CN102895671B - 一种微小rna在预防和/或治疗心脏疾病中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种微小RNA在预防和/或治疗心脏疾病中的用途。本发明提供的微小RNA为包含以下SEQ ID NO：1序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。该微小RNA可以作为一种新型的药物组合物用于心脏疾病的预防和/或治疗。

Description

一种微小RNA在预防和/或治疗心脏疾病中的用途

技术领域

本发明属于生物医药工程领域及心脏疾病的预防和治疗领域，涉及一种外源性的非编码小RNAs的新用途，具体涉及一种微小RNA(microRNA，miRNA)在预防和/或治疗心脏疾病中的用途。

背景技术

目前，心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部2004年底公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数超过1.6亿，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。

目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、预防和治疗。

miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子。许多研究表明，miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。

细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞都会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这一点可能是一些心脏疾病发病的机理。钙调磷酸酶(calcineurin)在心肌梗死及心肌肥厚等心脏疾病发生发展过程中发挥重要作用，抑制calcineurin的表达或活性在预防、治疗这些心脏疾病中具有潜在的应用价值。

目前研究发现许多miRNA通过调控凋亡相关靶蛋白的表达而参与细胞凋亡的发生，这些miRNA有促凋亡的，也有抑凋亡的。开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、预防和治疗具有极其重要的意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的是设计针对钙调磷酸酶催化亚基mRNA的3’非翻译区(3’UTR)互补的微小RNA(miRNA)，将其命名为miRNA-4pp，它具有抑制钙调磷酸酶表达的作用，进一步研究发现miRNA-4pp能够抑制心肌细胞凋亡，并且确定了其在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，目的是将其应用到这些心脏疾病的预防及治疗中。

本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种微小RNA在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的用途，其中所述微小RNA为包含以下SEQ ID NO：1序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：

5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。

优选地，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化。

另一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的微小RNA和药学上可接受的病毒、载体或辅料，其中所述微小RNA为包含以下SEQ ID NO：1序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体：5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。

优选地，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等。其中纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100纳米的微型颗粒，可能是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。

优选地，所述药物组合物的给药方式为口服给药或注射给药；更优选地，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。

再一方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物组合物在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的用途。

优选地，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化。

综上所述，本发明人通过实验证明miRNA-4pp在心肌缺血损伤及心肌细胞凋亡中的变化及其心肌保护作用。具体地，本发明人通过研究发现，miRNA-4pp具有抑制心肌细胞凋亡的功能。通过合成miRNA-4pp模拟物，加强miRNA-4pp的表达可以抑制心肌细胞凋亡。小鼠尾静脉注射miR-4pp可以减轻缺血再灌注损伤所致的心肌细胞凋亡，减小心肌梗死面积，可改善缺血再灌注损伤所致的心功能失调，检测指标包括左室舒张末压(LVEDP)，左室压力上升和下降最大变化速率(±dp/dt max)和LVEF(左室射血分数)。给予miRNA-4pp还能改善缺血再灌注损伤所致的心脏重塑，包括降低心重体重比，边缘区的心肌细胞横截面积(WGA染色)及心肌纤维化(Masson染色)并改善心功能。miRNA-4pp通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用，miRNA-4pp对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。

由此可见，本发明人通过实验研究发现，miRNA-4pp(5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’)通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。过表达miRNA-4pp，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善、心肌纤维化及心脏结构重塑均在一定程度上被抑制。将miRNA-4pp模拟物或与适当的载体结合形成药物，导入心脏或体内，对许多心脏疾病将具有预防及治疗作用。发明人通过合成miRNA-4pp模拟物从小鼠尾静脉注射给药，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，在动物模型证明了miRNA-4pp对缺血性心脏病的治疗作用。

因此，本发明提供了将miRNA-4pp与适当载体或辅料如壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或直接心肌注射的方式，用于预防和/或治疗心脏疾病、改善心脏功能、阻止心肌纤维化及心肌重构的发生。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为过表达miRNA-4pp对缺氧诱导的原代心肌细胞凋亡的影响；其中，图1A为miRNA-4pp模拟物(图中以miRNA-4pp表示)转染原代心肌表达水平检测，miR-NC为作为阴性对照；图1B为原代心肌细胞转染miRNA-4pp模拟物对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响，miR-NC为作为阴性对照；

图2为过表达miRNA-4pp对心肌缺血损伤的抵抗作用；其中，图2A为小鼠尾静脉注射miRNA-4pp模拟物(图中以miRNA-4pp表示)后检测心肌组织miRNA-4pp表达水平，其中miR-NC作为阴性对照；图2B为过表达miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的比较，以假手术处理的小鼠作为对照；其中图2C为过表达miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后心肌梗死面积比较，其中的1、2、3、4分别表示每组试验的心肌梗死的表观图。

图3为过表达miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后24小时心功能状况比较；图3A检测为LVEDP(左室舒张末压)的比较结果，图3B为检测±dp/dt max(左室压力上升和下降最大变化速率)的比较结果，图3C为检测LVEF(左室射血分数)的比较结果，均以假手术处理的小鼠作为对照。

图4为过表达miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠心肌缺血再灌注后2周心脏重塑、心肌纤维化及心功能比较；其中图4A为心重体重比比较；图4B为麦胚凝集素(WGA)染色比较心肌细胞横截面面积；图4C为Masson染色比较心肌纤维化程度；图4D为心功能状况比较，检测指标包括左室收缩内径(LVIDs)、左室舒张内径(LVIDd)、短轴缩短率(FS)，均以假手术处理的小鼠作为对照。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

除非特别说明，以下各实施例中使用的实验动物C57小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；提取总RNA使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，逆转录反应使用逆转录试剂盒(Takara公司)，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-4pp的表达水平的方法参见Chen，C.，et al.Real-timequantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33，e179，2005。miRNA-4pp模拟物的序列为SEQ IDNO：1：5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’，由上海吉玛公司合成。

实施例1miRNA-4pp抑制心肌细胞凋亡的实验

本实施例中以原代培养的心肌细胞为模型，检测miRNA-4pp是否能够抑制心肌细胞的凋亡。

对于心肌细胞凋亡实验模型，参照文献Tan，W.Q.，Wang，K.，Lv，D.Y.&Li，P.F.Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through TransactivatingCatalase.J Biol Chem 283，29730-29739(2008)中记载的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞。原代心肌细胞转染miRNA-4pp模拟物以过表达miRNA-4pp，同时转染miRNA-NC作为阴性对照。转染采用脂质体(购自Invitrogen公司)，miRNA-4pp及miRNA-NC终浓度为150nM。转染24小时后，在低氧培养箱(氧含量小于1％)中培养处理细胞24小时，诱导细胞凋亡。提取RNA，进行逆转录反应后，通过实时荧光定量PCR技术检测miRNA-4pp的表达水平。

台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况，具体方法如下：

台盼蓝的使用浓度为0.4％，用胰蛋白酶将细胞消化成单个分离的细胞，连同上清一起收集细胞，经PBS洗涤，加适量台盼蓝混匀染色，光镜下任意选取4-5个视野计数，每组计数总细胞数约200个，计算被染成蓝色的细胞占所有细胞的比例，就可估算细胞的凋亡率。

结果显示，原代心肌细胞转染miRNA-4pp后，miRNA-4pp表达水平显著上升，见图1A。过表达miRNA-4pp可以显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡，结果见图1B。

实施例2miRNA-4pp过表达抑制心肌缺血损伤实验验证

本实施例验证了miRNA-4pp过表达是否能够抑制心肌缺血损伤。

1.小鼠经尾静脉注射miRNA-4pp模拟物可显著抑制心肌缺血再灌注损伤

以C57小鼠为实验对象，按照如下方法注射miRNA-4pp模拟物或miRNA-NC：

小鼠尾静脉20mg/kg注射miR-4pp模拟物或阴性对照miRNA-NC。

模拟物注射3天后，进行心脏缺血再灌注手术，并以假手术处理的小鼠作为对照，具体操作如下：

小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管。在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)。以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5小时以上作为结扎成功的标志。缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注。以ST段下降为标志。清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔。再灌注3小时，进行TUNEL检测心肌细胞凋亡。再灌注24小时，用Evans blue/TTC双染测定心肌梗死面积。

具体方法如下：

心肌缺血再灌注模型建立24小时后，重新结扎左前降支，注射2％伊文斯蓝(Evans blue)，取出心脏，用生理盐水洗去血液后，称取全心重和心室重量，沿着垂直于左室长轴的方向将左心室横切成5片切片，置于37℃。1％氯化三苯基四氮唑(TTC)磷酸缓冲液中染色15min，数码相机记录每片心肌的情况，剪去各心肌片被染色的非梗塞区，把未染色梗塞区的心肌称重，除以全心重或心室重分别得到梗塞范围占全心重或占心室重的百分率，此即心肌梗塞面积。

心梗面积按如下方法计算：左心室面积(left ventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk，AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积。危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％；心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％。

实时定量PCR检测了心肌组织中miRNA-4pp表达水平，结果显示，注射miR-4pp模拟物的小鼠缺血/再灌注(I/R)组心肌组织比miRNA-NC小鼠I/R组凋亡细胞数目明显减少(图3B)，心肌梗死面积明显减少(图3C)，有统计学差异(p＜0.01)。

实施例3miRNA-4pp过表达小鼠在心肌缺血再灌注中具有改善心功能的作用。

参照实施例2的方法，对miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠实行缺血再灌注手术，并以假手术处理的小鼠作为对照，缺血45分钟再灌注24小时，采用Millar导管闭胸式经颈动脉插管法(SPR-839，Millar Instrument，Houston，Texas)对miRNA-4pp小鼠(n＝8)和miRNA-NC小鼠(n＝8)进行心功能监测，检测方法参见Yan Feng，et al.Innate immune adaptor MyD88mediates neutrophil recruitment and myocardial injury afterischemia-reperfusion in mice.Am J Physiol Heart Circ Physiol.2008September；295(3)：H1311-H1318。检测指标包括左室舒张末压(LVEDP)，左室压力上升和下降最大变化速率(±dp/dt max)和左室射血分数(LVEF)。

结果显示，与对照小鼠I/R相比，miR-4pp过表达小鼠I/R的LVEDP显著降低，±dp/dt max与LVEF均明显升高，说明miRNA-4pp过表达具有改善心功能的作用(图3)。

实施例4miRNA-4pp过表达改善心功能，阻止心脏结构重塑、心肌纤维化的实验验证

参照实施例2的方法，对miRNA-4pp小鼠及miRNA-NC小鼠进行心肌缺血再灌注手术，并以假手术处理的小鼠作为对照。

缺血再灌注两周取心脏进行WGA及Masson染色，分别用来观察小鼠心肌细胞横截面积大小及纤维化程度。具体方法参见：Lin，Z.，et al.miR-23a functions downstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy.ProcNatl Acad Sci U S A106，12103-12108(2009)和Dolber，P.C.，Bauman，R.P.，Rembert，J.C.&Greenfield，J.C.，Jr.Regional changes in myocyte structure inmodel of canine right atrial hypertrophy.Am J Physiol267，H1279-1287(1994)。

结果如图4所示，表明与miRNA-NC小鼠I/R组相比，miR-4pp过表达小鼠I/R组的心重/体重比(图4A)、横截面积(图4B)与胶原面积(图4C)都显著下降，说明miRNA-4pp可以阻止心脏结构重塑、心肌纤维化。同时miRNA-4pp小鼠心功能也得到显著改善(图4D)。

Claims (7)

1.一种微小RNA在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途，其中所述微小RNA为以下SEQ ID NO:1序列的核酸：

5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’。

其中，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化。

2.一种用于治疗心脏疾病的药物组合物，其包含治疗有效量的微小RNA和药学上可接受的载体或辅料，其中所述微小RNA为以下SEQ IDNO:1序列的核酸：

5’-UUAAGACUGCCUAAUUCAGUUU-3’；

其中，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为病毒。

4.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的载体或辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以口服或注射的方式给药。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述注射给药方式选自静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射和心肌注射。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗心脏疾病的药物中的用途，其中，所述心脏疾病选自心肌梗死、心肌缺血损伤、冠心病、心肌肥厚和心肌纤维化。