CN107447019A - piRNA‑12和piRNA‑12抑制剂的应用及应用其的产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种piRNA‑12和piRNA‑12抑制剂的应用及应用其的产品，涉及医学工程的技术领域。本发明提供的piRNA‑12在缺氧诱导的血管平滑肌细胞凋亡过程中表达量显著上调，其中piRNA‑12含有如SEQ ID NO.1所示的序列；给予piRNA‑12腺病毒增加piRNA‑12表达，可以诱导血管平滑肌细胞凋亡；piRNA‑12抑制剂能够降低piRNA‑12的内源性表达，可以抑制血管平滑肌细胞凋亡。因此，本发明提供的piRNA‑12可以作为一种新的生物标志物，应用于心脏疾病的诊断和/或预后评估；而与之相应的piRNA‑12抑制剂，可以作为一种新型的药物用于心血管疾病的预防和/或治疗。

Description

piRNA-12和piRNA-12抑制剂的应用及应用其的产品
技术领域
本发明涉及医学工程技术领域，尤其是涉及一种piRNA-12和piRNA-12抑制剂的应用及应用其的产品。
背景技术
伴随着人们生活水平的提高、生活习惯改变、人口老龄化、环境不断变化，我国心血管病(Cardiovascular diseases，CVD)的危险因素持续增长，发病率在不断攀升，发病年龄也有所提前，导致CVD的发病率和死亡率居高不下，心血管疾病仍然是人类健康的头号杀手。在我国居民主要疾病死亡构成比中，心血管疾病占居首位，超过了肿瘤及其他疾病，是我国疾病患者的第一大致死原因。据2012年的《中国心血管病报告》，我国心血管病患人数为2.9亿，每10秒就有1人死于心血管病,每年约有350万人死于心血管病，占总死亡原因的41％。心血管病流行广，病程长，费用贵，致死致残率高。CVD的防治负担成为我国当今社会人群健康所面临的重要公共卫生问题，加强心血管疾病的防治已刻不容缓。
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病致残致死的主要原因，是最常见的和最具有危害性的疾病之一，严重影响人类健康，往往累及心、脑、肾等器官，并且和糖尿病、高血压、高血脂、吸烟、肥胖、高脂饮食和缺乏运动等因素密切相关。可以说，动脉粥样硬化严重影响了人们的生活质量和生命安全，所以预防和治疗动脉粥样硬化具有重要意义。
piRNA是新近研究发现的一类内源性非编码小RNA分子。有些研究表明，piRNA对于维持心血管正常生理功能具有重要作用，心血管中的piRNA异常表达与许多心血管疾病的发生相关。因此，将piRNA作为心血管疾病治疗的靶点，开发相关药物具有潜在的临床应用价值。单一的piRNA可以同时作用于多个靶基因的mRNA的表达，这样药物作用于一个piRNA可以调节多个参与心血管发病基因的表达，影响多个信号通路，从整体上达到治疗疾病的目的。由于piRNA在病理状态下表达水平不同，因此可以通过检测piRNA的表达水平来预测和诊断疾病。
细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程。它是一个主动的、高度有序的、由基因控制及一系列酶参与的过程，对正常胚胎发育，维持细胞群体及恶性病变过程中均起重要作用，在保证多细胞生物的健康生存过程中扮演着关键的角色。
细胞凋亡存在于AS的各个阶段，是导致AS斑块不稳定的主要因素。VSMC是血管壁的主要组成成分之一，也是AS斑块中发生凋亡的主要细胞。VSMC的过度增殖和凋亡对于AS的发生、发展以及最后不稳定阶段有着重要影响。在生理状态下，VSMC以比较慢的速度进行更新。在动脉粥样硬化发病早期，VSMC向内膜迁移在动脉脂肪斑周围异常增殖和增生。而在动脉粥样硬化发展的后期，VSMC以调亡为主，增加了斑块的不稳定性，使斑块易于破裂脱落，从而增加血栓形成的概率。因而VSMC增殖和凋亡的失衡是决定动脉粥样硬化发生发展的主要因素。
引起VSMC凋亡的病理因素有很多，但在大多数疾病(如缺血、再灌、血管炎症、动脉粥样硬化等)的发病过程中，均涉及活性氧簇(ROS)的水平升高。ROS是一类含有包括O2-和H2O2在内的含氧的具有活性的化学物质。ROS在VSMC增殖过程中有重要作用，能够引起DNA合成增加。O2-降低能够抑制黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤介导的DNA合成，使细胞凋亡增加。H2O2减少则导致细胞增殖，并且H2O2能够诱导由bcl-2和p53等凋亡蛋白介导的VSMC凋亡，该过程通过OH-实现，且成剂量依赖性。bcl-2抗凋亡作用也是通过清除自由基实现的。
对于心血管相关疾病的致病机理，或者针对其更有效的治疗药物在现今阶段而言，仍然有很多是未知的，仍需要不断的探索和研究，有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供piRNA-12的应用，本发明的第二个目的在于提供用于特异性检测piRNA-12的引物的应用，本发明的第三个目的在于提供用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，本发明的第四个目的在于提供piRNA-12抑制剂的应用，本发明的第五个目的在于提供用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，以缓解现有技术中存在的心脏疾病致病机理或者治疗药物等相关研究的不足。
本发明提供了piRNA-12在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒中的应用，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
另外，本发明还提供了用于特异性检测piRNA-12的引物在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒中的应用，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步的，所述用于特异性检测piRNA-12的引物含有如SEQ ID NO.3所示的序列。
另外，本发明还提供了一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测piRNA-12的引物，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步的，所述用于特异性检测piRNA-12的引物含有如SEQ ID NO.3所示的序列。
另外，本发明还提供了piRNA-12抑制剂在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的应用，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步的，所述piRNA-12抑制剂为与所述SEQ ID NO.2所示的序列有90％以上同源性的核苷酸序列，优选的，所述piRNA-12抑制剂的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-O-甲基修饰
另外，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，所述药物包括piRNA-12抑制剂，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
进一步的，所述piRNA-12抑制剂为与所述SEQ ID NO.2所示的序列有90％以上同源性的核苷酸序列，优选的，所述piRNA-12抑制剂的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-O-甲基修饰
进一步的，所述药物为口服制剂或者注射制剂。
发明人通过研究发现，本发明提供的piRNA-12在缺氧诱导的血管平滑肌细胞凋亡过程中表达量显著上调；而且，给予piRNA-12腺病毒增加piRNA-12表达，可以诱导血管平滑肌细胞凋亡；另外，piRNA-12抑制剂能够降低piRNA-12的内源性表达，可以抑制血管平滑肌细胞凋亡。因此，本发明提供的piRNA-12可以作为一种新的生物标志物，应用于心脏疾病的诊断和/或预后评估；而与之相应的piRNA-12抑制剂，可以作为一种新型的药物用于心脏疾病的预防和/或治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为piRNA-12在小鼠各个组织器官的差异表达情况；
图2为动脉粥样硬化疾病模型小鼠和正常小鼠中piRNA-12的表达水平；
图3为六月龄和八月龄动脉粥样硬化疾病模型小鼠血液指标测试结果；
图4A为过氧化氢处理诱导的血管平滑肌细胞凋亡过程中piRNA-12表达水平的变化
图4B为过氧化氢处理诱导的血管平滑肌细胞凋亡的结果图；
图5A为piRNA-12抑制剂处理后piRNA-12的表达情况；
图5B为piRNA-12抑制剂处理对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的情况。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中涉及的piRNA-12可以为：与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.1所示序列的序列，或者SEQ ID NO.1所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.1所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.1所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.1所示序列完全相同的序列。
本发明中涉及的心脏疾病，包括高血压、冠心病和动脉粥状硬化中的一种或者多种。
本发明涉及的用于特异性检测piRNA-12的引物，包括扩增piRNA-12序列的引物。
本发明提供的piRNA-12抑制剂，为与SEQ ID NO.2所示的序列有90％以上同源性的核苷酸序列。
本发明提供的用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，可以将piRNA-12抑制剂包装成病毒。
本发明提供的用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，可以将piRNA-12抑制剂与药剂学上可以接受的载体或者辅料联合使用，载体或者辅料选自壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种。
本发明提供的用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，包括有效剂量的piRNA-12抑制剂，优选的有效剂量为20-200mg/kg。
本发明提供的piRNA-12抑制剂的核苷酸序列中的每一个碱基，均进行了2’-O-甲基修饰，能够起到稳定抑制剂的作用。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。
除非特别说明，以下各实施例中使用的实验动物S-D小鼠(其品种为C57BL/6小鼠)均购自北京维通利华实验动物技术有限公司；提取总RNA使用Trizol试剂盒(Invitrogen公司)，逆转录反应使用逆转录试剂盒(Takara公司)，实时荧光定量PCR技术检测piRNA-12的表达水平的方法参见Chen，C.，等.Real-time quantification of microRNAs bystem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res 33，e179，2005。
除非特别说明，以下各实施例中所用的TUNEL法参见：Anti-apoptotic effectsof rosiglitazone in hypercholesterolemic rabbits subjected to myocardialischemia and reperfusion.Cardiovasc Res.2004；62:135-144。
除非特别说明，以下各实施例中的piR-12是指piRNA-12；piR-12抑制剂是指piRNA-12抑制剂。
除非特别说明，以下各实施例中的piRNA-12的序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体为：
5’-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGUU-3’。
除非特别说明，以下各实施例中的piRNA-12抑制剂的序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，并对每一个碱基进行了2’-O-甲基修饰，具体序列为：
5’-AACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA-3’。
除非特别说明，以下各实施例中所用的阴性对照为下述SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，具体为：
5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。
除非特别说明，以下各实施例中所用的用于特异性检测piRNA-12的引物为下述SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，具体为：
5’-TGGAAGACTAGTGATTTTGTTGTT-3’。
实施例1小鼠不同器官中piRNA-12的表达情况
为了观察比较piRNA-12在小鼠不同组织器官中的表达水平，解剖小鼠，取新鲜组织，Trizol法提取RNA，进行逆转录反应后，通过实时荧光定量PCR技术检测piRNA-12的表达水平。
结果如图1所示，piRNA-12在心脏中表达水平最高，血管中表达水平低于心脏，其他器官中几乎没有检测到piRNA-12的表达。
实施例2动脉粥样硬化疾病模型小鼠和正常小鼠血管中piRNA-12的表达水平
八月龄的动脉粥样硬化疾病模型小鼠和正常小鼠，解剖取主动脉，从主动脉弓到腹腔横隔膜段血管，剔除脂肪组织，新鲜组织加入Trizol，用组织研磨器粉碎血管，提取RNA，进行逆转录反应后，通过实时荧光定量PCR技术检测piRNA-12的表达水平。
结果如图2所示，在动脉粥样硬化疾病模型小鼠中piRNA-12的表达水平相对于正常小鼠明显下调。
实施例3动脉粥样硬化疾病模型小鼠血液指标测试
为了确定疾病模型小鼠的动脉粥样硬化发病程度，进行了血液指标的检测。取六月龄和八月龄疾病模型小鼠，从心脏抽取新鲜血液，低温离心，取血清，分别用不同的试剂盒检测血清中甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL-C)，高密度脂蛋白(HDL-C)和总胆固醇(TC)的含量，然后与正常小鼠比较。
结果如图3所示，结果显示六月龄和八月龄的动脉粥样硬化模型小鼠血液四项指标均明显高于正常小鼠，达到动脉粥硬化的血液指标。
实施例4血管平滑肌细胞凋亡实验模型中piRNA-12表达情况
对于血管平滑肌细胞凋亡实验模型，用100μmol/L过氧化氢加0.1mM硫酸亚铁处理血管平滑肌细胞的不同时间点，提取RNA，进行逆转录反应后，通过实时荧光定量PCR技术检测piRNA-12的表达水平。
结果如图4A和图4B所示，由图4A可以看出，piRNA-12表达水平在过氧化氢处理1～6h内显著上调。如图4B可以看出，加入过氧化氢后，血管平滑肌细胞随着处理时间的增加凋亡加剧。
实施例5piRNA-12抑制剂抑制血管平滑肌细胞凋亡的实验
本实施例中以血管平滑肌细胞为模型，检测piRNA-12抑制剂(antagomir)(即piRNA-12反义核苷酸序列，其中所有的碱基都进行了2’-O-甲基修饰，含有如SEQ ID NO.2所示的序列，其由GenePharma有限公司合成)或阴性对照(含有如SEQ ID NO.4所示的序列，其由GenePharma有限公司合成)是否能够抑制血管平滑肌细胞的凋亡。
转染以上所述的化学修饰的piRNA-12抑制剂于血管平滑肌细胞，以抑制内源性的piRNA-12，24小时后，100μmol/L过氧化氢加0.1mM硫酸亚铁处理血管平滑肌细胞1小时后换成不含过氧化氢及硫酸亚铁的正常培养液，使用TUNEL法检测血管平肌细胞凋亡情况。
结果如图5A和5B所示，由图5A可以看出，加入piRNA-12抑制剂后，过氧化氢处理后的血管平滑肌细胞的piRNA-12表达水平明显下降；由图5B可以看出，piRNA-12抑制剂可以显著抑制过氧化氢诱导的血管平滑肌细胞凋亡。
综上所述，本发明人通过大量的实验证明piRNA-12抑制剂在血管平滑肌细胞凋亡中的变化及其保护作用。具体地，本发明人通过研究发现，piRNA-12在缺氧诱导的血管平滑肌细胞凋亡过程中piRNA-12表达显著上调。通过合成piRNA-12特异性抑制剂降低其内源性表达可以抑制血管平滑肌细胞凋亡。piRNA-12抑制剂通过抑制血管平滑肌细胞凋亡对心血管具有保护作用，piRNA-12抑制剂对许多心血管疾病具有潜在的预防和治疗价值。而给予piRNA-12腺病毒增加piRNA-12表达则可以诱导血管平滑肌细胞凋亡。由此可见，本发明人通过实验研究发现，piRNA-12抑制剂通过抑制血管平滑肌细胞凋亡对心血管具有保护作用。血管平滑肌细胞缺氧过程piRNA-12表达显著上调，piRNA-12的上调可能诱导了血管平滑肌细胞凋亡的发生。piRNA-12在动脉粥样硬化动物模型的血管平滑肌组织中表达上调，注射piRNA-12抑制剂降低其内源性表达，可以减少斑块形成，血管功能显著改善。将piRNA-12抑制剂与适当的载体结合形成药物，导入血管或体内，对许多心血管疾病将具有预防及治疗作用。发明人通过化学合成piRNA-12抑制剂从冠状动脉注射入小鼠血管，发现动脉粥样硬化程度明显被抑制，在动物模型证明了piRNA-12抑制剂对动脉粥样硬化疾病的治疗作用。
因此，本发明提供了将piRNA-12抑制剂与适当载体或辅料如壳聚糖、胆固醇、脂质体、纳米颗粒等包装形成药物，通过口服、静脉注射、肌肉注射、冠状动脉内注射的方式，用于预防和/或治疗心血管疾病、改善心脏功能。此外，本发明还提供了采用包含特异性检测微小RNA的引物的试剂盒，通过实时荧光定量PCR、纳米微球技术检测患者外周血血浆中piRNA-12的表达水平，用于对冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心脏疾病的诊断和/或预后评估。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛大学
<120> piRNA-12和piRNA-12抑制剂的应用及应用其的产品
<130> 2017
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 1
uggaagacua gugauuuugu uguu 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacaacaaaa ucacuagucu ucca 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggaagacta gtgattttgt tgtt 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims (10)

1.piRNA-12在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.用于特异性检测piRNA-12的引物在制备用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒中的应用，其特征在于，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用于特异性检测piRNA-12的引物含有如SEQ ID NO.3所示的序列。
4.一种用于诊断和/或预后评估心脏疾病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测piRNA-12的引物，其特征在于，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测piRNA-12的引物含有如SEQ ID NO.3所示的序列。
6.piRNA-12抑制剂在制备用于预防和/或治疗心脏疾病的药物中的应用，其特征在于，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述piRNA-12抑制剂为与所述SEQ IDNO.2所示的序列有90％以上同源性的核苷酸序列，优选的，所述piRNA-12抑制剂的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-O-甲基修饰。
8.一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，其特征在于，所述药物包括piRNA-12抑制剂，所述piRNA-12含有如SEQ ID NO.1所示的序列。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述piRNA-12抑制剂为与所述SEQ IDNO.2所示的序列有90％以上同源性的核苷酸序列，优选的，所述piRNA-12抑制剂的核苷酸序列的每个碱基均进行了2’-O-甲基修饰。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂或者注射制剂。
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