CN103933578A

CN103933578A - miRNA-185的应用和含有其的药物组合物

Info

Publication number: CN103933578A
Application number: CN201310026000.4A
Authority: CN
Inventors: 李培峰; 李倩
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2013-01-22
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2033-01-22
Also published as: CN103933578B

Abstract

本发明提供一种miRNA-185的应用和含有其的药物组合物，具体为miRNA-185在制备用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物中的应用，所述miRNA-185全长为22bp，具有促肿瘤细胞凋亡功能。本发明miRNA-185在细胞模型和裸鼠模型下均具有增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的功能，在低浓度抗肿瘤药物阿霉素处理的条件下即可有效的促进肿瘤细胞的凋亡，克服了肿瘤治疗中肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性问题，可将miRNA-185包裹成药物分子，通过静脉注射或肌肉注射的方式，辅助以低浓度的抗肿瘤药物，达到治疗肿瘤减少毒副作用的目的，具有广阔的应用前景。

Description

miRNA-185的应用和含有其的药物组合物

技术领域

本发明属于医药生物工程领域。本发明具体涉及一种内源性的非编码小RNA的应用，尤其涉及一种内源性的非编码miRNA-185的应用和含有其的药物组合物；更具体地，本发明涉及该miRNA-185的增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的应用，以及miRNA-185在制备治疗肿瘤及制备新的抗肿瘤的药物中的用途。

背景技术

肿瘤是危害人类健康和生命的重大杀手，目前全世界有肿瘤病人约1400万，我国每年发病人数约200万，死亡140-150万，且发病人数和死亡人数呈现不断增长的趋势，目前肿瘤已超过心脑血管疾病成为威胁人类健康的头号杀手。目前常用的肿瘤化疗及放疗是通过诱导肿瘤细胞凋亡而达到治疗肿瘤的目的。

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡，是细胞在特定的内源和外源信号诱导下，遵循自身的程序，发生的受遗传调控的主动的高度有序的自我结束生命的过程，在生物体的进化、维持内环境的稳定以及系统生长发育中起着重要的作用。异常的细胞凋亡将会引起多种疾病的发生，例如过度的细胞凋亡会引发心血管疾病，神经退行性疾病等，而细胞凋亡不足则会诱发肿瘤。

但是细胞的凋亡过程调控异常，可抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药。治疗后耐药性的形成导致对抗肿瘤药物的敏感性降低，从而导致了治疗的失败。因此化疗药物在治疗肿瘤过程中的耐药性问题，已成为目前临床治疗中的重大难题。

随着科技的发展和肿瘤细胞信号传导途经研究的不断深入，以生物靶分子为基础的肿瘤生物治疗成为研究抗肿瘤药物的热点。肿瘤的生物疗法以分子生物学、细胞生物学和分析免疫学为基础，与手术放疗化疗三大常规疗法作用相互补充，大幅提高肿瘤的治疗疗效。将生物技术与放疗化疗结合起来，引入促凋亡的分子可以逆转肿瘤细胞产生的耐药性，增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，从而避免了传统的放疗化疗方法引起的耐药性和毒副作用的缺点，达到治疗肿瘤的效果。

本领域迫切需要了解促肿瘤细胞凋亡相关的因子，将其作为药物治疗的靶分子应用于临床的治疗中，因此寻找与促肿瘤细胞凋亡相关的因子与放疗化疗结合治疗肿瘤疾病，具有广阔的前景。

miRNA是最近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，通过对其靶基因的表达的调控，影响了生物体内的多种信号通路。已有文献研究在肿瘤发生发展过程中miRNA的表达水平发生变化，这提示了miRNA与肿瘤的发生发展与治疗可能都存在着密切的关系，因此为将miRNA作为靶点开发抗肿瘤药物应用于肿瘤治疗提供了理论依据和可能。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种内源性非编码miRNA-185的新用途，为将miRNA作为靶点开发抗肿瘤的药物，应用于肿瘤治疗提供了理论依据和可能。

除非另外说明，本文中的“miRNA-185”的序列为下述SEQ NO:1所示的核苷酸序列：5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’（SEQ IDNO:1）。

除非另外说明，本文中的“miRNA-185模拟物”是指，在miRNA-185的序列的每一个碱基上均进行了2′-O-甲基修饰后所得的miRNA，其序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’（SEQ ID NO:1）。

除非另外说明，本文中的“细胞融合度”是指细胞覆盖整个培养皿表面面积的百分比。

针对上述目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种miRNA-185在制备用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物中的应用，所述miRNA-185的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’（SEQ ID NO:1）。

优选地，所述miRNA-185的序列的在每一个碱基上均进行了2′-O-甲基修饰。

优选地，所述肿瘤为宫颈癌。

优选地，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤化疗药物。

优选地，所述抗肿瘤化疗药物为阿霉素。

另一方面，本发明还提供一种用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物组合物，该药物组合物包括有效量的本发明所述的miRNA-185，以及一种或多种药用赋形剂或药用载体。

优选地，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物。

优选地，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤化疗药物。

更优选地，所述抗肿瘤化疗药物为阿霉素。

优选地，所述药学上可接受的赋形剂或载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

优选地，所述药物组合物可为肌肉或静脉注射剂。

再一方面，本发明提供本发明所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为宫颈癌。

本发明人提供了一种新的编码具有促肿瘤细胞凋亡功能的小RNA的miRNA-185，全长为22bp。通过转染进入到肿瘤细胞内，发挥克服肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药性的功能。将转染了miRNA-185的肿瘤细胞进行低浓度的阿霉素处理及进行裸鼠皮下接种细胞通过尾静脉注射低浓度阿霉素，观察miRNA-185在细胞模型和裸鼠模型下的增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的功能，表明miRNA-185在细胞模型和裸鼠模型下均具有增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的功能，在低浓度抗肿瘤药物阿霉素处理的条件下即可有效的促进肿瘤细胞的凋亡，克服了肿瘤治疗中肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性问题。因此，miRNA-185可成为一种治疗肿瘤的药物，具体的可以将miRNA-185包裹成药物分子，即将miRNA-185与适当的载体或辅料连接成药物，通过静脉注射或肌肉注射的方式，辅助以低浓度的抗肿瘤药物，达到治疗肿瘤，减少毒副作用的目的。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表明miRNA-185在阿霉素处理的Hela细胞中的表达水平变化，图中dox表示抗肿瘤药物阿霉素，横坐标表示用抗肿瘤药物阿霉素对Hela细胞进行处理的时间，纵坐标表示以未处理的Hela细胞中miRNA-185的表达量为基准，在阿霉素处理过程中Hela细胞中miRNA-185的表达水平；

图2表明miRNA-185在Hela细胞中的促凋亡功能，台盼蓝染色法检测细胞凋亡，其中NC表示负对照，dox表示抗肿瘤药物阿霉素，a-f分别表示如下：

a表示在miRNA-185、负对照和阿霉素均不存在的情况下处理Hela细胞的结果，

b表示在miRNA-185存在，负对照和阿霉素不存在的情况下处理Hela细胞的结果，

c表示在miRNA-185和阿霉素不存在，负对照存在的情况下处理Hela细胞的结果，

d表示在miRNA-185和负对照不存在，0.2μM的阿霉素存在的情况下处理Hela细胞的结果，

e表示在负对照不存在，miRNA-185和0.2μM的阿霉素存在的情况下处理Hela细胞的结果，

f表示在miRNA-185不存在，负对照和0.2μM的阿霉素存在的情况下处理Hela细胞的结果；

图3表明自上海吉玛制药有限公司合成的miRNA-185模拟物：2′-O-甲基修饰的5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’在Hela细胞中的促凋亡功能，台盼蓝染色法检测细胞凋亡，其中，NC表示负对照，dox表示抗肿瘤药物阿霉素，a-c分别表示如下：

a表示在miRNA-185模拟物、负对照和阿霉素均不存在的情况下处理Hela细胞的结果，

b表示在miRNA-185模拟物和0.2μM的阿霉素存在，负对照不存在的情况下处理Hela细胞的结果，

c表示在负对照和0.2μM的阿霉素存在，miRNA-185模拟物不存在的情况下处理Hela细胞的结果；

图4表明miRNA-185在裸鼠水平上的促凋亡功能。

具体实施方式

除非另外说明，以下实施例中所用的负对照（NC）是指下式SEQ IDNO:2：所示的核苷酸：5’-GAAGCAAGGAUCUGAUCAGGUG-3’（SEQ IDNO:2），（由上海吉玛制药有限技术公司合成）。

除非另外说明，以下实施例中所用的引物均由上海吉玛制药有限技术公司合成。

除非另外说明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1阿霉素处理的Hela细胞中miRNA-185的表达水平检测

Hela细胞使用DMEM培养基（购自GBICO公司）在37℃，CO₂的浓度为5体积%的恒温培养箱中培养。至细胞融合度达到80%时，分别用浓度为2μM的抗肿瘤药物阿霉素（购自Sigma公司）处理细胞0h、1h、3h、6h、12h、24h后，弃去培养基，用Trizol收集细胞，按照提取RNA的常规步骤提取处理细胞的总RNA。紫外分光光度计检测其提取的质量和浓度后，应用逆转录酶（购自Toyobo公司）将提取的RNA反转录成cDNA（转录条件为42℃条件下反应1小时，95℃条件下3分钟灭活反转录酶，反转录的引物序列为5'-GTCGTATCCAATTCGCACTGGATACGACTCAGGA-3'（SEQ ID NO:7）），其中标黑带下划线的为在PCR检测中的下游引物，然后采用实时荧光定量PCR试剂盒（购自Takara公司），按照试剂盒操作说明书，对miRNA-185的表达水平进行检测，观察在阿霉素处理Hela细胞的过程中miRNA-185的表达变化。

PCR引物设计如下：

上游引物:5'-CATGGAGAGAAAGGCAGT-3'（SEQ ID NO:8），其中16个碱基为miRNA-185的基因编码序列中加黑框的部分；

下游引物:5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’-3’（SEQ ID NO:9）

PCR反应条件为：95℃30s预变性，95℃5s，58℃30s，72℃30s，循环45个反应。

结果如图1所述，结果显示随着阿霉素处理Hela细胞时间的增加，miRNA-185的表达水平呈现明显上升的趋势。

实施例2miRNA-185及负对照（negative control）腺病毒构建

应用基因组提取试剂盒（购自北京全式金生物技术有限公司）提取HEK-293细胞（购自ATCC，保藏编号CRL-1573）的基因组DNA，以此为模板，进行PCR扩增，得到近600bp的目的片段（SEQ ID NO:4），其包括miRNA-185的基因序列（SEQ ID NO:3）及上下游约各200bp序列，PCR引物设计如下：

上游引物:5’-GGCATGAGAGGGTGTTGGAAT-3’（SEQ ID NO:5）

下游引物:5’-GTAGGACAGACAGGCAGAAAG-3’（SEQ ID NO:6）

扩增得到的目的片段的序列如下：

5-′GCTGTGGTGGGCCTGTGTGGGGACCTTGTAGGACCTAGGGAACCTGCAGGGCTTGGCTTAGGGAGCACACAGGGGCCCAGGCAAAGGCAAGGTCACAGGTCGGGGGAGGTGAAGCTGGCAGGGGGAGGGGGAGACCTGCTGGCTAGAGCTGGGTTGGGGGCCGGTGGGCAGTGGGCCTGGCTCGAGC ATGACCGCGTCTTCGTCGAGGCCACAGCCCTTGGCTCTGCGCCCACACCTCCAGTGCCAGGCTGTCCGGAGATCTGTTTATGGCCTTCCCTTGGACCATGGAGCCCTCCCTGCCACTGGTGCCTGGAGGGCTGGTCTGCTGCCCCTGCACCCTGGCCAGCTAGGATGGTGGGGTCCTGCAGCTGAACTGGGGGTGC -3′（SEQ ID NO:4），其中带下划线加黑的为miRNA-185基因序列（SEQID NO:3），其余的为它的上下游序列，带下划线斜体的部分分别为上游引物序列和下游引物的反向互补序列。

PCR反应条件为：95℃3min预变性，95℃50s，55℃50s，72℃50s，循环30个反应，72℃总延伸10min。

得到的PCR产物亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno1.0-CMV系统，构建miRNA-185过表达腺病毒。按照公司说明书步骤，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架（Adenovirus LacZ Backbone）共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，HEK-293细胞扩增收集病毒，测定病毒滴度。同时将一段22bp的无义序列（5’-GAAGCAAGGAUCUGAUCAGGUG-3’，（SEQ ID NO:2），由上海吉玛制药有限技术公司合成）作为负对照按照上述同样的步骤，亚克隆连入Ambion公司的pSilencer Adeno1.0-CMV系统，将PacⅠ线性化的该载体与线性化的腺病毒骨架（Adenovirus LacZBackbone）共转染HEK-293细胞，构建得到负对照（negative control）的过表达腺病毒。

实施例3miRNA-185在Hela细胞中的促凋亡功能

Hela细胞（购自ATCC，保藏编号CCL-2）使用DMEM培养基（购自GBICO公司）在37℃，CO₂的浓度为5体积%的恒温培养箱中培养。至细胞融合度达到80%时，用实施例2构建的miRNA-185腺病毒和负对照（NC）腺病毒感染Hela细胞（作为对照），病毒感染24小时后，再以0.2μM低浓度阿霉素（购自Sigma公司）处理细胞24小时后，通过胰酶消化，再收集细胞，以0.4%台盼蓝染色收集的细胞3分钟，于显微镜下计数，计算miRNA-185对处理了低浓度阿霉素的Hela细胞的细胞凋亡的影响。结果如图2所示，表明过表达了miRNA-185的Hela细胞明显增强了对低浓度的阿霉素的敏感性，Hela细胞的死亡率大大增加。

为了进一步验证miRNA-185的促进肿瘤细胞凋亡的功能，进行以下试验：

DMEM培养基培养的Hela细胞，至细胞融合度达到80%时，采用Fugene HD转染试剂（购自Roche公司）转染miRNA-185的模拟物（由上海吉玛制药有限技术公司合成），序列为5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’（SEQ ID NO:1），其中在每一个碱基均进行了2′-O-甲基修饰。用负对照（NC）腺病毒感染Hela细胞24小时后，以0.2μM低浓度的阿霉素处理细胞24小时，然后用胰酶消化，收集细胞，以0.4%台盼蓝染色收集的细胞3分钟，然后在显微镜下计数，从而计算细胞凋亡比率。

结果如图3所示，表明合成的miRNA-185模拟物能够显著增强Hela细胞对低浓度阿霉素的敏感性，Hela细胞的死亡率大大增加。

实施例4miRNA-185在裸鼠水平上的促凋亡功能

将实施例2构建的miRNA-185腺病毒感染培养的Hela细胞作为miRNA-185组，及实施例2构建的负对照腺病毒同样感染培养的Hela细胞作为负对照组，感染病毒24小时后，胰酶消化收集细胞，接种1×10⁷个细胞于无胸腺的BALB/c裸鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）背部皮下，至裸鼠皮下瘤块长到200mm³时，于尾静脉注射2mg/kg阿霉素，每3天注射一次，并且每3天测量记录瘤块的体积，按公式：长×宽²/2计算，连续试验一个月。观察miRNA-185在裸鼠水平上的促凋亡功能。

结果如图4所示，结果表明同样处理低浓度的阿霉素药物，miRNA-185处理的细胞接种的裸鼠瘤块体积明显小于负对照组，说明在裸鼠水平上，miRNA-185的过表达明显的增强了肿瘤细胞对低浓度阿霉素药物的敏感性，在低浓度阿霉素处理下即可有效的抑制肿瘤细胞增殖，肿瘤细胞的体积比单纯用阿霉素减小了很多，克服了肿瘤细胞对化疗药物阿霉素的耐药性。

Claims

1.miRNA-185在制备用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物中的应用，所述miRNA-185的序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

SEQ ID NO:1：5’-UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA-3’。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-185的序列在每一个碱基上均进行了2′-O-甲基修饰。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤化疗药物，优选地，所述抗肿瘤化疗药物为阿霉素。

5.一种用于抗肿瘤疾病或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物组合物，该药物组合物包括治疗有效量的权利要求1至4任一项中所述的miRNA-185，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括抗肿瘤药物，优选地，所述抗肿瘤药物为抗肿瘤化疗药物，更优选地，所述抗肿瘤化疗药物为阿霉素。

7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的赋形剂或载体选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为肌肉或静脉注射剂。

9.根据权利要求5至8中任一项所述的药物组合物在制备用于抗肿瘤或增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性的药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为宫颈癌。