CN115369118A - Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用 - Google Patents

Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因治疗药物制备技术，具体是关于Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用。本发明的Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法，是通过CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵上进行Helz2基因敲除，再通过显微注射和配繁，获得Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型。本发明构建了Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型和发明了靶向Helz2基因治疗肿瘤的新疗法。本发明可为阐明Helz2在肿瘤发生发展中的作用机制提供可靠的动物模型，也为临床上针对Helz2基因在治疗和/或预防肿瘤的药物筛选和制备中提供靶点，并且提供了治疗肿瘤的新疗法。

Description

Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因治疗药物制备技术，具体是关于Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用。
背景技术
Helz2(Helicase with zinc finger 2)[OMIM 611265]，又称PRIC285或PDIP1，是一种2649个氨基酸的核解酶蛋白，也是过氧化物酶体增殖物激活受体α相互作用复合体(Peroxisome proliferator activated receptorαinteracting complex，PRIC)的一部分。Helz2由两个ATP结合序列、一个RNaseB结构域和双DNA/RNA解旋酶序列组成，其参与了多种与基因调控相关的机制，包括基因转录、mRNA加工和DNA修复。它可作为PPARα和PPARγ以及其他核受体(RXRA、THRA、THRB)的核转录共激活因子。
Helz2还参与细胞脂质、糖类代谢和肝脏代谢过程，与脂肪细胞分化和原发性胆汁性肝硬化密切相关。Helz2在人和小鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD)中的表达上调，其缺失激活了肝脏长型功能性瘦素受体(Functionalleptin receptor long form，Leprb)的表达，并抑制了肥胖小鼠的NAFLD发展和体重增加。据报道，Helz2的结合体PPARγ可以调节小鼠炎症基因如Ccl3、Ccl7、Cxcl10和Tgtp的表达。PPARγ在先天免疫反应中也发挥了重要作用并与免疫相关疾病有关，例如HCV/HIV感染、骨关节炎、痤疮。就其本身而言，Helz2能结合对免疫反应具有重要作用蛋白的能力，例如BCL6和ISG15。另外，Helz2被发现在哺乳动物中具有抗病毒功能，该基因被鉴定为是具有抗病毒免疫保守成分的干扰素刺激基因(Interferon stimulated gene，ISG)。此外，还发现了Helz2在IFN抗病毒反应中的介导作用，具体涉及Helz2转录和细胞核蛋白的上调，以及转录程序的激活。
然而，利用Helz2基因敲除小鼠模型在抗肿瘤方面的研究及应用未见报道。为了进一步阐明Helz2表达水平下降对肿瘤发生发展的影响，需要构建Helz2基因敲除小鼠，并对其进行肿瘤建模，为探究Helz2影响肿瘤细胞生长机制，抑制肿瘤发生发展的作用以及治疗和/或预防肿瘤的新方法提供动物模型。
CRISPR/Cas9基因组编辑系统是细菌适应性免疫系统的一部分，用于抵御来自噬菌体和质粒的侵入性核酸。CRISPR/Cas9基因编辑工具不仅功能强大，而且具有特异性强、效率高等特点，可以准确、快速地进行基因编辑。虽然有研究报道在细胞水平利用这一技术干扰Helz2基因表达的研究。但是未有利用CRISPR/Cas9系统获得纯合子Helz2基因敲除小鼠模型与相应的研究应用。也未有靶向Helz2基因或其表达的产物在肿瘤治疗当中的研究及应用。
基因靶向治疗正在成为一种重要的肿瘤治疗方法。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是在转录后水平抑制特定基因表达的最强大的靶向疗法之一。人工合成RNAi主要有两种类型：siRNA和shRNA。之前研究已经证明了siRNA具有以下局限性：细胞对其摄取能力不足、稳定性差、在体内外易于被降解和在临床实验中递送效率低。然而，病毒载体介导的shRNA具有长效而稳定的基因沉默能力。shRNA的慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，该载体能在哺乳动物各类细胞中稳定表达shRNA。这类载体已在相关肿瘤动物模型的临床数据库中得到验证。因此，慢病毒介导的shRNA策略是一种具有吸引力的肿瘤治疗候选疗法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种构建靶向Helz2基因敲除动物模型的方法，以及靶向干扰Helz2基因在肿瘤药物的制备或筛选和在肿瘤防治药物中的应用。
本发明的第一个方面，为一种Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法，其通过CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵上进行Helz2基因敲除，再通过显微注射和配繁，获得Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型(Helz2-Cas9-KO)。为探究Helz2基因与肿瘤之间的机理研究提供了理想的动物模型，也为Helz2-Cas9-KO小鼠模型在制备或筛选治疗和/或预防肿瘤药物中的应用提供了支撑。
进一步的，所述Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法包括如下步骤：
步骤一，靶向小鼠Helz2基因的sgRNA识别序列设计和构建sgRNA；通过对Helz2基因进行分析，确定具体的敲除区域后，根据靶基因设计一对相应的gRNA序列，并合成sgRNA序列；sgRNA序列包括，
SEQ ID No.1：5’-GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-CCTACACCCGACAGAGGTGTAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGCAGTGACAGTCTTATGGGTGG-3’；
SEQ ID No.4：5’-GGCATACAGAGGATTGCCACAGG-3’。
将合成的sgRNA序列在体外转录成mRNA；
步骤二，将步骤一中获得的mRNA与Cas9质粒一并通过显微注射的方式注射入小鼠受精卵中，培育后获得F0代小鼠。
步骤三，通过PCR和测序鉴定筛选出阳性F0代小鼠；
步骤四，F0代小鼠性成熟配繁，获得阳性F1代小鼠。
本发明的第二个方面，为上述方法获得的Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型在制备或筛选抗肿瘤和/或预防肿瘤药物中的应用。所述应用包括药物靶标的筛选、药物的筛选、药物的药效学评价和药物的安全性评价。
本发明的第三个方面，为一种用于构建Helz2基因敲除动物模型的sgRNA序列，其包括下述SEQ ID No.1-SEQ ID No.4基因序列中的一种或多种，
SEQ ID No.1：5’-GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-CCTACACCCGACAGAGGTGTAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGCAGTGACAGTCTTATGGGTGG-3’；
SEQ ID No.4：5’-GGCATACAGAGGATTGCCACAGG-3’。
本发明的第四个方面，为一种含有靶向Helz2基因的载体，其靶向干扰Helz2基因的靶点序列为下述基因序列中的一种或多种，
SEQ ID No.5：5’-GCTATCAAGTCTGTCACTACT-3’；
SEQ ID No.6：5’-GCACGATGCTGTATGGCTTTG-3’；
SEQ ID No.7：5’-GGGCCTCATTGACACTCAAAG-3’。
所述载体为慢病毒载体复合物、腺病毒、腺相关病毒、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、脂质体(LNPs)、聚合物(Polymers)、溶瘤病毒之一，或其它生物学上可接受的基因载体。
本发明的第五个方面，为上述含有靶向Helz2基因的载体在制备抑制Helz2基因表达的生物制剂中的应用。
本发明的第六个方面，为一种治疗和/或预防肿瘤药物，其含有靶向Helz2基因或其表达的产物。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种潜在治疗和/或预防肿瘤的关键靶点Helz2，借助于CRISPR/Cas9基因技术和shRNA干扰技术分别构建了Helz2-Cas9-KO小鼠模型和发明了靶向Helz2基因治疗肿瘤的新疗法。通过Helz2-Cas9-KO小鼠体内荷瘤实验和野生型小鼠荷瘤后经shRNA干扰介导的靶向Helz2基因治疗证实了敲除Helz2基因能够显著抑制肿瘤细胞的生长，并延长了小鼠的生存期。
本发明可为阐明Helz2基因在肿瘤发生发展中的作用机制提供可靠的动物模型，也为临床上针对Helz2基因在治疗和/或预防肿瘤的药物筛选和制备中提供靶点，并且还提供了靶向Helz2基因治疗肿瘤的新疗法，应用前景广泛。
附图说明
图1为Helz2-Cas9-KO小鼠策略设计图。
图2为电泳结果图。其中：B6为阴性对照，是B6基因组DNA；N为空白对照，无模板的对照；TRANS 2K PLUS II条带：8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
图3为实施例1中间皮瘤AE17荷瘤Helz2-Cas9-KO小鼠生存曲线。
图4为实施例2中间皮瘤40L荷瘤Helz2-Cas9-KO小鼠生存曲线。
图5为实施例3中卵巢癌ID8荷瘤Helz2-Cas9-KO小鼠生存曲线。
图6为实施例4中肺癌Lewis荷瘤Helz2-Cas9-KO小鼠生存曲线和肿瘤生长情况。
图7为实施例5中乳腺癌E0771荷瘤Helz2-Cas9-KO小鼠生存曲线。
图8为实施例7中sh-NC-AE17和sh-Helz2-AE17细胞荷瘤野生型小鼠生存曲线。
图9为实施例8中sh-Helz2治疗AE17荷瘤野生型小鼠模式图。
图10为实施例8中sh-Helz2治疗AE17荷瘤野生型小鼠生存曲线。
图11为实施例9中Helz2在泛癌中的表达情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
图1和图2显示了本发明实施例中Helz2-Cas9-KO小鼠策略设计图和电泳鉴定结果图。
实施例1：间皮瘤细胞株AE17细胞小鼠模型建立
首先，将8～10周龄小鼠分为两组，分别为野生型小鼠(wild-type)组和Helz2敲基因小鼠(knockout)组。然后，将处于对数生长期的间皮瘤细胞株AE17细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含1×105个细胞。最后，取100μl AE17细胞悬液分别接种于野生型小鼠(wild-type)和Helz2敲基因小鼠(knockout)腹腔中。每天观察小鼠情况。
结果显示：野生型小鼠荷瘤后于第50天开始死亡，至第127天全部死亡；Helz2敲基因小鼠荷瘤后一直均无明显腹水和异常以及死亡，观察截止于第174天。以上结果表明Helz2敲基因小鼠较野生型小鼠荷瘤后能够显著延长小鼠生存期(P＜0.001)，提示Helz2敲基因小鼠具有显著的抗间皮瘤AE17能力，见图3。
实施例2：间皮瘤细胞株40L细胞小鼠模型建立
首先，将8～10周龄小鼠分为两组，分别为野生型小鼠(wild-type)组和Helz2敲基因小鼠(knockout)组。然后，将处于对数生长期的间皮瘤细胞株40L细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含2×105个细胞。最后，取100μl 40L细胞悬液分别接种于野生型小鼠(wild-type)和Helz2敲基因小鼠(knockout)腹腔中。每天观察小鼠情况。
结果显示：野生型小鼠荷瘤后于第43天开始死亡，至第66天全部死亡；Helz2敲基因小鼠荷瘤后一直均无明显腹水和异常以及死亡，观察截止于第166天。以上结果表明Helz2敲基因小鼠较野生型小鼠荷瘤后能够明显延长小鼠生存期(P＜0.001)，提示Helz2敲基因小鼠具有显著的抗间皮瘤40L能力，见图4。
实施例3：卵巢癌细胞株ID8细胞小鼠模型建立
首先，将8～10周龄小鼠分为两组，分别为野生型小鼠(wild-type)组和Helz2敲基因小鼠(knockout)组。然后，将处于对数生长期的卵巢癌细胞株ID8细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含1×106个细胞。最后，取100μl ID8细胞悬液分别接种于野生型小鼠(wild-type)和Helz2敲基因小鼠(knockout)腹腔中。每天观察小鼠情况。
结果显示：野生型小鼠荷瘤后于第50天开始死亡，至第66天全部死亡；Helz2敲基因小鼠荷瘤后第65天开始死亡，最后死亡的Helz2敲基因小鼠于第86天死亡，还剩一只Helz2敲基因小鼠一直均无明显腹水和异常以及死亡，观察截止于第156天。以上结果表明Helz2敲基因小鼠较野生型小鼠荷瘤后能够明显延长小鼠生存期(P＝0.006)，提示Helz2敲基因小鼠具有显著的抗卵巢癌ID8能力，见图5。
实施例4：肺癌细胞株Lewis细胞小鼠模型建立
首先，将8～10周龄小鼠分为两组，分别为野生型小鼠(wild-type)组和Helz2敲基因小鼠(knockout)组。然后，将处于对数生长期的肺癌细胞株Lewis细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含2×106个细胞。最后，取100μl Lewis细胞悬液分别接种于野生型小鼠(wild-type)和Helz2敲基因小鼠(knockout)右肩胛皮下处。每天观察小鼠情况。
结果显示：野生型小鼠荷瘤后于第26天开始死亡，至第34天全部死亡；Helz2敲基因小鼠荷瘤后第31天开始死亡，至第68天全部死亡。以上结果表明Helz2敲基因小鼠较野生型小鼠荷瘤后能够明显延长小鼠生存期(P＝0.021)，有效抑制肿瘤生长，提示Helz2敲基因小鼠具有显著的抗卵巢癌抗肺癌Lewis能力，见图6。
实施例5：乳腺癌细胞株E0771细胞小鼠模型建立
首先，将8～10周龄小鼠分为两组，分别为野生型小鼠(wild-type)组和Helz2敲基因小鼠(knockout)组。然后，将处于对数生长期的乳腺癌细胞株E0771细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含8×104个细胞。最后，取100μl E0771细胞悬液分别接种于野生型小鼠(wild-type)和Helz2敲基因小鼠(knockout)腹腔中。每天观察小鼠情况。
结果显示：野生型小鼠荷瘤后于第26天开始死亡，至第33天全部死亡；Helz2敲基因小鼠荷瘤后一直均无明显腹水和异常以及死亡，观察截止于第90天。以上结果表明Helz2敲基因小鼠较野生型小鼠荷瘤后能够明显延长小鼠生存期(P＝0.001)，提示Helz2敲基因小鼠具有显著的抗乳腺癌E0771能力，见图7。
实施例6：慢病毒感染构建稳定敲减Helz2基因的间皮瘤细胞株AE17细胞(sh-Helz2-AE17)
将对数生长期的AE17细胞按每孔2000个细胞接种于96孔中，待细胞密度为40％-60％时进行sh-Helz2感染AE17细胞，每组3个复孔，以sh-NC作为对照组(sh-NC-AE17)；将滴度为108的慢病毒原液稀释为三个梯度：原液、10倍稀释、100倍稀释；将三个不同浓度的病毒液体，各取10μl至每组的3个复孔中，每孔加入1:1000的polybrene(终浓度为5μg/ml)，十字混匀，将细胞放回细胞培养箱孵育；24小时后更换为新鲜培养基；感染72-96小时后，观察荧光的表达情况，通过预实验确定感染细胞的最佳稀释倍数，实验发现AE17细胞感染的最佳浓度为原液，因此采用原液浓度进行正式感染；在感染前进行72小时最低杀死细胞量的嘌呤霉素预实验，提前在24孔板培养AE17细胞至对数生长期，加入不同浓度的嘌呤霉素(1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml、10μg/ml)，72小时后挑选最低杀死细胞浓度；实验挑选的最低杀死细胞浓度是3μg/ml；AE17细胞感染后连续培养一周，期间将AE17细胞从96孔板消化转移至6孔板，进行嘌呤霉素筛选，筛选培养1个月，即可获得稳定敲减Helz2基因的AE17(sh-Helz2-AE17细胞)。
实施例7：构建慢病毒感染的AE17细胞(sh-NC-AE17细胞和sh-Helz2-AE17细胞)荷瘤野生型小鼠模型
首先，将8～10周龄野生型小鼠分为两组，分别为sh-NC-AE17组和sh-Helz2-AE17组。然后，将处于对数生长期的sh-NC-AE17细胞和sh-Helz2-AE17细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含3×105个细胞。最后，取100μl的sh-NC-AE17细胞和sh-Helz2-AE17细胞液分别接种于野生型小鼠腹腔中。每天观察小鼠情况。
结果显示：sh-NC-AE17组小鼠荷瘤后于第35天开始死亡，至第48天全部死亡；sh-Helz2-AE17组小鼠荷瘤后于第63天死亡一只小鼠，剩余小鼠无明显腹水和异常，观察截止于第182天。以上结果发现与sh-NC-AE17组相比，sh-Helz2-AE17组小鼠能够显著延长荷瘤小鼠的生存期(P＝0.025)，提示经过慢病毒sh-Helz2感染后的AE17细胞体内成瘤能力显著减弱，见图8。
实施例8：shRNA干扰介导的靶向Helz2基因治疗AE17荷瘤野生型小鼠模型
首先，将8～10周龄小鼠分为四组，分别为sh-NC对照组和sh-Helz2-1、sh-Helz2-2、sh-Helz2-3治疗组。然后，将处于对数生长期的间皮瘤细胞株AE17细胞经胰酶消化后，PBS洗涤1次，调整活细胞浓度为每100μl体积中含1×105个细胞。最后，取100μl AE17细胞悬液分别接种于野生型小鼠腹腔中。
将10μl的滴度为108慢病毒原液sh-NC和sh-Helz2分别加入到90μl的无菌PBS中稀释，即获得100μl的慢病毒使用液。于接种肿瘤细胞第12小时，使用慢病毒使用液sh-NC和sh-Helz2分别注射到荷瘤野生型小鼠腹腔中，注射体积为上述稀释后100μl的慢病毒使用液。此为第1次使用慢病毒sh-Helz2治疗。于第1次治疗间隔3天，按第1次方式重复再次治疗。此为第2次使用慢病毒sh-Helz2治疗。于第2次治疗间隔3天，按第1次方式重复再次治疗。此为第3次使用慢病毒sh-Helz2治疗。于第3次治疗间隔3天，按第1次方式重复再次治疗。此为第4次使用慢病毒sh-Helz2治疗。于第4次治疗间隔7天，按第1次方式重复再次治疗。此为第5次使用慢病毒sh-Helz2治疗。于第5次治疗间隔7天，按第1次方式重复再次治疗。此为第6次使用慢病毒sh-Helz2治疗。治疗间隔时间如图9所示，一共治疗6次。
结果显示：sh-NC对照组荷瘤小鼠于第51天开始死亡，至第63天全部死亡；sh-Helz2-1治疗组荷瘤小鼠于第52天开始死亡，至第92天全部死亡(P＝0.197)；sh-Helz2-2治疗组荷瘤小鼠于第74天开始死亡，剩余一只小鼠无明显腹水和异常，观察截止于第113天(P＝0.025)；sh-Helz2-3治疗组荷瘤小鼠于第63天开始死亡，剩余两只小鼠无明显腹水和异常，观察截止于第113天(P＝0.063)。以上结果表明与sh-NC对照组相比，sh-Helz2治疗组能够显著延长荷瘤小鼠的生存期，提示针对Helz2基因为靶点开发的慢病毒运载的shRNA(sh-Helz2)能够有效的治疗荷瘤小鼠，提升生存时间和生存质量，见图10。
实施例9：为了探究Helz2基因在其它类型肿瘤中的表达情况，利用数据库TCGA和GTEx共分析了15776例样本，结果发现，膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸润癌(BRCA)、宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形成性胶质细胞瘤(GBM)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、急性髓细胞样白血病(LAML)、脑低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺癌(PAAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、胃癌(STAD)、睾丸癌(TGCT)、甲状腺癌(THCA)和子宫内膜癌(UCEC)共25类肿瘤中均高表达Helz2(*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001)，见图11，提示在这些肿瘤中，针对Helz2基因靶点进行干扰也具有同实施例8一样具有治疗肿瘤的作用。
序列表
<110> 江苏康可得生物技术股份有限公司
<120> Helz2基因在肿瘤防治药物中的应用
<130> 2022
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gccccagagt taccagatgg agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
cctacacccg acagaggtgt agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
agcagtgaca gtcttatggg tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggcatacaga ggattgccac agg 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
gctatcaagt ctgtcactac t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gcacgatgct gtatggcttt g 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gggcctcatt gacactcaaa g 21

Claims (9)

1.一种Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征是：通过CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵上进行Helz2基因敲除，再通过显微注射和配繁获得Helz2全身性基因敲除的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的Helz2基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征是：用于敲除小鼠Helz2基因的sgRNA序列包括下述SEQ ID No.1-SEQ ID No.4基因序列中的一种或多种，
SEQ ID No.1：5-GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-CCTACACCCGACAGAGGTGTAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGCAGTGACAGTCTTATGGGTGG-3’；
SEQ ID No.4：5’-GGCATACAGAGGATTGCCACAGG-3’。
3.一种权利要求1所述Helz2全身性基因敲除的纯合小鼠模型在在制备或筛选抗肿瘤和/或预防肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征是：所述应用包括药物靶标的筛选、药物的筛选、药物的药效学评价和药物的安全性评价。
5.一种用于构建Helz2基因敲除动物模型的sgRNA序列，其特征是：包括下述SEQ IDNo.1-SEQ ID No.4基因序列中的一种或多种，
SEQ ID No.1：5’-GCCCCAGAGTTACCAGATGGAGG-3’；
SEQ ID No.2：5’-CCTACACCCGACAGAGGTGTAGG-3’；
SEQ ID No.3：5’-AGCAGTGACAGTCTTATGGGTGG-3’；
SEQ ID No.4：5’-GGCATACAGAGGATTGCCACAGG-3’。
6.一种含有靶向Helz2基因的载体，其特征是：其靶向干扰Helz2基因的靶点序列为下述基因序列中的一种或多种，
SEQ ID No.5：5’-GCTATCAAGTCTGTCACTACT-3’；
SEQ ID No.6：5’-GCACGATGCTGTATGGCTTTG-3’；
SEQ ID No.7：5’-GGGCCTCATTGACACTCAAAG-3’。
7.根据权利要求6所述的含有靶向Helz2基因的载体，其特征是：所述载体为慢病毒载体复合物、腺病毒、腺相关病毒、N-乙酰半乳糖胺、脂质体、聚合物、溶瘤病毒之一，或其他生物学上可接受的基因载体。
8.一种权利要求6所述的含有靶向Helz2基因的载体在制备抑制Helz2基因表达的生物制剂中的应用。
9.一种治疗和/或预防肿瘤药物，其特征在于：其含有靶向干扰Helz2基因或其表达的产物。
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