中ROC曲线的曲线下面积(AreaUnder the Curve，AUC)以及P值对高危miRNAs进行分级。AUC越大，提示指标的诊断能力越好，而p值主要用于衡量一次错误发生的指标，引入这两种统计学概念主要是为了保证纳入高风险miRNAs的准确性和有效性，避免使用我们试剂盒及相关程序的过程中发生假阳性及假阴性的发生。
表2：高危miRNAs的分级标准
Figure BDA0002673271050000082
注：危险级别由A到C依次下降
如图1所示：miR-661在肿瘤组织和癌旁组织中的表达差异；对比正常肺组织miR-661在肺癌组织中高表达。
如图2所示：miR-421在正常人和肺癌病人血清中的表达；建对比正常人miR-421在肺癌患者血清中高表达。
结合回顾性研究的结果，我们认为对比正常人体内的高危miRNAs水平高于2.5倍即存在耐药和转移风险，我们设计了如下两个程序，来分别检测受检者耐药和转移的风险。
检测肿瘤组织内高危miRNAs的表达情况来预测受检者对目前化疗用药是否产生耐药或预测该受检者是否易产生耐药，流程大致如图3所示：肿瘤组织内miRNA含量确定耐药评分的程序，检测肺癌患者肺癌组织中9种高危miRNA对比正常人的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的耐药评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则改患者仍旧耐药评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于3；反之耐药评分为0。
检测外周血液内高危miRNAs的表达情况来预测受检者在化疗过程中是否易发生转移，流程大致如图4所示：外周血液内miRNA含量确定转移评分的程序，检测肺癌患者外周血中9种高危miRNA对比正常人外周血的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的转移评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则改患者仍旧转移评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于3；反之转移评分为0。
上述两种检测结果综合分析以评估耐药风险及预后的流程致如图5所示：外周血液内miRNA含量确定转移评分的程序，计算患者耐药评分和转移评分之和，若总分大于10，则说明患者预后差，转移和耐药风险高；若总分大于3小于等于10之间，则说明患者耐药和转移风险适中，需要考虑调整用药；若总分小于等于3，则说明耐药及转移风险小，预后好。
本专利发明了一种通过检测肺癌体内的耐药高风险miRNAs来评估化疗过程中发现耐药和转移的风险的方法：取临床受检者肿瘤组织或外周血，检测其中的高风险miRNAs对比正常人体内水平，即可对化疗中可能发生的风险进行前瞻性评估，有效降低无效化疗率或提前止损低效率化疗。在临床化疗中，常会碰到肿瘤对化疗药物不敏感，即产生耐药现象，或肿瘤通过血液向全身扩散，即产生转移现象，从而导致化疗失败甚至危及病人生命。究其原因，缺乏简便可操作的临床耐药和转移评价方式占到很大的因素。本专利技术的关键区别点通过回顾性研究对体内发现的高风险miRNAs进行分类通过有针对性的检测高风险miRNAs在体内的水平来评价用药及转移情况，填补了市面上这类需求的空缺。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
cgcatcccct agggcattgg tgt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ctgtgcgtgt gacagcggct ga 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
atcaacagac attaattggg cgc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
ttgaaaggct atttcttggt c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
tgcctgggtc tctggcctgc gcgt 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
aaaagtgctt acagtgcagg tag 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
tagcttatca gactgatgtt ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
agggcttagc tgcttgtgag ca 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
tgtctgcccg catgcctgcc tct 23

Claims (9)

1.一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒，其特征在于：包括三部分：针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒、针对外周血液的实时荧光PCR检测试剂盒和一个特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序；所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒检测的高风险miRNAs如下：miR-324-5p、miR-210-3p、miR-421、miR-21、miR-661、miR-106a、miR-27a、miR-346及miR- 423-3p。
2.一种权利要求1所述评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤为：
第一步，针对肿瘤组织的实时荧光定量PCR检测试剂盒：组织称重，加1ml TRizol/50mg试剂，混匀，冰上放置裂解5 min；
第二步：加氯仿 200μl/ml TRizol ，剧烈摇匀，使其呈乳浊液，静置5 min；
第三步：12000g, 4度离心, 15 min；
第四步：吸取上清至另一EP管，加入等体积预冷异丙醇，混匀；
第五步：2000 g, 4度离心, 15 min；
第六步：弃上清，加1 ml 75%乙醇，洗涤沉淀，7500g， 4度离心, 10 min；
第七步：吸净上清，晾干酒精；
第八步：加RNase-free water溶解RNA；
第九步：测定总RNA浓度；
第十步：取1 μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十一步，针对外周血液的实时荧光定量PCR检测试剂盒：取新鲜的全血200-800ul，加入10倍体积的TRIzol，充分吹打混匀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
第十二步：每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿，静置3min，离心12000g，4℃，15min；
第十三步：将上层水相转移到1.5ml EP管中，加等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，离心12000g，4℃，10min，弃上清；
第十四步：加入1ml的75%乙醇，上下颠倒10次，离心7500g，4℃，10min，弃上清；
第十五步：室温下干燥5-10min（充分干燥不好溶解），加入40ul的RNase-free-water充分溶解RNA，可在60℃水浴锅中促溶10min；
第十六步：测定总RNA浓度；
第十七步：取1 μgRNA逆转录得到的cDNA后进行扩增；
第十八步：上述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测；
第十九步：特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序分析。
3.根据权利要求2所述的一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR均以U6作为检测的内参物基因，以20μL作为qPCR扩增的反应体系，上机检测。
4.根据权利要求3所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述上机检测，以内参的循环数作为对照，计算2^-△△CT，再进行统计学分析。
5.根据权利要求4所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述特制的可针对PCR结果进行分级定性的程序为根据对已有数据的临床前瞻性研究，依据统计数据中ROC曲线的曲线下面积（Area Under the Curve，AUC）以及P值对高危miRNAs进行分级。
6.根据权利要求5所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述AUC越大，提示指标的诊断能力越好，而p值主要用于衡量一次错误发生的指标。
7.根据权利要求6所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测肿瘤组织内高危miRNAs的表达情况来预测受检者对目前化疗用药是否产生耐药或预测该受检者是否易产生耐药，步骤为检测肺癌患者肺癌组织中9种高危miRNA对比正常人的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的耐药评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5,则改患者仍旧耐药评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则耐药评分大于3；反之耐药评分为0。
8.根据权利要求7所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测外周血液内高危miRNAs的表达情况来预测受检者在化疗过程中是否易发生转移，步骤为检测肺癌患者外周血中9种高危miRNA对比正常人外周血的表达情况，如果有大于2/3的miRNA大于正常人的表达水平的2.5倍，则该病人的转移评分大于9；反之对其中A组的miRNA进行评估了，若A组miRNA患者/正常人水平大于2.5,则改患者仍旧转移评分大于9；反之比较B组，若B组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于6；反之比较C组，若C组miRNA患者/正常人水平大于2.5，则转移评分大于3；反之转移评分为0。
9.根据权利要求8所述一种评估肺癌耐药和转移发生风险的检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述检测结果综合分析以评估耐药风险及预后的流程为计算患者耐药评分和转移评分之和，若总分大于10，则说明患者预后差，转移和耐药风险高；若总分大于3小于等于10之间，则说明患者耐药和转移风险适中，需要考虑调整用药；若总分小于等于3，则说明耐药及转移风险小，预后好。
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