CN105288660B - MiRNA-22在制备MMP14和Snail表达抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miRNA‑22、miRNA‑22mimics或miRNA‑22agomir在制备MMP14和Snail表达抑制剂，或MMP14和Snail过度表达所致肿瘤的治疗药物，或抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的试剂中的应用，为开发新型肿瘤治疗药物提供了新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及miRNA-22在制药上的用途。
背景技术
胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率居各类肿瘤之首，而且预后较差。每年约有17万人死于胃癌，几乎接近全部恶性肿瘤死亡人数的1/4。
微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长度约为20～25nt的内源性非编码RNA分子，普遍存在于真核生物中。它不编码蛋白质或多肽，而是与靶基因的信使RNA(mRNA)的3’-非翻译区(3’-UTR)互补结合，诱导靶mRNA的降解或者抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调控作用。研究表明，大约50％的miRNAs在基因组上定位于肿瘤相关区域或脆性位点(fragile site)。MiRNAs作为一类新的癌基因或抑癌基因，其表达失衡与多种肿瘤发生密切相关。MiRNA-22位于染色体17p13(1,563,947bp-1,564,031bp)，被证实在诸如结肠癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、食道癌等多种肿瘤中表达下调，在肿瘤细胞的生长、分化和转移方面发挥着重要的调控作用，是一类新的抑癌基因。
肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物学特征，是引起恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因。基质金属蛋白酶MMP14是细胞外基质降解过程中的重要酶类，对细胞外基质包括基底膜均有降解作用，从而破坏了机体防御肿瘤侵袭与转移的能力，增强了肿瘤的侵袭性。此外，MMP14还能够促进细胞分泌proMMP2和proMMP9。Snail在细胞水平调节细胞间的黏附，是上皮型钙粘蛋白(E-cadherin)重要的转录抑制子，其过度表达会促进细胞迁移以及诱导上皮细胞向间充质细胞转化，从而引起肿瘤的发展、侵袭和转移。近来研究发现，MMP14和Snail基因在胃癌组织中的表达上调，与胃癌的发生、发展和转移密切相关。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于对MMP14和Snail基因与miRNA-22之间的关系进行深入研究，为寻找新型肿瘤治疗药物提供新的思路和方法。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1.MiRNA-22、miRNA-22mimics或miRNA-22agomir在制备MMP14和Snail表达抑制剂中的应用。
MiRNA mimics(又称miRNA模拟物)是针对miRNA的成熟体设计并合成的小片段双链miRNA，作用与miRNA的成熟体相同，可以上调细胞内相应miRNA的含量，但结构略有不同。MiRNA agomir是在化学合成的mimics的基础上，经过特殊化学修饰升级的产品，结构与使用方式与mimics有不同，但作用是一样的，都是使得内源性的miRNA上调。与miRNA mimic相比，miRNA agomir在动物体内具有更高的稳定性和miRNA活性，更易通过细胞膜、组织间隙而富集于靶细胞，在动物实验中可以用全身或局部注射等方法进行给药，作用效果持续时间长。
2.MiRNA-22、miRNA-22mimics或miRNA-22agomir在制备MMP14和Snail过度表达所致肿瘤的治疗药物中的应用。
进一步，所述肿瘤为胃癌。
进一步，所述治疗药物是抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的药物。
进一步，所述治疗药物是抑制胃癌细胞增殖、腹腔播散和肺转移的药物。
3.MiRNA-22、miRNA-22mimics或miRNA-22agomir在制备抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的试剂中的应用。
进一步，所述胃癌细胞为SGC-7901细胞或HGC-27细胞。
本发明的有益效果在于：本发明对MMP14和Snail基因与miRNA-22之间的关系进行了深入研究，以胃癌为肿瘤模型。研究结果表明，MMP14和Snail基因为miRNA-22的靶基因，miRNA-22能够通过抑制MMP14和Snail的表达进而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和转移，尤其对胃癌细胞的转移具有良好的抑制作用。因此，miRNA-22、miRNA-22mimics或miRNA-22agomir不仅可以用于制备MMP14和Snail表达抑制剂，以及抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的试剂，更重要的是可以用于制备MMP14和Snail过度表达所致肿瘤的治疗药物，从而为开发新型肿瘤治疗药物提供了新的思路和方法。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为荧光素酶实验的结果。
图2为细胞转染后免疫印迹实验的结果：1泳道为阴性对照miR-NC组，2泳道为miR-22mimics组。
图3为MiR-22和MMP14pcDNA或Snail pcDNA共转染免疫印迹实验的结果：1泳道为阴性对照miR-NC组，2泳道为miR-22mimics组，3泳道为miR-22mimics+pcDNA3.1-MMP14组或miR-22mimics+pcDNA3.1-Snail组。
图4为miR-22通过抑制MMP14和Snail的表达抑制肿瘤细胞侵袭(左)和转移(右)的实验结果。
图5为建立裸鼠胃癌模型的实验结果。
图6为体内腹腔播散实验的结果。
图7为体内腹腔播散成瘤后免疫印迹实验的结果：1泳道为阴性对照组，2泳道为Agomir-22组。
图8为体内肿瘤转移实验的结果：A为肺组织HE染色，B为Agomir-22组和阴性对照组中发生和没有发生肿瘤肺部转移的裸鼠数量。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照试剂制造厂商所建议的条件进行。
肿瘤侵袭(ECM550)试剂盒和细胞迁移分析(ECM220)试剂盒购自Millipore公司；野生型MMP14-3’UTR，Snail-3’UTR和突变型MMP14-3’UTR，Snail-3’UTR的正、反义序列由上海生工生物工程有限公司合成；MMP14和Snail一抗购自Abcam公司；GAPDH一抗购自Cellsignaling公司；miR-22mimics和阴性对照miR-NC、Agomir-22和Agomir阴性对照购自RIBOBIO公司；CCK8试剂盒购自Beyotime公司；内参质粒pRL-TK和双荧光素酶报告基因检测系统购自Promega公司；质粒pcDNA3.1-MMP14和pcDNA3.1-Snail购自百恩维生物科技公司；SGC-7901细胞和HGC-27细胞购自ATCC细胞库。
实施例1 荧光素酶实验证实MMP14和Snail基因为miR-22的靶基因
合成野生型(wt)MMP14-3’UTR、Snail-3’UTR和突变型(mut)MMP14-3’UTR，Snail-3’UTR寡核苷酸序列。具体方法如下：
野生型MMP14-3’UTR正义序列：CCTTGCCCAAACTCAGGCAGCTG(SEQ ID No.1)
野生型MMP14-3’UTR反义序列：CAGCTGCCTGAGTTTGGGCAAGG(SEQ ID No.2)
野生型Snail-3’UTR正义序列：GATGCCCCGAGCCCAGGCAGCTA(SEQ ID No.3)
野生型Snail-3’UTR反义序列：TAGCTGCCTGGGCTCGGGGCATC(SEQ ID No.4)
突变型MMP14-3’UTR正义序列：CCTTGCCCAAACTCAGGTTCATG(SEQ ID No.5)
突变型MMP14-3’UTR反义序列：CATGAACCTGAGTTTGGGCAAGG(SEQ ID No.6)
突变型Snail-3’UTR正义序列：GATGCCCCGAGCCCAGGTCAGTA(SEQ ID No.7)
突变型Snail-3’UTR反义序列：TACTGACCTGGGCTCGGGGCATC(SEQ ID No.8)
将上述成对的正义序列和反义序列两条核苷酸片段按1μg/μL的浓度各取2μL，与1×退火缓冲液(10mM、pH8.0的Tris+50mM NaCl+1mM EDTA)46μL混合，于90℃放置3min再30℃放置1h进行退火，分别制得野生型MMP14-3’UTR、野生型Snail-3’UTR、突变型MMP14-3’UTR和突变型Snail-3’UTR寡核苷酸序列。
将microRNA荧光素酶报告质粒pMIR-REPORT用Hind III和Spe I双酶切后，与上述野生型MMP14-3’UTR、野生型Snail-3’UTR、突变型MMP14-3’UTR或突变型Snail-3’UTR寡核苷酸序列进行连接，分别制得野生型MMP14-3’UTR重组质粒pMIR-wt-MMP14-3’UTR、野生型Snail-3’UTR重组质粒pMIR-wt-Snail-3’UTR、突变型MMP14-3’UTR重组质粒pMIR-mut-MMP14-3’UTR和突变型Snail-3’UTR重组质粒pMIR-mut-Snail-3’UTR。将HEK293细胞接种于96孔板中，24h后细胞贴壁达50％时，将miR-22mimics或阴性对照miR-NC，与重组质粒pMIR-wt-MMP14-3’UTR、pMIR-wt-Snail-3’UTR、pMIR-mut-MMP14-3’UTR或pMIR-mut-Snail-3’UTR，以及内参质粒pRL-TK共转染HEK293细胞，具体操作按照脂质体2000试剂盒说明书进行。转染24h后，用双荧光素酶报告基因检测系统处理裂解细胞，用GloMAX20/20发光检测仪检测荧光强度。
结果见图1，与阴性对照相比，野生型MMP14-3’UTR在加入miR-22mimics后荧光强度变弱，而突变型MMP14-3’UTR在加入miR-22mimics后荧光强度几乎不变，说明MMP14基因的3’UTR含有miR-22的结合位点，MMP14基因是miR-22的靶基因；同样，野生型Snail-3’UTR在加入miR-22mimics后荧光强度变弱，而突变型Snail-3’UTR在加入miR-22mimics后荧光强度几乎不变，说明Snail基因的3’UTR含有miR-22的结合位点，Snail基因是miR-22的靶基因。
实施例2 细胞转染后免疫印迹实验证实miR-22抑制胃癌细胞中MMP14和Snail的表达
用6孔板分别培养SGC-7901细胞和HGC-27细胞，至细胞贴壁生长汇合率达到50％时，用脂质体2000试剂盒转染：用Opti-MEM I reduced serum medium培养基按体积比25:1稀释lipofectamine 2000，轻轻混合后室温放置5min，得转染试剂；另将50nM mir-22mimics或阴性对照miR-NC 15μL加入opti-MEM I reduced serum medium培养基750μL中，轻轻混合后室温静置5min，从中吸取750μL，与之前制备的转染试剂750μL充分混匀，室温孵育20min后吸取250μL加至细胞培养孔中，轻摇混匀后37℃孵育细胞18-48h。将转染后的全细胞用细胞裂解缓冲液裂解，12000rpm离心15min，收集上清，BCA法测定蛋白浓度，然后取20μg蛋白，经10％SDS-PAGE分离后，湿法转印至PVDF膜上，根据marker标示切下MMP14和Snail、GAPDH的条带区域，用5％脱脂奶粉溶液封闭后，分别用MMP14和Snail一抗(1:500稀释)、GAPDH一抗(1:5000稀释)孵育过夜，再加入辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG孵育1h，用持久性化学发光底物试剂(supersignal west dura extended durationsubstrate)处理并曝光显示。结果见图2，与阴性对照相比，两种细胞过表达miR-22后MMP14和Snail蛋白表达水平均降低，表明细胞过表达miR-22能够显著抑制其靶基因MMP14和Snail的蛋白表达水平。
实施例3 细胞侵袭和转移实验证实miR-22通过抑制MMP14和Snail的表达进而抑制胃癌细胞的侵袭和转移
MiR-22和MMP14pcDNA或Snail pcDNA共转染免疫印迹实验：将SGC-7901细胞接种于6孔板中，24h后细胞贴壁达50％时，将miR-22mimics或阴性对照miR-NC转染SGC-7901细胞，或将miR-22mimics与质粒pcDNA3.1-MMP14或pcDNA3.1-Snail共转染SGC-7901细胞，具体操作按照脂质体2000试剂盒说明书进行，转染完毕后进行免疫印迹实验。结果见图3，与阴性对照组相比，miR-22mimics组的MMP14和Snail表达水平均降低，而miR-22mimics+pcDNA3.1-MMP14组以及miR-22mimics+pcDNA3.1-Snail组的MMP14和Snail表达水平变化不大。
细胞侵袭和转移实验：SGC-7901细胞和HGC-27细胞分别转染miR-22mimics、阴性对照miR-NC、miR-22mimics+pcDNA3.1-MMP14、miR-22mimics+pcDNA3.1-Snail，然后分别用肿瘤侵袭(ECM550)试剂盒和细胞迁移分析(ECM220)试剂盒测定转染后能够穿透膜的细胞数目。具体操作步骤如下：1)用无血清培养基清洗transwell小室2小时；2)消化法从细胞培养瓶中获取细胞，用RPMI1640培养基洗3遍后，用含有1％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞至细胞浓度为5×105个/mL；3)上室加入200μL浓度为5×105个/mL的细胞悬液，下室加入600μL含有10％FBS的RPMI1640培养基(含有5μg/mL纤维蛋白作为黏连亚族)，37℃培养20-24h；4)培养完毕后，用棉签擦去上室上面的非侵袭细胞，移去transwell，倒置，风干；5)将小室置于加有500μL含有0.1％结晶紫染色液的24孔板中，37℃条件下使膜浸没在培养液中30min；6)取出小室，PBS清洗后，拍照并计数。结果见图4，与阴性对照组相比，转染miR-22mimcs后，两种细胞的侵袭和转移均不同程度受到抑制，而共转染miR-22mimics+pcDNA3.1-MMP14或miR-22mimics+pcDNA3.1-Snail后，两种细胞的侵袭和转移水平基本恢复。
上述实验结果表明：miR-22通过抑制MMP14和Snail的表达进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。
实施例4 动物实验证实miR-22具有显著抑制胃癌细胞增殖、侵袭和转移的作用
利用5μM Agomir-22过表达SGC-7901细胞中miR-22的表达，同时设置阴性对照组(同样浓度的Agomir阴性对照)。将已经稳定过表达成熟miR-22的SGC-7901细胞重悬于PBS中制成浓度为5×105个/mL的细胞悬液。
建立裸鼠胃癌模型：选取5-6周龄的雌性裸鼠，皮下注射上述细胞悬液100μL至裸鼠腋窝，连续5周观察记录肿瘤的大小。结果见图5，过表达miR-22的SGC-7901细胞注射裸鼠5周后，agomir-22组的肿瘤体积显著小于阴性对照组，提示miR-22具有显著抑制胃癌细胞增殖的作用。
体内腹腔播散实验：选取5-6周龄的雌性裸鼠，腹腔注射上述细胞悬液100μL，4周后处死裸鼠，打开腹腔记录肿瘤结节的数目。结果见图6，agomir-22组的肿瘤结节数目显著低于阴性对照组，提示miR-22能够显著抑制肿瘤的腹腔播散。另取腹腔内形成的肿瘤细胞进行免疫印迹实验。结果见图7，与阴性对照组相比，agomir-22组的MMP14和Snail表达水平均降低。
体内肿瘤转移实验：选取5-6周龄的雌性裸鼠，尾静脉注射上述细胞悬液100μL，5周后处死裸鼠，取出肺组织，固定后做HE染色，显微镜下观察肿瘤结节。结果见图8，agomir-22组的肺部转移灶数目显著低于阴性对照组，提示miR-22能够显著抑制胃癌细胞的肺转移。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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1.MiRNA-22、miRNA-22mimics 或miRNA-22agomir 在制备MMP14 和Snail 表达抑制剂中的应用。
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