JP2023013932A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ配列に基づく新規ｓｉＲＮＡ及びその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の増殖を抑制するｓｉＲＮＡを提供する。【解決手段】ここで開示されるｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とから構成される。センス鎖は、５’末端の塩基がグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）である１９～２３塩基からなるターゲット配列と、該ターゲット配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングとから構成される。アンチセンス鎖は、上記ターゲット配列と相補的な配列と、該相補的な配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングとから構成される。ここで、上記ターゲット配列の少なくとも一部は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含んでいる。【選択図】図８

Description

本発明は、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２，ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２）の増殖を抑制するｓｉＲＮＡとその利用に関する。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はヒトに感染し、ＣＯＶＩＤ－１９（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ２０１９）を発症させるウイルスであり、急速に重篤な肺炎等の症状を引き起こし、感染者を死に至らしめることもある病原性のウイルスである。２０１９年１２月から２０２０年初期にかけてこのウイルスによる感染症が発見されて以来、その感染は世界全体に広がり、従来知られているＳＡＲＳやＭＥＲＳ等と同様に、世界の経済や人命に重篤な影響を与えるウイルス感染症となっている。

非特許文献１には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染経路に寄与するスパイクタンパク質（以下、「Ｓタンパク質」ともいう）の構造が開示されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有するＳタンパク質はウイルス粒子の表面に存在し、ヒト細胞の細胞膜に存在するアンジオテンシン変換酵素ＩＩ（ＡＣＥ２）と結合することで、ウイルス粒子がヒト細胞内へ侵入することを促す。

コンピューターズ・イン・バイオロジー・アンド・メディスン（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１２８巻、 ２０２１年、 アーティクルナンバー１０４１２４ ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、５９２巻、７８５３号、２０２１年、ｐｐ．２８３－２８９

ところで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大に伴い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質が変異した多様な変異株が報告されている。Ｓタンパク質が変異することで、ヒト細胞のＡＣＥ２への結合力が高まり感染力が増強することや、Ｓタンパク質の構造が変化し、既存の抗体が認識し難い構造に変化する等の問題が生じ得る。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大を抑制するためには、抗体医薬や抗体産生を促すワクチンの開発等の免疫化学からのアプローチだけでなく、多様な側面からのアプローチが求められている。

そこで、本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制するｓｉＲＮＡを提供することを主な目的とする。また、別の側面として、該ｓｉＲＮＡを含む組成物を提供することを目的とする。また、該組成物の利用方法を提供することを目的とする。

本発明者は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の特定のタンパク質の発現を抑制することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制できると推察した。ここで、本発明者らは、ＲＮＡｉのターゲット配列として、シグナルペプチド領域に注目した。シグナルペプチド領域はタンパク質の輸送および局在を指示する部分であることから、タンパク質が本来の機能を適切に発揮するために欠かせない領域の一つであるといえる。そのため、シグナルペプチド領域に変異が生じたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、タンパク質の本来の機能を適切に維持できなくなり、淘汰され易くなると推察される。したがって、感染が拡大するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（変異株を含む）においては、シグナルペプチド領域に変異が起こり難く、配列が保存される傾向があるものと推察される。即ち、シグナルペプチド領域をターゲットとしたＲＮＡｉによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果が得られれば、変異株を含む感染拡大の虞のある多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対しても増殖抑制効果が得られると推察される。

そこで、本発明者らが鋭意検討を行った結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含む塩基配列を有するｓｉＲＮＡを使用することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制できることが見出された。その一方で、驚くべきことに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が有するＯＲＦ８タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部をターゲットとしたｓｉＲＮＡでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果は見られなかった（詳細は、後述の試験例で示す）。即ち、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果は、ｓｉＲＮＡが単にシグナルペプチド領域をターゲットとすることで得られるのではなく、Ｓタンパク質におけるシグナルペプチド領域をターゲットとすることにより得られることが見出された。

ここで開示されるｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とから構成されており、上記センス鎖は、５’末端の塩基がグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）である１９～２３塩基からなるターゲット配列と、上記ターゲット配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングとから構成される。上記アンチセンス鎖は、上記ターゲット配列と相補的な配列と、該相補的な配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングとから構成されている。そして、上記ターゲット配列の少なくとも一部は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質（Ｓタンパク質）のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする。
かかる構成のｓｉＲＮＡは、Ｓタンパク質の発現量を抑制し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制することができる。

また、ここで開示されるｓｉＲＮＡの好ましい一態様では、上記ターゲット配列の３’末端側の５塩基のうち少なくとも３塩基はアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）である。これにより、アンチセンス鎖がＲＮＡｉに関与するタンパク質であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ易くなるため、より好適にＲＮＡｉが誘導され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖抑制効果がよりよく発揮される。

また、ここで開示されるｓｉＲＮＡの好ましい一態様では、上記ターゲット配列は、以下の（１）～（７）：
（１）ＧＵＵＵＵＡＵＵＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵ（配列番号１）；
（２）ＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡ（配列番号２）；
（３）ＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡ（配列番号３）；
（４）ＧＵＵＵＧＵＵＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＡ（配列番号３１）；
（５）ＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵ（配列番号３２）；
（６）ＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵ（配列番号３３）；
（７）ＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵ（配列番号３４）；
のいずれかからなる。上記（１）～（７）に示す配列は、Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含むため、Ｓタンパク質の発現を好適に抑制し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖を効果的に抑制することができる。

また、ここで開示されるｓｉＲＮＡの好ましい一態様では、上記オーバーハングを構成する塩基配列がチミン・チミン（ＴＴ）である。これにより、ＲＮＡｉが誘導され易くなり得る。

上記目的を実現するため、本開示により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制するために用いられる組成物が提供される。ここで開示される組成物は、ここで開示されるｓｉＲＮＡを含むことを特徴とする。また、本開示により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対しての治療方法が提供される。ここで開示される治療方法の一態様では、ここで開示される組成物をヒトを除く動物に投与することを含むことを特徴とする。これにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した動物個体中でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖が抑制され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染による症状を緩和し得る。

例１～３に示すｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の細胞内から得られる総ＲＮＡ量を示すグラフである。 ＯＲＦ８のシグナルペプチド領域またはその近傍をターゲットとしたｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の細胞内から得られる総ＲＮＡ量を示すグラフである。 例１～３に示すｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の培養培地（上清試料）中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数を示すグラフである。なお、ウイルスＲＮＡコピー数は、細胞内から得られた総ＲＮＡ量で補正されている。 例１～３に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＳタンパク質のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例１～３に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオカプシドタンパク質（以下、「Ｎタンパク質」ともいう）のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例１～３に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＯＲＦ８（１）のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例１～３に示すｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＯＲＦ８（２）のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例２に示すｓｉＲＮＡを０～５０ｎＭの濃度範囲でトランスフェクションしたときのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＳタンパク質のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例２に示すｓｉＲＮＡを０～５０ｎＭの濃度範囲でトランスフェクションしたときのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＮタンパク質のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例７～１０に示すｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後の培養培地（上清試料）１ｍＬ中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＲＮＡコピー数を示すグラフである。 例７～１０に示すｓｉＲＮＡを１０ｎＭまたは５０ｎＭの濃度でトランスフェクションしたときのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＳタンパク質のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。 例７～１０に示すｓｉＲＮＡを１０ｎＭまたは５０ｎＭの濃度でトランスフェクションしたときのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞抽出試料中に含まれるＮタンパク質のＲＮＡ量の変化を示すグラフである。

以下、ここで開示される技術について詳細に説明する。本明細書において特に言及している事項（例えばｓｉＲＮＡの構成）以外の事柄であって、実施に必要な事柄（例えばポリヌクレオチドの合成方法等に関するような一般的事項等）は、細胞工学、生理学、医学、薬学、有機化学、生化学、遺伝子工学、タンパク質工学、分子生物学、遺伝学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。ここに開示される技術は、本明細書に開示されている内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。

なお、本明細書において、「ポリヌクレオチド」とは、複数（２以上）のヌクレオチドがリン酸ジエステル結合で結ばれたポリマーを指す用語であり、ヌクレオチドの数によって限定されない。例えば、ヌクレオチドとしてデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両者を含むものも本明細書における「ポリヌクレオチド」に包含される。
また、本明細書において「人為的に設計されたポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド鎖（全長）がそれ単独で自然界に存在するものではなく、化学合成或いは生合成（即ち遺伝子工学に基づく生産）によって人為的に合成されたポリヌクレオチドをいう。

また、本明細書において、塩基配列は「５’」および「３’」の記載が付されていない限り、常に左側が５’末端側であり、右側が３’末端側を示す。
また、本明細書において、数値範囲をＡ～Ｂ（ここでＡ，Ｂは任意の数値）と記載している場合は、一般的な解釈と同様であり、Ａ以上Ｂ以下（Ａを上回り且つＢを下回る範囲を含む）を意味するものである。

ここで開示されるｓｉＲＮＡは、センス鎖と、アンチセンス鎖とから構成されている。センス鎖は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの塩基配列の一部と同様の塩基配列を有するターゲット配列を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖のターゲット配列と相補的な配列を含む。センス鎖とアンチセンス鎖はターゲット配列部分でハイブリダイズされており、ｓｉＲＮＡは二本鎖を形成している。なお、センス鎖およびアンチセンス鎖は人為的に合成されたポリヌクレオチドである。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は一本鎖ＲＮＡウイルスであることが知られており、そのゲノムＲＮＡの配列は、例えばＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等のデータベースから入手することができる。なお、データベースによっては、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム配列がウラシル（Ｕ）に代えてチミン（Ｔ）で表記されるが、この場合には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が一本鎖ＲＮＡウイルスであることを考慮し、ＴをＵに読み替えることができる。

ｓｉＲＮＡは細胞内に導入されることで、ＲＮＡｉを誘導し得る。必ずしもこのメカニズムに限定されるものではないが、典型的には、ｓｉＲＮＡは細胞内に導入された後、アンチセンス鎖がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれる。そして、アンチセンス鎖に含まれる配列と相補的な配列（即ち、ターゲット配列）を有するＲＮＡを認識し、該ＲＮＡを切断、もしくは翻訳阻害をする。これにより、所望のタンパク質の発現を抑制することができる。ここで開示されるｓｉＲＮＡは、このようなメカニズムを利用し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の発現を抑制することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制する。

ここで開示されるターゲット配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡの一部と同様の塩基配列から構成される。また、ターゲット配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列（以下、「ＳＰ塩基配列」ともいう。）の少なくとも一部を含んでいる。
なお、本明細書において、「Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域」とは、非特許文献１および２に開示されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の１番目から１６番目までのアミノ酸配列（配列番号４）から成るペプチド領域のことをいう。即ち、本明細書において「Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列（ＳＰ配列）」とは、配列番号５に示す４８塩基からなる塩基配列のことをいう。

ターゲット配列のうち、ＳＰ塩基配列に含まれる配列が占める割合は、ターゲット配列全体を１００％としたとき、例えば、４５％以上であることが好ましく、６０％以上、７５％以上、９０％以上、または１００％であってよい。シグナルペプチド領域をコードする塩基配列は変異し難い配列であると推測されるため、かかる割合を有するターゲット配列は、感染が拡大し得る多様なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対しても増殖抑制効果を発揮し得る。

ターゲット配列が、ＳＰ塩基配列由来の配列以外の塩基配列を含む場合は、ＳＰ塩基配列由来の配列の５’末端側または３’末端側に、ＳＰ塩基配列由来の配列以外の塩基配列が備えられる。即ち、ターゲット配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡにおけるＳＰ塩基配列の５’末端側に連続している塩基配列を含んでいてもよく、ＳＰ塩基配列の３’末端側に連続している塩基配列を含んでいてもよい。これらの配列は、例えばＮＣＢＩが公開しているデータベース等で確認することができる。

ターゲット配列の長さは、従来公知のｓｉＲＮＡの設計と同様であればよい。例えば、１９塩基以上２３塩基以下、または、１９塩基以上２１塩基以下であってよく、１９塩基から構成されていてもよい。これにより、細胞内でＲＮＡｉが好適に誘導され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制することができる。

ターゲット配列は、典型的には、リボヌクレオチドのポリマーであるポリヌクレオチドで構成される。換言すれば、ターゲット配列はＲＮＡで構成される。即ち、ターゲット配列の塩基配列は、典型的には、Ａ（アデニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）の４文字、またはａ、ｕ、ｇ、ｃの４文字で表記される。

ターゲット配列の５’末端は、グアニンまたはシトシンであることが好ましい。グアニンおよびシトシンは相補鎖との結合力がアデニンおよびウラシルよりも高いため、センス鎖の５’末端側（即ち、アンチセンス鎖の３’末端側）の安定性が高くなる。換言すれば、アンチセンス鎖の５’末端側の安定性が相対的に低くなる。メカニズムの詳細は明らかではないが、ＲＩＳＣはセンス鎖、アンチセンス鎖のうち、５’末端側がよりエネルギー的に不安定な鎖を優先的に取り込む傾向がある。そのため、ターゲット配列の５’末端がグアニンまたはシトシンであることで、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに取り込まれ易くなり、ＲＮＡｉをより好適に誘導し得る。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果がより好適に発揮される。

ターゲット配列の３’末端側の５塩基において、アデニンおよびウラシルが６０％以上（即ち３塩基以上）含まれることが好ましく、８０％以上（即ち４塩基以上）含まれてもよく、１００％（即ち５塩基）であってもよい。これにより、アンチセンス鎖の５’末端側の安定性が３’末端側よりも相対的に低くなる。その結果、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに取り込まれ易くなり、ＲＮＡｉをより好適に誘導し得る。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果がより好適に発揮される。

ターゲット配列全体のＧＣ含量（ターゲット配列を構成する塩基配列全体に占めるＧおよびＣの合計割合）は、特に限定されるものではないが、例えば、２０％以上６０％以下であるとよく、３０％以上５０％以下が好ましく、３０％以上４５％以下であってよい。ＧＣ含量は、ＲＩＳＣに取り込まれるアンチセンス鎖と、ターゲット配列を有するＲＮＡとの結合力や、ＲＮＡの切断容易性等に関わるパラメータである。上記ＧＣ含量であれば、ＲＮＡｉの効果を好適に発揮することができる。

センス鎖は、ターゲット配列に加え、オーバーハングを有することが好ましい。オーバーハングはターゲット配列の５’末端側または３’末端側に付加される塩基配列である。好ましくは、オーバーハングはターゲット配列の３’末端側に付加される。オーバーハングが付加されることにより、ＲＮＡｉがより効果的に誘導されるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を好適に抑制することができる。

オーバーハングは、２～４塩基からなる塩基配列で構成され、好ましくは２塩基からなる塩基配列で構成される。オーバーハングを構成する塩基配列は特に限定されるものではないが、好適な一例としては、ＴＴ（チミン・チミン）、ＵＵ（ウラシル・ウラシル）等が挙げられる。なお、オーバーハングがＴＴである場合には、オーバーハングはＤＮＡで構成される。

オーバーハングは、ポリヌクレオチド（ダイマー、トリマー、もしくはテトラマー）から構成される。オーバーハングを構成するポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみ、デオキシヌクレオチドのみ、またはデオキシヌクレオチドとリボヌクレオチドとの両方を含んで構成されていてもよい。即ち、センス鎖およびアンチセンス鎖は、全体がＲＮＡであってよく、ＲＮＡとＤＮＡとのキメラポリヌクレオチドであってよい。また、オーバーハングは修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、その他の公知のヌクレオチド類似体等を含み得る。

センス鎖は、例えば、２１塩基以上２７塩基以下の塩基配列で構成され、２１塩基以上２５塩基以下、または２１塩基以上２３塩基以下で構成され得る。好適な一例では、ターゲット配列１９塩基と、オーバーハング２塩基とからなる２１塩基で構成される。かかる例では、ＲＮＡｉが効果的に誘導されるため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を好適に抑制することができる。

アンチセンス鎖は、センス鎖のターゲット配列と相補的な塩基配列を有する。これにより、アンチセンス鎖はセンス鎖とハイブリダイズされ、二本鎖構造が形成される。なお、上記相補的な塩基配列の部分は、典型的には、リボヌクレオチドのポリマー（ＲＮＡ）で構成されている。

アンチセンス鎖は、センス鎖と同様、オーバーハングを有する。オーバーハングは、上記相補的な塩基配列の５’末端側若しくは３’末端側に付加されている。好ましい一例では、センス鎖のオーバーハングがターゲット配列の３’末端側に付加されているとき、アンチセンス鎖のオーバーハングは上記相補的な塩基配列の３’末端側に付加されている。
なお、アンチセンス鎖におけるオーバーハングの構成は上述したセンス鎖のオーバーハングの構成と同様であってよい。典型的には、アンチセンス鎖のオーバーハングの塩基配列は、ハイブリダイズするセンス鎖のオーバーハングと同じであるが、異なる塩基配列であってもよい。

アンチセンス鎖は、例えば、２１塩基以上２７塩基以下の塩基配列で構成され、２１塩基以上２５塩基以下、または２１塩基以上２３塩基以下で構成され得る。好適な一例では、アンチセンス鎖はセンス鎖と同じ長さの塩基配列で構成され、オーバーハングを除く塩基配列が全てセンス鎖のターゲット配列と相補的な塩基配列で構成される。

ここで開示されるｓｉＲＮＡのターゲット配列の好適な配列の具体例として、配列番号１～３、３１～３４で示される以下の塩基配列：
（１）ＧＵＵＵＵＡＵＵＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵ（配列番号１）；
（２）ＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡ（配列番号２）；
（３）ＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡ（配列番号３）；
（４）ＧＵＵＵＧＵＵＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＡ（配列番号３１）；
（５）ＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵ（配列番号３２）；
（６）ＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵ（配列番号３３）；
（７）ＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵ（配列番号３４）；
が挙げられる。なお、配列番号１～３、３１～３４に示す塩基配列はいずれもＲＮＡで構成されている。

配列番号１に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の１６～３４番目の塩基配列であり、ＳＰ塩基配列の一部の塩基配列である。
配列番号２に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の３１～４９番目の塩基配列である。配列番号２に示す塩基配列のうち、１～１８番目までの塩基配列はＳＰ塩基配列の一部であり、１９番目のＡはＳＰ塩基配列外の配列である。
配列番号３に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の４０～５８番目の塩基配列である。配列番号３に示される塩基配列のうち、１～９番目までの塩基配列はＳＰ塩基配列の一部であり、１０～１９番目の塩基配列はＳＰ塩基配列外の配列である。
配列番号３１に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の３～２１番目の塩基配列であり、ＳＰ塩基配列の一部の塩基配列である。
配列番号３２に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の２５～４３番目の塩基配列であり、ＳＰ塩基配列の一部の塩基配列である。
配列番号３３に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の３３～５１番目の塩基配列である。配列番号３３に示す塩基配列のうち、１～１６番目までの塩基配列はＳＰ塩基配列の一部であり、１７～１９番目の塩基配列はＳＰ塩基配列外の配列である。
配列番号３４に示される塩基配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質をコードする塩基配列の３５～５３番目の塩基配列である。配列番号３４に示す塩基配列のうち、１～１４番目までの塩基配列はＳＰ塩基配列の一部であり、１５～１９番目の塩基配列はＳＰ塩基配列外の配列である。
ターゲット配列が配列番号１～３、３１～３４のいずれかで構成されるｓｉＲＮＡは、後述の試験例で示すように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制することができる。

ここで開示されるｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖は、一般的な化学合成法に準じて製造することができる。例えば、市販のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を使用して合成することができる。また、インビトロまたはインビボにおいて、遺伝子工学的手法に基づいてｓｉＲＮＡを合成してもよい。なお、合成されたセンス鎖およびアンチセンス鎖は精製されていることが好ましく、例えばＨＰＬＣ等により精製することができる。

ここで開示されるｓｉＲＮＡは、例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖をアニーリング（ハイブリダイズ）することで製造することができる。アニーリング方法は従来公知の方法に従えばよく、ターゲット配列を構成する塩基配列に応じてアニーリング温度、冷却速度等を調整すればよい。一例では、センス鎖とアンチセンス鎖とを溶媒中で等量混合し、９０℃で１分～５分間加熱後、４℃～室温まで冷却することで、アニーリングを行うことができる。溶媒としては、例えば、蒸留水、純水、超純水、バッファー（例えば、ｐＨ７．４の３０ｍＭ～５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨバッファー）等を使用できる。なお、活性のあるＲＮａｓｅ（ＲＮＡ分解酵素）が溶媒に混入することを防ぐため、溶媒は、例えばＤＥＰＣ処理、オートクレーブ処理等がされたものが好ましく用いられる。
なお、ｓｉＲＮＡは、溶媒に溶解した溶液状であってよく、ゲル状であってよく、粉末状であってもよい。

以上、ここで開示されるｓｉＲＮＡについて説明したが、本開示により、さらに、ここで開示されるｓｉＲＮＡを含む組成物が提供される。ここで開示される組成物は、使用形態に応じて医薬（薬学）上許容され得る種々の担体を含み得る組成物として提供され得る。担体としては、例えば、希釈剤、賦形剤等として医薬において一般的に使用される担体が好ましい。かかる担体としては、組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。また、かかる担体は、適当な濃度のアルコール（エタノール等）水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得、或いはリポソームであってもよい。また、医薬用組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。また、従来公知のドラッグデリバリーシステムに利用される担体を含み得る。

組成物の形態は、特に限定されない。例えば、典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水または適当な緩衝液（例えばＰＢＳ）等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
ｓｉＲＮＡ（主成分）および種々の担体（副成分）を材料にして種々の形態の薬剤（組成物）を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製剤方法自体は本開示を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ監修，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ刊（１９９０）が挙げられる。

また、組成物はここで開示されるｓｉＲＮＡを１種単独で、または２種以上の複数で含み得る。ｓｉＲＮＡを２種以上含むことにより、発現抑制のターゲットとなる配列種が増加するため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制をより好適に実現し得る。一方で、ｓｉＲＮＡを１種単独で含む場合には、ターゲット配列に類似した塩基配列を有する宿主細胞のｍＲＮＡの翻訳を阻害する虞（いわゆる、オフターゲット効果）が低減される。ここで開示されるｓｉＲＮＡは、１種単独で使用した場合であってもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制することができるため、１種単独であっても好適に使用することができる。

また、本開示により、ここで開示される組成物を用いたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する治療方法が提供される。ここで開示される治療方法は、ヒト及び／又はヒトを除く動物に対してここで開示される組成物を投与することを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトだけでなく、ヒト以外の動物に対して感染し得るウイルスである。このような動物としては、例えば、イヌ、ネコ、トラ、ライオン、フェレット、ミンク、ハムスター、サル等の哺乳動物等が挙げられる。

組成物の投与方法は、従来動物の治療に使用されている方法に準じればよく、特に限定されない。組成物は、生体内（インビボ）において、その形態および目的に応じた方法や用量で使用され得る。例えば、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射によって患者または動物個体（即ち生体）の患部（例えば悪性腫瘍組織、ウイルス感染組織、炎症組織等）に所望する量だけ投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものや軟膏等のゲル状若しくは水性ジェリー状のものを、直接所定の組織（即ち、例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、炎症細胞等を含む組織や器官等の患部）に投与することができる。あるいは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。経口投与の場合は、消化管内での消化酵素分解を抑止すべくカプセル化や保護（コーティング）材の適用が好ましい。

また、ここで開示されるｓｉＲＮＡおよび組成物は、生体外（インビトロ）において、真核細胞に対しても使用することができる。インビトロにおける真核細胞は、例えば、生体から摘出された種々の細胞塊、組織、臓器、器官、血液、およびリンパ液、ならびにセルライン等を包含する。インビトロで使用される際には、ｓｉＲＮＡは、例えば、種々の市販のトランスフェクション試薬と混合され得る。ｓｉＲＮＡ濃度は、特に限定されるものではないが、例えば、真核細胞の培養培地中で、１ｎＭ以上であって、５ｎＭ以上（例えば６．２５ｎＭ以上）であり得る。また、トランスフェクション効率の観点から、例えば、１μＭ以下であるとよく、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１２．５ｎＭ以下であり得る。さらに、ここで開示されるｓｉＲＮＡは、低濃度であっても顕著なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抑制効果を発揮するため、例えば、ｓｉＲＮＡ濃度は、１０ｎＭ以下、８ｎＭ以下、６．５ｎＭ以下であってもよい。

また、ここで開示されるｓｉＲＮＡに含まれるターゲット配列は、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）にも使用され得る。ｓｈＲＮＡは、ターゲット配列と、その相補的な配列とが一本鎖上に存在するＲＮＡであり、これらの間にはループ構造を形成するためのループ配列が存在する。ｓｈＲＮＡは、ループ構造を有することで、ターゲット配列とその相補的な配列とがハイブリダイズし、局所的な二本鎖構造を形成する。これにより、細胞内に存在する酵素であるＤｉｃｅｒによってｓｈＲＮＡがプロセシングされ、ここで開示されるｓｉＲＮＡが形成され得る。

ｓｈＲＮＡの構成は、従来公知のｓｈＲＮＡと同様であってよい。ｓｈＲＮＡの長さは、例えば、５０～７０塩基であり得る。また、ループ配列の長さは、例えば１９～２９塩基であり得る。また、ｓｈＲＮＡは、ベクター（例えばレンチウイルス発現ベクター）内に組み込まれ得る。ｓｈＲＮＡを使用することで、細胞内で安定的にＲＮＡｉを誘導し得るため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を安定的に抑制し得る。

以下、ここに開示される技術に関するいくつかの試験例を説明する。ただし、ここに開示される技術は試験例に示すものに限定されるものではない。

＜ｓｉＲＮＡの調製＞
ユーロフィンジェノミクス株式会社にポリヌクレオチドの合成を依頼し、１２種類のポリヌクレオチドを得た。各ポリヌクレオチドの塩基配列を表１に示す。なお、各ポリヌクレオチドにおいて、３’末端側の「ＴＴ」（オーバーハング）はＤＮＡであり、その他の配列（ターゲット配列）部分はＲＮＡで構成されている。得られたポリヌクレオチドは、相補的な配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせることで、例１～６に用いるｓｉＲＮＡをそれぞれ調製した。

表１に示す例１～３は上述したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含むように設計されたｓｉＲＮＡである。一方で、例４～６は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ８タンパク質に対するｓｉＲＮＡである。ＯＲＦ８タンパク質はシグナルペプチド領域を有しており、ＯＲＦ８タンパク質をコードする塩基配列の１～４５番目の配列（配列番号１８）がシグナルペプチド領域をコードする塩基配列である。
例４のｓｉＲＮＡは、ＯＲＦ８タンパク質をコードする塩基配列の１３～３１番目の塩基配列（例４のセンス鎖のＴＴを除く配列部分）をターゲットとしている。即ち、ＯＲＦ８タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列内の一部と同様となるように設計されている。
例５のｓｉＲＮＡは、ＯＲＦ８タンパク質のＯＲＦ８タンパク質をコードする塩基配列の４０～５８番目の塩基配列（例５のセンス鎖のＴＴを除く配列部分）をターゲットとしている。即ち、ＯＲＦ８タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含むように設計されている。
例６のｓｉＲＮＡは、ＯＲＦ８タンパク質のＯＲＦ８タンパク質をコードする塩基配列の５２～７０番目の塩基配列（例６のセンス鎖のＴＴを除く配列部分）をターゲットとしている。即ち、ＯＲＦ８タンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列を含まないように設計されている。

［試験１］
＜細胞へのｓｉＲＮＡの導入およびウイルス感染＞
（例１～６）
試験１では、上記準備したｓｉＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果を検討した。この検討には、ヒトＡＣＥ２遺伝子を安定発現するように形質転換されたヒト肝癌由来細胞株であるＨｕｈ７－ＡＣＥ２細胞を用いた。また、Ｈｕｈ７－ＡＣＥ２細胞の培養培地として、１０％ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を用いた。まず、Ｈｕｈ７－ＡＣＥ２細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように、細胞培養用の４８ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で２４時間培養した。次に、トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、上記準備したｓｉＲＮＡを１０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ（ウェル内培地中ｓｉＲＮＡ濃度１０ｎＭ）または５０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ（ウェル内培地中ｓｉＲＮＡ濃度５０ｎＭ）となるようにウェルに加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ_２環境下で６時間培養後、ウェルにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生株を２×１０^４ＴＣＩＤ_５０／ｗｅｌｌとなるように加え、さらに２時間培養した。その後、ＰＢＳでウェルを洗浄し、上記培養培地をウェルに加え、２日間さらに培養し後、ウェル中の培地（上清）を回収した。次に、回収した上清に、等量の２×ＲＮＡ溶解バッファー（０．４μＬ ＳＵＰＥＲａｓｅＩ（商標）ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、４０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を混合し、室温で１０分間静置した。その後、蒸留水で１０倍に希釈し、ｑＰＣＲ用の上清試料を調製した。
一方で、ウェル中の細胞を回収し、ＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーンより購入）を用いてＲＮＡを単離し、回収した。回収して得られたＲＮＡ量は２６０ｎｍの吸光度に基づき測定した。回収したＲＮＡのうち５００ｎｇ分のＲＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてｃＤＮＡ（以下、「細胞抽出試料」ともいう）を調製した。

（参考例１）
参考例１では、トランスフェクションおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の添加を行わなかったこと以外は上述の例１～６と同様にして、上清試料および細胞抽出試料を得た。即ち、参考例１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のない例を示す。

各例の細胞内から得られた総ＲＮＡの量を比較した。図１および２では、参考例１を１００％としたときの値を示しており、値が低いほど細胞の生存数が低いと推定することができる。

図１に示すように、Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部をターゲットとしたｓｉＲＮＡをトランスフェクションした例１～３では、いずれも参考例１の３０％以上の値を示した。特に、例２においてはｓｉＲＮＡの添加量に関わらず約８０％の値を示し、例３においては、ｓｉＲＮＡを５０ｐｍｏｌ添加したとき（ｓｉＲＮＡ濃度５０ｎＭ）、約８０％の値を示した。一方で、図２に示すように、ＯＲＦ８タンパク質のシグナルペプチド領域またはその近傍をターゲットとした例４～６では、２％以下の低い値を示した。これらの結果から、Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部をターゲットとしたｓｉＲＮＡをトランスフェクションした場合には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を受けた細胞からＲＮＡを回収可能なことがわかる。

次に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖数を比較するため、参考例１、例１～３の上記調製した上清試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ量をｑＰＣＲ（定量ＰＣＲ；ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）により測定した。ＰＣＲ機はＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用した。プライマーは、Ｎ－ｓａｒｂｅｃｏをターゲットとするプライマーを用いた。表２にプライマー配列を示す。Ｎ－ｓａｒｂｅｃｏのプライマーは、サルベコウイルス属（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が属する属名）が有するＮタンパク質の保存領域をターゲットとする。ここでは、ｑＰＣＲで求めたＮ－ｓａｒｂｅｃｏのＲＮＡ量をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数（ウイルスＲＮＡコピー数）として示す。上清試料のｑＰＣＲには、ｑＰＣＲ試薬としてＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＴＢ Ｇｒｅｅｎ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＰＬＵＳ ＲＴ‐ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ機は上記と同じのものを用いた。結果を図３に示す。なお、標準曲線は日本遺伝子研究所から購入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ（１０^５ｃｏｐｉｅｓ／μＬ）を用いて作成した。

図３は、上清試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数を示すグラフである。ここでは、かかるＲＮＡコピー数を細胞から得られた総ＲＮＡ量１０００ｎｇあたりの値となるよう補正した。即ち、図３に示される値は、単位細胞あたりのウイルスＲＮＡ産生量とみなすことができる。図３に示すように、例１～３では、ｓｉＲＮＡの添加量を増加させることで、単位細胞あたりのウイルスＲＮＡコピー数を大きく減少させることができることが確かめられた。

次に、細胞抽出試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ量をｑＰＣＲにより定量した。ｑＰＣＲ用試薬としてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ リアルタイムＰＣＲ マスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を使用し、ＰＣＲ機は上記と同じのものを使用した。プライマーは、Ｓタンパク質の内部領域、ＯＲＦ８の内部領域（「ＯＲＦ８（１）」と表記する）、ＯＲＦ８より上流からＯＲＦ８の内部までの領域（「ＯＲＦ８（２）」と表記する）、Ｎタンパク質のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的な領域（「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｎ」と表記する）をターゲットとする４種類を使用した（表２参照）。また、ｑＰＣＲの標準化のためにヒトＧＡＰＤＨをターゲットするｑＰＣＲを行った（プライマーは表２参照）。
図４～７は、細胞抽出試料のＧＡＰＤＨのＣｔ値から上清試料中の各種ターゲット領域のＣｔ値を引いた値を示す。図４～７は、縦軸の値が小さいほど、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの存在量が少ないことを示す。

図４～７に示すように、例１～３は、ｓｉＲＮＡのターゲットとしたＳタンパク質だけでなく、他の領域のＲＮＡの存在量を低減させたことがわかる。即ち、例１～３において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖（ゲノムＲＮＡの増加）が抑制されたことがわかる。また、例１～３のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡを５０ｐｍｏｌ添加したとき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡの増殖をより効果的に抑制することができることが確かめられた。

［試験２］
次に、例２のｓｉＲＮＡを用いて、ｓｉＲＮＡの濃度依存的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増殖抑制効果をさらに検討した。上述した試験１の方法のうち、トランスフェクションの際の培地中ｓｉＲＮＡ濃度を０ｎＭ（即ち、トランスフェクション試薬のみ）、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭとした以外は同様にして行った。また、参考例２として、ｓｉＲＮＡおよびトランスフェクション試薬を添加せず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させた例を実施した。

試験２では、細胞抽出試料に含まれるＳタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量をそれぞれｑＰＣＲにより定量した。なお、ｑＰＣＲの方法は試験１の細胞試料のｑＰＣＲの方法と同様であり、プライマーは表２に示すＳタンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎをターゲットするプライマーを用いた。結果を図８および９に示す。なお、図８および９は、ｓｉＲＮＡを０ｎＭ添加した場合を１とした相対値を示している。

図８および９に示すように、例２で用いたｓｉＲＮＡをトランスフェクションすることにより、ｓｉＲＮＡ濃度依存的に細胞抽出試料中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ量が減少することがわかる。さらに、ｓｉＲＮＡ濃度を６．２５ｎＭとしたときであっても、０ｎＭのときと比較して、Ｓタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量が１００分の１以下となった。これにより、例２で用いたｓｉＲＮＡは、低濃度であっても、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制できることがわかる。

［試験３］
試験３では、ユーロフィンジェノミクス株式会社にポリヌクレオチドの合成を依頼し、８種類のポリヌクレオチドを得た。各ポリヌクレオチドの塩基配列を表３に示す。なお、各ポリヌクレオチドにおいて、３’末端側の「ＴＴ」（オーバーハング）はＤＮＡであり、その他の配列（ターゲット配列）部分はＲＮＡで構成されている。得られたポリヌクレオチドは、相補的な配列を有するセンス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせることで、例７～１０に用いるｓｉＲＮＡをそれぞれ調製した。表３に示す例７～１０は、上述したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含むように設計されたｓｉＲＮＡである。

（例７～１０）
試験１のうち、使用したｓｉＲＮＡを表３に示すｓｉＲＮＡに変更した以外は同様にして、上清試料と細胞抽出試料とを調製した。また、ｓｉＲＮＡを添加しない系（即ち、ｓｉＲＮＡが０ｎＭ）も同時に実施した。上清試料に対し、表２に示すＮ－ｓａｒｂｅｃｏをターゲットとするプライマーを用いたｑＰＣＲを行い、上清試料１ｍＬあたりのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数を測定した。なお、ｑＰＣＲの方法は試験１の上清試料のｑＰＣＲの方法と同様である。結果を図１０に示す。

図１０に示すように、例７～例１０のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡを添加することで、上清試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数が減少することがわかる。特に、例８～１０では、ｓｉＲＮＡ濃度依存的に上清試料に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡコピー数が減少していることがわかる。

また、細胞抽出試料に含まれるＳタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量をそれぞれｑＰＣＲにより定量した。ｑＰＣＲの方法は試験１の細胞試料のｑＰＣＲの方法と同様であり、プライマーは表２に示すＳタンパク質およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－Ｎをターゲットするプライマーを用いた。結果を図１１および１２に示す。なお、図１１および１２は、ｓｉＲＮＡを０ｎＭ添加した場合（即ち未添加）を１とした相対値を示している。

図１１および１２に示すように、例７～１０のいずれにおいても、ｓｉＲＮＡを添加することで、細胞抽出試料中のＳタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量が減少することがわかる。即ち、例７～１０で用いたｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制することがわかる。また、例８～１０で用いたｓｉＲＮＡでは、濃度依存的に細胞抽出試料中のＳタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量を減少させることができることがわかる。さらに、例８～１０で用いたｓｉＲＮＡは、１０ｎＭという低濃度であっても、０ｎＭのときと比較して、Ｓタンパク質およびＮタンパク質のＲＮＡ量が１００分の１以下とすることができることが確かめられた。これにより、例８～１０で用いたｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制できることがわかる。

特に限定されるものではないが、以上の試験例から、ここで開示されるｓｉＲＮＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制メカニズムは、次のように推定される。ここで開示されるｓｉＲＮＡは、Ｓタンパク質のシグナルペプチド領域の少なくとも一部をターゲットとするため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムＲＮＡのターゲット配列を分解または翻訳阻害をする。これにより、Ｓタンパク質の発現が抑制される。そのため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子上のＳタンパク質の量が減少し、ヒト細胞表面に存在するＡＣＥ２と結合する頻度が減少する。その結果、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子の感染の拡大が抑制され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制することができる。一方で、例４～６において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果が得られなかったのは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染拡大のメカニズムにおいて、ＯＲＦ８タンパク質は必要不可欠なものではなかったと推定される。即ち、ｓｉＲＮＡによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖抑制効果は、そのターゲット配列に依存し得るものであり、ここで開示されるｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を顕著に抑制できるものといえる。

以上、ここに開示される技術の具体例を詳細に示したが、これらは例示にすぎず、特許請求の範囲を限定するものではない。特許請求の範囲に記載の技術には、以上に例示した具体例を様々に変形、変更したものが含まれる。

ここで開示されるｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の顕著な増殖抑制効果を発揮し、生存細胞の数を増加させることができる。このため、ここで開示されるｓｉＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する治療薬として用いることができ得る。また、ここで開示されるｓｉＲＮＡは、アミノ酸変異が生じ難いと推定されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のシグナルペプチド領域の少なくとも一部をターゲットとしているため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対しても、増殖抑制効果を発揮し得る。

配列番号１～３ ｓｉＲＮＡのターゲット配列
配列番号６～１７ １～１９番目のヌクレオチドはＲＮＡである。
配列番号１９～３０ プライマー
配列番号３１～３４ ｓｉＲＮＡのターゲット配列
配列番号３５～４２ １～１９番目のヌクレオチドはＲＮＡである。

Claims (6)

1. センス鎖と、アンチセンス鎖とから構成されるｓｉＲＮＡであって、
   前記センス鎖は、
   ５’末端の塩基がグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）である１９～２３塩基からなるターゲット配列と、
   前記ターゲット配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングと
   から構成され、
   前記アンチセンス鎖は、
   前記ターゲット配列と相補的な配列と、
   該相補的な配列の３’末端側に付加された２～４塩基からなるオーバーハングと
   から構成されており、
   ここで、前記ターゲット配列の少なくとも一部は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のシグナルペプチド領域をコードする塩基配列の少なくとも一部を含む、
   ｓｉＲＮＡ。
2. 前記ターゲット配列の３’末端側の５塩基のうち少なくとも３塩基はアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
3. 前記ターゲット配列は、以下の（１）～（７）：
   （１）ＧＵＵＵＵＡＵＵＧＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵ（配列番号１）；
   （２）ＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡ（配列番号２）；
   （３）ＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵＵＡＣＡＡ（配列番号３）；
   （４）ＧＵＵＵＧＵＵＵＵＵＣＵＵＧＵＵＵＵＡ（配列番号３１）；
   （５）ＣＣＡＣＵＡＧＵＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵ（配列番号３２）；
   （６）ＣＵＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵ（配列番号３３）；
   （７）ＣＵＡＧＵＣＡＧＵＧＵＧＵＵＡＡＵＣＵ（配列番号３４）；
   のいずれかからなる、請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ。
4. 前記オーバーハングを構成する塩基配列がチミン・チミン（ＴＴ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ。
5. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増殖を抑制するための組成物であって、請求項１～４のいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡを含む、組成物。
6. ヒトを除く動物に対して請求項５に記載の組成物を投与することを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療方法。

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