CN1238365C - Eb病毒反义寡聚脱氧核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

EB病毒可在所有鼻咽癌组织中检测到，本发明采用反义寡聚脱氧核苷酸技术，分别设计合成EB病毒EBNA1和LMP1的反义寡聚脱氧核苷酸，经实验证明，其能够有效抑制EB病毒的增殖和复制，从而可以作为药物用于预防和治疗鼻咽癌。

Description

EB病毒反义寡聚脱氧核苷酸及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种EB病毒反义寡聚脱氧核苷酸及其应用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物的用途。

背景技术

1977年，Paterson等发现一种由13-25核苷酸组成的反义寡聚脱氧核苷酸，它可以通过碱基互补配对(Watson-Crick原理)，与双链DNA形成三键，或与RNA形成杂交双键，从而阻断基因的复制、转录、转录后加工或翻译(Proc.Natl.Sci.USA.74：4370-74)。它也可以通过激发Rnase H的活力、降解RNA、GADNA杂交双键中的RNA链等方式最终阻断基因表达。它能特异性地与相关顺序的RNA作用使之失活，从而有效地、选择性地杀死靶细胞，而不影响正常细胞功能(Clark et al.，Leukemia.14：347-5，2000)。Whitsell等通过皮下注射N-myc反义核苷酸于带有神经上皮瘤的小鼠后，N-myc蛋白消失，细胞形态变化及肿瘤缩小(Antisense Res.Dev.1：343/50，1991)。随即，首个反义核苷酸(fomivisen)药物被美国食品药物管理局批准治疗由巨细胞病毒(cytomegalovirus)感染所引起的视网膜炎(retinitis)(Ocul Immunol.Inflamm.7：189-98，1999)。目前已有十几个反义寡聚脱氧核苷酸，作为抗肿瘤药物被批准进行II期和III期临床实验研究，例如G3139(针对靶基因Bcl-2，适合对黑色素瘤和B细胞淋巴瘤治疗，Jansen et al.，Lancet，356：1728-33，2000)，ISIS3521(针对靶基因蛋白激酶A，适合对小细胞肺癌，实体肿瘤治疗，Yuen et al.，Clin.Cancer Res.6Suppl：4572S，abstr)，MG98(针对靶基因DNA甲基化转移酶，适合对实体肿瘤治疗，sju et al.，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.19：250a，2000)等等。

基于肿瘤细胞与正常细胞具有不同的基因表达，针对性地设计了与肿瘤相关分子的靶向作用关系，即只杀死肿瘤细胞，而不影响正常细胞的生理功能，这就是反义核苷酸所特有的基因、组织选择性，构成了其安全低毒的特点。因此反义核苷酸是近年才发现的一类新型药物。

鼻咽癌是东南亚地区常见肿瘤，并与食道癌、肝癌并称中国三大肿瘤。EB病毒是一种疱疹病毒，与多种疾病和肿瘤相关。它能在鼻咽癌肿瘤细胞中100％地被检测到，但不能在正常人上皮组织细胞中检出(Klein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.71：4737-41，1974)。EB病毒在正常人群中呈抑制状态，但在鼻咽癌组织中，EB病毒呈活化状态，因此利用病毒在鼻咽部早期癌变阶段能活化并不断复制的特点，可应用抗病毒外壳抗原和早期抗原，从高危人群中检测出早期鼻咽部癌变病人(Zeng et al.，Intervirology，13：162/68，1980)。目前，临床治疗上尚无专门抑制EB病毒的药物。曾用一般抗病毒类药物Ganckclovir(抑制DNA聚合酶和激酶)抑制EB病毒，但缺少有效性和特异性，毒性作用大。

我实验室Geogre Klein教授等早在1974年就展开了EB病毒和鼻咽癌关系的研究。研究表明，鼻咽癌在东南亚地区的明显高发，可能与不同的病毒株有关(Hu et al.，J Gel.Virology，72：2399-2409，1999)。在EB病毒编码膜蛋白中，LMP1基因在鼻咽癌的发生与发展过程中具有十分重要的作用，被称为癌基因。LMP1在90％以上的鼻咽癌及癌前病变组织中均呈阳性，这提示LMP1具有引导早期癌变并促进癌症发展的作用。实验证明，EB病毒能体外恶化转化人的淋巴细胞和上皮细胞，而其中病毒编码的膜蛋白LMP1的检出又和病人的恶性程度相关(Hu et al.，Euro.J.Cancer.31：658-60，1995)。从中国鼻咽癌患者中分离出来的LMP1，对正常人上皮细胞具有很强的恶性转化能力(Hu et al.，Oncogene，8：1575-83，1993)，并可通过基因突变逃避机体免疫系统的监视(Hu et al.，Cancer Res.60：5111-17，2000)。

EBNA1是EB病毒编码的核抗原，存在于所有EB病毒阳性的肿瘤组织中，是EB病毒的持家蛋白(homeholder，Yates et al.，Nature 313：812-5，1985)。EBNA1对EB病毒在体内的存在，增殖与复制起着十分重要的作用(Sample et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88：6343-7，1999；Wilson & Levine，Cur.Topics in Micro.& Immun.182：375-84，1992)。

因此抑制EBNA1和LMP1这两个基因的表达将直接抑制EB病毒的复制、活化和从而抑制肿瘤生长，也同时阻止了癌变，即预防癌变形成。特别是在IgAEA/VCA阳性人群中，EBNA1和LMP1反义核苷酸药物更具有其它药物所不具有的预防作用。

发明内容

本发明的目的是提供一类针对EB病毒重要靶分子的复制及合成进行抑制的反义寡聚脱氧核苷酸，它们能有效地和处于活化状态的病毒主要靶分子结合，阻断病毒的复制、生存及表达，抑制正常鼻咽细胞中活化病毒的致癌作用，抑制病毒在癌变中的促癌作用，抑制新生血管形成及癌细胞的转移能力，直接及间接地抑制肿瘤的发生和肿瘤的生长。

为达到这一目的，本发明采用反义寡聚脱氧核苷酸技术，分别设计合成EBNA1和LMP1的反义寡聚脱氧核苷酸，经筛选得到的五个EBNA1反义寡聚脱氧核苷酸序列是：

E1A： CAG ACA TGA TTC ACA CTA A

E1A2：CCA CTG CCG CCG GAG CCT T

E1A3：GAA CAC ACC GGC GAC CCA F

E1A4：CGA TGC TTT CCA AAC CAC C

E1A5：GTT CCA CCG TGG GTC CCT T

经筛选得到的五个LMP1反义寡聚脱氧核苷酸序列是：

LAS1：TCT CCA CCG GAA CCA GAA G

LAS2：ACC AAT AGA GTC CAC CAG T

LAS3：GCT CCT CCA GTC CAG TCA C

LAS4：GTG TCA GGA GCA AGG CAG

LAS7：ACA ATG CCT GTC CGT GCA A

本发明的反义寡聚脱氧核苷酸也进行了保护性修饰：在其5’端和3’端各三个磷酸根上有一个氧原子被硫取代(Phosphorothiate)，使其不易被体内核酸酶降解，使反义核苷酸在组织中滞留时间延长。

在模拟实验上，使用了药物吸收增强剂以提高细胞对反义寡聚脱氧核苷酸的摄入作用。EBNA1的活性测定是基于EBNA1结合病毒起始复制Orip顺序中的FR片段，启动位于下游区的荧光报导系统。LMP1的活性测定是基于LMP1结合于NF-KB中的核心顺序，启动下游区的蛋白合成报导系统。

经活性测定，正义寡聚脱氧核苷酸和错义寡聚脱氧核苷酸对EBV编码的EBNA1和LMP1表达无抑制作用，而研制的各种EBNA1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸在低浓度下即分别对靶基因表达形成明显的抑制作用(＞85％)。在有效作用浓度下，反义寡聚脱氧核苷酸对细胞的毒性作用很小，但肿瘤细胞生长速度却很大地减低。使用反义寡聚脱氧核苷酸单次剂量作用于肿瘤细胞，即可使细胞内EBNA1和LMP1的蛋白表达水平出现明显抑制(＞85％)，并维持抑制状态达60小时之久，免疫印迹实验也证明，EBNA1和LMP1的蛋白呈明显降低。反义寡聚脱氧核苷酸的抑制程度与剂量呈线性关系。两个不同靶分子的反义寡聚脱氧核苷酸同时使用，可增加协同抑制作用。可见，本发明的EBNAL1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸具有预防癌变及治疗与EB病毒相关的肿瘤生长(鼻咽细、淋巴瘤、何杰氏瘤等)的作用，可应用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物。

本发明的优点，是所设计的反义寡聚脱氧核苷酸与已知的作用位点不同，修饰不同却能有效地以低浓度去抑制EB病毒EBNA1的合成，使病毒无法繁殖，有劫除致病的作用，同时通过抑制LMP1的表达，减低恶性程度和转移能力。此外，本发明的EBNAL1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸，其碱基序列与反向互补的靶序列结合，因此有比抗体更高的专一性，更低的毒副作用，更没有由抗体、多肽所引起的免疫对抗作用。

文献上有对EBNAL1(Roth et al.，Blood.84(2)：582/7，1994)及LMP1(Masciarelli et al.，Oncogene.21(26)：4166-70，2002)反义寡聚核苷酸在B-95-8细胞上作用研究的有限报道，但没有对上皮细胞及鼻咽癌的作用研究，其反义核酸顺序都是经典地从起始密码子开始的15核苷酸，它们的有效作用浓度很高(150mM-500mM以上)，特异性低。本发明所设计的反义寡聚脱氧核苷酸与以上的反义核酸有不同顺序，作用位点不同，具有特异性强，有效作用浓度低(5nm)特点，并在细胞及整体动物实验中显示出其特异的抑制作用。

附图说明

图1为本发明的两个不同靶分子的反义寡聚脱氧核苷酸协同抑制细胞生长的结果示意图，其中E1A3为EBNA1反义核苷酸，LAS7为LMP1反义核苷酸，其余为对照，纵向为细胞生长力。

图2为本发明的EBNA1反义核苷酸抑制鼻咽癌细胞中EBNA1活性的有效作用时间的示意图，其中E1A3为EBNA1反义核苷酸，E1S2为正义核苷酸；横向为作用时间，纵向为抑制百分比。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明的EB病毒EBNA1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸对鼻咽癌细胞作用的专一性和有效性，但并不限制本发明在鼻咽癌及EB病毒相关肿瘤治疗中的应用范围。

实验研究材料及方法

细胞：CTWO3细胞株得自台湾的鼻咽癌患者(Lin et al，1993)，以含有geneticin抗性的重组EBV，感染得到EBV阳性的TWO3细胞株，以C-LMP1表达质粒转染得到TWO3/LMP1细胞株；C666-1来自香港的鼻咽癌患者，为EBV阳性的鼻咽癌细胞株(Dolly Huang，1996)；CNE-1细胞株建自高分化鼻咽癌患者；293A为腺病毒-SV40生化之胎肾上皮细胞；B95-8由EBV感染Mormoset淋巴细胞得到。

表达质粒与寡核苷酸：EBNA1表达质粒由本中心构建，EBNA1的活性测定是基于细胞内表达的EBNA1结合到病毒起始复制顺序中的FR片段，启动位于下游区的荧光报导系统；CAOLMP1表达质粒由本实验室构建。LMP1蛋白在细胞内表达水平是通过测定LMP1结合于NF-KB中的核心顺序，位于荧光素酶(luciferase)基因上游的pConFkB luc(含有3个KB结合位点)DNA活性，启动下游区的荧光报道系统；PCMVBGal用于校正转染效率。

本发明的EBNA1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸的合成方法在多个公司都能进行，如瑞典的Invitrogene公司等，并已有专利，详细情况各公司都有介绍，因此此处不再赘述；另外，作为药效实验的对照，相应地设计了正义寡聚脱氧核苷酸片段(即与mRNA序列相同的片段)和错义寡聚脱氧核苷酸片段(即核苷酸组份相同而序列不同的寡聚脱氧核苷酸片段)。此外作为药效实验的对照的正义寡聚脱氧核苷酸片段和错义寡聚脱氧核苷酸片段也进行保护性修饰。

反义寡聚脱氧核苷酸抑制EBNA1和LMP1活性的测定方法

(1)细胞转染：胰酶消化单层细胞(TWO3，C666-1，CNE-1，B95-8及293A)或进行震荡使其悬浮于PBS中，以不含抗生素的完全培养液(PBR1640 or DMEM，Gibco BRL，Life Technology)制备细胞悬液，接种于12或24孔培养板中，于37℃，5％CO₂孵育过夜。以脂质包裹体Lipofectin(Invitrogene)或药物吸收增强剂chitosan(Bioolymer)转染细胞，Lipofectin稀释于OPTIMEM培养基(GiBco，Life Technology)，室温下放置30分钟后，与稀释于OPTIMEM培养基的质粒、寡核苷酸，及报导系统共同孵育15分钟，将反应混合物加入培养板中，与细胞作用6小时后，换成正常培液，在以后的各个不同时间收获细胞。

(2)luciferase活性测定：反义寡聚脱氧核苷酸与鼻咽癌细胞作用6小时后，根据EBNA1能与FR结合及LMP1能与KB位点结合的量，对EBNA1和LMP1蛋白水平给予定量分析。用细胞培养裂解液(CCLR，Promega)裂解细胞，将裂解细胞悬液收集于Eppendorf管中，离心吸取上清液，取10ul与50ul荧光素(luciferin)混合，以Turner design荧光测定仪(Luminometer，TD-20/20，turner Designs，USA)测定活性。同样裂解液与ONPG(O-Nitrophenyb-D-Galactopyranoside，Sigma)反应后，于420nm测得OD值即B-Gal活性用于校正转染效率。

实施例1、EBNA1反义寡聚核苷酸抑制EBNA1在B95-8中的表达

EBNA1反义寡聚脱氧核苷酸在5-25mM浓度下与B95-8细胞作用6小时后，换成含血清的正常培养液继续培养48小时，与此同时以正义寡聚脱氧核苷酸(即与mRNA序列相同的片段)/错义寡聚脱氧核苷酸(即核苷酸组分相同而序列不同的多聚脱氧核苷酸片段)作对照，并在不同时间收集细胞；收集的细胞经裂解后离心取上清，测定其荧光活性；通过荧光活性测定，筛选各种顺序的反义寡聚脱氧核苷酸在细胞内对EBNA1表达的抑制力，5个筛选出的EBNA1反义寡聚脱氧核苷酸抑制EBNA1表达水平的结果如表1所示，可见，5个筛选出的EBNA1反义寡聚脱氧核苷酸均能抑制EBNA1表达水平达到90％以上。

                       表1

编码	序列	抑制百分比(％)
			E1A	CAG ACA TGA TTC ACA CTA A	90
E1A2	CCA CTG CCG CCG GAG CCT T	90
			E1A3	GAA CAC ACC GGC GAC CCA F	94
E1A4	CGA TGC TTT CCA AAC CAC C	91
			E1A5	GTT CCA CCG TGG GTC CCT T	92

实施例2、LMP1反义寡聚核苷酸抑制LMP1在B95-8中的表达

LMP1反义寡聚脱氧核苷酸在25-50mM浓度下与B95-8细胞温育6小时后，换成含血清的正常培养液，继续培养48小时，与此同时以正义寡聚脱氧核苷酸/错义寡聚脱氧核苷酸作对照，并在不同时间收集细胞；收集的细胞经裂解后离心取上清，测定其荧光活性；通过荧光活性测定，筛选各种顺序的反义寡聚脱氧核苷酸在细胞内对LMP1表达的抑制力，5个筛选出的LMP1反义寡聚脱氧核苷酸抑制LMP1表达的结果如表2所示，可见，5个筛选出的LMP1反义寡聚脱氧核苷酸抑制LMP1表达水平达到80％以上。

编码	序列	抑制百分比(％)
			LAS1	TCT CCA CCG GAA CCA GAA G	80
LAS2	ACC AAT AGA GTC CAC CAG T	85
			LAS3	GCT CCT CCA GTC CAG TCA C	90
LAS4	GTG TCA GGA GCA AGG CAG	81
			LAS7	ACA ATG CCT GTC CGT GCA A	85

实施例3、两个不同靶分子的反义寡核苷酸协同抑制细胞生长

TWO3细胞经过转染后，与EBNA1和LMP1反义寡核苷酸单独或合并温育6小时，继续培养48小时后细胞计数，其结果如图1所示。可见，单独用反义寡核苷酸处理的细胞，生长力分别为对照的81％和71％。同时受到两个反义寡核苷酸处理的细胞，可明显抑制细胞生长为对照的60％。

实施例4、反义核苷酸抑制鼻咽癌细胞中EBNA1活性的有效作用时间

EBNA1反义核苷酸(E1A3)、正义核苷酸(E1S21)在5nM的浓度下与EBV阳性的鼻咽癌细胞TWO3共同作用6小时后，换成含血清的正常培养液继续培养，并在不同时间收集细胞；收集的细胞经裂解后离心取上清，测定其荧光活性，其结果如图2所示，可见，EBV阳性的TWO3细胞，经EBNA1反义核苷酸6小时作用后，EBNA1的表达活性可持续被抑制60小时以上。

以上实验证明，本发明的EBNAL1和LMP1反义寡聚脱氧核苷酸在药物吸收增强剂的作用下，可有效控制靶基因在癌细胞内的表达，支持直接应用在喷雾、鼻滴及胶糖等给药形式，具有预防癌变及治疗与EB病毒相关的肿瘤生长(鼻咽细、淋巴瘤、何杰氏瘤等)的作用，已具备临床上开发试用的价值，可应用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物。

Claims (6)

1、EB病毒EBNA1的反义寡聚脱氧核苷酸，其特征在于所述核苷酸的序列为下列五个中的任一个：

E1A： CAG ACA TGA TTC ACA CTA A

E1A2：CCA CTG CCG CCG GAG CCT T

E1A3：GAA CAC ACC GGC GAC CCA F

E1A4：CGA TGC TTT CCA AAC CAC C

E1A5：GTT CCA CCG TGG GTC CCT T。

2、EB病毒LMP1的反义寡聚脱氧核苷酸，其特征在于所述核苷酸的序列为下列五个中的任一个：

LAS1：TCT CCA CCG GAA CCA GAA G

LAS2：ACC AAT AGA GTC CAC CAG T

LAS3：GCT CCT CCA GTC CAG TCA C

LAS4：GTG TCA GGA GCA AGG CAG

LAS7：ACA ATG CCT GTC CGT GCA A

3、如权利要求1或2所述的任一EBNA1或LMP1反义寡聚脱氧核苷酸，其特征在于所述反义寡聚脱氧核苷酸进行了保护性修饰，其5’端和3’端各三个磷酸根上一个氧原子被硫所取代。

4、如权利要求1、2或3所述的任一EBNA1或LMP1反义核苷酸序列或其组合用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物的用途。

5、如权利要求4所述的EBNA1或LMP1反义核苷酸序列或其组合用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物的用途，其特征在于所述预防和治疗鼻咽癌的药物还可以包括药物吸收增强剂聚氨基葡萄糖和环化糊精。

6、如权利要求4或5所述的EBNA1或LMP1反义核苷酸序列或其组合用于制备预防和治疗鼻咽癌的药物的用途，其特征在于所述预防和治疗鼻咽癌的药物可以是喷雾、鼻滴或胶糖。

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