CN110684841A - let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用 - Google Patents

let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供提供let‑7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用。主要呈现以下方面应用：(1)rSjP40在人LX‑2细胞株中上调let‑7b和其启动子的表达；(2)let‑7b参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程；(3)rSjP40可促进肝组织中let‑7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关。本发明通过日本血吸虫重组虫卵蛋白P40(recombinant Schistosoma japonicum p40,rSjP40)抑制人肝星状细胞活化过程中let‑7b的作用及分子机制，建立基于基因水平的抑制血吸虫感染肝纤维化，得到let‑7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，从而有望在未来解决血吸虫感染肝纤维化的问题。

Description

let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物 方面的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用。
背景技术
肝纤维化是一种旨在维持器官完整性的可逆性伤口愈合过程，纤维化通常由各种因素引起的慢性肝损伤引起，主要是病毒感染，血吸虫病和酒精中毒等。虽然已经证明许多药物在体外和动物模型中具有抗纤维化活性，但是这些药物中没有一种在临床上被证明是有效的。
肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSC,HSCs)在其启动、进展和消退中通过分泌促进门静脉纤维细胞，成纤维细胞和骨髓来源的肌成纤维细胞的纤维化因子来产生胶原蛋白，从而形成纤维化。了解肝纤维化的分子机制及其与HSC的关系对于发现新的治疗靶标至关重要。
血吸虫病是一种主要的慢性疾病，发生在生活在流行地区的人类，这是由于寄生虫卵的积累引起的大量病理性肝纤维化。来自被捕获的卵子的持续抗原刺激导致免疫细胞募集到感染部位，导致周围肉芽肿的形成和最终的纤维化。血吸虫虫卵蛋白(SjP40)是日本血吸虫的主要虫卵抗原，能减少肝星状细胞中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达，减轻肝纤维化。另外，重组的日本血吸虫虫卵蛋白rSjp40能够在体外抑制HSCs的活化，这种抑制作用能调节胶原表达。
微小RNA(miRNA)是高度保守的、小的非编码RNA，其在转录后调节基因表达的基本生物过程的，以及细胞应答。在肝脏中，miRNA特征与肝性脑病，肝硬化和肝癌有关。miRNA在肝病发生发展中的生物学意义和治疗潜力是一个快速发展的领域。虽然很多研究集中在miRNA在纤维化不同通路上的调节，但是其中关于调节HSCs在纤维化进程中的关键miRNA的报道却很少受到关注。Let-7(let-7)家族由位于9条不同染色体上的13个成员组成，其成员调节细胞周期，细胞分化，凋亡；关于Let-7(let-7)、SjP40共同针对血吸虫感染肝纤维化的治疗方法或药物尚未有研究。
发明内容
本发明提供let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，以解决背景技术中所提出的问题。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用。
进一步的，主要呈现以下方面应用：(1)rSjP40在人LX-2细胞株中上调let-7b和其启动子的表达；(2)let-7b参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程；(3)rSjP40可促进肝组织中let-7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关。
进一步的，具体包括以下方面：
(1)rSjP40在人LX-2细胞株中上调let-7b和其启动子的表达；
(1-1)利用rSjP40处理人LX-2细胞株，检测rSjP40在抑制人LX-2细胞株活化过程中let-7b及I型胶原相关变化；
(1-2)利用rSjP40刺激转染了let-7b启动子质粒的人LX-2细胞株，检测rSjP40对let-7b启动子活性表达的作用；
(2)let-7b参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程；
(2-1)筛选及确认let-7b的靶基因；
(2-2)将let-7b抑制物及其对照转染至人LX-2细胞株，使用rSjP40刺激处理转染抑制物后的人LX-2细胞株，观察rSjP40在抑制人LX-2细胞活化过程中let-7b及其靶基因发挥的作用；
(3)rSjP40可促进肝组织中let-7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关；
(3-1)构建小鼠肝纤维化模型，天狼星红染色，观察rSjP40对胶原变化的影响；
(3-2)检测小鼠肝纤维化模型中胶原和let-7b的变化，检测rSjP40对胶原和let-7b的影响。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明通过日本血吸虫重组虫卵蛋白P40(recombinant Schistosoma japonicum p40,rSjP40)抑制人肝星状细胞活化过程中let-7b的作用及分子机制，建立基于基因水平的抑制血吸虫感染肝纤维化，得到let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，从而有望在未来解决血吸虫感染肝纤维化的问题。
附图说明
图1为本发明的实施例中rSjP40在人LX-2细胞株中影响let-7b的表达图。
图2为本发明的实施例中pGL3-let-7b启动子质粒单双酶切琼脂糖凝胶结果图。
图3为本发明的实施例中rSjP40增强let-7b启动子活性的表达图。
图4为本发明的实施例中在人LX-2细胞株中，collagenI和TGFβRI与let-7b的关系图；其中，图4A为TargetScan软件预测collagen I3’UTR和TGFβRI 3’UTR与let-7b结合位点示意图；图4B为Western blot检测let-7b对collagen I3’UTR和TGFβRI 3’UTR的表达水平的影响，与对照组相比，*P＜0.05；图4C为Western blot检测转染let-7b inhibitor的人LX-2细胞加入rSjP40刺激后观察与HSCs活化有关的I型胶原、TGFβRI和α-SMA蛋白的表达变化，与对照组相比，*P＜0.05。
图5为本发明的实施例中构建psiCHECK2-collagen I 3’UTR突变型质粒示意图；其中，图5A:突变序列两次PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；图5B为psiCHECK2-collagen I 3’UTR突变型质粒单双酶切琼脂糖凝胶电泳验证图。
图6为本发明的实施例中psiCHECK2-collagen I 3’UTR野生型与突变型双荧光素酶报告基因检测结果图。
图7为本发明的实施例中psiCHECK2-collagen I 3’UTR突变型(MUT)双荧光素酶报告基因检测结果图。
图8为本发明的实施例中构建rSjP40与CCL4处理的小鼠肝纤维化模型，天狼星红染色图。
图9为本发明的实施例中小鼠肝纤维化模型中胶原和let-7b的RT-qPCR检测结果图。
图10为本发明的实施例中小鼠肝纤维化模型小鼠肝组织RT-qPCR检测胶原表达结果图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，具体包括以下方面：
在已转染let-7b抑制物的人LX-2细胞株加入rSjP40刺激，观察相关纤维化标记物的变化，利用rSjP40处理转染了let-7b启动子的LX-2细胞，观察let-7b启动子活性的变化得出：
(1)rSjP40在人LX-2细胞株中上调let-7b和其启动子的表达：
(1-1)利用rSjP40处理人LX-2细胞株，检测rSjP40在抑制人LX-2细胞株活化过程中let-7b及I型胶原相关变化，使用RT-qPCR检测rSjP40对let-7b的表达影响。本发明中，在人LX-2细胞株中加入rSjP40(20μg/ml)后48小时检测let-7b的具体变化，经RT-qPCR检测显示let-7b的表达在48小时明显上升，与对照组相比，*P＜0.05，如图1所示，RT-qPCR检测结果说明在rSjP40能促进let-7b的表达。
(1-2)利用rSjP40刺激转染了let-7b启动子质粒的人LX-2细胞株，检测rSjP40对let-7b启动子活性表达的作用；本发明以提取的人LX-2细胞全基因组DNA为模板，以及设计好的let-7b启动子引物，采用PCR扩增let-7b启动子序列片段(1478bp)。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示在1478bp处有一光亮条带与目的条带大小吻合，符合预期结果然后经过连接、转化、挑菌等步骤，进行单双酶切验证成功以后。经上海生工公司进行测序表明结果符合预期，表明pGL3-let-7b启动子质粒构建成功，pGL3-let-7b启动子质粒单双酶切琼脂糖凝胶电泳检测图，如图2所示，其中，MarkerA为λ-HindⅢdigest DNA，1为pGL3-Basic单酶切，2为质粒单酶切，3为质粒双酶切，4为菌液PCR，MarkerB为DL2000 DNA。
双荧光素酶报告基因检测结果显示rSjP40对let-7b启动子活性的影响，本发明在转染了let-7b启动子的肝星状细胞中加入rSjP40后检测荧光素酶活性。如图3所示，结果显示，与pGL3-Basic组相比，转染pGL3-miR-155启动子组荧光活性增高；与转染pGL3-miR-155启动子组相比，rSjP40和pGL3-miR-155启动子共处理组荧光活性显著增高，双荧光素酶报告基因检测结果显示rSjP40对let-7b启动子活性的影响，与对照组相比，*P＜0.05。NS代表P>0.05；rSjP40能够增强let-7b启动子活性。
(2)let-7b通过直接靶向collagen I-3’UTR区抑制I型胶原表达，参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程：
(2-1)筛选及确认let-7b的靶基因；如图4A为TargetScan软件预测collagen I3’UTR和TGFβRI 3’UTR与let-7b结合位点示意图。Western blot检测let-7b对collagen I3’UTR和TGFβRI 3’UTR的表达水平的影响，与对照组相比，*P＜0.05；如图4B所示，本发明在研究人LX-2细胞中I型胶原和TGFβRI与let-7b的之间的相互关系，在人LX-2细胞中转染了let-7b的模拟物和let-7b抑制剂用Western blot来检测相应蛋白的表达变化。最终Western blot显示I型胶原和TGFβRI蛋白水平在转染let-7b模拟物后的表达均会下降，而转染let-7b抑制剂组两者都表达上调。
(2-2)将let-7b抑制物及其对照转染至人LX-2细胞株，使用rSjP40刺激处理转染抑制物后的人LX-2细胞株，观察rSjP40在抑制人LX-2细胞活化过程中let-7b及其靶基因发挥的作用。
本发明进一步确认let-7b与rSjP40之间的关系，在转染了let-7b抑制物的人LX-2细胞中加入rSjP40培养48小时以后，检测HSCs活化过程中相关蛋白的表达，如图4C所示，Western blot检测转染let-7b inhibitor的人LX-2细胞加入rSjP40刺激后观察与HSCs活化有关的I型胶原、TGFβRI和α-SMA蛋白的表达变化，与对照组相比，*P＜0.05；在加入了rSjP40处理的人LX-2细胞中let-7b抑制物没有逆转TGFβRⅠ的表达，因此，根据检测结果，可以推测出与rSjP40影响HSCs活化过程有直接关系的靶基因是I型胶原。
构建psiCHECK2-collagen I3’UTR野生型(WT)质粒
结合查阅文献以及The miRBase和TargetScan软件预测结果，本发明设计了collagen I3’UTR野生型(WT)序列的上下游引物(引物名称标记为collagen I 3’UTR)。使用提取的人LX-2细胞株全基因组的DNA为扩增模板，采用PCR扩增技术使用设计的上下游，将所需要的目的片段collagen I 3’UTR野生型序列扩增出来，经过酶切、连接、转化、摇菌、双酶切电泳验证。琼脂糖凝胶电泳验证结果表明，质粒双酶切发现有6273bp和784bp各处有一光亮带，把质粒送去上海生工公司测序，比对结果表明psiCHECK2-collagen I 3’UTR野生型(WT)质粒构建成功。
构建psiCHECK2-collagen I 3’UTR突变型(MUT)质粒根据基因定点突变方法，本发明设计了针对collagen I 3’UTR序列中的关键位点设计的引物(引物标记为MUT-collagen I 3’UTR，表3)，采用PCR扩增技术，得到两个PCR产物片段(片段A，片段B)，长度分别为467bp和351bp，如图5A，其中，MarkerA为DL2000，A为467bp，B为351bp C为784bp。然后以这两个片段为模板，以collagen I 3’UTR野生型(WT)序列为引物进行PCR，最终我们得到与野生型长度一样的PCR产物的片段,送去上海生工生物公司比对与预期结果一致，如图5B，其中，Markerλ-HindⅢ为digest DNA，1为psiCHECK-2载体单酶切；2为质粒单酶切，3为质粒双酶切，4为菌液PCR；Marker B为DL2000 DNA。
为了验证人LX-2细胞中I型胶原和let-7b之间是否是直接作用的关系，我们成功构建含有目的collagen I-3’UTR序列的野生型(WT)质粒。荧光素酶报告结果表明在人LX-2细胞中共同转染let-7b和collagen I-3’UTR野生型质粒后，与对照组相比，I型胶原荧光活性在转染了let-7bmimic组下降，而let-7b抑制组则显著上调，如图6所示，检测let-7b对collagen I-3’UTR(WT)质粒的双荧光素酶报告基因检测结果，与对照组相比，*P＜0.05。
本发明将之前构建psiCHECK2-collagen I 3’UTR突变型(MUT)质粒与let-7b共转染，荧光素酶结果表明，与对照组相比，之前的野生型荧光素酶活性变化消失，如图7。综合上述的实验证明，let-7b通过直接与collagen I-3’UTR区域相结合来调节I型胶原的表达。
(3)rSjP40可促进肝组织中let-7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关：
(3-1)构建小鼠肝纤维化模型，天狼星红染色，观察rSjP40对胶原变化的影响；构建rSjP40与CCL4处理的小鼠肝纤维化模型，将小鼠肝组织切片进行了天狼星红染色，使用高倍显微镜观察切片，发现单纯的CCL4模型肝小叶附近胶原沉积严重，而在加入了rSjP40组的小鼠肝组织切片表明胶原有显著的下调，与对照组相比，如图8。体内结果表明rSjP40能够减少体内胶原的沉积，延缓肝纤维化的进程。
(3-2)检测小鼠肝纤维化模型中胶原和let-7b的变化，检测rSjP40对胶原和let-7b的影响。如图9所示，与对照组相比，CCL4处理组的小鼠胶原表达最高，而加入了高低剂量rSjP40处理的小鼠胶原表达则有明显的下调。
本发明还检测了let-7b的表达变化，RT-qPCR检测结果表明在rSjP40组的let-7b表达明显高于CCL4组，这个结果与胶原的变化相反，因此，在小鼠模型rSjP40能够促进let-7b的上调，同时也能降低在肝纤维化进程中胶原的沉积，如图10。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，其特征在于，主要呈现以下方面应用：(1)rSjP40在人LX-2细胞株中上调let-7b和其启动子的表达；(2)let-7b参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程；(3)rSjP40可促进肝组织中let-7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关。
3.根据权利要求2所述的let-7b和rSjp40在制备预防或治疗血吸虫感染肝纤维化药物方面的应用，其特征在于，具体包括以下方面：
(1)rSjP40在人LX-2细胞株中上调let-7b和其启动子的表达；
(1-1)利用rSjP40处理人LX-2细胞株，检测rSjP40在抑制人LX-2细胞株活化过程中let-7b及I型胶原相关变化；
(1-2)利用rSjP40刺激转染了let-7b启动子质粒的人LX-2细胞株，检测rSjP40对let-7b启动子活性表达的作用；
(2)let-7b参与到rSjP40抑制人肝星状细胞的活化过程；
(2-1)筛选及确认let-7b的靶基因；
(2-2)将let-7b抑制物及其对照转染至人LX-2细胞株，使用rSjP40刺激处理转染抑制物后的人LX-2细胞株，观察rSjP40在抑制人LX-2细胞活化过程中let-7b及其靶基因发挥的作用；
(3)rSjP40可促进肝组织中let-7b表达增加，与胶原的表达水平呈负相关；
(3-1)构建小鼠肝纤维化模型，天狼星红染色，观察rSjP40对胶原变化的影响；
(3-2)检测小鼠肝纤维化模型中胶原和let-7b的变化，检测rSjP40对胶原和let-7b的影响。
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