CN104548137B - 一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途 - Google Patents
一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途，药物组合物包括lncRNA抑制剂和载体；lncRNA抑制剂的核苷酸序列为：5’‑CAGUGAGGUAGUCUCACAA‑3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。药物组合物中lncRNA抑制剂的含量为0.5‑1克。该药物组合物用于心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的治疗和防治。本发明选用的原料科学合理，制备工艺简单，药物作用明显，使用范围广，安全可靠，应用环境友好。
Description
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种短的核苷酸的新药及其用途，特别是一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其在预防或治疗心脏疾病中的用途。
背景技术：
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界每年有一千七百多万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。随着人类生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据近期公布的最新统计结果表明，18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥大、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的药物用于心脏病的诊断和防治。
细胞凋亡(apoptosis)又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大和心力衰竭等，心肌细胞会发生凋亡。由于成熟的心肌细胞不能分裂增殖，心肌细胞过度凋亡必然会使心肌细胞数目减少，这可能是心脏疾病发病的机理。
通常，lncRNA是指大于200个核苷酸的非编码RNA，与其他非编码RNA相比较，lncRNA具有类型多、作用模式多和数量多的特点；lncRNA可以通过改变染色质的结构来调节基因的表达，也可以通过顺式或反式方法来沉默或激活一个基因或一个基因家族，甚至整条染色体。由于lncRNA功能很广泛，所以lncRNA与心脏疾病的关系已经引起了人们的重视。现在lncRNA在心脏中的表达调控以及功能尚且不为人们所知，我们想对这类在心脏中表达的lncRNA进行表达调控以及功能的研究，从而加深人们对心肌梗死分子机制的了解，提供新的药物作用靶点。这对于开发以lncRNA为策略的心脏疾病的诊断和治疗药物具有及其重要的意义和应用前景。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种lncRNA抑制剂用于制备诊断、预防或治疗心脏疾病的药物组合物及其用途，确定或发现促进心肌细胞凋亡和心肌梗死的心脏特异性表达的lncRNA，进一步确定其在心脏疾病中的作用，并将其抑制剂应用于这些心脏疾病的诊断和防治药物中。
为了实现上述发明目的，本发明涉及的一种含lncRNA抑制剂的药物组合物包括lncRNA抑制剂和药学上可接受的载体；所述lncRNA抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：5’-CAGUGAGGUAGUCUCACAA-3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种，优选地为脂质体纳米粒；药物组合物中lncRNA抑制剂的的含量为0.5-1克。
所述药物组合物以口服或注射的方式给药；其中，所述注射给药方式包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射或心肌注射。
本发明的含lncRNA抑制剂的药物组合物用于心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的治疗和防治。
本发明的药物组合物可制成用于预防或治疗心脏疾病的试剂盒，含有的lncRNA抑制剂与载体构成药物导入体内，所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种，优选地为脂质体纳米粒，用于心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的预防与治疗。
本发明通过实验发现lncRNA在心肌缺血损伤及缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中表达显著上调；通过转染和注射lncRNA抑制剂抑制lncRNA的表达能够抑制心肌细胞凋亡、心肌缺血损伤和心肌梗死面积减少；通过抑制心肌细胞凋亡对心脏具有保护作用。
本发明与现有技术相比，其选用的原料科学合理，制备工艺简单，药物作用明显，使用范围广，安全可靠，应用环境友好。
附图说明：
图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中lncRNA表达水平的变化图；
图2为抑制内源性的lncRNA对心肌细胞凋亡的抑制的作用图；
图3为lncRNA抑制剂对心肌缺血损伤的抑制作用图。
具体实施方式：
下面通过具体实施例并结合附图进一步阐述本发明。
以下各实施例中涉及的原代心肌细胞培养，细胞转染，心脏缺血再灌手术步骤，Evans blue/TTC双染和TUNEL检测均参见以下文献：Wang JX,etal,miR-499regulatesmitochondrial dynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-1.2011January 17:71-78；其中所用的试验动物为小鼠，其小鼠品种为C57/BL6，购自北京医科大学；所用的酶如限制性内切酶、扩增酶和逆转录酶等，均购自北京奥博生物有限公司；所用的试剂均为分析纯级试剂，且从正规渠道商购获得。
实施例1、
本实施例药物组合物包括lncRNA抑制剂和药学上可接受的载体；所用的lncRNA抑制剂的核苷酸序列如下列SEQ ID NO:1所示：5’-AGUGAGGUAGUCUCACAA-3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；药物组合物中lncRNA抑制剂的的含量为0.5-1克。
将本发明的lncRNA抑制剂药物组合物以口服或注射的方式给药，用于心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的治疗和防治。
实施例2、
心肌缺血及心肌细胞缺氧诱导的心肌细胞凋亡过程中lncRNA表达情况检测，本实施例对心肌细胞凋亡实验模型，采用常规的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，低氧培养箱(氧浓度低于1％)培养不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测lncRNA的表达水平，图1为心肌缺血损伤及缺氧处理(Anoxia)的心肌细胞凋亡过程中lncRNA表达水平的变化图，其中图1A表明原代心肌细胞缺氧处理lncRNA表达水平；图1B表明小鼠心肌缺血损伤lncRNA表达水平；在低氧处理4h-8h内显著上调(图1A)；采用结扎小鼠冠状动脉建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，通过实时荧光定量PCR技术检测lncRNA的表达水平，结果显示缺血30min-120min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组的lncRNA表达水平显著上升(图1B)，其中以假手术组(sham)作为对照组。
实施例3、
lncRNA抑制剂抑制心肌细胞凋亡的实验，本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型，转染lncRNA抑制剂核苷酸(lncRNA抑制剂核苷酸序列是与lncRNA一段编码序列完全反向互补的序列，5’-CAGUGAGGUAGUCUCACAA-3’，与lncRNA结合来抑制lncRNA的表达)，转染24小时后，在低氧培养箱中培养处理细胞3小时，诱导细胞凋亡，台盼兰染色方法检测心肌细胞凋亡情况，结果见图2，其中图2A表示原代心肌细胞转染lncRNA抑制剂(anta-lncRNA)抑制内源性的lncRNA的表达；图2B表示对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的影响，转染NC作为阴性对照。图2显示，抑制内源性lncRNA能够显著抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡。
实施例4、
lncRNA抑制剂抑制心肌缺血损伤及凋亡实验，本实施例以C57/BL6小鼠为实验对象，每组8只小鼠，将测得的结果用one-way ANOVO统计软件进行统计学分析，按照如下方法注射30mg/kg lncRNA抑制剂核苷酸(anta-lncRNA)和它的阴性对照(NC)(该lncRNA抑制剂核苷酸是在2’端进行了甲氧修饰，即在核酸的2’端的羟基被甲氧基取代以增强核酸的稳定性。该修饰是由上海吉玛公司进行修饰的)(以购自上海吉玛公司的一段无关序列为阴性对照序列，其不抑制现有已知的任何基因的表达，其序列为：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)；小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区。颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉，开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏；稀释lncRNA抑制剂于磷酸盐缓冲液(PBS)中，终体积为200μL，26号导管从心尖进入动脉根部，注射lncRNA抑制剂时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒，监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔，等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中；心电图监测整个手术过程；注射lncRNA抑制剂核苷酸3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测。颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管；在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)；以I、aVL导联ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志，缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注，以ST段下降为标志；清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔；再灌注24小时用Evans blue/TTC双染测定心肌梗死面积；
lncRNA抑制剂对心肌缺血损伤的抵抗作用如图3所示；其中图3A为小鼠心肌注射lncRNA抑制剂后实施心肌缺血再灌注手术的试验结果，ARR/LV表示危险区总面积/左心室面积，INF/AAR表示梗死区面积/危险区总面积，INF/LV表示梗死区面积/左心室面积，其中每组从左到右依次为没有加处理的对照组，经缺血再灌注的对照组(Con)，经缺血再灌注的阴性对照处理组(NC)和经缺血再灌注的lncRNA抑制剂处理组(anta-lncRNA)；图3B为小鼠心肌注射lncRNA抑制剂后心肌凋亡的结果。
结果显示：注射lncRNA抑制剂的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p<0.01)，见图3A。
本实施例涉及的心梗面积按如下方法计算：危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％，心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％；同时又检测了注射lncRNA抑制剂、对I/R的凋亡的影响，用TUNEL检测(图3B)，结果显示lncRNA抑制剂可显著抑制心肌缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡的发生，其中以假手术组作为对照组；以上的结果说明小鼠经冠状动脉注射lncRNA抑制剂可显著抑制心肌缺血再灌注损伤。
序列表
SEQ ID NO:1
5’- CAGUGAGGUAGUCUCACAA-3’
Claims (4)
1.一种用于治疗和防治心肌梗死、心肌缺血性损伤和心肌纤维化的含IncRNA抑制剂的药物组合物，其特征在于药物组合物包括lncRNA抑制剂和载体；所述lncRNA抑制剂的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：5’-CAGUGAGGUAGUCUCACAA-3’；所述载体为壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种；药物组合物中lncRNA抑制剂的的含量为0.5-1克。
2.根据权利要求1所述的用于治疗和防治心肌梗死、心肌缺血性损伤和心肌纤维化的含lncRNA抑制剂的药物组合物，其特征在于药物组合物以口服或注射的方式给药。
3.一种如权利要求1或2所述的含lncRNA抑制剂的药物组合物在制备治疗心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的试剂盒中的应用。
4.一种如权利要求1或2所述的含lncRNA抑制剂的药物组合物在制备治疗心肌梗死、心肌缺血损伤和心肌纤维化的药物中的应用。
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