CN111154755B - 一种双链寡核苷酸dna及其应用 - Google Patents
一种双链寡核苷酸dna及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111154755B CN111154755B CN201911300932.7A CN201911300932A CN111154755B CN 111154755 B CN111154755 B CN 111154755B CN 201911300932 A CN201911300932 A CN 201911300932A CN 111154755 B CN111154755 B CN 111154755B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- dna
- seq
- double
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种双链寡核苷酸DNA及其应用。所述的双链寡核苷酸DNA的正义链的核苷酸序列包含如序列表中SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列,反义链的核苷酸序列包含如序列表中SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列;所述的正义链和所述的反义链的长度均为30bp以上;或者,正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示,反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示;或者,正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示,反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.18所示。本发明找到最短的DNA片段,使得将来产业化时合成容易,降低成本。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种双链寡核苷酸DNA及其应用。
背景技术
STING信号通路在先天免疫中的发现及其在肿瘤学中的潜在意义,使STING成为最小分子免疫肿瘤学靶标。几乎所有的大小制药公司都在竞争最有效和最具选择性的STING配体的制备,并试图在临床试验中证明其在缩小肿瘤方面的有效性。但是,STING是细胞内分子,无法通过抗体评估。它的天然配体cGAMP是环状二核苷酸结构,极易溶于水,但不稳定且在细胞外会迅速降解。大部分制药企业都致力于创造既保留两亲性结构,又结构稳定并具有细胞渗透性的配体衍生物。尽管具有极大的挑战性,但一些大型制药公司(诺华、默克和葛兰素史克)已通过各种肿瘤模型中肿瘤的缩小报道了STING的小分子配体衍生物及其在体内的活性。
但是,所有天然STING配体都属于可能涉及多个关键信号途径的次要信息。到目前为止,这是使用配体衍生物靶向STING的最具挑战性的问题。所有报道的小分子化合物的体内功效研究都是使用IT(肿瘤内)注射作为可行的药物传递途径,这将限制其临床应用。有两篇报道尝试将天然STING配体包装到脂质纳米颗粒中,并通过在小鼠模型中进行静脉注射成功进行了全身性递送。由于这些纳米颗粒仍然没有靶向机制,因此大剂量次级信息传递的最终安全性,仍有待于在灵长类动物中进行观察。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中存在的缺少针对STING信号通路的小分子药物的缺陷,提供一种双链寡核苷酸DNA及其应用。
本发明人选择将重点放在STING上游,cGAS[环状GMP-AMP(cGAMP)]合酶,其为人们长期以来大力研究的STING依赖型胞质DNA传感器,可通过2'3'-cGAMP的合成激活STING信号通路。作为先天性和获得性免疫之间的重要桥梁,抗原呈递细胞[例如树突细胞(DC)]表达cGAS作为这些细胞中的DNA传感器。通过这些机制,免疫系统可以对各种DNA病毒和细菌感染产生有效的应答。
本发明提供一种双链寡核苷酸DNA,所述的双链寡核苷酸DNA的正义链的核苷酸序列包含如序列表中SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列,反义链的核苷酸序列包含如序列表中SEQ ID NO.20所示的核苷酸序列;所述的正义链和所述的反义链的长度均为30bp以上;
或者,正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示,反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示;
或者,正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示,反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.18所示。
较佳地,所述正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所示,所述的反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示;
或者,所述正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.13所示,所述的反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.14所示;
或者,所述正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.15所示,所述的反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供一种序列长度为30bp以上的双链寡核苷酸DNA在制备治疗STING信号通路相关的疾病的药物中的应用。
较佳地,所述的双链寡核苷酸DNA为如上所述的双链寡核苷酸DNA。
所述的STING信号通路相关的疾病为病毒感染或者肿瘤;所述的病毒可为本领域常规的病毒,例如流感病毒、疱疹病毒等。
本发明还提供一种STING信号通路激活剂,其包含如上所述的双链寡核苷酸DNA。
较佳地,所述的STING信号通路激活剂为治疗病毒感染或者肿瘤的药物。
本发明还提供一种药盒,其包括药盒A和药盒B,所述的药盒A包含如上所述的双链寡核苷酸DNA,所述的药盒B包含抗肿瘤药物。
其中,所述的抗肿瘤药物优选免疫药物。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
本发明找到最短的DNA片段,使得将来产业化时合成容易,降低成本。同时短DNA也可能使得体内系统给药的配方相对容易开发。最后,小片段DNA相对体内细胞内毒性可能将较低。本发明人测试了不同长度的dsDNA,意外发现40个核苷酸是充分激活cGAS并激发IFN-β的最小dsDNA长度。
附图说明
图1为2种不同长度的dsDNA在细胞内的激活效应。
图2为6种不同长度的dsDNA在细胞内的激活效应。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
以下实施例中所用的THP-1细胞市售可得;所用的RNA提取试剂盒为RNApureTissure&Cell Kit;所用的反转录试剂盒为HiFiScript cDNA Synthesis Kit;所用的荧光定量PCR试剂为UltraSYBR Mixture。
实施例1
合成2对不同长度的随机序列的oligo DNA,(序列如表1),通过PCR仪退火形成2条对应长度的dsDNA。
将适量生长状态良好的THP-1细胞接种至24孔细胞培养板中,在37℃,5%CO2培养箱中孵育过夜。随后将2-3μg不同长度的dsDNA分别转染细胞(转染的方法为本领域常规操作),转染后细胞继续在37℃,5%CO2培养箱中孵育8-9小时。
孵育完成后,收集细胞,提取细胞总RNA。以RNA为模板,用RT-PCR方法检测IFN-β基因(引物序列见表2)的表达量,GAPDH基因为内参。
表1不同长度的oligo DNA序列设计表
表2人IFN-β基因的上下游引物
引物 | 序列 | 碱基数目 |
上游引物 | AGGACAGGATGAACTTTGAC(SEQ ID NO.5) | 20 |
下游引物 | TGATAGACATTAGCCAGGAG(SEQ ID NO.6) | 20 |
结果显示,40bp的dsDNA序列能够有效激活STING信号通路(见图1),可能是dsDNA序列的最佳长度。
实施例2
重新合成了6种不同长度的随机的oligo DNA序列(见表3),按照实施例1的方法再次进行实验分析。
结果显示,dsDNA序列长度≥30bp时均能激活STING信号通路;而40bp的dsDNA序列的激活效应最强(图2)。因此,双链寡核苷酸DNA(dsDNA)序列在表达cGAS的细胞内能够有效激活STING信号通路,刺激细胞过量表达IFN-β,且40bp的dsDNA序列是最大程度激活STING信号通路的最短DNA片段长度。
表3不同长度的oligo DNA序列设计表
其中,5~7号正义链的共有序列为TGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGAT(SEQ ID NO.19);5~7号反义链的共有序列为ATCTAATTCAACAAGAATTGGGACA(SEQ ID NO.20)。
SEQUENCE LISTING
<110> 百力司康生物医药(杭州)有限公司
<120> 一种双链寡核苷酸DNA及其应用
<130> P19014672C
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 1
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttcag 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 2
ctgaacgacg aacgacgaac gtcga 25
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 3
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttcatcgacg ttcgtcgttc 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 4
gaacgacgaa cgtcgatgaa cgacgaacga cgaacgtcga 40
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 5
aggacaggat gaactttgac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 6
tgatagacat tagccaggag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 7
cttgttgaat tagatggtga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 8
tcaccatcta attcaacaag 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 9
caattcttgt tgaattagat ggtga 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 10
tcaccatcta attcaacaag aattg 25
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 11
tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 12
tcaccatcta attcaacaag aattgggaca 30
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 13
tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagat 35
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 14
atctaattca acaagaattg ggacaactcc agtga 35
<210> 15
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 15
tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 40
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 16
tcaccatcta attcaacaag aattgggaca actccagtga 40
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 17
tcactggagt tgtccattgt taatttagac gagtctgaag ctctccaatt cttgttgaat 60
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 18
attcaacaag aattggagag cttcagactc gtctaaatta acaatggaca actccagtga 60
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 正义链
<400> 19
tgtcccaatt cttgttgaat tagat 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 反义链
<400> 20
atctaattca acaagaattg ggaca 25
Claims (8)
1.一种双链寡核苷酸DNA,其特征在于,其中正义链的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示,反义链的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示。
2.如权利要求1所述的双链寡核苷酸DNA在制备治疗STING信号通路相关的疾病的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的疾病为病毒感染或者肿瘤。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,所述的病毒感染中的病毒为流感病毒或者疱疹病毒。
5.一种STING信号通路激活剂,其特征在于,其包含如权利要求1所述的双链寡核苷酸DNA。
6.如权利要求5所述的STING信号通路激活剂,其特征在于,所述的STING信号通路激活剂为治疗病毒感染或者肿瘤的药物。
7.一种药盒,其包括药盒A和药盒B,其特征在于,所述的药盒A包含如权利要求1所述的双链寡核苷酸DNA,所述的药盒B包含抗肿瘤药物。
8.如权利要求7所述的药盒,其特征在于,所述的抗肿瘤药物为免疫药物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911300932.7A CN111154755B (zh) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 一种双链寡核苷酸dna及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911300932.7A CN111154755B (zh) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 一种双链寡核苷酸dna及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111154755A CN111154755A (zh) | 2020-05-15 |
CN111154755B true CN111154755B (zh) | 2020-11-20 |
Family
ID=70557534
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911300932.7A Active CN111154755B (zh) | 2019-12-17 | 2019-12-17 | 一种双链寡核苷酸dna及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111154755B (zh) |
-
2019
- 2019-12-17 CN CN201911300932.7A patent/CN111154755B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN111154755A (zh) | 2020-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2971881C (en) | Rna interference agents for gst-pi gene modulation | |
CN105018492B (zh) | 不对称干扰rna的组合物及其用途 | |
CN113544269A (zh) | 环状多核糖核苷酸及其药物组合物 | |
WO2015023938A1 (en) | Epigenetic regulators of frataxin | |
CN113249380B (zh) | 靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用 | |
KR20180104692A (ko) | Angpt2 및 pdgfb를 표적화하는 rna 복합체를 사용하는 혈관신생 관련 질환의 치료 | |
KR20180104075A (ko) | IL4Rα, TRPA1, 또는 F2RL1을 표적화하는 RNA 복합체를 사용한 아토피 피부염 및 천식의 치료 | |
EP3816287A1 (en) | Sirna structures for high activity and reduced off target | |
WO2013064584A1 (en) | Double-stranded RNA for immunostimulation | |
JP5371424B2 (ja) | Rna干渉のためのオリゴヌクレオチドおよびその生物学的適用 | |
US20090023670A1 (en) | Regulation of Transgene Expression by RNA Interference | |
CN111154755B (zh) | 一种双链寡核苷酸dna及其应用 | |
EP3119887B1 (en) | Improved small interfering ribonucleic acid molecules | |
US20170233760A1 (en) | Biologically active nucleotide molecules for selectively killing off cells, use thereof, and application kit | |
US10844383B1 (en) | Microrna dyslipidemia inhibitor | |
KR20210144601A (ko) | 이중가닥 올리고뉴클레오티드 및 이를 포함하는 코로나바이러스감염증-19〔covid-19〕치료용 조성물 | |
JP6978561B2 (ja) | GST−π遺伝子を調節するためのRNA干渉剤 | |
US20220401466A1 (en) | Rna action inhibitor and use thereof | |
EP4119665A1 (en) | Sirna based on rna sequence of sars-cov-2 and use thereof | |
CN112852965B (zh) | lnc-ZNF100-5功能性表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用 | |
JP5959522B2 (ja) | ヒト血液がん細胞のアポトーシスを誘導するヘプタマー型スモールガイド核酸 | |
JP5789927B2 (ja) | 放射線照射コラーゲン様ペプチドを用いた核酸導入法 | |
US20220047619A1 (en) | Rna interference agents for gst-pi gene modulation | |
US11045488B2 (en) | RNA interference agents for GST-π gene modulation | |
CN111107853B (zh) | 用于抑制载脂蛋白C-III (APOC3)的表达的RNAi试剂和组合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |