CN106795564A - 肺癌检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了诊断对象中肺癌的方法,通过在获自该患者的生物样品中检测miRNA标识,所述标识的存在提供的对癌症的指示早于本领域认可的替代性方法,包括但不限于,低剂量计算机断层扫描(LDCT)。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年9月9日提交的临时申请USSN 62/047,932的优先权和权益,其内容通过引用全文纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及分子生物学以及癌症诊断和治疗的领域。
背景技术
肺癌是全世界范围内癌症死亡的头号病因,并且其发生率在妇女和发展中国家中持续上升。因为肺癌在其早期阶段是无症状的,所以大部分患者被诊断出晚期疾病,例如,当肿瘤无法切除时。因此,总体存活率非常低:5年为16%。因此,开发筛选程序和新诊断工具以改善在疾病仍然可治愈的早期阶段(I-II期)检测疾病的能力是重要的。
低剂量计算机断层扫描(LDCT)是诊断肺癌的有效工具,如几项单臂和随机研究所证明。然而,已经出现了关于全国实施的LDCT筛选程序的可行性和成本的问题。虽然LDCT的目标是由年龄和吸烟史鉴定的高风险个体,但可证明基于其他风险因素如肿瘤标志物的选择前标准的精细化极有利于实现广泛且低成本地实施LDCT筛选。
对于用作第一线筛选处理来预选择需要通过LDCT进一步诊断研究的患者的侵入性最低且相对廉价的血液检测有长期未满足的需求。这种测试将降低靶筛选群的大小,并且将毫无疑问在成本、筛选摄取速率和降低参与者医疗处理上有优势。
本发明提供了用作第一线筛选处理来预选择需要通过LDCT进一步诊断研究的患者的侵入性最低且相对廉价的血液检测法。
发明概述
本发明描述了诊断对象中肺癌的方法,所述方法通过如下方式进行:在获自该患者的生物样品中检测miRNA标识,所述标识的存在提供的对癌症的指示早于本领域认可的替代性方法,包括但不限于,低剂量计算机断层扫描(LDCT)。
参与细胞分化、增殖和凋亡调控的微小RNA(miRNA)、非编码短RNA将成为最具前景的血源性肿瘤标志物类别之一。miRNA的表达通常在人类肿瘤中失调,导致体液,包括血清和血浆中miRNA概况改变。此外,无细胞miRNA在血液中显示出显著的稳定性,这归因于抵御恶劣条件和由微囊泡,如外来体,或由蛋白质复合物,如高密度脂蛋白复合物或阿尔古蛋白提供的血液RNA酶的保护。
本发明提供证据表明检测到的循环miRNA的miRNA标识提供了关于癌症,包括肺癌的早期指标。
本发明提供了在大规模研究中验证本文所述方法的功效的数据,该研究的目标是在COSMOS(对吸烟对象的连续观察)肺癌筛选程序中招募的高风险个体的组中检测肺癌,包括无症状和/或早期肺癌。该数据证明本发明的方法提供了针对肺癌的低成本、易实施的诊断筛选工具。
本发明提供了在有此需要的对象中诊断肺癌的方法,包括(a)在来自对象的生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度降低;(b)在生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度增加;和(c)当检测到(a)中各miRNA的降低的丰度并检测到(b)中各miRNA的增加的丰度时,诊断对象患有肺癌。
本发明的方法可用于诊断无症状肺癌和/或早期肺癌。本发明的方法可用于诊断任何亚型的肺癌。
本发明的方法的生物样品和/或对照生物样品可包括生物流体,基本由生物流体组成或者由生物流体组成。示例性的生物流体包括,但不限于,唾液、尿液、血液、或淋巴液。本发明的方法的生物样品和/或对照生物样品可包括血液、全血、血浆和/或血清,基本由其组成或者由其组成。本发明的方法的生物样品可包括血清,基本由血清组成或者由血清组成。
本发明的方法的对照生物样品可包括获自至少2个正常对象的血液、全血、血浆和/或血清,基本由其组成或者由其组成。本发明的方法的对照生物样品可包括获自至少2个正常对象的血清,基本由其组成或者由其组成。
根据本发明的方法,与对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度降低可以是与对照值的统计学显著差异。或者,或另外,与对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度增加可以是与对照值的统计学显著差异。
本发明的统计学显著差异可表征为小于0.05的p-值。本发明的统计学显著差异可表征为小于0.001的p-值。本发明的统计学显著差异可表征为小于0.0001的p-值。
根据本发明的方法,与对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度的降低可表示为倍数差异。或者,或另外,与对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度的增加可表示为倍数差异。
本发明提供了在有此需要的对象中诊断肺癌的方法,包括(a)在来自对象的生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度降低;(b)在生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度增加;(c)计算风险分数和(d)当检测到(a)中各miRNA的降低的丰度并检测到(b)中各miRNA的增加的丰度时,诊断对象患有肺癌。在该方法的某些实施方式中,风险分数是(a)倍数降低(fold decrease)与加权系数,或(b)倍数增加(fold increase)与加权系数的乘积,其中通过例如,对角线判别分析(DLDA)确定加权系数。
本发明的方法的各miRNA的对照值可通过如下方法来确定,其包括检测来自正常对象的对照生物样品hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度。在这些方法的某些实施方式中,本发明的至少一个正常对象没有癌症。或者,或另外,至少一个正常对象没有肺癌。
本发明的方法的对象可以是男性或女性。本发明的方法的对象可以是任何年龄;然而,对象优选成人。
本发明的方法的对象可以是无症状的。
本发明的方法的对象可患有I期或II期肺癌。
本发明的方法的对象可存在发展肺癌的一种或多种风险因素。发展肺癌的示例性风险因素包括,但不限于,个人或家族癌症史、吸烟和/或接触二手烟的历史、和/或对预防性或治愈性医疗护理的有限接触。或者,或另外,暴露于来自其环境的细颗粒的对象具有发展肺癌的较高风险。例如,暴露于烟(包括二手烟)、氡气、石棉或其他化学物(例如,砷、铬和/或镍)、和/或纳米尺寸颗粒(例如,来自制造工程和/或汽车尾气的颗粒和灰尘)的个体具有发展肺癌的较高风险。癌症家族史和任意一种或多种本文所述的风险因素的组合可进一步增加个体发展肺癌的风险。
本发明的方法还可包括,如果对象诊断患有肺癌,则进行低剂量计算机断层扫描(LDCT)或推荐(refer)该对象进行LDCT的步骤。
本发明的方法还可包括,如果对象诊断患有肺癌,则向该对象提供治疗或推荐该对象治疗的步骤。
根据本发明的方法的某些实施方式,(a)和/或(b)的检测步骤可包括使用针对(a)或(b)的至少一种miRNA有特异性的至少一种人miRNA茎环引物转录步骤(a)和/或(b)中的各miRNA以生成对应于各miRNA的互补DNA(cDNA)、扩增各cDNA,和确定与至少一种管家miRNA相比各cDNA的相对丰度。在这些方法的某些实施方式中,针对至少一种miRNA有特异性的至少一种人miRNA茎环引物和至少一种miRNA杂交以形成至少一种双链体。在这些方法的某些实施方式中,扩增步骤包括进行定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。在这些方法的某些实施方式中,至少2种管家miRNA包括miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、或miR-19a。或者,至少2种管家miRNA可包括miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、和miR-19a。
在这些方法的某些实施方式中,通过向各cDNA的原始循环阈值(CT)添加比例因数以生成标准化的(CT)值来确定各cDNA的相对丰度。可通过确定选自下组的至少2种管家miRNA的平均循环阈值:miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、和miR-19a,并且从恒定值(K)减去平均CT来确定本发明的比例因数。在本发明方法的某些实施方式中,恒定值(K)等于21.646。在这些方法的某些实施方式中,使用标准化的CT值来确定加权系数。
本发明的方法还可包括确定对象的风险分数的步骤。在这些方法的某些实施方式中,按照以下计算风险分数:RS=-(∑iwixi-THRES),其中i分别对应于(a)和(b)的各miRNA,并且其中THRES=-261.779,wi是第i种miRNA的加权系数,并且xi是第i种miRNA的表达值。第i种miRNA的表达值也被称作第i种miRNA的原始CT。在这些方法的某些实施方式中,风险分数大于或等于5,表明对象具有发展癌症的高风险。在这些方法的某些实施方式中,风险分数小于5并且大于或等于-5,表明对象具有发展癌症的中等风险。在这些方法的某些实施方式中,风险分数小于-5,表明对象具有发展癌症的低高风险。
附图的简要说明
附图主要是示例性的目的并且不旨在限制本文所述的发明主题的范围。附图不必放大;在一些情况中,本文所述的发明主题的各种方面可在附图中放大或夸大显示以促进对不同特征的理解。在附图中,类似的附图编号一般是指类似的特征(例如,功能上类似和/或结构上类似的元素)。
图1是显示研究设计的图。血清获自2个独立集合:(i)COSMOS研究[48个患有肺癌的患者(T),984(12+972)个选自没有肺癌的连续组的个体(N),38个具有良性肺结节的患者(NOD),16个患有慢性阻塞性肺病的患者(COPD),24个患有肺炎的患者(PN),和5个由于疑似肺癌而经历手术但在组织学分析上呈阴性(即,手术假阳性)的患者(良性)];(ii)欧洲癌症中心(IEO)的胸外科手术部[74个患有肺癌的患者(T)]。来自COSMOS研究的血清样品被分成校准组、验证组和特异性组(参见实施例1)。来自胸外科手术的血清样品包括临床组。
图2A是验证组中miR-测试的接受者操作特征(ROC)曲线的一对图。缩写:AUC,曲线下面积;T,患有肺癌的患者,N,没有肺癌的个体。
图2B是显示特异性组加COSMOS肺癌患者(左图)和临床组(右图)中miR-测试风险分数的一对图。也显示平均风险评分和p值(单因素ANOVA)。虚线表示用于决定双类别分层中阳性或阴性结果的miR-测试截止值(=0)(NOD,具有超过5年的跟踪后尺寸稳定的LDCT-检测到的、非钙化的肺结节的患者;COPD,患有慢性阻塞性肺病的患者;PN,患有肺炎的患者;良性,由于疑似肺癌而经历手术但在组织学分析上阴性(即,手术假阳性)的患者;肿瘤,来自COSMOS实验的肺癌患者:AC,腺癌;SCC,鳞状细胞癌;LCC,大细胞癌;LCC,大细胞肺癌;SCLC,小细胞肺癌)。括号中显示了组中的患者数量。
图2C是显示来自具有相同肿瘤组织亚型(即,腺癌)的临床组,针对不同吸烟状态分层的肺癌患者的miR-测试风险分数的图。也显示了平均风险分数和p-值(单因素ANOVA)(前吸烟者,在肺癌诊断前戒烟超过5年的患者)。
图3是显示手术去除肿瘤后miR-测试性能的一对图。在跟踪访问期间,在手术前和手术后1、5和12个月时收集血清样品的16个I期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的MiR-测试风险分数。患者的数量根据匹配的血样样品的可及性变化并且显示在线形图的底部(风险,miR-测试风险分数;pts,患者;前-,手术前;后-,手术后;mo,手术后的月数)。使用单尾配对t-检验来计算P-值(P)。虚线表示用于分配阳性或阴性测试结果的miR-测试截止值(=0)。
图4A是显示NCI-60细胞系组数据组中147种已知循环miRNA(147-miRNA)的无监督聚类分析的一对图。使用CellMiner网页应用(版本1.5;[30])下载标准化的NCI-60miRNA表达概况数据(OSU V3芯片)。探针组水平的数据在聚类前进行均值中心化。灰度条表示miRNAlog2相对表达(“类型”,衍生的细胞系的来源组织:LC,非小细胞肺癌;LE,白血病;OV,卵巢癌;BC,乳腺癌;RE,肾癌;CNS,中枢神经系统的肿瘤;CO,结肠癌;PR,前列腺癌。“聚类类型”,按照主要三种分支定义聚类:Epith-样(上皮-样),优先在LC细胞中表达的miRNA;Inflam-样(炎性-样),优先在白血病细胞中表达的miRNA;未定义,其表达在LC和LE细胞中属于异质性的miRNA)。
图4B是显示限于NSCLC或白血病NCI-60细胞系的34-和13-miRNA标识的无监督聚类分析的一对图。探针组水平的数据在聚类前进行均值中心化。
图4C是显示来自验证组的患有或未患有肺癌的患者的血清中34-miRNA标识的“炎性-样”和“上皮-样”miRNA组分的量的一对柱形图。灰度表示不同miRNA。加粗的miRNA也存在于13-miRNA标识中(miR-测试)。星号标识肺癌患者和健康个体之间明显不同的miRNA血清定量(p<0.05)。通过斯氏t-检验来计算P-值。
图4D是选自验证和特异性组(健康,来自972COSMOS组的没有肺结节或其他肺病的个体(假阳性;N=18);NMD,来自特异性组的患有非恶性肺病的患者(假阳性;N=11);肿瘤,来自COSMOS组的肺癌患者(N=28))的miR-测试阳性个体的“炎性-样”和“上皮-样”miRNA组分的量的一对柱形图。(Y-轴,qRT-PCR数据的-ddCT)。星号,与健康个体相比,在NMD或肿瘤患者组之间miRNA血清定量的统计学显著差异(p<0.05)。§与健康个体或NMD患者相比,在肺癌患者中miRNA血清定量的统计学显著差异(肿瘤特异性,p<0.05)。通过斯氏t-检验来计算P-值。
图5A是显示由miR-29a血清定量分层的肺癌死亡率的图。应用竞争风险方法来估计肺癌死亡率的累积发生率。进行Gary检验来检验分层中的差异(miR-29a高,血清定量高于中值(Ct<26.5);miR-29a低,血清定量低于中值(Ct>26.5))。
图5B是显示在肺癌患者和因良性疾病而经历手术的患者(手术假阳性)中通过qRT-PCR分析的miR-29a的血清定量的图。Y-轴,针对6种管家miRNA进行标准化的CT(参见实施例1)。通过韦氏t-检验来计算P-值。
图6是在研究中分析的全部患者组中使用原始标识(34-miRNA)或“减少的”13-miRNA标识获得的风险分数的系列相关性图。使用JMP软件计算皮尔森相关性系数。从2个模型(34或13-miRNA)分配的风险分数在所有组中强相关(皮尔森r>0.96),支持了13-miRNA模型的可靠性(miR-测试)。
图7是显示在相同血清样品的36个重复分析的均值上中心化的13-miRNA风险分数的分布。虚线标识距离均值1个标准偏差(±σ)。
发明详述
本发明提供了用于肺癌早期检测的“miR-测试”。miR-测试的示例性实施方式包括诊断患有肺癌,包括无症状和/或早期肺癌的对象的方法,包括(a)从对象获得生物样品;(b)在生物样品中检测与对应于hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度降低;和(c)在生物样品中检测与对应于hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度增加;其中检测到(b)中各miRNA的降低的丰度和(c)中各miRNA的增加的丰度表明对象中的肺癌发展,从而诊断对象患有肺癌。为了支持本发明的miR-测试,提供数据用于在大组的高风险个体中验证这种诊断肺癌,包括无症状和/或早期肺癌的方法。在该研究中,测试在高和中等风险类被归在一起时达到86%的灵敏度,而53%的个体被定位在低miRNA风险类别中。miR-测试的NPV大于99%,因此,低风险个体可安全地避免后续的LDCT筛选。用miR-测试获得的高灵敏度和NPV与用单独LDCT观察到的相当,这表明miR-测试可取代LDCT作为第一线筛选工具。相反,与LDCT相比,测试的较低特异度将不会影响整体筛选结果,因为具有阳性miR-测试结果的病例会被要求经过LDCT以确认诊断并定位肿瘤病灶以供后续手术。
对于假阴性(即,miR-测试-阴性肺癌患者)和假阳性(miR-测试-阳性个体,但在LDCT后阴性)结果,15个死亡例中仅2个(验证和临床组)是假阴性。在低、中等和高风险类别中,每1000个患者/年的死亡率分别是0、51和71。虽然我们组中较低数量的死亡例限制了这些结果的统计功效,认为由miR-测试错失的肿瘤可能是无痛的或者甚至代表由LDCT做出的过度诊断。值得注意的是,5个具有良性肿瘤的患者(具有阳性LDCT结果)中的5个是miR-测试-阴性的。类似地,大部分NMD患者(83个中的72个;87%)是miR-测试-阴性的。后面的这种结果是相对的,因为在LDCT筛选试验中,有高至28%的高假阳性结果。这使得对于LDCT结果的解释以及后续关于筛选事件间隔的决定变得复杂:这种困难可由第一线筛选测试来缓解,其显著减少了没有肺癌的个体的不必要LDCT。对于miR-测试假阳性,这些事件可能不必代表对测试的固有限制,因为血液测试可预见LDCT诊断。
miR-测试具有作为肺癌筛选程序中的第一线工具引入所需的准确性和稳健性特征。如果实施,miR-测试将使LDCT的数量降低超过50%,同时保留LDCT的诊断灵敏度。
实施例
实施例1:miRNA血液测试研究
研究群体
在该研究中采用患者和个体的4个独立组:i)校准组,ii)验证组,iii)特异性组,iv)临床组(参见图1):
校准组:24个体选自COSMOS试验(12个具有筛选检测到的肺癌并且12个无肺癌;图1,表2)并用于精细化miRNA标识(即,miR-测试)。先前筛选12个肺癌患者,以衍生34-miRNA标识(参见,Vickers KC,Palmisano BT,Shoucri BM等,Nat Cell Biol 2011;13(4):423-33)。
验证组:在包括36个具有LDCT检测到的肺癌的患者和972个没有肺癌的患者的COSMOS研究中招募的独立组的1008个体中验证miR-测试,其随机选自2011年3月至2012年3月的连续组。
特异性组:使用83个患者的第三组用于对miR-测试的进一步验证。这些个体选自COSMOS研究参与者并且不包括在该研究中使用的任何其他组中。该组包括:i)38个在5年跟踪时具有尺寸稳定的CT-检测到的孤立肺结节的个体;ii)16个患有慢性阻塞性肺病的患者;iii)24个患有肺炎的个体;iv)和5个因良性肺部肿瘤而经历手术的个体。重要的是,通过LDCT,这些个体都没有在超过5年的跟踪期内发生肺癌。
临床组:使用74个在COSMOS试验以外诊断患有肺癌的患者的第四独立组。这些患者从2005年11月至2008年1月在欧洲癌症中心经过手术。
关于通过miR-测试筛选的所有个体和患者的临床和病理特征的信息在表1和表2中报道。报告了关于年龄(岁)和吸烟状态(吸烟史)的平均±标准偏差(SD),并且报告了年龄的中值、四分位(Q1;Q3)和全范围(最小-最大)。除了以下的几乎所有个体可得到吸烟史的信息:25个患者(a)和36个患者(h)(AC,肺腺癌;SCC,肺鳞状细胞癌;SCLC,小细胞肺癌;LCC,大细胞肺癌;COPD,慢性阻塞性肺病;NOD,稳定的孤立肺结节;PN,肺炎;良性,因良性肺结节而经历手术的患者(手术假阳性))。基于由国际抗癌联盟(UICC)出版的《恶性肿瘤TNM分类》(TNM Classification of Malignant Tumors),第7版来定义肿瘤阶段。由于凑整,百分数总和可能并不是100。
表1.各组中患者的临床和病理特征。
表2.用于对循环miRNA标识精细化的校准组的临床病理学特征。
“校准组”中的12个无症状肺癌患者是用于得到miR-测试的174个体的原始组的部分。
按照美国癌症联合委员会的指南(http://www.cancerstaging.org/)确定诊断时的肿瘤阶段。从所有参与者获得知情同意书。校准、验证和特异性组的患者和个体都在COSMOS研究中招募,这是针对高风险个体的肺癌诊断预期的筛选程序。所有招募的个体都是吸烟者或前吸烟者,其接触吸烟超过20年,年龄超过50岁。
对于图3中所示的实验,在手术前后从一组没有接受化疗的I期疾病的肺癌患者收集血清。
血液收集
在任何分析或仪器过程之前通过标准静脉切开术收集血液样品(10mL)。前3mL的血液不用于血清制备以防止皮肤污染。通过在具有凝血激活剂的管(S-Monovette 7.5mLREF01.1601-斯卡特德公司(Sarstedt))中收集血液,在室温下放置3小时至凝血,然后在室温下在3000rpm(1000g,Megafuge 2.0,贺利氏公司(Heraeus))下旋转10分钟来制备血清。在离心之后立即移出血清,剩余0.5cm以避免破坏血清-凝血界面。然后血清被分装到条码化的冷冻管中并在干冰中速冻。等份储存在专用的-80℃冰箱中。
血清miRNA纯化和表达概况
总RNA纯化,包括miRNA,基于异硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法(TriZol-LS,应用生物系统公司(Applied Biosystem))和基于抽柱的总RNA纯化(MiRneasy小试剂盒,凯杰公司(Qiagen))。简言之,0.3mL血清以3∶1的体积比与Trizol-LS混合用于裂解。在变性之后,向溶液中添加一定量的合成miRNA(5 x 108个拷贝的miR-34a)以监测提取效率。向溶液中添加0.24mL体积的氯仿,其然后在4℃下在11800g下离心15分钟。去除过定量(0.35mL;样品最终体积的约70%)的水相。优选这一选择以限制来自相间的污染。
通过Qiacube仪(凯杰公司),按照“miRNEASY Mini”标准方案自动进行后续步骤。RNA在30mL中洗脱并储存在-80℃下直至进一步分析。通过使用MicroLab Star液体操作来优化逆转录(RT)和扩增前反应(Pre-AMP)方案。按照生产商的说明,在2720热循环仪(应用生物系统公司)中,用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒和定制的人miRNA-特异性茎环引物集(应用生物系统公司)从固定体积(3μL)的总RNA进行RT。然后,RT产物与水1∶2稀释;按照生产商的说明,用TaqMan PreAmp主混合物(2X)和Megaplex预扩增引物人集A(应用生物系统公司)预扩增5μL稀释的RT产物(12个循环的PCR)。预扩增反应与Tris-EDTA缓冲液0.1X以1∶4稀释。接着,6μL稀释的预扩增反应与46.5μL水和52.5μL的TaqMan通用主混合物II(应用生物系统公司)合并。最终溶液(105μL)加载到定制低密度阵列微RNA定制组(应用生物系统公司)的一条泳道中。使用生产商推荐的循环条件在Applied Biosystems 7900HT热循环仪上进行qRT-PCR。使用HamiltonSTAR液体操作工作站来使大部分上述过程自动化。
qRT-PCR数据分析-miRNA概况和数据标准化
数据输出成文本格式用于进一步分析。如果qRT-PCR扩增曲线呈现“Tholdfail”错误标记(即,自动阈值化算法失败),则弃去数据。随后,原始Ct值经标准化。
为了运行miR-测试,数据采用以下过程使用6种“管家”miRNA基因(miR-197,miR-19b,miR-24,miR-146,miR-15b,miR-19a)的平均CT(HK-平均)标准化:通过“HK-平均”减去恒定值(K=21.646)计算各样品的比例因数(SF)。然后数据使用下式通过这些SF标准化以消除技术波动:
SF+miRNA CT原始=CT标准化 (1)
如果通过qRT-PCR,CT大于30.01或者“未确定”,则数据设为30.01并跳过标准化。这些标准化策略确保独立于用于训练miR-测试的样品的原始组,并且在不需要内参的情况下进行新的样品分类。
校准组用于:i)通过使用对角线判别分析(DLDA)作为类别度量使miRNA标识的DLDA加权系数(wi)精细化(BRB-ArrayTools,版本4.3.0-Beta_2Release);ii)降低标识中miRNA的数量。使用留一法(LOO)交叉验证过程来交叉验证分类器并估计校准组中的灵敏度和特异度。使用设为0.05的置信水平的参数t-检验用于特征选择。通过进行1000次类别标签排列来评价分类器性能的统计学差异。如果加权表达(CT标准化*wi)的内和(inner sum)大于阈值的绝对值,则样品被分类为阳性或阴性。由于权重和阈值都是负数,风险分数计算为:
RS=-(∑iwixi-THRES),i=1...13(13-miRNA标识) (2)
其中THRES=-261.779,wi是第i种miRNA的加权系数(表3),并且xi是第i种miRNA的表达值(CT)。
所用分析使用R统计软件版本2.14.1的内部开发的定制R脚本自动化进行。该脚本使得能够读取来自Applied Biosystems ViiA 7TM的输出文件的信息内容并且自动提供miR-测试风险分数。
miRNA标识精细化
使用校准组通过优化的血清miRNA检测方案来精细化34-miRNA标识(参见,Bianchi F,Nicassio F,Marzi M等,EMBO molecular medicine 2011;3(8):495-503)。简言之,添加改善循环miRNA的预扩增步骤(PreAMP)[约23对比约31循环阈值(Ct),平均],并且自动化所有的纯化和样品制备步骤(包括PreAMP)。该过程使技术变异最小化,其导致标识中从34到13的miRNA的较低数量,同时保留原始模型的性能(表3和4;图6)。当进行对同一样品的重复测量时,13-miRNA标识(miR-测试)显示±5波动的miR-测试分数(图7)。基于这些结果,三类风险(即,高、中等和低)如下定义:高风险分数对应于>5的值;中等风险分数对应于<5且>-5的值;低风险分数对应于<-5的值。
表3报道了包括miR-测试的13 miRNA的miRNA试验、登录号(Ace)、序列、和miRbase命名(版本20)。倍数变化(倍)和p-值(参数t-检验)是指校准组中12个正常血清对比12个肿瘤血清中的miRNA的表达。Wi是对角线判别分析(DLDA)计算的加权系数并用于miR-测试中以计算风险分数。
表3.包括miR-测试的13 miRNA(从上到下分别是SEQ ID No:1-13)。
校准组中原始34-miRNA标识和降低的13-miRNA标识(miR-测试)的灵敏度(SEN)和特异度(SPE)示于表4。灵敏度和特异度基于对角线判别分析(DLDA)分类器的交叉验证结果(参见实施例1)。使用0风险分数来计算灵敏度和特异度。
表4.校准组中34-和13-miRNA的性能比较。
统计学分析
使用JMP 10软件(SAS)和SAS 9.3(北卡罗来纳州卡雷的SAS仪器公司(SASInstitute,Cary NC))来进行分析。通过竞争风险方法来估计累积肺癌-特异性死亡率。
实施例2:在肺癌筛选程序中验证miR-测试
针对在肺癌筛选试验COSMOS中招募的高风险个体(中毒吸烟者,年龄超过50岁),和在筛选外诊断的肺癌患者设计多层级研究(图1)。在初始步骤中,原始34-miRNA标识经精细化(参见,Bianchi等),考虑多种技术改进(参见实施例1)。这种精细化使得标识降低至13miRNA(下文,miR-测试,表2和3),其保持与原始34-miRNA标识相同的性能(表4,和图6)。标识降低在转换到临床实践上是有利的,因为其降低了测试的成本和复杂性。
miR-测试然后在COSMOS试验中招募的1008个对象的独立“验证组”中验证(图1,表1)。在该组中,当使用0风险分数作为截止时,测试显示了0.85的AUC(曲线下面积)和分别为75%、78%和75%的准确性(ACC)、灵敏度(SE)和特异度(SP)(图2A,表5)。
接着,试图模拟“临床”环境,其中miRNA-测试用作归类筛选以鉴定应该随后经LDCT的个体。验证组被分成三个风险类别:高、中等和低(参见实施例1)。通过将高和中等风险类别分组在一起,测试的灵敏度增加至86%(36个肿瘤中的31个,表5)。对不需要经LDCT的低风险类别中个体(1008中533个(53%)包括5个肿瘤;表5)的分析显示miR-测试超过99%的阴性预测值(NPV)。36个LDCT-检测到的肿瘤中的5个被miR-测试分类为低风险(假阴性)的事实可能反映了测试现有形式的固有限制。然而,在假阴性病例中,我们在所有筛选的个体中15个登记死亡中没有观察到任何死亡事件(验证和临床组)。另外,在低、中等和高风险类别中,每1000个患者/年的死亡率分别是0、51和71。虽然我们组中较低数量的死亡限制了这些结果的统计功效,认为由miR-测试错失的肿瘤可能是无痛的或者代表由LDCT做出的过度诊断。然而,值得注意的是,2-或3-类别分层中,分配为低风险分数的验证组中的个体都没有在跟踪期(超过30个月)内死于肺癌(表5)。
表5显示了各种测试中miR-测试的表现。报告了分配到不同miR-测试类别的个体的数量。括号中是总数的百分比。基于由国际抗癌联盟(UICC)出版的《恶性肿瘤TNM分类》(TNM Classification of Malignant Tumors),第7版来定义肿瘤阶段。§使用两类别分层(阳性:>0;阴性:<0)的miR-测试表现。在验证组中,灵敏度(SE)为78%并且特异性(SP)为75%。在特异性组中,SP为87%。在临床组中,SE为70%。使用三类别分层(高:>5;中等:<5且>-5;低:<-5)的miR-测试表现。
表5.各种组中miR-测试的表现。
实施例3:各种临床相关环境中miR-测试的表现分析。
接着进行一系列实验以分析各种临床相关环境中miR-测试的表现。为了评价miR-测试在非恶性肺病(NMD)和肺癌之间区分的能力,选择来自COSMOS研究的患有慢性阻塞性肺病(COPD)、良性肺结节或肺炎的个体(图1,表1)组建“特异性组”(参见方法)。在该组中,当应用量类别分层时,83个体中的11个(13%)被miR-测试分配为阳性分数(图2B,左图;表5)。当应用三类别分层时,在这些中,只有3个(4%)被分类为高风险(表5)。重要的是,5个因良性肿瘤而经历手术的患者(手术假阳性)中5个被miR-测试分配为阴性分数(图2B)。因此,miR-测试在患有NMD的个体组中显示出高特异性(87%),进一步证实其可靠性。
然后miR-测试应用于第三独立组,“临床组”,其由在COSMOS试验外诊断患有肺部肿瘤的患者组成(图1,参见实施例1)。该分析允许在携带更晚期肺癌(II-III期)的未选择群中评价测试性能,其在筛选检测到的肿瘤中通常是代表数不足的(表1)。临床组中miR-测试的性能与验证组中的性能相当(SE,70%;表5)。此外,在临床组中不同肿瘤阶段(I期,SE69%;II-III期,SE 72%;表5)和亚型(图2B)之间没有观察到性能上的主要差异。另外,在来自临床组的腺癌患者中,在吸烟者、前吸烟者(超过5年)和从未吸烟者的风险分数间没有观察到显著差异(P=0.78;图2C)。
最后,分析了手术前后I期,非小细胞肺癌(NSCLC)患者组的血清样品以评价miR-测试肿瘤特异性(参见实施例1)。在手术后1个月,在miR-测试风险分数上没有显著的总体降低(p=0.39;图3)。在一些患者中,风险在没有任何残留疾病的情况下增加,可能由于血清miRNA的长期稳定性和/或手术期间miRNA释放。值得注意的是,在手术后5个月,大部分患者有显著降低(p=0.017,图3)。在2个在手术后12个月时可获得血清的患者中,相对于5个月的风险分数,miR-测试风险分数持续降低并且在两个病例中都产生阴性测试结果(图3)。
实施例4:肺癌患者中循环miR-测试miRNA的来源。
感兴趣的生物学问题涉及循环miRNA的来源及其在癌症患者中的波动。miRNA可存在于血清中,由于其从过继细胞中的被动释放或者来自微囊泡或与miRNA-结合蛋白的复合物中的主动释放,这保护它们免于降解。
分析了NCI-60肿瘤细胞数据组中循环miRNA的表达。虽然这种方法有明确警告(例如,表达的miRNA不必分泌,并且即使它们被分泌,其表达水平可能无法反映它们的分泌水平),其是可指导进一步分析的可行初始步骤。
初始时,进行了对所有在血清中可靠检测的miRNA的无监督聚类分析(147-miRNA,参见Bianchi等)。这产生了三个主要组:i)优先在造血来源的细胞系中表达的miRNA,其称为“炎性-样”聚类;ii)优先在上皮来源的细胞系中表达的miRNA,其称为“上皮-样”聚类;iii)没有明显可区分表达图案的miRNA(图4A)。当分析限于肺癌和白血病细胞系时,3-聚类结构保留并且更明显,无论用147-miRNA标识(图4A,右图)或34-和13-miRNA标识(图4B)来研究该数据组。统计学分析证明肺癌或白血病细胞系中属于34-和13-miRNA标识的几种miRNA的显著调节(分别是34-和13-miRNA标识中的16和8;表6)。
上述发现表明我们标识的miRNA的双重来源。因此,研究了双组分对标识性能的影响。首先,确定同时需要两种组分来维持灵敏度和特异度之间的良好折衷(表7)。接着,分析了来自验证组中个体的血清中,我们的标识中存在的上皮-样和炎性-样miRNA的水平。“炎性-样”miRNA显示准典型的表现,与健康个体相比,6种miRNA中的5种显示在癌症患者中增加(图4C)。相反,“上皮-样”聚类显示更异质性的表现(图4C)。
最后,分析了验证和特异性组中miR-测试-阳性个体中上皮-和炎性-样miRNA的表达(图4D)。该分析揭示了2个有趣的特征:i)大部分“炎性-样”miRNA在NMD患者(假阳性)的血清中增加,与肺癌患者相似,其与存在慢性或严重肺部炎症相一致(图4D);ii)在“上皮-样”聚类中,我们发现相对于健康个体,miR-29a在肺癌患者(真阳性)中显著增加,但在NMD患者中没有(p=0.008;图4D),从而代表了真肿瘤特异性miRNA。因此,增加的miR-29a血清定量与不良预后相关(p=0.025;图5A)。另外,与肺癌患者相比,患有良性肿瘤(手术假阳性)的患者有较低量的血清中miR-29a(p=0.003)(图5B)。
在NCI-60细胞系组(限于肺癌(LC)和白血病细胞系(LE))中34-miRNA(或13-miRNA)标识中明显调节的miRNA示于表6。基因表达数据在其平均数上中心化(miRNA ID,微小RNA OSU V3芯片相对前miRNA ID;登录,miRBASE登录号;miRNA,成熟miRNA名称;加粗,属于原始34-miRNA标识的成熟miRNA(N=16);从分析中排除miR-32因为其在两个聚类中都存在;聚类类型,基于正文中所述的聚类分析的鉴定miRNA)。通过双尾t-检验来计算P-值。
表6.在NCI-60细胞系组(限于肺癌(LC)和白血病细胞系(LE))中34-miRNA(或13-miRNA)标识中调节的miRNA。
验证组(N=1008)中完全13-miRNA miR-测试,和没有炎性-样(上皮-样)或上皮-样(炎性-样)组分的miR-测试的灵敏度(SEN)和特异度(SPE)示于表7。0风险分数用作截止值以分配阳性和阴性测试结果。
表7.“上皮-样”和“炎性”的诊断功效评价。
等同形式
下面所附说明中详细描述了本发明的一种或多种实施方式。可采用与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明。通过说明书和权利要求书,不难了解本发明的其它特征、目的和优点。在本说明书和所述权利要求书中,单数形式包括复数形式,除非上下文另有明确说明。除非另有说明,本文所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。本说明书中引用的所有专利和出版物都在此处引用作为参考。
前述说明仅处于说明的目的显示并且不旨在限制本发明至公开的精确形式,本发明受到所附权利要求的限制。
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序列表
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意大利癌症研究基金会分子肿瘤学研究所(IFOM - Fondazione Istituto FIRC diOncologia Molecolare)
米兰大学(UNIMI - Universit?degli Studi di Milano)
P·迪费奥雷(DI FIORE, PIER PAOLO)
F·比安基(BIANCHI, FABRIZIO)
F·尼卡西奥(NICASSIO, FRANCESCO)
M·J·L·N·马尔奇(MARZI, MATTEO JACOPO LUCA NICOLO)
F·蒙塔尼(MONTANI, FRANCESCA)
<120> 肺癌检测方法
<130> GENS-007/001WO 322003-2091
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<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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uauugcacuu gucccggccu gu 22
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
uguaaacauc cuacacucag cu 22
<210> 3
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
caacggaauc ccaaaagcag cug 23
<210> 4
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<212> RNA
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ucaggcucag uccccucccg au 22
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<212> RNA
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cuggcccucu cugcccuucc gu 22
<210> 6
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
uguaaacauc cuacacucuc agc 23
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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uuauaauaca accugauaag ug 22
<210> 8
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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agagguagua gguugcauag uu 22
<210> 9
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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gccccugggc cuauccuaga a 21
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uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
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ugucaguuug ucaaauaccc ca 22
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<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
cagugguuuu acccuauggu ag 22
Claims (46)
1.一种在需要的对象中诊断肺癌的方法,所述方法包括
(a)在来自所述对象的生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、和hsa-mir-331-3p各自的丰度降低;
(b)在所述生物样品中检测与对应于来自对照样品的hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的对照丰度值相比,hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度增加;并且
(c)当检测到(a)中各miRNA的降低的丰度并检测到(b)中各miRNA的增加的丰度时,诊断所述对象患有肺癌。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物样品包括生物流体。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述生物流体是唾液、尿液、血液、或淋巴液。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,生物样品包括血液、全血、血浆和/或血清。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物样品包括血清。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法,其特征在于,所述降低是与对照值相比的统计学显著差异,或者所述增加是与对照值相比的统计学显著差异,或两者同时。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,统计学显著差异表征为小于0.05的p-值。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,统计学显著差异表征为小于0.001的p-值。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,统计学显著差异表征为小于0.0001的p-值。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述降低和/或所述增加表达为倍数差异。
11.如权利要求1所述的方法,还包括计算风险分数的步骤。
12.如权利要求11所述的方法,其特征在于,所述风险分数是以下的乘积
(a)倍数降低与加权系数,或
(b)倍数增加与加权系数,
其中所述加权系数由对角线判别分析(DLDA)确定。
13.如权利要求1所述的方法,其特征在于,通过一种方法确定各miRNA的对照值,所述方法包括检测来自正常对象的对照生物样品中的hsa-mir-92a-3p、hsa-mir-30b-5p、hsa-mir-191-5p、hsa-mir-484、hsa-mir-328-3p、hsa-mir-30c-5p、hsa-mir-374a-5p、hsa-mir-7d-5p、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-29a-3p、hsa-mir-148a-3p、hsa-mir-223-3p、和hsa-mir-140-5p各自的丰度。
14.如权利要求13所述的方法,其特征在于,至少一个正常对象没有癌症。
15.如权利要求13所述的方法,其特征在于,至少一个正常对象没有肺癌。
16.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述对照生物样品包括生物流体。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,所述对照生物流体是唾液、尿液、血液、或淋巴液。
18.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述对照生物样品包括血液、全血、血浆和/或血清。
19.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述对照生物样品包括血清。
20.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述对照生物样品包括获自至少2个正常对象的血液、全血、血浆和/或血清。
21.如权利要求19所述的方法,其特征在于,所述对照生物样品包括获自至少2个正常对象的血清。
22.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对象无症状。
23.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对象患有早期肺癌。
24.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述对象患有I期肺癌。
25.如权利要求23所述的方法,其特征在于,所述对象患有II期肺癌。
26.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述对象存在发展肺癌的一种或多种风险因素。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述对象具有个人或家族癌症史。
28.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述对象具有吸烟和/或接触二手烟的历史。
29.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述对象对预防性或治愈性医疗护理具有有限接触。
30.如权利要求1所述的方法,还包括,如果对象诊断患有肺癌,则进行低剂量计算机断层扫描(LDCT)或推荐所述对象进行LDCT的步骤。
31.如权利要求1所述的方法,还包括,如果对象诊断患有肺癌,则向所述对象提供治疗或推荐所述对象治疗的步骤。
32.如权利要求1所述的方法,其特征在于,(a)和/或(b)的检测步骤包括
使用针对(a)或(b)的至少一种miRNA有特异性的至少一种人miRNA茎环引物转录(a)和/或(b)中的各miRNA,以生成对应于各所述miRNA的互补DNA(cDNA),
扩增各所述cDNA,并且
确定与至少一种管家miRNA相比各所述cDNA的相对丰度。
33.如权利要求33所述的方法,其特征在于,所述针对至少一种miRNA有特异性的至少一种人miRNA茎环引物和所述至少一种miRNA杂交以形成至少一种双链体。
34.如权利要求33所述的方法,其特征在于,所述扩增步骤包括进行定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)。
35.如权利要求33所述的方法,其特征在于,至少2种管家miRNA包括miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、或miR-19a。
36.如权利要求33所述的方法,其特征在于,至少2种管家miRNA是miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、和miR-19a。
37.如权利要求33所述的方法,其特征在于,通过向各cDNA的原始循环阈值(CT)添加比例因数以生成标准化的(CT)值来确定各所述cDNA的相对丰度。
38.如权利要求37所述的方法,其特征在于,所述比例因数通过以下方式确定
确定选自下组的至少2种管家miRNA的平均循环阈值:miR-197、miR-19b、miR-24、miR-146、miR-15b、和miR-19a,并且从恒定值(K)减去平均CT。
39.如权利要求37所述的方法,其特征在于,所述恒定值(K)等于21.646。
40.如权利要求37所述的方法,其特征在于,使用所述标准化的CT值来确定加权系数。
41.如权利要求1所述的方法,还包括确定所述对象的风险分数的步骤。
42.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述风险分数如下计算:
RS=-(∑iwixi-THRES),
其中i分别对应于(a)和(b)的各miRNA,并且其中THRES=-261.779,wi是第i种miRNA的加权系数,并且xi是第i种miRNA的表达值。
43.如权利要求42所述的方法,其特征在于,所述第i种miRNA的表达值是所述第i种miRNA的原始CT。
44.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述风险分数大于或等于5,表明所述对象具有发展癌症的高风险。
45.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述风险分数小于5且大于或等于-5,表明所述对象具有发展癌症的中等风险。
46.如权利要求41所述的方法,其特征在于,所述风险分数小于-5,表明所述对象具有发展癌症的低高风险。
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