CN105267990B - 一种含有miRNA-873的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种含有miRNA‑873的药物组合物及其用途，每毫升含有miRNA‑873的药物组合物中1，2‑二油酰基‑3‑三甲氨基丙烷含量为0.5‑25mg，miRNA‑873与1，2‑二油酰基‑3‑三甲氨基丙烷的摩尔比为1：150‑205，DC胆固醇含量为0.l‑5mg，1，2‑二油酰基‑3‑磷脂酰乙醇胺含量为0.l‑20mg，聚乙二醇2000含量为l‑80mg，其余为磷酸盐缓冲液，用于治疗心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化的心脏疾病；其药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。
Description
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种内源性非编码小RNA的新药及其用途，尤其是一种含有miRNA-873的药物组合物及其预防或治疗心脏疾病的用途。
背景技术：
心血管疾病是人类健康和生命的主要威胁，是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百多万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和；随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。根据国家卫生部近期公布的最新统计结果表明，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，估计全国患病人数1.6亿多，由此造成的心肌肥厚、心肌梗死、冠心病、以及心力衰竭等凋亡相关心脏疾病的病人达几千万。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术、方法用于心脏病的诊断、防治。miRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子，许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的miRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，药物作用于一个miRNA可以调节多个参与心脏发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于miRNA在心脏病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测miRNA的表达水平来预测诊断疾病。
心肌细胞死亡是许多心血管疾病的细胞学基础。细胞死亡主要包括凋亡和坏死两种形式，过去的观点认为细胞凋亡受信号通路调控，而坏死不受信号通路调控，是一种被动的细胞死亡形式。近年来研究发现细胞坏死(Necroptosis)，是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。细胞坏死信号通路调控，涉及蛋白激酶RIP1和RIP3等分子，同时细胞坏死的调控分子与炎症、神经系统疾病、免疫功能异常密切相关。在许多心肌损伤或心脏病理状态下，如心肌缺血再灌注损伤、心肌肥大、心力衰竭等，心肌细胞均会发生坏死。然而心肌细胞坏死的信号通路还远未阐明，miRNA在调控心肌细胞坏死过程中的通路也有待进一步研究，所以寻找心脏中特异表达的、参与心肌细胞坏死的miRNA，阐明其作用机理，对于开发以miRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗具有及其重要的意义和应用前景。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，寻求提供一种含有miRNA-873的药物组合物及其预防或治疗心脏疾病的用途。
为了实现上述目的，本发明涉及的含有miRNA-873的药物组合物包括miRNA-873、1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(D0TAP)、DC胆固醇、1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、聚乙二醇2000(PEG2000)和磷酸盐缓冲液，每毫升含有miRNA-873的药物组合物中1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(D0TAP)含量为0.5-25mg，miRNA-873与1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷(D0TAP)的摩尔比为1：150-205，DC胆固醇含量为0.l-5mg，1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)含量为0.l-20mg，聚乙二醇2000(PEG2000)含量为l-80mg，其余为磷酸盐缓冲液。
本发明所述miRNA-873的序列为5’-GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU-3’。
本发明所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-8.0。
本发明的含有miRNA-873的药物组合物，用于治疗心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化的心脏疾病。
本发明涉及的含有miRNA-873的药物组合物在心脏中高表达，心肌缺血损伤和H2O2诱导的心肌细胞死亡过程中，miRNA-873表达显著下调；通过转染miRNA-873药物组合物或miRNA-873转基因小鼠加强miRNA-873的表达能够抑制心肌细胞坏死及心肌缺血损伤，心肌梗死面积减少；心肌缺血再灌注损伤后，过表达miRNA-873能够减轻缺血再灌注损伤所致的坏死，减小心肌梗死面积，过表达miRNA-873还能改善缺血再灌注损伤所致的心功能的损伤；miRNA-873通过抑制心肌细胞坏死对心脏具有保护作用，miRNA-873对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值。
本发明设计的药物组合物与现有技术相比，H2O2诱导或心肌缺血损伤过程中miRNA-873表达显著下调，miRNA-873的下调能诱导心肌细胞坏死的发生；miRNA-873在缺血再灌注动物模型的心肌组织中表达下调，过表达miRNA-873的心脏特异性转基因小鼠，可以抵抗心肌缺血再灌注损伤，心肌梗死面积减少，心功能显著改善。通过将miRNA-873药物组合从冠状动脉注射入小鼠心脏，发现心肌缺血损伤程度明显被抑制，动物模型证明miRNA-873对缺血性心脏病的治疗作用，将miRNA-873与载体包装形成药物分子，通过口服或注射用于防治心脏疾病和改善心脏功能，阻止心肌纤维化及心肌重构的发生；其药物组合物制备工艺简单，药效明显，使用方便，治疗环境友好。
附图说明：
图1为心肌缺血损伤及H2O2诱导的心肌细胞死亡过程中miRNA-873表达水平的变化的试验结果示意图，图中A为原代心肌细胞H2O2处理miRNA-873表达水平的试验结果示意图；B为小鼠心肌缺血miRNA-873表达水平的试验结果示意图。
图2为miRNA-873过表达抑制H2O2诱导的心肌细胞坏死的实验结果示意图。原代心肌细胞转染miRNA-873药物组合物，检测miRNA-873过量表达对H2O2诱导的心肌细胞坏死的作用。图中使用碘化丙啶(PI)染色标记坏死心肌细胞，DAPI染色标记心肌细胞的细胞核，计算发生坏死的细胞数占心肌细胞数目的百分比。
图3为miRNA-873过表达抑制心肌缺血损伤实验结果示意图，图中A为小鼠经冠动脉注射miRNA-873药物组合物后，其心脏的左心室面积(LV)所占的百分比和危险区总面积(AAR)所占的百分比实验结果示意图；图中B为小鼠经冠动脉注射miRNA-873药物组合物后对缺血再灌注手术(I/R)引起的心肌坏死的实验结果示意图。
具体实施方式：
下面结合附图并通过实施例对本发明进一步说明，实验小鼠C57和大鼠均购自北京医科大学。
实施例1：心肌缺血及H2O2诱导的心肌细胞坏死过程中miRNA-873表达情况检测
本实施例使用心肌细胞坏死实验模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞(大鼠乳鼠购自北京医科大学，大鼠品系为Wistar大鼠，大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Tan,etal,Foxo3a Inhibits CardiomyocyteHypertrophy through Transactivating Catalase J Biol Chem.2008October 31；283(44):29730-29739)，500uM H2O2处理不同时间，提取RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-873的表达水平，如图1A所示，miRNA-873表达水平在H2O2诱导8h～12h内显著下调。
本实施例以假手术处理的大鼠作为对照组，采用结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，实时荧光定量PCR技术检测miRNA-873的表达水平，如图1B所示，结果显示缺血30min～60min心肌缺血组织较非缺血组织及非缺血模型组miRNA-873表达水平显著下降。
实施例2：miRNA-873抑制心肌细胞凋亡的实验
本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。转染miRNA-873药物组合物，miRNA-873随机序列作为对照(即NC)，24小时后，使用H2O2诱导处理细胞12小时，检测心肌细胞坏死；PI染色方法检测心肌细胞死亡情况，结果显示过表达miRNA-873可以显著抑制H2O2诱导的心肌细胞凋亡。
实施例3：miRNA-873过表达抑制心肌缺血损伤实验验证
本实施例设计的小鼠经冠状动脉注射miRNA-873药物组合物可显著抑制心肌缺血再灌注损伤，以C57小鼠为实验对象，按照如下方法注射miRNA-873药物组合物及miRNA-873药物组合物阴性对照(NC)，并以假手术处理小鼠为作为对照组，以C57小鼠为野生型。小鼠称重并麻醉，仰卧位固定，剪毛并用碘酒消毒手术区；颈部正中切开气管并插管，连动物呼吸机进行正压通气，在胸骨左缘处及心脏搏动处纵行切开皮肤约3cm，逐层钝性分离皮下组织、肌肉,开胸,小心提起心包并剪开，充分暴露心脏；将200μL药物组合物悬液经26号导管从心尖进入动脉根部，注射时同时夹闭主动脉及肺动脉，持续夹闭20秒；监测5min，待心脏恢复窦律后，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔；等小鼠清醒后，脱离呼吸机，放回笼中，心电图监测整个手术过程；注射3天后进行心脏缺血再灌注手术，具体操作如下：小鼠麻醉后，背位固定于实验用木板上，并进行心电图监测，颈部正中切开气管并插管，连动物人工呼吸机，于第四肋间开胸，小心提起心包并剪开，充分暴露心脏、血管；在肺动脉圆锥和左心耳之间，以左冠状静脉主干为标志，于左心耳根部下方2mm处进针，进针深度0.5mm；以6/0带针缝合线穿过心肌表层，在肺动脉圆椎旁出针；待心电图恢复稳定10min后，予以结扎左冠状动脉前降支(LAD)，以ST段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5h以上作为结扎成功的标志，缺血45min之后，松开结扎线开始再灌注；以ST段下降为标志，清除胸腔内积血并用去针头注射器抽吸气体关闭胸腔，再灌注24h用伊文氏蓝双染测定心肌梗死面积；结果显示：注射miRNA-873药物组合物的小鼠I/R组心肌梗死面积比野生小鼠I/R组明显降低，有统计学差异(p<0.01)，见图3A；其心梗面积按如下方法计算：左心室面积(leftventricle，LV)为蓝色、红色和白色面积之和；危险区总面积(area at risk，AAR)为红色和白色面积之和；梗死区面积(infarct area，INF)为白色面积；危险区面积(AAR/LV，％)＝(危险区总面积/左心室面积)×100％，心梗面积(INF/AAR，％)＝(梗死区面积/危险区总面积)×100％；同时又检测了注射miRNA-873药物组合物对I/R坏死的影响，用细胞凋亡检测试剂盒(TUNEL法)检测(图3B)，结果表明注射了miRNA-873药物组合物的组份与I/R组份相比凋亡率明显的减小，即miRNA-873对心肌具有保护作用。
Claims (3)
1.一种miRNA-873在制备治疗心脏疾病的药物组合物中的应用，其特征在于该药物组合物包括miRNA-873、1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷、DC胆固醇、1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000和磷酸盐缓冲液，每毫升含有miRNA-873的药物组合物中1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷含量为0.5-25mg，miRNA-873与1，2-二油酰基-3-三甲氨基丙烷的摩尔比为1：150-205，DC胆固醇含量为0.l-5mg，1，2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺含量为0.l-20mg，聚乙二醇2000含量为l-80mg，其余为磷酸盐缓冲液；所述心脏疾病为心肌梗死、心肌缺血损伤、心肌肥厚或心肌纤维化。
2.根据权利要求1所述miRNA-873在制备治疗心脏疾病的药物组合物中的应用，其特征在于所述miRNA-873的序列为5’-GCAGGAACUUGUGAGUCUCCU-3’。
3.根据权利要求1所述miRNA-873在制备治疗心脏疾病的药物组合物中的应用，其特征在于所述磷酸盐缓冲液的pH值为6.0-8.0。
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