CN102115787B - 一种微小rna及其反义核酸在制备诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的试剂盒或药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种微小RNA及其反义核酸在诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病中的用途。本发明提供的微小RNA为包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：5′-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3′。该微小RNA可以作为一种新的生物标志物应用于心脏病病的诊断和/或预后评估。此外，该微小RNA的反义核酸可以作为一种新型的药物用于心脏疾病的预防和/或治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药工程领域，涉及一种内源性的非编码小RNA及其反义核酸的新用途，具体涉及一种微小RNA(microRNA，miRNA)及其反义核酸在诊断、预防和/或治疗心脏疾病中的用途。
背景技术
心血管疾病主要包括高血压、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。毫无疑问，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。
心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称。它是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，它是许多心血管疾病的综合性表现。心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应。多种情况可以引起人体内血液动力的增加，比如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，也就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随者发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大，如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏 发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。
随着近来miRNA研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。对于miRNA来说，其调控方式的特点决定了它的靶基因不会只有一个，而是一对多的方式，这就是使得miRNA的功能研究内容非常丰富。许多研究表明，miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。
尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在心脏肥厚和心肌纤维化等心脏疾病中的关键miRNA仍没有确定，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。
发明内容
本发明的目的是确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的微小RNA(miRNA)，进一步确定其在心肌肥大、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一方面，本发明提供一种微小RNA及其反义核酸在制备用于诊断、预防、治疗和/或预后评估心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，其中所述微小RNA为包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述微小RNA反义核酸为包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3’(SEQ IDNO.2)。
优选地，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰。
另一方面，本发明提供一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测微小RNA的探针或引物，其中所述微小RNA为包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’(SEQ ID NO.1)。
优选地，所述试剂盒中包含的探针或引物具有以下所示的序列： 5’-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3’(SEQ ID NO.1)。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的微小RNA反义核酸和药学上可接受的病毒、载体或辅料，其中所述微小RNA反义核酸为包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3’(SEQ ID NO.2)。
优选地，所述药物组合物中微小RNA反义核酸的含量为0.5-1克。
优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球、微囊等。
优选地，所述药物组合物以口服或注射的方式给药；更优选地，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。
综上所述，本发明人通过大量的实验研究发现miRNA-223在肥大的心肌细胞和心脏肥厚中表达显著上调。具体地，本发明人通过构建miRNA-223过表达腺病毒或miRNA-223转基因小鼠加强miRNA-223的表达发现，miRNA-223过表达在细胞水平能诱导心肌细胞肥大的发生，此外，与对照组相比，miRNA-223转基因小鼠的心脏有明显的肥大表型及纤维化程度，同时一些肥大基因的表达也有明显的增加。更具体而言，本发明人发现，与对照组相比，miRNA-223在肥大的心肌细胞中有明显的提高，对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积、蛋白/DAN的比值及肌小节的重组也都有明显的增加。此外，miRNA-223转基因小鼠的心脏表型、心脏体重比、边缘区的心肌细胞横截面积(wGA染色)及心肌纤维化(Masson染色)都有了明显的增加。以上说明，miRNA-223能够诱导心肌肥大的发生，这意味着miRNA-223可作为一种早期诊断和早期预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。因此，本发明提供了包含特异性检测miRNA-223的探针或引物的试剂盒，通过实时荧光定量PCR、纳米微球技术检测患者外周血血浆中miRNA-223的表达水平，用于对心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病和心衰等心脏疾病的诊断和/或预后评估。
另外，本发明人通过大量的试验证明miRNA-223的反义核酸对心肌肥厚及心肌纤维化具有保护作用。具体地，本发明人在细胞水平通过转染miRNA-223的反义核酸发现，它能够抑制肥大刺激因子所诱导的心肌细胞肥大，包括肥大指标如细胞表面积，蛋白/DAN的比值及肌小节的重组也 与对刺激组相比都有了明显的降低。在动物水平通过注射外源miRNA-223的反义核酸也能够抑制肥大模型的肥大效应包括心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)及心肌纤维化(Masson染色)都有了明显的降低，同时心功能也有了明显的改善。以上说明，miRNA-223的反义核酸通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。因此，本发明提供了将miRNA-223反义核酸与适当载体或辅料如壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于预防和/或治疗心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为心脏肥大刺激及血管紧张素(Ang II)诱导的心肌细胞肥大过程中miRNA-223表达水平的变化；其中A为Ang II诱导小鼠心脏肥大刺激的miRNA-223表达水平；B为原代心肌细胞Ang II处理的miRNA-223表达水平。
图2为miRNA-223过表达腺病毒的构建；其中A为1.0CMV穿梭载体示意图；B为miRNA-223腺病毒感染原代心肌表达水平检测。
图3为miRNA-223过表达对心肌细胞肥大的促进作用；其中A为原代心肌细胞感染miRNA-223腺病毒对心肌细胞表面积的影响；B为原代心肌细胞感染miRNA-223腺病毒对蛋白/DAN的影响；C为原代心肌细胞感染miRNA-223腺病毒对肌小节的影响。
图4为miRNA-223转基因小鼠的构建；其中A为miRNA-223心脏特异性转基因打靶载体图谱；B为miRNA-223转基因小鼠阳性克隆的鉴定；C为miRNA-223转基因小鼠及野生型小鼠个脏器中miRNA-223表达水平检测。
图5为miRNA-223转基因小鼠与野生型小鼠的比较；其中A为心脏表型及心脏体重比；B为边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)；C为心肌纤维化(Masson染色)。
图6为miRNA-223反义核酸能够抑制血管紧张素所诱导的肥大；其中A为原代心肌细胞转染miRNA-223反义核酸(antagomir)能够抑制心 肌细胞的表面积；B为蛋白/DNA；C为肌小节重组。
图7为小鼠静脉注射miRNA-223反义核酸(antagomir)能抑制血管紧张素所诱导的肥大模型；其中A为心脏表型；B为肥大标记基因及心脏体重比；C为心肌细胞横截面积(WGA染色)。
图8为小鼠静脉注射miRNA-223反义核酸(antagomir)与野生型小鼠的心功能比较；其中A为室间隔厚度(LVSd)；B为左心室后壁厚度(PWd)，C为左心室收缩期内径(LVIDs)；D为短轴缩短率(FS)。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
除非特别指出，以下各实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括细胞培养，RNA的提取，RCR扩增，荧光定量PCR，载体的构建、扩增及转染，细胞染色等等，均可参见以下文献：W.-Q.Tan，etal，Foxo3a InhibitsCardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem.2008October 31；283(44)：29730-29739；Wang K，etal，miR-9and NFATc3regulate myocardin in cardiac hypertrophy，J Biol Chem.2010 Apr16；285(16)：11903-12；Lin Z，etal，miR-23a functions downstream of NFATc3 toregulate cardiac hypertrophy，PNAS，2009，106(29)：12103-12108)。上述文献在此全文引入作为参考。
实施例1心脏肥大刺激及血管紧张素(Ang II)诱导的心肌细胞肥大过程中miRNA-223表达水平变化的检测
本实施例采用对C57/BL6小鼠(购自北京医科大学)进行腹腔注射0.6mg/kg/day血管紧张素(购自sigma公司)连续两周的方法对心脏进行肥大刺激，检测miRNA-223在心脏中不同时间点的表达水平。提取心脏的总RNA(用TIZOL试剂盒)，实时荧光定量PCR检测miRNA-223的表达水平。
结果显示，肥大刺激24小时之内miRNA-223的表达水平有了显著的升高，如图1A所示。
对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，对心肌细胞用150nM Ang II进行处理，在培养的不同时间， 提取细胞的总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-223的表达水平。
结果显示，miRNA-223表达水平在Ang II处理1小时之内有了显著的上升，如图1B所示。
实施例2miRNA-223腺病毒的构建
采用Ambion公司的pSilencer Adeno 1.0-CMV系统构建miRNA-223过表达载体或腺病毒。按照公司说明书构建相应载体及腺病毒，具体方法如下。
提取大鼠心脏的基因组，以其为模板，PCR扩增miRNA-223及其上下游两端各将近200bp的序列(PCR体系50ul，PCR条件如下：95℃3min一个循环；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min共28个循环；最后72℃延伸5min)，PCR引物设计如下，扩增片段约400bp：
上游引物：5′-GCCAGTCATGTTAGTGTCTGCCATT-3′(SEQ ID NO.3)，
下游引物：5′-TGATGCATACTAGGCTTAGAGGCCC-3′(SEQ ID NO.4)。
将该片段用spe1和xho1进行双酶切，再将腺病毒载体pSilencer AdenoCMV1.0shuttle vector载体(载体图谱见图2A)进行双酶切后与上述酶切后的片段进行连接，即将片段克隆入腺病毒载体中。Pac I酶切线性化该载体及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)，共转染HEK-293细胞，包装腺病毒，扩增收集病毒，测定病毒滴度。Real-time PCR鉴定miRNA-223是否表达。
将miRNA-223腺病毒感染原代心肌细胞，24小时后，收集细胞，提取RNA，Real-time PCR检测miRNA-223表达水平。
结果显示，感染miRNA-223腺病毒的细胞miRNA-223表达量明显升高，而感染对照组β-gal腺病毒的细胞miRNA-223表达没有变化(图2B)。
实施例3miRNA-223促心肌细胞肥大的实验
本实施例中，以原代培养的心肌细胞为模型，检测miRNA-223是否能够促心肌细胞肥大。
用实施例2构建的miRNA-223腺病毒感染心肌细胞以过表达miRNA-223，并以β-gal腺病毒作为对照，病毒感染48小时后，对细胞进行表面积的测量，结果见图3A。提取细胞的蛋白并测定细胞DNA的量来进行蛋白DNA比值的检测(图3B)，同时，通过对心肌细胞进行肌小节 结构的染色来观察其变化(图3C)。
以上结果显示，过表达miRNA-223可以显著促进心肌细胞的肥大。
实施例4miRNA-223心脏过表达转基因小鼠模型的构建
通过PCR的方法从小鼠基因组扩增含有miRNA-223前体序列的DNA片段，将其克隆到pαMHC-clone26载体(从北京军事医学科学院获得，通过Kpn1和HindIII双酶切后进行连接)。miRNA-223的表达受载体上的心脏特异性启动子CMV调控，载体图谱见图4A。应用常规的显微注射方法将该载体导入受精卵，筛选、繁育miRNA-223转基因小鼠(委托沈阳医学院构建)。
通过PCR的方法鉴定转基因阳性小鼠(PCR体系50ul，PCR条件如下：95℃3min一个循环；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min共28个循环；最后72℃延伸5min)，结果见图4B。通过实时荧光定量PCR技术检测了miRNA-223转基因小鼠各脏器中miRNA-223的表达量，结果见图4C。在野生型小鼠各个脏器中miRNA-223在心脏中特异表达，其它脏器中miRNA-223表达量低或不表达。miRNA-223转基因(Tg)小鼠与野生型(WT)小鼠相比，心脏中miRNA-223表达量升高至少6倍，而其它脏器中miRNA-223的表达没有变化。
实施例5miRNA-223转基因小鼠与野生型小鼠的比较
对实施例4所构建的miRNA-223转基因小鼠与野生型小鼠的心脏进行表型分析，通过石蜡切片鉴定整体外形，通过HE染色来对细胞质和细胞核进行着色(图5A)及WGA染色(图5B)确定细胞的横截面积大小，通过Masson染色来区分纤维化程度(图5C)；同时检测了心脏体重比(图5A)。
实验结果显示，与野生型(WT)小鼠相比，miRNA-223转基因(Tg)小鼠的心脏表型有了明显的增大，心脏体重比及纤维化程度也都有显著的提高，说明miRNA-223可以促进心脏结构重塑、心肌纤维化。
实施例6miRNA-223反义核酸对血管紧张素所诱导肥大的抑制作用
对原代心肌细胞通过脂质体(lipfectin2000)转染miRNA-223反义核酸(Antagomir，AN，其序列为5′-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3′ (SEQ ID NO.2)，委托上海吉玛制药技术有限公司合成)后，能有效的抑制miRNA-223的表达，同时细胞用150nMAng II进行处理，经过24小时之后，进行心肌肥大指标的检测，例如肌小节的重组(图6A)、细胞表面积(图6B)及蛋白/DNA(图6C)。
以上实验结果证明，miRNA-223反义核酸能够有效的抑制Ang II所诱导的心肌细胞肥大。
实施例7小鼠静脉注射miRNA-223反义核酸能够抑制血管紧张素所诱导的肥大模型
对小鼠用血管紧张素(Ang II)静脉注射(0.6mg/kg/day)，两周后，小鼠的心脏有明显的肥大，而同时加入实施例6中的miRNA-223反义核酸(25mg/kg/day)可以明显减弱Ang II所诱导的肥大效应。但是，同时向小鼠注射miRNA-223反义核酸的负对照(antagomir negative control，NC其序列为5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’(SEQ ID NO.5)，25mg/kg/day)和Ang II，并不能减弱Ang II的肥大表型(图7A)，同时也检测了肥大标记基因及心脏体重比(图7B)，细胞的横截面积大小(WGA染色)(图7C)。
以上的实验结果证实，miRNA-223反义核酸能够在整体水平抑制心脏肥大的发生。
实施例8小鼠静脉注射miRNA-223反义核酸与野生型小鼠的心功能比较
向小鼠静脉注射血管紧张素(Ang II，0.6mg/kg/day)及实施例6中的miRNA-223反义核酸(25mg/kg/day)可以改善单独注射血管紧张素(AngII)所诱导的心功能的失调。心功能的指标包括室间隔厚度(LVSd，图8A)，左心室后壁厚度(PWd，图8B)，左心室收缩期内径(LVIDs，图8C)以及短轴缩短率(FS，图8D)。
实验结果显示，miRNA-223反义核酸能够明显改善肥大模型所引起的心功能失调。
Claims (9)
1.一种微小RNA反义核酸在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，其中所述微小RNA反义核酸为以下序列所示的核苷酸序列：
5'-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3'（SEQ ID NO.2）。
2.一种微小RNA在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒中的用途，其中所述微小RNA的序列为以下序列所示的核苷酸序列：
5'-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3'（SEQ ID NO.1）。
3.根据要求1或2所述的用途，其特征在于，所述心脏疾病选自心肌肥大、心肌纤维化、冠心病、心肌炎、心瓣膜疾病、高血压和心衰。
4.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包含用于特异性检测微小RNA的探针或引物，其中所述微小RNA的序列为以下序列所示的核苷酸序列：
5'-UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA-3'（SEQ ID NO.1）。
5.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的微小RNA反义核酸和药学上可接受的病毒、载体或辅料，其中所述微小RNA反义核酸的序列为以下序列所示的核苷酸序列：
5'-UGGGGUAUUUGACAAACUGACA-3'（SEQ ID NO.2）。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含的微小RNA反义核酸的含量为0.5~1g。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体、环糊精、微球和微囊。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以口服或注射的方式给药。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。
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