CN109207599A - 一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，所述外周血miRNA标志物包括hsa‑miR‑1291、hsa‑miR‑1‑3p、hsa‑miR‑214‑3p中至少一种。本发明基于大量样本验证，明确3个适用于中国人群非小细胞肺癌的特异性诊断标志物，相对国际上报道的其它miRNA标志物，具备有更高的人群特异性；这3个miRNA诊断标志物均为首次提出，相较于其他miRNA分子标志物更可靠。

Description

一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物

技术领域

本发明涉及疾病早期检测技术领域，特别涉及一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物。

背景技术

肺癌是全世界范围内肿瘤死亡的首要原因，2016年中国癌症中心发布的统计显示，在429万新发癌症病人群中，肺癌是73.3万；在280万的癌症死亡人数中，肺癌占据了其中的61万，是我国名副其实的“第一癌症”。其中，非小细胞肺癌约占所有肺癌的80％，约75％的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。因为肺癌早期症状不明显，75％的肺癌患者就诊时已有局部浸润和远处转移，失去了手术治疗的机会，而目前的治疗手段对肺癌总生存率的提高效果不大，II-IV期肺癌患者5年生存率大约在40％-5％之间，而I期患者5年生存率可高达92％。因此，加强对高危人群的筛查，提高早诊、早治率是减少肺癌死亡率的最有效方法。

X胸片和痰涂片是肺癌筛查最常规的技术，但其敏感性太低；纤支镜刷检或活检能直接窥视病灶，能病理定性，但有创，难以在大样本人群中推广；低剂量螺旋CT是目前被认为最有效的肺癌筛查技术，无创、敏感性高，然而有高达96.4％的假阳性率，而且筛查的成本比较高。因此需要开发新的微创、经济、敏感性和特异性均比较高的早期筛查的技术。

微小核酸(microRNA，miRNA)是近年来发现的一类长度为19—25个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3'UTR的完全或不完全配对,降解靶标基因mRNA或抑制其翻译,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着类似于致癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的表达谱具有明显的组织特异性,在不同肿瘤中具有特定的表达模式。这些特点使得miRNA有可能成为肿瘤诊断新的生物学标记和治疗靶标。同已知的循环核酸(DNA和RNA)一样,miRNA广泛存在于肺癌高危健康人和肿瘤患者的血清中,其种类和数量会随着生理状况和病程变化而改变。循环miRNA可能来自于凋亡或坏死的细胞，或者是细胞的主动释放和循环细胞的裂解。这些内源循环miRNA分子多数不是以游离形式存在,而是与蛋白等构成颗粒,因而内源性的循环RNA分子具有良好的抗RNase降解能力,有较高的稳定性。这一特性为循环miRNA作为生物标志物进行检测提供了可能。

许多研究报道了miRNA在肺癌中的异常表达，尽管现有的研究发现了许多非常有前景的肺癌早期诊断血清miRNA，但由于检测对象包含组织，血清，血浆等，检测方法包含测序法，扩增法，杂交法等，研究中入组样本的选取不严格；各种因素缺乏一致性，导致非小细胞肺癌的miRNA标志物没有统一的定论，这些结果并不一致，并且不能相互验证，最终能用于肺癌筛查的血清miRNA生物标志物以及生物标志物组合标志物还未见定论。

其中最关键的原因有以下两点：

1、病例和对照样本的选取、收集、保存过程中出现偏差。样本的类别不同，必然会对生物标志物的研发、验证带来不确定性。外周血中变化的miRNA主要是由肺癌相关细胞分泌到细胞外的，其组成成分与细胞内或者全血样本中必然不同，同时也会受到其他因素的影响，例如是否经过治疗等。大多数miRNA是稳定的存在于健康人群以及癌症人群的外周血中的，并由身体各种组织细胞分泌，各类环境、遗传等非癌症因素，均会影响其表达量。为了排除影响，需要选取大量的人群样本作为研发、验证，以确定生物标志物的真实性。同时，已有研究证明，通过使用不同方法分离、储存的外周血样本，其生物标志物含量也会有所不同。通过癌症组织细胞找到的生物标志物、通过对比晚期癌症找到的生物标志物、通过对比使用不同方法分离、保存的样本找到的生物标志物以及没有经过大量样本研发、验证过的生物标志物，都可能是假阳性的结果，不一定能经得起大规模实验的验证。

2、由于分子量很小，导致了miRNA在检测上存在一定的难度。尤其在低含量的外周血中，如何稳定，灵敏的检测miRNA一直是一个难题。现有一些高通量芯片、测序以及高通量RT-PCR筛选方法的局限性包括稳定性差、重复性差以及低灵敏度等，结合使用少量样本，在研发阶段容易导致产生假阴性结果，忽略重要的miRNA生物标志物。同时，技术的不稳定性，也增加了生物标志物在独立样本中验证的不确定性，容易增加结果假阳性、假阴性的概率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，基于大量样本验证，明确3个适用于中国人群非小细胞肺癌的特异性诊断标志物，相对国际上报道的其它miRNA标志物，具备有更高的人群特异性；这3个miRNA诊断标志物均为首次提出，相较于其他miRNA分子标志物更可靠。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，所述外周血miRNA标志物包括hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p中至少一种。

所述外周血miRNA标志物采用hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p中的一种或两种作为内参基因。

所述外周血为血清或血浆。

所述外周血miRNA标志物在诊断为非小细胞肺癌患者的外周血中的表达与在对照样本中的表达相比被上调。

所述对照样本是未患非小细胞肺癌的受试者。

所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞肺癌、腺癌肺癌。

一种用于非小细胞肺癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包含所述的外周血miRNA标志物。

一种所述的外周血miRNA标志物在制备通过如下方法预测所述受试者发展或具有非小细胞肺癌可能性的非小细胞肺癌诊断试剂中的用途，所述方法包括：

-检测从所述受试者获得的外周血样品中miRNA的存在；

-测量所述外周血样品中权利要求1所述的至少一种miRNA的表达水平；

-使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者发展或具有非小细胞肺癌的可能性。

miRNA的表达水平的分数是使用选自由以下各项组成的组的分类算法计算的：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。

使用对照的表达水平预训练所述分类算法。

其中所述对照是选自未患非小细胞肺癌对照和非小细胞肺癌患者组成的组的至少一种。

其中所述分类算法比较所述受试者的表达水平与所述对照的表达水平并且返回数学分数，所述数学分数鉴定所述受试者属于对照组中的任一个的可能性。

其中所述miRNA的表达水平是浓度、log(浓度)、Ct/Cq数、2的Ct/Cq数次方中的任一种。

所述非小细胞肺癌包括各阶段非小细胞肺癌。

所述受试者包括且不限于亚洲人、欧洲人、美洲人。

现有报道中对于用于肺癌的血清/血浆miRNA生物标志物没有统一的定论，这些结果并不一致，有些是上调、有些是下调，并且不能相互验证，最终能用于肺癌筛查的血清miRNA生物标志物以及生物标志物组合标志物还未见定论，现有报道举例如下：

本发明基于大量样本验证，明确3个适用于中国人群非小细胞肺癌的特异性诊断标志物，相对国际上报道的其他miRNA标志物，具备有更高的人群特异性；这3个miRNA诊断标志物均为首次提出，相较于其他miRNA分子标志物具备更高的灵敏度和特异性。

附图说明

图1为本发明筛选非小细胞肺癌的miRNA标志物的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。

图2为确定本发明用于诊断非小细胞肺癌患者血清中miRNA标志物的方法步骤图。对照组包括健康，肺部炎症受试者。

图3为所有可靠检测到的272个miRNA的表达水平热图。热图表示所有能可靠检测到的miRNA；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。点的颜色表示浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度，使用颜色表示病例-对照的受试者。

图4为研发队列中29个有差异表达的miRNA的表达水平热图。miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。点的颜色表示浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度，使用颜色表示病例-对照的受试者。

图5为miRNA标志物组合在各队列的ROC图。

图6为miRNA标志物组合在各队列对照和癌症表达量的线箱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

申请人在研究中发现可以用于非小细胞肺癌诊断的miRNA标志物，非小细胞肺癌可以被可靠地鉴定。

本发明公开的所有miRNA序列均已经储存在miRBase数据库中(http:// www.mirbase.org/)。

表1

本发明公开了一种确定非小细胞肺癌诊断标志物的方法(图2)，包括：

a、在一定数量的非小细胞肺癌患者血清中高通量测量多个miRNA的表达水平；

b、在一定数量的对照血清中确定上述多个miRNA的表达水平；

c、比较a和b中多个miRNA的相对表达水平，筛选出差异表达的一个或多个miRNA作为非小细胞肺癌的诊断标志物，用来鉴定测试者血清。

实施例：

一、研发队列血清样本要求，采集和制备

本研究中使用了六个癌症病例-对照队列，发现和验证了用于检测早期肺癌的生物标记物和生物标记物组合(图1)。研发队列中的肺癌病例来自中国浙江省肿瘤医院，对照样本来自中国浙江省柯桥市的肺癌LDCT城市筛查项目。每年抽烟超过10包的受试者被定义为吸烟者。为了让研究组和对照受试者的年龄尽可能匹配，只有年龄在40至85岁之间的受试者被纳入本研究。

在实验设计中，对200μL的血清进行提取并且将总RNA逆转录并且通过预扩增来增加cDNA的量，但是却不改变miRNA的相对表达水平。稀释经过预扩增的cDNA以进行qPCR测量。若miRNA表达浓度小于500个拷贝/毫升，则被排除在分析之外并且被认为在后续的研究中是不可检出的。

二、逆转录-实时荧光PCR操作过程及结果

本发明使用RT-qPCR技术检测血清样本中520个候选miRNA的特异性表达。使用人工合成的miRNA标准曲线来确定每ml血清样品的拷贝数。其中，在多于90％的样品中可靠地检测到272种miRNA(表达水平≥500个拷贝/毫升)(图3)。这是比先前所报道的使用其它技术的研究更高数目的miRNA，突出了使用良好实验设计和良好控制的工作流程的重要性。用受试者工作特征曲线(ROC)来表示单个miRNA或多个体生物标志物组的特性。使用顺序前向浮动搜索(SFFS)算法来优化miRNA生物标记物的选择，曲线以下的面积(AUC)值来选择最优标志物。使用逻辑回归方程来构建多自由度的生物标记物组，来区分对照组和癌症组。

进一步研究发现了用于NSCLC检测的单个miRNA生物标记物，校正之后发现29个miRNAs的p值小于0.01，并且癌症组和对照之间的差异超过1个绝对标准分数，其中在非小细胞肺癌受试者中上调了22个，下调了7个。在研发队列中提取这29个miRNA进行分层聚类，观察到癌症和对照受试者之间有明显的分级(图4)。在非小细胞肺癌病例的各个阶段之间没有观察到太多差异。因此，在验证队列中，将继续验证验这29个候选的miRNA生物标记物。

三、验证队列验证上述29个miRNA

本发明用两个匹配的病例-对照队列来继续检测这29种血清miRNA生物标志物。验证队列1中，423个癌症和对照样本来源和研发队列相同，但目标人群扩展为男性，女性，吸烟和非吸烟人群。验证队列2里，样本为218个东欧男性，女性，吸烟，非吸烟人群。以上两个验证队列只包含早期(1期和2期)非小细胞肺癌样本。小于0.4的miRNA标志物不具有显著性，3个p-value小于0.01且在两个验证队列中的绝对标准分数大于均0.4的miRNA被进一步选为非小细胞肺癌检测的生物标志物(hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p)。

四、验证队列验证上述候选miRNA

本发明又用了3个另外的验证队列验证这3个miRNA生物标志物(hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p)。验证队列3包括了237个与研发队列和验证队列1相同来源的中国癌症和对照样本。验证队列4包括了340个癌症和对照的独立样本。验证队列5包括了65个新加坡人种样本。为了更准确的预测非小细胞肺癌，生物标志物组合是更好的选择。3个miRNA标志物(hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p)和2个内参基因(hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p)组合在研发队列和验证队列中的诊断效能如图5和图6所示。总的来说，用这5个miRNA标志物组合来检测非小细胞肺癌有80％的敏感度和90％的特异性。图6为各个队列的样本用5个miRNA标志物组合计算得到的分数。可以很好地区分非小细胞肺癌和健康对照人群。

本发明建立了一个完整的工作流程，用于发现和验证血清miRNA生物标志物组合，及成功确定了用于检测非小细胞肺癌的生物标志物及生物标志物组合。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 觅瑞（杭州）生物科技有限公司；浙江省肿瘤医院

<120> 一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物

<130> 2018.11

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> 人类(human)

<400> 1

uggcccugac ugaagaccag cagu 24

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类(human)

<400> 2

uggaauguaa agaaguaugu au 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类(human)

<400> 3

acagcaggca cagacaggca gu 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类(human)

<400> 4

uuuguucguu cggcucgcgu ga 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人类(human)

<400> 5

ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims (15)

1.一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血miRNA标志物包括hsa-miR-1291、hsa-miR-1-3p、hsa-miR-214-3p中至少一种。

2.根据权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血miRNA标志物采用hsa-miR-375、hsa-let-7a-5p中的一种或两种作为内参基因。

3.根据权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血为血清或血浆。

4.根据权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述外周血miRNA标志物在诊断为非小细胞肺癌患者的外周血中的表达与在对照样本中的表达相比被上调。

5.根据权利要求4所述的一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述对照样本是未患非小细胞肺癌的受试者。

6.根据权利要求1所述的一种用于非小细胞肺癌诊断的外周血miRNA标志物，其特征在于：所述非小细胞肺癌包括鳞状细胞肺癌、腺癌肺癌。

7.一种用于非小细胞肺癌诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的外周血miRNA标志物。

8.一种如权利要求1所述的外周血miRNA标志物在制备通过如下方法预测所述受试者发展或具有非小细胞肺癌可能性的非小细胞肺癌诊断试剂中的用途，其特征在于，所述方法包括：

-检测从所述受试者获得的外周血样品中miRNA的存在；

-测量所述外周血样品中权利要求1所述的至少一种miRNA的表达水平；

-使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者发展或具有非小细胞肺癌的可能性。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：miRNA的表达水平的分数是使用选自由以下各项组成的组的分类算法计算的：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：使用对照的表达水平预训练所述分类算法。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：其中所述对照是选自未患非小细胞肺癌对照和非小细胞肺癌患者组成的组的至少一种。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的用途，其特征在于：其中所述分类算法比较所述受试者的表达水平与所述对照的表达水平并且返回数学分数，所述数学分数鉴定所述受试者属于对照组中的任一个的可能性。

13.根据权利要求8至12所述的用途，其特征在于：其中所述miRNA的表达水平是浓度、log(浓度)、Ct/Cq数、2的Ct/Cq数次方中的任一种。

14.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述非小细胞肺癌包括各阶段非小细胞肺癌。

15.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述受试者包括且不限于亚洲人、欧洲人、美洲人。