CN102973953B - miRNA-874及其反义核苷酸的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miRNA-874及其反义核苷酸的用途，具体为miRNA-874反义核苷酸在制备用于治疗和预防重大心脏疾病（心肌肥大，心肌纤维化）的药物组合物中的作用，以及miRNA-874核苷酸在制备用于诊断或预后上述心脏疾病的药物组合物或试剂盒中的作用。miRNA-874的反义核苷酸能够抑制心脏肥厚及心肌细胞肥大，同时也具有改善心功能、抑制心脏结构重塑及心脏纤维化的功能。miRNA-874的反义核苷酸可以作为一种新型的药物作用靶点，对心肌肥大起到防治作用，对于由心肌肥大引起的心肌纤维化、冠心病及心衰等心脏疾病的预防及治疗在临床上具有重要意义。

Description

miRNA-874及其反义核苷酸的用途

技术领域

本发明涉及一种内源性的非编码小RNAs的新药用途，具体涉及miRNA-874及其反义核苷酸的用途，尤其涉及其miRNA-874及其反义核苷酸在制备用于诊断、防治心脏疾病的药物中的用途，属于心脏疾病的诊断、预防和治疗领域。

背景技术

心血管疾病主要包括高血压、冠心病、充血性心力衰竭等。目前，心血管疾病仍然是人类健康的头号杀手，全世界范围内每年有一千七百万人死于心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的总和。在我国，随着人民生活水平日益提高和饮食结构的改变，心血管疾病死亡率呈明显上升趋势，已超过癌症成为第一大致死原因。毫无疑问，预防和治疗心血管疾病仍然是医学与生物学的重大任务。

心肌肥大是指组织水平上心肌组织的增厚和细胞水平上心肌细胞体积的增大的总称。它是由于心肌细胞体积增大而导致心脏体积增大所发生的一种疾病。该病是由一些生理和病理因素的共同刺激而发生的，它是许多心血管疾病的综合性表现。心肌肥大是心肌病的一种，是心肌细胞针对于血液动力学增加的一种应答反应。多种情况可以引起人体内血液动力的增加，比如高血压，心脏瓣膜疾病。长期的超负荷血液动力刺激会引起以心肌细胞体积增大为特征的心肌细胞重塑过程，也就是心肌肥大。现在一般认为存在两种情况的心肌肥大，一种是正常的生理性肥大，比如出生后伴随者发育发生的心肌肥大，还有体育锻炼引起的心肌肥大；另外一种是病理性心肌肥大，其早期特征是室壁和室间隔增厚，心肌收缩功能增强，因此被视为代偿性肥大,如果病情一直未得到缓解，心肌肥大后期会发生心室壁间质纤维化、心肌细胞收缩功能失调以及能量代谢，基因表达和电生理特征的异常，最终导致心脏功能衰竭。鉴于心肌肥大的发生是一个进行性不可逆过程，而且最终会引起心力衰竭，现代医学已经把它作为心脏发生临床病变的一个里程碑式的心肌形态变化，认为它是导致心脏疾病和心脏猝死的一个危险因素。

随着近来miRNA研究的热潮，这种内源性非编码小RNAs已经作为一个基因表达调节的中心因子显露，参加许多重要的生理过程。对于miRNA来说，它调控方式的特点决定了它的靶基因不会只有一个，而是一对多的方式，这就是使得miRNA的功能研究内容非常丰富。许多研究表明miRNA对于维持心脏正常生理功能具有重要作用，心脏中的miRNA异常表达与许多心脏疾病的发生相关。因此，将miRNA作为心脏疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。

尽管越来越多的miRNA作为人类疾病的生物标志物及治疗靶点被发现，但在心脏肥厚和心肌纤维化心脏疾病中的关键miRNA仍没有确定，其所发挥的功能是对该领域科研人员的挑战。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是确定或发现调控心肌细胞肥大的在心脏中表达的miRNA，进一步确定其在心肌肥厚、冠心病、心肌纤维化等心脏疾病中的关键作用，将其应用到这些心脏疾病的诊断、防治中。

除非特别指明，本文中的“miR-874”均指“miRNA-874”，其序列为下述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列：

5'-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3'。

除非特别指明，本文中的“miR-874反义核苷酸”、“874反义核苷酸”和“anta-874”均指“miRNA-874反义核苷酸”，其序列为下述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列：

5'-UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3'。

除非特别指明，本文中的“anta-NC”均指“miRNA-874反义核苷酸的阴性对照”，其序列为下述SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列：

5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'。

除非特别指明，本文中的“PE”均指“苯肾上腺素”。

除非特别指明，本文中的“ET-1”均指“内皮素”。

针对上目的，本发明提供的技术方案如下。

一方面，本发明提供一种miRNA-874的反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，其中，所述miRNA-874反义核苷酸的序列为下述SEQ ID NO:2的核苷酸序列：5'-UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3'。

优选地，所述miRNA-874反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。

优选地，所述的心脏疾病选自心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰中的一种或多种。

还一方面，本发明还提供一种用于预防或治疗心脏疾病的药物组合物，其中，所述药物包含上述本发明所述的miRNA-874反义核苷酸序列和药学上可接受的载体、病毒或辅料。

优选地，所述载体选自胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。

优选地，所述药物组合物的给药方式选自口服、静脉注射和肌肉注射。

另一方面，本发明还提供一种miRNA-874核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，其中，所述miRNA-874的序列为下述SEQ ID NO:1的核苷酸序列：

5'-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3'。

优选地，所述的心脏疾病选自心肌肥厚、心肌纤维化、冠心病及心衰中的一种或多种。

本发明还提供一种用于诊断或预后心脏疾病的药物组合物或试剂盒，其中，所述药物组合物或试剂盒包含上述本发明所述的miRNA-874核苷酸和药学上可接受的载体、病毒或辅料。

优选地，所述载体选自胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种。

本发明人通过实验发现miRNA-874在肥大的心肌细胞和心脏肥厚中表达显著上调。通过构建miRNA-874过表达腺病毒或miRNA-874转基因小鼠加强miRNA-874的表达发现，miRNA-874过表达在细胞水平能诱导心肌细胞肥大的发生，miRNA-874的转基因小鼠的心脏在用肥大刺激因子处理后与对照组相比有了明显的肥大表型及纤维化程度，同时一些肥大基因的表达也与对照组相比有了明显的增加。

具体的，本发明人发现miRNA-874在肥大的心肌细胞中与对照组相比有了明显的提高，对其进行肥大指标的检测发现，心肌肥大的指标如细胞表面积，蛋白/DAN的比值及肌小节的重组也与对照组相比都有了明显的增加。miRNA-874的转基因小鼠在用肥大刺激因子（苯肾上腺素）后的心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积（WGA染色）及心肌纤维化（Masson染色）与野生型相比都有了明显的增加。以上实验说明miRNA-874能够诱导心肌肥大的发生，这意味着miRNA-874可作为一种早期诊断预防心肌肥大，心肌纤维化等心脏疾病的生物标志物。

另外，本发明人通过大量的试验证明miRNA-874的反义核苷酸对心肌肥厚，心肌纤维化具有保护作用。具体的，本发明人在细胞水平通过转染miRNA-874的反义核苷酸发现，它能够抑制肥大刺激因子所诱导的心肌细胞肥大，包括肥大指标如细胞表面积，蛋白/DAN的比值及肌小节的重组也与刺激组相比都有了明显的降低。在动物水平通过注射外源miRNA-874的反义核苷酸也能够抑制肥大模型的肥大效应包括心脏表型，心脏体重比，边缘区的心肌细胞横截面积（WGA染色）及心肌纤维化（Masson染色）都有了明显的降低，同时心功能也有了明显的改善。

以上实验说明miRNA-874的反义核苷酸通过抑制心肌细胞肥大对心脏具有保护作用，它对许多心脏疾病具有潜在的预防和治疗价值，可成为一种治疗心肌肥大，预防心肌纤维化的药物。具体的，可以合成反义miRNA-874的反义核苷酸并与适当载体如胆固醇，纳米颗粒，脂质体等连接形成药物，通过口服，静脉或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病进行治疗。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏体重比及心脏功能的比较，其中，A为miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏体重比的比较；B为miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能的比较；

图2示出了miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠在PE刺激下心脏体重比及心脏功能的比较，其中，A为在PE刺激下，miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏体重比的比较；B为miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能的比较；

图3示出了经心脏肥大刺激因子PE（苯肾上腺素）和ET-1（内皮素）诱导的心肌细胞肥大过程中miRNA-874表达水平的变化。其中，A为大鼠乳鼠原代心肌细胞经PE处理后miRNA-874随时间的表达水平；B为大鼠乳鼠原代心肌细胞ET-1处理后miRNA-874随时间的表达水平，纵坐标表示以未处理的大鼠原代心肌细胞中miRNA-874的表达水平为基准，在PE或ET-1处理过程中大鼠原代心肌细胞中miRNA-874的表达水平；

图4示出了对经miRNA-874反义核苷酸转染的原代细胞进行PE处理，在细胞水平上对PE所诱导的肥大的抑制情况，其中，A为心肌细胞的表面积的比较；B为蛋白/DNA比率的比较；

图5示出了对小鼠进行静脉注射miRNA-874反义核苷酸（antagomir）能抑制PE所诱导的肥大模型，其中，检测指标包括A心肌细胞横截面积（WGA染色）和B心脏体重比。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。

除非特别指明，以下实施例中所用到的小鼠的品系均为C57/BL6，其中，miRNA-874转基因小鼠购自沈阳医学院，野生型小鼠购自北京医科大学。

除非特别指明，以下实施例中涉及的各种实验方法和操作，包括大鼠乳鼠原代心肌细胞的制备和培养，腺病毒的构建及感染心肌细胞的剂量，细胞表面积测量，蛋白/DNA比值计算，肌小节结构的染色，心脏石蜡切片，HE染色及WGA染色，心脏体重比的检测方法，心脏功能指标的详细叙述，载体的构建、扩增及转染，细胞染色等等，均可参见以下文献：W.-Q.Tan,et al,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase J Biol Chem.2008 October 31;283(44):29730-29739；Wang K,et al,miR-9 and NFATc3 regulate myocardin in cardiachypertrophy,J Biol Chem.2010 Apr 16;285(16):11903-12；Lin Z,et al,miR-23afunctions downstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy，PNAS,2009,106(29):12103-12108）。上述文献在此全文引入作为参考。

实施例1 miRNA-874转基因小鼠的心脏体重比及心功能与野生型相 比没有明显的改变

对miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠心脏进行心脏体重比分析，其中，两组小鼠各自的取样数量均为26只。实验结果如图1A显示miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠相比心脏体重比没有显著的提高，说明miRNA-874转基因小鼠本身并没有明显的肥大表型改变。

同时检测的心功能的指标包括左心室后壁厚度（LVPWd），短轴缩短率（FS）。如图1中的B所示，，实验结果显示miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏功能没有明显的区别。

实验例2 miRNA-874转基因小鼠在PE（苯肾上腺素）刺激下与野 生型小鼠相比心脏体重比及心功能有了明显的改变

对miRNA-874转基因小鼠与野生型小鼠的心脏用肥大刺激因子PE进行腹腔埋泵注射处理，其中，取用miRNA-874转基因小鼠6只，野生型小鼠6只，PE用量为75mg/kg/天。对照组分别为使用生理盐水代替PE进行处理的miRNA-874转基因小鼠和野生型小鼠。二周后进行心脏体重比分析，见图2中的A。实验结果如图2A所显示的，miRNA-874转基因小鼠经过PE处理后的心脏体重比与对照组相比有了显著的提高，说明经过PE处理后的miRNA-874转基因小鼠有了明显的肥大表型改变。

心功能的检测包括LVPWd（左心室后壁厚度），FS（短轴缩短率）以及LVSd(室间隔厚度)，如图2中的B所示，结果表明，以上指标与野生型小鼠相比有了明显的肥大改变（见图2中的B）。

实验例3 在PE和内皮素（ET-1）刺激下miRNA-874表达水平的变 化

对于心肌细胞肥大模型，采用本实验室已建立的方法培养大鼠乳鼠原代心肌细胞，对心肌细胞用PE和ET-1（PE的用量为50μM；ET-1的用量为100nM）进行处理，在培养的不同时间，提取细胞的总RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测（可参见以下文献：W.-Q.Tan,Kun Wang,et al.,Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase.J Biol Chem.2008 October 31;283(44):29730-29739）

具体为，PCR扩增miRNA-874的基因序列

（TTAGCCCTGCGGCCCCACGCACCAGGGTAAGAGAGACTCGCTTCCTGCCCTGGCCCGAGG，SEQ ID NO:3）及其上下游两端各将近200个bp的序列，扩增片段约476bp，具体为：

CTCTTTGGGTTTTGCCTTCATGCTTTCTGGTTGTTGGATGTGTGCCCCAACCCCCCCTGCCCCAGTTGTTTCTGAATATTGCCATCAGTTCCTGTCAGGGGCACCTGTTGCTTAAGAGCCTGCGTGGGCCAGTCTTCTACTCTACTGGACACACTTCCATTGGATGAATTTTTCTGGTG GACCGACTGGCTGGGCCTGCTTTCTGCCCAGCTTACCTGTCACGGAAGAGAGTCTGGACACACACGACTACTCTTGCCCCACGGAGAAAGTGTGCACAGCCTGGGCTGTCCCCTCTGACCTGAGTGGACGTCTCCTGTGGCCAGGGTTAGAGTCTCCATCCACACGTGTTTACCAGTGTTTACCATCTGCTCTGT(SEQID NO:4)，其中带下划线加黑的为miRNA-874的基因序列；其余的为它的上下游序列，带下划线斜体的为上游引物序列和下游引物的反向互补序列，

(PCR体系50ul，PCR条件如下：95°C 3min一个循环;95°C 30sec,56°C30sec,72°C 1min共28个循环；最后72°C延伸5min)，PCR引物设计如下，：

上游引物：5'-CATGGTCCCCACTCTGATTCT-3'（SEQ ID NO:5）,

下游引物：5'-GGCCGTGAGAATCAACACGTG-3'（SEQ ID NO:6）

miRNA-874的表达水平。实验结果如图3所显示的，miRNA-874表达水平在PE和ET-1处理6小时之内有了显著的上升（见图3中A和B）。

实验例4 miRNA-874反义核苷酸能够在细胞水平上抑制PE所诱导的 肥大

对大鼠乳鼠原代心肌细胞进行miRNA-874反义核苷酸的转染，转染的具体步骤可参见以下文献：Kun Wang,Bo Long,et al.,miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fis1.Nature Communications.2012April 17;781(3)。同时使用PE对心肌细胞进行处理，PE的用量为50μM，经过24小时之后，对心肌细胞进行心肌肥大指标的检测，例如细胞表面积（见图4中的A）和蛋白/DNA（见图4中的B）的检测。实验结果如图4所显示的，经miRNA-874反义核苷酸（anta-874）转染的细胞表面积和蛋白质/DNA比率明显低于miRNA-874反义核苷酸的阴性对照组（anta-NC）（见图4中的A和图4中的B），这证明miRNA-874反义核苷酸能够有效地抑制PE所诱导的心肌细胞肥大。

实验例5 小鼠静脉注射miRNA-874反义核苷酸（antagomir）能抑制 PE所诱导的肥大模型

此实验所用的miRNA-874的反义核苷酸均为经过修饰的miRNA-874反义核苷酸，修饰方式为对miRNA-874反义核苷酸的每个碱基都进行了2’-甲氧基修饰用以增加miRNA-874反义核苷酸在体内的稳定性。miRNA-874反义核苷酸的修饰及合成都是由上海吉玛公司完成的。

取小鼠24只，平均分成4组。对小鼠用PE埋泵处理二周后（同实施例2的操作），小鼠的心脏有明显的肥大改变。对经PE处理的小鼠进行静脉注射miRNA-874反义核苷酸anta-874或miRNA-874反义核苷酸的阴性对照（anta-NC），注射量为每只小鼠30mg/kg/天(anta-NC的序列为5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3'（SEQ ID NO:7），修饰方式与miRNA-874反义核苷酸的修饰方式相同，也是由上海吉玛公司合成)。对上述小鼠进行细胞的横截面积大小（通过WGA染色法）（见图5中的A）及心脏体重比（见图5中的B）的检测。实验结果如图5所显示的，加入miRNA-874反义核苷酸（anta-874）可以明显减弱PE所诱导的肥大效应（见实施例5）；但是，同时向小鼠注射miRNA-874反义核苷酸的阴性对照（anta-NC）和PE,并不能减弱PE所诱导的肥大效应（见图5中的A和B）。以上的实验结果证实miRNA-874反义核苷酸能够在整体水平抑制PE所诱导的心脏肥大的发生。

Claims (3)

1.一种miRNA-874的反义核苷酸在制备用于预防或治疗心脏疾病的药物中的用途，其中，所述miRNA-874反义核苷酸的序列为下述SEQ IDNO:2的核苷酸序列：

5'-UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3'，

其中，所述的心脏疾病选自心肌肥厚、心肌纤维化及心衰中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述miRNA-874反义核苷酸的核苷酸序列在每个碱基均进行了2’-甲氧基修饰。

3.一种miRNA-874核苷酸在制备用于诊断或预后心脏疾病的药物或试剂盒中的用途，其中，所述miRNA-874的序列为下述SEQ ID NO:1的核苷酸序列：

5'-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3'

其中，所述的心脏疾病选自心肌肥厚、心肌纤维化及心衰中的一种或多种。