CN110403954B - LncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用 - Google Patents

LncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了lncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用。通过超表达和沉默lncRNA XLOC_110286证实其参与抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，促进人脐静脉内皮细胞的凋亡，抑制人脐静脉内皮细胞迁移，抑制人脐静脉内皮细胞小管形成，进一步说明lncRNA XLOC_110286可能对梗死后的血管新生具有抑制作用。因此，lncRNA XLOC_110286的抑制剂可用于制备促进血管新生的药物。具体的，lncRNA XLOC_110286的抑制剂可用于制备促进心肌梗死后血管新生的药物。

Description

LncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中 的应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及一种长链非编码RNA XLOC_110286(lncRNA XLOC_110286)的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用。
背景技术
心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是一种严重危害人类健康的心血管疾病，该病基于冠状动脉粥样硬化狭窄，形成的血块阻塞冠状动脉管腔，由于长时间缺血最终导致心肌坏死，被称为“人类健康的头号杀手”。
血管新生指的是从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而来的新血管，主要是通过出芽生殖的方式形成功能完善的血管，主要包括内皮细胞的增殖、出芽和迁移。在受损心脏中，有效的血管重塑能让病灶区得到一定程度恢复，血管内皮细胞在成体心脏损伤后的血管新生中扮演重要角色。
长链非编码RNA(Long Non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA，绝大多数的lncRNA没有蛋白编码能力。越来越多的研究表明，lncRNA可作为重要调节因子参与到包括MI在内的各种疾病的发生和/或发展中，其在心血管生理学和病理学中起到至关重要的作用。近年来很多文献报道lncRNA在肿瘤疾病中通过调节人脐静脉内皮细胞(HUVECs)从而影响血管新生，而MI后的血管新生却鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种长链非编码RNA XLOC_110286(lncRNA XLOC_110286)的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用。
本发明以lncRNA XLOC_110286为研究对象，采用了分子细胞生物学方法研究其在心肌梗死后血管新生中的应用，第一次证实了lncRNA XLOC_110286在人脐静脉内皮细胞的应用，通过超表达和沉默lncRNA XLOC_110286证实其能够参与抑制人脐静脉内皮细胞增殖、促进人脐静脉内皮细胞凋亡、抑制人脐静脉内皮细胞迁移、抑制人脐静脉内皮细胞小管形成，进一步说明lncRNA XLOC_110286可能参与抑制心肌梗死后的血管新生。因此，lncRNAXLOC_110286的抑制剂可用于制备促进血管新生的药物，特别是可用于制备促进心肌梗死后血管新生的药物。
所述的lncRNA XLOC_110286的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的lncRNA XLOC_110286抑制剂为lncRNA XLOC_110286的siRNA或lncRNAXLOC_110286的RNA干扰载体。
本发明还提供一种促进血管新生的药物，该药物含有有效量的lncRNA XLOC_110286抑制剂。优选，所述的促进血管新生的药物是促进心肌梗死后血管新生的药物。
本发明通过基因工程技术改变lncRNA XLOC_110286在人脐静脉内皮细胞中的表达量，证实：在体外环境下，lncRNA XLOC_110286抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，促进人脐静脉内皮细胞的凋亡；lncRNA XLOC_110286抑制人脐静脉内皮细胞的迁移；lncRNA XLOC_110286抑制人脐静脉内皮细胞的小管形成。
具体的验证试验及结果为如下：
1、本发明通过EdU法检测到，在人脐静脉内皮细胞内超表达lncRNA XLOC_110286后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比人脐静脉内皮细胞的增殖率降低(P<0.05)(图1)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比人脐静脉内皮细胞的增殖率升高(P<0.01)(图2)。
2、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测到，在人脐静脉内皮细胞内超表达lncRNA XLOC_110286后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比人脐静脉内皮细胞的凋亡率升高(P<0.01)(图3)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比人脐静脉内皮细胞的凋亡率降低(P<0.01)(图4)。
3、本发明通过Transwell小室法检测到，在人脐静脉内皮细胞内超表达lncRNAXLOC_110286后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比人脐静脉内皮细胞的细胞迁移数减少(P<0.01)(图5)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比人脐静脉内皮细胞的细胞迁移数增多(P<0.05)(图6)。
4、本发明通过Matrigel基质胶法检测到，在人脐静脉内皮细胞内超表达lncRNAXLOC_110286后，与对照组(Blank)相比人脐静脉内皮细胞的成管数减少(P<0.01)(图7)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(Blank)相比人脐静脉内皮细胞的成管数增多(P<0.01)(图8)。
本发明的有益效果为：
本发明检测了超表达/沉默lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞的增殖、凋亡、迁移、成管情况，为其在血管新生中的分子机理和作用机制奠定基础。同时，本发明的结果显示lncRNA XLOC_110286参与抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，促进人脐静脉内皮细胞的凋亡，抑制人脐静脉内皮细胞迁移，抑制人脐静脉内皮细胞小管形成，进一步说明lncRNAXLOC_110286可能对梗死后的血管新生具有抑制作用，这为研究防治心肌梗死的新靶点和新策略提供了理论依据和临床基础。lncRNA XLOC_110286抑制剂可用于制备促进血管新生的药物，特别是可用于制备促进心肌梗死后血管新生的药物。
附图说明
图1是EdU法检测超表达lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞增殖的结果图。其中，pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286表示超表达lncRNA XLOC_110286；pcDNA3.1(-)为对照组。
图2是EdU法检测沉默lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞增殖的结果图。其中，lncRNA XLOC_110286 Silencer表示沉默lncRNA XLOC_110286；NC为对照组。
图3是Annexin V-FITC法检测超表达lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞凋亡的结果图。其中，pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286表示超表达lncRNA XLOC_110286；pcDNA3.1(-)为对照组。
图4是Annexin V-FITC法检测沉默lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞凋亡的结果图。其中，lncRNA XLOC_110286 Silencer表示沉默lncRNA XLOC_110286；NC为对照组。
图5是Transwell小室法检测超表达lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞迁移的结果图。其中，pcDNA3.1(-)-lncRNA1表示超表达lncRNA XLOC_110286；pcDNA3.1(-)为对照组。
图6是Transwell小室法检测沉默lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞迁移的结果图。其中，lncRNA1 Silencer表示沉默lncRNA XLOC_110286；NC为对照组。
图7是Matrigel基质胶法检测超表达lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞小管形成的结果图。其中，pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286表示超表达lncRNA XLOC_110286；Blank为对照组。
图8是Matrigel基质胶法检测沉默lncRNA XLOC_110286后人脐静脉内皮细胞小管形成的结果图。其中，lncRNA XLOC_110286 Silencer表示沉默lncRNA XLOC_110286；Blank为对照组。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
下述实施例中的lncRNA XLOC_110286 Silencer具有沉默lncRNA XLOC_110286的功能，由广州市锐博生物科技有限公司合成；lncRNA XLOC_110286 SilencerNC不具有沉默lncRNA XLOC_110286的功能，是lncRNA XLOC_110286 Silencer的对照，由广州市锐博生物科技有限公司提供。
实施例1
1、构建基因超表达载体
从差异lncRNA中筛选出与心梗相关的lncRNA XLOC_110286作为研究对象。DNAMAN软件分析发现lncRNA XLOC_110286基因全长序列无Kpn I和Nhe I两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1(-)载体(购自BioMed公司，货号CL408-01)存在Kpn I和Nhe I酶切位点。primer premier 5.0软件设计基因全长引物，其上下游引物分别加上Kpn I和Nhe I酶切位点序列。以人脐静脉内皮细胞cDNA 为模板，PCR扩增目的片段(扩增的目的片段是lncRNAXLOC_110286序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1(-)载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自Magen公司)，命名为pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286(含有lncRNA XLOC_110286序列)。
2、人脐静脉内皮细胞的培养
(1)从液氮罐中取出内皮细胞，放入37℃水浴解冻。
(2)配制ECM完全培养基：93％ECM+5％FBS+1％ECGS+1％双抗。
(3)解冻好的细胞加入适量完全培养基，1000rpm室温离心5min。
(4)弃去上清，加入适量PBS缓冲液清洗细胞，1000rpm室温离心5min。
(5)弃去上清，用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃，5％CO2培养箱中静置培养。
所述的双抗为青霉素和链霉素。
3、细胞RNA抽提及反转录
细胞总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)培养人脐静脉内皮细胞至合适密度，弃培养基，PBS清洗细胞两次，根据细胞量加入1000μL TRIzol，并反复吹打几次，使之充分裂解。
(2)将裂解液转移至新的1.5mL无RNA酶离心管中，冰孵5min使核蛋白复合物完全分离。
(3)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，冰孵5min，4℃11000rpm离心15min，可见混合物分为三层，RNA位于上层水相中。
(4)将上层水相转移至新的1.5mL无RNA酶离心管中，加入500μL异丙醇混匀，冰孵10min，4℃1100rpm离心10min。
(5)移走上清，小心地用75％的乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心3min。
(6)弃上清，干燥RNA至湿润状，适量DEPC水溶解RNA沉淀。
mRNA反转录参照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect RealTime)cDNA反转录试剂盒进行。
4、人脐静脉内皮细胞的接种和转染
(1)人脐静脉内皮细胞汇合度达到90％～95％时，弃培养基，PBS清洗细胞2遍。
(2)适量胰蛋白酶消化，待消化完全立即加入等量完全培养基终止消化。
(3)PBS清洗2遍，期间1000rpm室温离心5min。
(4)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养。
(5)次日，观察内皮细胞状态，待细胞汇合度达70％～90％时即可转染。
(6)转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0002136909550000071
3000试剂盒说明书进行；分为4组，分别为超表达lncRNA XLOC_110286组(转染pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286)、对照组(转染pcDNA3.1(-))、沉默lncRNA XLOC_110286组(转染lncRNA XLOC_110286 Silencer，所述的lncRNA XLOC_110286 Silencer具有沉默lncRNAXLOC_110286的功能，其是由6条序列组成，3条ASO序列和3条siRNA序列)和对照组NC(转染lncRNAXLOC_110286Silencer NC，所述的lncRNAXLOC_110286 Silencer NC不具有沉默lncRNAXLOC_110286的功能，其是由2条序列组成，1条ASO序列和1条siRNA序列)，每组设置3个重复。
(7)转染后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养。
(8)根据实验目的在转染后24～48h收集细胞。
5、人脐静脉内皮细胞增殖检测
本发明中EdU法检测细胞增殖实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-LightTMEdU Apollo 567 In vitro Kit进行。具体步骤如下(以48孔板为例)：
(1)用完全培养基按1000:1的比例稀释Edu溶液，制备适量Edu培养基。
(2)每孔200μLEdu培养基孵育2h，弃培养基。
(3)PBS清洗细胞2次，每次5min。
(4)每孔100μL细胞固定液(用PBS稀释的80％丙酮)室温孵育30min，弃固定液。
(5)每孔200μLPBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS。
(6)每孔200μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育20min，弃染色反应液。
(7)每孔200μL渗透剂(含0.5％Triton X的PBS)脱色摇床清洗2次，每次10min，弃渗透剂，PBS清洗5min。
(8)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst3342反应液，避光保存。
(9)每孔200μL1×Hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育20min，弃染色反应液。
(10)每孔200μLPBS清洗2次，清洗完成后每孔200μL PBS保存待用。
(11)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。
本发明通过基因工程技术外源合成lncRNAXLOC_110286超表达载体(pcDNA3.1(-)-lncRNAXLOC_110286)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA XLOC_110286Silencer)，并将其转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后参照EdU试剂盒说明书，对内皮细胞的增殖情况进行检测。检测结果表明，超表达lncRNA XLOC_110286后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比内皮细胞的增殖率降低(P<0.05)(图1)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比内皮细胞的增殖率升高(P<0.01)(图2)。
6、人脐静脉内皮细胞凋亡检测
本发明使用Annexin V-FITC/PI技术检测细胞凋亡，参照广州科易达生物科技有限公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)取出细胞培养板，室温下用PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS；
(2)适量胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，之后加入等量完全培养基终止消化；
(3)1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷PBS清洗细胞2次。调整每管细胞数为0.2～1.0×106个，加入500μL 1×Annexin V Buffer重悬细胞。
(4)每管样品加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温(25℃)避光反应15min。
(5)反应完后立即用流式细胞仪检测分析。
本发明通过基因工程技术外源合成lncRNA XLOC_110286超表达载体(pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA XLOC_110286Silencer)，并将其转染至人脐静脉内皮细胞内，48h后参照FITC Annexin V ApoptosisDetection Kit with PI说明书，对内皮细胞的凋亡情况进行检测。检测结果表明，超表达lncRNA XLOC_110286基因后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比内皮细胞的凋亡率升高(P<0.01)(图3)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比内皮细胞的凋亡率降低(P<0.01)(图4)。
7、人脐静脉内皮细胞迁移检测
(1)采用无血清培养基清洗细胞，计数，配成细胞悬液。
(2)将100μL细胞悬液混匀200μL无血清培养基，加入Transwell培养板上室。
(3)在Transwell培养板下室加入500μL含有10％FBS的条件培养基。
(4)细胞在培养箱中培养48h后甲醛立即固定。
(5)将上室中未迁移的细胞用湿棉签擦去，显微镜观察下室中的细胞，并拍照保存。
本发明通过基因工程技术外源合成lncRNA XLOC_110286超表达载体(pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA XLOC_110286Silencer)，并将其转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后参照Transwell小室法说明书，对内皮细胞的迁移情况进行检测。检测结果表明，超表达lncRNA XLOC_110286基因后，与对照组(pcDNA3.1(-))相比内皮细胞的迁移数减少(P<0.01)(图5)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与对照组(NC)相比内皮细胞的迁移数增多(P<0.05)(图6)。
8、人脐静脉内皮细胞成管检测
(1)Matrigel基质胶于4℃冰箱过夜融化，48孔板与枪头于4℃冰箱预冷过夜。
(2)冰上操作：每孔100μL基质胶加至48孔板，确保胶完全覆盖孔底，避免加入过程中产生气泡。
(3)37℃孵育60min。
(4)消化细胞，确保每孔有2万至3万个细胞。
(5)37℃孵育2～8h，随时可在荧光显微镜下观察，10h内完成拍照。
本发明通过基因工程技术外源合成lncRNA XLOC_110286超表达载体(pcDNA3.1(-)-lncRNA XLOC_110286)和lncRNA功能抑制的沉默试剂(lncRNA XLOC_110286Silencer)，并将其转染至人脐静脉内皮细胞内，24h后参照Matrigel基质胶法说明书，对内皮细胞的成管情况进行检测。检测结果表明，超表达lncRNA XLOC_110286基因后，与未经过任何处理的内皮细胞(空白对照，Blank)相比内皮细胞的成管数减少(P<0.01)(图7)，沉默lncRNA XLOC_110286后，与未经过任何处理的内皮细胞(空白对照，Blank)相比内皮细胞的成管数增多(P<0.01)(图8)。
本发明以lncRNA XLOC_110286为研究对象，通过超表达和沉默lncRNA XLOC_110286证实其参与抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，促进人脐静脉内皮细胞的凋亡，抑制人脐静脉内皮细胞迁移，抑制人脐静脉内皮细胞小管形成，进一步说明lncRNA XLOC_110286可能对梗死后的血管新生具有抑制作用。因此，lncRNA XLOC_110286的抑制剂可用于制备促进血管新生的药物，具体的，lncRNA XLOC_110286的抑制剂可用于制备促进心肌梗死后血管新生的药物。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省实验动物监测所
华南农业大学
<120> LncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1555
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaagagaag ccaggccggg agcgctgctc aggccagttt ggggccgggt tagggcccat 60
gcggggatca gtctttgggg ggctggttcc aggaacacct tgctactcct ggagccccca 120
cgtggtggct ctgggctgga ttccccttgt tcccgggggc tggaaggggg ccgacccttc 180
cggcctgcgc tgagccaggg gctgggggcc gggctcctgg tggcaggccc gggcggcgtt 240
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ggagacctta ggtctctggg cccggcactg cttaggagaa aaggagcgac ctgttgctct 600
tcctaagggg actccagcta gcaaggcctg tgcccagaat gcggtggcga agtctttgga 660
cgtaggaaca gaaccatcag gggtacttcc tctccagcaa taaaaactat taaatttgct 720
aagctcttcc tgtgtgcagg cattgttctg attgctttac atgtcacgtt ttatataata 780
tgtacaacct attgagatag atattgctgt tatcctcgtt ttacagataa ggaaactgag 840
gcttagagag gtaaagtaac tcaaccaagg tcacacagtc agcggcttaa accggggtga 900
tcactagccc tagctagttt atagctgctg ttctttatgg cctggccccc tagtggttgg 960
gctagaaaag ggagaaagaa agcttttaat cctaggcaaa gttgtaaagg tgttttgttt 1020
ttctgctagt ggactcactt tttaatcaga aagaaactga aaaactccaa agtgaaattg 1080
ctaaccctaa ctattgtgtg tgttgagagt gggggagcta aatgagattc tgggattgag 1140
ttttgtaaga tctgccatcc tgaggaaaca tgaattattc ccttgaactg caaagcaata 1200
actttagaat cagatctggt gttataatcc tacctgctat gccctcccta gctctcatcc 1260
agtcacttaa atgtcaaata catatggaaa acatctagca caatccacag taaatgttat 1320
tttccttcct ttctgagact tcctttcctt gtctctagga agagggaagg gaatccaggt 1380
gtttgaaaac taaataagat acgtcagtat ttggagacta ggaagggctc tataaatatc 1440
agtagttctt ttgtggcagt gagttaagta tgtgggttgt cactgcagca acttgggtca 1500
ctgctgtggc acaggtttaa tccctggcct gggaacttct gcatgccacg cgcat 1555

Claims (2)

1.lncRNA XLOC_110286的抑制剂在制备促进血管新生的药物中的应用，所述的lncRNAXLOC_110286的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的lncRNA XLOC_110286的抑制剂为lncRNA XLOC_110286的siRNA或lncRNA XLOC_110286的RNA 干扰载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，是在制备促进心肌梗死后血管新生的药物中的应用。
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