TWI414301B - 以微核醣核酸miＲ－１４１為標的治療小核醣核酸病毒感染 - Google Patents

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Description

以微核醣核酸miR-141為標的治療小核醣核酸病毒感染 相關申請案
本申請案主張2008年12月15日申請的美國專利臨時申請案第61/122,530號的優先權，藉由引述將其內容完整併入於此。
本發明係關於藉由抑制miR-141活性而治療小RNA病毒的感染。本發明亦揭示一種用於鑑定miR-141抑制性化合物的方法以及一種用於鑑定可由抗miR-141療法治療之目標病毒感染的方法。
微核糖核酸是經由RNA干擾而調節轉錄後基因表現短單鏈RNA分子。通常，其結合至其目標RNAs的3'非轉譯區(3'UTRs)，藉此阻斷轉錄作用。某些病毒攜帶編碼微核糖核酸的基因。這些病毒性微核糖核酸調節病毒和細胞兩者的基因表現，以促使其於宿主細胞內的增殖。
小RNA病毒是一種含有被二十面體蛋白外殼包覆之正股RNAs的一群小型、無外套膜的病毒。其造成人類和動物各種病狀，例如，無菌性腦膜炎、腦炎、感冒、手足口病、結膜炎、皰疹性咽峽炎，及肝炎。目前仍無用於治療小RNA病毒感染的藥物。
在一方面中，本發明的特徵為一種治療小RNA病毒感染或減少病毒蛋白產生的方法，其藉由將有效治療量之微核糖核酸miR-141抑制劑及選擇性地結合另一抗病毒劑投與至有需要此治療的個體。此抑制劑係miR-141的反義寡核苷酸或靶向轉錄因子早期生長反應蛋白1(EGR1)之干擾RNA。miR-141的反義寡核苷酸可為含有與miR-141核苷酸序列互補之核苷酸序列具有至少90%相同性的RNA。較佳地，該反義RNA為含有CCAUCUUUACCAGACAGUGUUA(SEQ ID NO: 1)的核苷酸序列。靶向EGR-1的小干擾RNAs(siRNA)係特異性結合至EGR1 mRNA內的適當區域之RNA(例如，區域1、2或3)，藉此經由RNA干擾而抑制EGR1的轉錄作用。靶向EGR-1的siRNA的實施例包括，但不侷限於siEGR1-1(5'-AAAGGUUGCUGUCAUGUCCGA；SEQ ID NO: 2)；siEGR1-2(5'-AAUGGGACUGCUGUCGUUGA；SEQ ID NO: 3)；以及siEGR1-3(5'-UUAGGGUAGUUGUCCAUGGTG；SEQ ID NO: 4)。
可依本發明之方法治療的個體可為感染腸病毒(例如，腸病毒71)、小兒麻痺病毒(例如，小兒麻痺病毒3)，或柯沙奇病毒(例如，柯沙奇病毒B3)的人類患者。
在另一方面中，本發明的特徵為一種經分離的核酸，其包含與SEQ ID NO: 1或與EGR1區域1、E2區域2或EGR1區域3序列互補之核苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列。該經分離的核酸的實例包括SEQ ID NO: 1-4。此處「經分離的核酸」一詞意指實質上不含天然連結分子之核酸，也就是此等天然連結分子至多構成含有該核酸之製備物的乾重之20%。可由任何適當方法測定其純度，例如，管柱層析法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法和HPLC法。
亦屬於本發明範圍內者是任何上述的miR-141抑制劑於製備供治療小RNA病毒感染或減少病毒蛋白產生的藥物之用途。
在又另一方面中，本發明的特徵為一種鑑定抗小RNA病毒候選藥物的方法。此方法包含至少四個步驟：(i)提供感染小RNA病毒的細胞，該細胞與未感染細胞比較顯現較低濃度的eIF-4E；(ii)使該細胞接觸化合物；(iii)檢測細胞內miR-141的活性；以及(iv)判定該化合物是否為用於治療導因於小RNA病毒之感染的候選藥物。若該化合物降低miR-141活性，則被鑑定為抗小RNA病毒候選藥物。在一實施例中，miR-141的活性可藉由此微RNA的含量予以測定。在另一實施例中，亦可藉由miR-141目標基因(例如，eIF-4E)的表現量予以測定。
本發明的特徵亦為一種鑑定可藉由抗miR-141療法予以治療之目標病毒感染(即，由目標病毒引起的感染)的方法。此方法包含：(i)提供經病毒感染的細胞；(ii)檢測細胞內miR-141的活性(即miR-141的含量或其目標基因的表現量)；以及(iii)判定該病毒感染是否為可由抗miR-141療法予以治療的目標病毒感染。感染後miR-141數量增加或感染後其目標基因表現量增加表示該感染為目標病毒感染。
在下列的描述中詳細說明本發明的一或多項具體實施例。從下列圖示和該實施例的詳細說明，以及從申請專利範圍附件將可更彰顯本發明的其他特色及優點。
申請人已發現某些小RNA病毒(例如，腸病毒71、小兒麻痺病毒3和柯沙奇病毒B3)非可預期地向上調節人類細胞內miR-141的表現。基因庫登錄號NR_029682(29-10-2009)可發現人類miR-141的核苷酸序列，包括前體miRNA、成熟miRNA，及反義miRNA*。人類miR-141與人類eIF-4E mRNA之3'UTR在鹼基上相互配對(參見圖1)，而經由RNA干擾壓制其轉譯作用。由於eIF-4E為細胞蛋白合成所必需，因此小RNA病毒誘發的miR-141過度表現導致細胞蛋白合成受到抑制。申請人亦已發現此病毒誘發的蛋白合成抑制作用可藉由阻斷miR-141和eIF-4E 3'UTR之間的結合或藉由降低miR-141的表現量，達到抑制miR-141活性，而獲得回復。
因此，本發明係關於一種利用有效量之miR-141抑制劑而治療小RNA病毒感染的方法。小RNA病毒包括，但不侷限於腸病毒(例如，人腸病毒A、B、C或D；小兒麻痺病毒和柯沙奇病毒)；鼻病毒(例如，人類鼻病毒A、B或C)；肝病毒(亦稱為肝RNA病毒例如A型肝炎病毒)；心病毒(例如，腦心肌炎病毒)；鵝口瘡病毒(例如，口蹄疫病毒)。此處「治療」一詞意指使用或投與含一或多種活性劑的組合物至感染小RNA病毒個體以達到治癒、癒合、減輕、舒緩、改變、矯正、改善、改進或影響該感染或該感染之症狀的目的。此處「有效量」意指單獨或結合一或多種其他活性劑而使該個體產生有效治療效應所需的各活性劑用量。如熟習本領域之技術者所習知，有效用量視投藥途徑、所選擇賦形劑及其他共用的活性劑而定。
用於本發明方法的miR-141抑制劑可為miR-141的反義寡核苷酸，即核糖核酸的寡聚物、去氧核糖核酸的寡聚物，或其與前體miR-141(例如，成熟miR-141或miR-141*，參見基因庫登錄號NR_029682)之片段互補或部分互補的類似物。此類反義寡核苷酸較佳為具有15至50個核苷酸(例如，19-25)的長度，包括與前述miR-141片段互補之序列具有至少80%(例如，90%、95%或98%)相同性的序列。其與該片段形成鹼基對並阻斷miR-141和eIF-4E mRNA之間的結合或前體miR-141形成成熟miR-141之進程。
該miR-141抑制劑亦可為靶向轉錄因子EGR1(EGR1干擾RNA)的干擾RNA，其可調節miR-141表現。此蛋白的編碼序列(SEQ ID NO: 7)顯示如下：
干擾RNA係一種經由RNA干擾作用而抑制目標基因表現的RNA分子(例如，miRNA或siRNA)。RNA干擾作用是一種雙鏈RNA引導訊息RNA之同源序列特異性裂解的過程。在哺乳動物細胞中，siRNA的21核苷酸雙螺旋體可啟動RNAi，而不活化宿主干擾素反應。
上述EGR1干擾RNA可靶向EGR1 mRNA內的適當區域，較佳為在編碼區(例如，標示於上述SEQ ID NO: 7中的區域1-3)內。該干擾RNA包括可與目標區域互補序列有至少80%(例如，90%、95%，或98%)相同性的核苷酸序列且在生理狀態下形成鹼基對。
兩種核酸「相同性百分比」的測定係利用Karlin和Altschul，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：2264-68，1990；改版於Karlin和Altschul，Proc. Natl. Acad Sci. USA 90：5873~77，1993中的演算法。此類演算法被併入Altschul等人，J. Mol. Biol. 215：403-10，1990中的NBLAST和XBLAST程式(第2.0版)中。可用分數=100字長-12的NBLAST程式進行BLAST核苷酸檢索，以獲得同源於本發明之核苷酸分子的核苷酸序列。當兩序列存在空隙時，可利用描述於Altschul等人，Nucleic Acids Res. 25(17)：3389-3402，1997的空隙BLAST程式。當利用BLAST和空隙BLAST程式時，可使用各自程式的預設參數(例如，XBLAST和NBLAST)。
可藉由習知的方法，即化學合成或重組技術，製備用於本發明方法的兩種反義寡核苷酸及干擾RNA。較佳地，其係由非天然核苷鹼基、糖或共價核苷間連鍵(主鏈)所組成。此類經修飾寡核苷酸賦予所欲性質，例如，提升細胞攝入、增進針對目標核酸的親和力，以及增加活體內穩定性。
在一實施例中，該反義寡核苷酸或干擾RNA具有一經修飾主鏈，包括保留磷原子者(參見，例如，美國專利案號3,687,808；4,469,863；5,321,131；5,399,676；和5,625,050)以及不具有磷原子者(參見，例如，美國專利案號5,034,506；5,166,315；和5,792,608)。含磷經修飾主鏈的實施例包括，但不侷限於硫代磷酸酯、掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺烷基磷酸三酯；甲基和其他烷基磷酸酯包括3'-亞烷基磷酸酯、5'-亞烷基磷酸酯和掌性磷酸酯、次磷酸酯；胺基磷酸酯包括3'-胺基磷醯胺和胺烷基磷醯胺、硫代磷醯胺、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯；具有3'-5'鍵結或2'-5'鍵結的硒磷酸酯和硼磷酸酯。此類主鏈亦包括具有反向極性者，即3'至3'、5'至5'或2'至2'鍵結。藉由短鏈烷基或環烷基核苷酸間鍵結、混合雜原子和烷基或環烷基核苷酸間鍵結，或一或多種短鏈雜原子或雜環核苷酸間鍵結形成不含有磷原子的經修飾主鏈。此類主鏈包括具有嗎啉基鍵結(部分形成自核苷酸的糖部分)；烷氧矽烷主鏈；硫化物、亞碸和碸主鏈；正乙烯基和硫代正乙烯基主鏈；亞甲基正乙烯基和硫代正乙烯基主鏈；核糖乙醯基主鏈；含烯烴主鏈；胺基磺酸主鏈；甲亞胺基和亞甲肼基主鏈；磺酸鹽和磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；以及其他具有混合N、O、S和CH2 成分部分者。
在另一實施例中，該用於本發明的反義寡核苷酸或干擾RNA包括一或多種經取代糖基團。此類經取代糖基團包括在其2'位置具有下列基團之其中之一者：OH；F；O-烷基；S-烷基；N-烷基；O-烯基；S-烯基；N-烯基；O-炔基；S-炔基；N-炔基；以及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基和炔基可被或未被C1 至C10 烷基或C2 至C10 烯基和炔基所取代。在其2'位置亦包括雜環烷基、雜環烷芳基、胺烷胺基、聚烷胺基、經取代矽烷基、RNA斷裂基團、信息基團、插入物、用於改善寡核苷酸之藥物動力學性質的基團、或用於改善寡核苷酸之藥效學性質的基團。經取代糖基團較佳為包括具有2'-甲氧乙氧基、2'-二甲基胺氧乙氧基和2'-二甲基胺基乙氧乙氧基者。參見Martin等人，Helv .Chim .Acta ，1995，78：486-504。
在又另一實施例中，反義寡核苷酸或干擾RNA包括一或多個經修飾天然核苷鹼基(即腺嘌呤、鳥糞嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。經修飾核苷鹼基包括述於美國專利案號3,687,808，The Concise Encyclopedia of Polymer Sci .and Engineering 第858-859頁，Kroschwitz,J. I.編輯，John Wiley ＆ Sons,1990；English等人Angewandte Chemie ，國際版，1991，30：613；以及Sanghvi,Y. S.第15章，Antisense Research and Applications 第289-302頁，CRC出版，1993中者。這些核苷鹼基中，有某些特別適用於增加反義寡核苷酸至其目標核酸的結合親和力。這些包括5-經取代嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6和O-6經取代嘌呤(例如，2-胺丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶)。參見Sanghvi等人編輯Antisense Research and Applications ，CRC出版，Boca Raton，1993年第276-278頁。
當製備出miR-141之反義寡核苷酸時，藉由此技藝中的習知方法可證實其阻斷miR-141與eIF-4E mRNA之3'-UTR之間結合的能力。實施例如下。使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)擴增eIF-4E mRNA之3'-UTR，以及將該PCR產物連接至其編碼區下游的報導基因(例如，冷光酶基因)。攜帶該eIF-4E 3'-UTR的報導基因被選殖進入表現載體，然後被導入適用於表現該報導基因的宿主細胞。以單獨miR-141或與欲測試的反義寡核苷酸進一步轉染該宿主細胞。在適當條件培養之後，檢測該宿主細胞之報導基因的表現程度。若該反義寡核苷酸能回復miR-141誘發之報導基因表現的抑制作用，則可證明此寡核苷酸能阻斷miR-141與該eIF-4E mRNA之3'-UTR的鹼基配對。
經由習知方法亦可檢測EGR1干擾RNA的活性。參見例如以下實施例3。
該miR-141或EGR1干擾RNA的反義寡核苷酸可與醫藥上可接受載劑混合而形成醫藥組合物。「可接受載劑」係指可與該組合物之活性成分(及較佳為可穩定化該活性成分)相容以及對被治療個體無害的載劑。適當的載劑包括，但不侷限於(a)與陽離子(例如，鈉、鉀、銨、鎂、鈣)及聚胺(例如，精胺和亞精胺)形成的鹽；(b)與無機酸(例如，氫氯酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸)形成的酸加成鹽；(c)與有機酸(例如，醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、褐藻酸、聚麩胺酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸)形成的鹽；以及(d)形成自陰離子元素(例如，氯、溴和碘)的鹽。其他適合的載劑包括微晶纖維素、甘露糖醇、葡萄糖、脫脂奶粉、聚乙烯吡咯啶酮、澱粉，及其組合。
利用熟知本醫學領域之技術者的習知方法可將上述的醫藥組合物投與至一個體。例如，輸送上述醫藥組合物可經由局部(例如，經由眼睛、陰道和直腸投藥)、肺部(例如，經由粉末或氣霧劑的吸入或灌氣)、氣管內、鼻內、經皮、口腔，或腸道外。腸道外投藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹腔內或肌肉內注射或輸液；或顱內投藥(例如，鞘內或腦室內)。當運用口服投藥時，該反義寡核苷酸較佳為包括至少2'-O-甲氧甲基修飾。
含該miR-141之反義寡核苷酸的可注射組合物可含有各種載劑，例如，植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸二異丙酯、乙醇，及多元醇(甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)。就靜脈注射而言，可藉由滴注法投與該寡核苷酸，藉此灌注含有該寡核苷酸和生理生上可接受賦形劑的醫藥調配物。生理上可接受賦形劑包括例如5%右旋糖、0.9%鹽水、林格氏液或其他適當賦形劑。肌肉內製劑，例如，適當可溶性鹽型肽之無菌調配物，可溶解於醫藥賦形劑內，例如，滅菌水、0.9%鹽水，或5%葡萄糖溶液，並予以投藥。為助於輸送，該反義寡核苷酸或干擾RNA可共軛於伴護劑(chaperon agent)。此處「共軛」意指結合兩個實體，其較佳為具有獲得兩實體之間相關治療效益的足夠親和力。共軛包括共價或非共價鍵結以及其他形式的結合，例如，包埋一實體於另一實體上或其內，或其一或該二實體於第三實體(例如，一分子團(micelle))上或其內。
該伴護劑可為天然物質，例如，蛋白質(如，人血清白蛋白、低密度脂蛋白，或球蛋白)、碳水化合物(如，葡聚糖、褐藻素(pullulan)、甲殼素、幾丁聚糖、菊醣(inulin)、環糊精或玻尿酸)，或脂肪。其亦可為重組或合成分子，例如，合成聚合物如合成聚胺基酸。聚胺基酸的實施例包括聚離胺酸(PLL)、聚L-天門冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(乳酸共聚-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物，及聚磷嗪。
在一實施例中，該伴護劑係一種包覆該寡核苷酸/干擾RNA的分子團、脂質體、奈米粒子或微球。製備此類分子團、脂質體、奈米粒子或微球的方法已為技術中所習知。參見例如美國專利案號5,108,921；5,354,844；5,416,016；及5,527,5285。
在另一實施例中，該伴護劑被用作為附著一或多種融合劑或縮合劑的基質。
融合劑可對局部pH產生反應。舉例而言，當接觸內質體的pH時，在其週遭環境中造成物理變化，例如，崩解或增加內質體膜通透性的滲透壓變化，因而有助於將反義寡核苷酸釋入宿主細胞的胞質內。較佳的融合劑可改變電荷，例如在低於生理範圍的pH之下(如pH 4.5-6.5)被質子化。融合劑可為含有在暴露於特定pH範圍時能進行改變電荷(如質子化)之胺基的分子。此類融合劑包括具有聚胺鏈(如乙烯亞胺)和膜破壞劑(如蜂毒肽(melittin))的聚合物。其他實施例包括聚組胺酸、聚咪唑、聚吡啶、聚丙烯亞胺和聚縮醛物質(如陽離子聚縮醛)。
縮合劑與該反義寡核苷酸相互作用而產生縮合(如減小寡核苷酸體積)，因此獲得對抗崩解的保護。該縮合劑較佳為包括經由例如離子作用力與寡核苷酸相互作用的基團(如帶電荷基團)。縮合劑的實施例包括聚離胺酸、精胺(spermine)、亞精胺(spermidine)、聚胺或其季鹽、偽胜肽-聚胺、擬肽聚胺、樹枝狀高分子聚胺、精胺酸、甲脒、魚精蛋白(protamine)、脂肪、陽離子卟啉，及α螺旋肽。
為增強效力，該上述醫藥組合物可共用另一抗菌劑。
此處亦揭示一種用於鑑定對抗小RNA病毒之潛能藥物的方法。在此方法中，在適當條件之下，以化合物處理感染小RNA病毒的細胞，然後檢測細胞miR-141的活性。此類化合物可為小分子或巨分子(例如，核酸和蛋白質)。若該化合物可抑制miR-141的活性，則其被鑑定對抗小RNA病毒之潛能藥物。藉由習知方法如即時PCR檢測經處理細胞內的miR-141本身含量，可測定miR-141的活性。其測定亦可藉由檢測其目標基因的表現量(即訊息RNA含量或蛋白含量)而達成。下表所列為許多受miR-141調節的例示目標基因：
可藉由目標基因預測程式例如述於Sethupathy等人Nat. Methods 3：881-886(2006)中的TargetCombo鑑定被miR-141調節的其他基因。亦可參見diana.pcbi.upenn.edu/cgi-bin/TargetCombo.cgi。
本發明亦提供一種鑑定於其宿主細胞內可向上調節miR-141活性之病毒的方法。此類病毒造成的感染可於抗miR-141療法中予以治療，即經由抑制miR-141的活性或表現而達成。miR-141活性的抑制包括向下調節miR-141的濃度或阻斷其結合至目標訊息RNA。可藉由檢測受病毒感染的細胞內的miR-141含量或miR-141目標基因的表現量而進行上述的方法(參見上述的表1)。若該感染的細胞顯現miR-141含量上升或目標基因的表現量降低，則表示該病毒造成的感染可於抗miR-141療法中予以治療。
已認為熟習本技藝之人士可根據上述的說明在不需進一步闡述之下將本發明發揮至極致。下列特定的實施例因此僅供說明之用途，並且在任何情況下不得成為本發明之限制。藉由引述將此處引述的全部公開資料併入於此。
實施例1：病毒感染所誘發的miR-141過度表現抑制細胞eIF-4E 的表現
在補充以1 mM L-麩胺酸、100單位/mL青黴素、100 ug/mL鏈黴素和10%胎牛血清(Gibco)的MEM培養基內培養人橫紋肌肉瘤(RD)細胞。以無血清培養基內的小兒麻痺3型病毒(PV3)、柯薩奇B3病毒(CVB3)或腸病毒71(EV71)感染該細胞，及在50X放大的ZEISS Axiovert 200M(Zeiss)攝影機拍攝病毒感染所造成的細胞病變效應。利用Image XpressMICRO 和MetaXpress影像分析軟體(MDS分析技術公司)分析所拍下的照片。在此試驗中，使用模擬感染細胞作為對照組。
感染後，收集細胞然後利用三唑(trizol)試劑(Invitrogen)萃取病毒感染和模擬感染細胞的RNAs。藉由TaqMan基因表現檢測儀(000463和Hs00908915；Applied Biosystems公司)，根據製造商的指示，進行即時PCR分析，以測定這些細胞中miR-141和eIF-4E mRNA的濃度。參見Belsham等人Trends Microbiol. 8：330-335(2000)。臨界循環(Ct)被定義為螢光超過0.2固定閥值的分率循環數。根據TagMan檢測之相同檢定法所測得U6 snRNA的Ct值(內部控制組)，將總RNA輸入值予以標準化。倍數變化的計算係藉由以下公式計算：2-ΔCT ×K，其中-ΔCT=-[CTmiRNA -CTU6 snRNA ]和K為常數。
獲得此試驗的結果顯示，感染8小時之後EV71-感染細胞、PV3-感染細胞和B3-感染細胞內的miR-141濃度分別較對照細胞高16倍、14倍和31倍。此外，發現在病毒感染的細胞內，eIF-4E之mRNA濃度係以時間依賴方式降低，但是對照細胞則否。
進行下列的冷光酶檢測，以確認miR-141對eIF-4E表現的抑制效應。藉由引子F1(5'-gagctcGAAGACACCTTCTGAGTATTCT-3'；SEQ ID NO: 8)和R1(5'-gccggcTAAAAGACAATTCACTGTACACAT-3'；SEQ ID NO: 9)，從RD的基因組DNA擴增全長3'UTR(wtUTR，含miR-141的目標位置)。利用引子F1和mutR1(5'-TTTTGTAGTGAGTCTTAATATGAAT-3'；SEQ ID NO: 10)及引子mutF1(5'-ATTCATATTAAGACTCACTACAAAA-3'；SEQ ID NO: 11)和R1，經由PCR獲得兩種突變的3'UTR片段(mutUTRs)。將兩種野生型3'UTR和突變型3'UTR選殖入pMIR-報導基因冷光酶載體(Ambion)，以獲得冷光酶-wtUTR和冷光酶-mutUTR報導基因構築體。
轉染24小時之前，在96孔盤內接種1 x 104 HEK293T細胞。利用RNAi-fect試劑(Qiagen)，以5：1的比例，將各冷光酶報導構築體或對照質體pRL-TK(Promega)共同導入具有miR-141的細胞。轉染48小時之後，將Dual-Glo冷光酶基質(Promega)加至各孔，並按照製造商的指示，藉由Victor3 多標記檢測儀(PerkinElmer)測定發光信號。利用水母冷光酶的活性作為內部控制組，將轉染效率正常化。所有的轉染在96孔盤內進行三重複試驗。
從此試驗獲得的結果顯示，共同轉染冷光酶-wtUTR報導構築體的細胞內可抑制高達50%的冷光酶活性，但在共同轉染冷光酶-mutUTR報導構築體的細胞內則否。此證明miR-141係經由與其3'UTR的鹼基配對抑制eIF-4E的表現。
經由RT-PCR，從RD細胞擴增全長eIF-4E編碼序列，使其5'端與編碼V5標記之序列連接，以及使其3'端與wtUTR或mutUTR的連接。形成的連接產物被選殖入pcDNA 3.1表現載體(Invitrogen)內，以製造表現構築體V5-eIF4E-wtUTR和V5-eIF4E-mutUTR。該兩種表現構築體被導入RD細胞以及經由新黴素篩選建立穩定細胞株。
以miR-141轉染所獲得的穩定細胞株，以及利用抗-V5抗體，藉由下列西方墨點法檢測V5-eIF4E的表現。收集細胞並於RIPA裂解液(50 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1 % Triton X-100,0.1 % SDS,1 %去氧膽酸鈉,1 mM PMSF及蛋白酶抑制劑混合液)內分解，以及藉由BCA蛋白檢測液(BioRad)測量細胞裂解液內的蛋白濃度。藉由12.5%的月桂基硫酸鈉聚丙醯胺凝膠電泳再次溶解蛋白，然後轉移於PVDF膜。於Tris-緩衝液(TBS)(20mM Tris-HCl(pH 7.5),150 mM NaCl,0.5% Tween-20)內以5%脫脂乳阻斷之後，將該膜與作為內部控制組的β-肌動蛋白特異性初級抗體(1：5000；Sigma)，或與V5標記特異性初級抗體(1：5000；Infitrogen)共同培養。將該膜清洗數次，以及與染料共軛的次級抗體共同培養，然後進行顯色。其西方墨點資料顯示，miR-141於轉染V5-eIF4E-wtUTR構築體的細胞內係以劑量依賴方式負調節V5-eIF4E的表現。在轉染V5-eIF4E-mutUTR構築體和miR-141的細胞內，則未觀察到miR-141的抑制效應。這些結果證明，miR-141經由與其mRNA之3'UTR的相互作用而負調節eIF4E的轉譯。
接著，以10感染複數的EV71、CVB3或PV3感染上述的穩定細胞株，以測定該病毒是否能藉由誘發miR-141表現而抑制eIF4E的表現。感染後4、8和12小時，收集細胞以及將細胞蛋白進行上述的西方墨點分析。其結果證明，感染EV71、CVB3或PV3者可依時間依賴方式降低轉染V5-eIF4E-wtUTR構築體之細胞內的V5-eIF4E濃度，但轉染V5-eIF4E-mutUTR構築體的細胞則否。顯然，這些小RNA病毒經由誘發miR-141表現而降低感染細胞內的eIF4E濃度，因而抑制宿主細胞蛋白的產生。因此，抑制miR-141活性可回復小RNA病毒感染造成之宿主細胞蛋白產生的抑制作用。
實施例2：藉由miR-141拮抗劑抑制病毒的增殖
在補充以1mM L-麩胺酸、100單位/mL青黴素、100 ug/mL鏈黴素和10%胎牛血清(Gibco)的MEM培養基內培養人橫紋肌肉瘤(RD)細胞。以miR-141拮抗劑(CCAUCUUUACCAGACAGUGUUA；SEQ ID NO: 1)、與miR-141互補的RNA，或陰性對照RNA，根據製造商指示，藉由siPORT NeoFX轉染試劑(Ambion)轉染這些細胞。以無血清培養基內的EV71感染該轉染的RD細胞以模擬轉染的RD的細胞。利用50X放大的ZEISS Axiovert 200M(Zeiss)攝影機拍攝EV71感染所造成的細胞病變效應。利用ImageXpressMICRO 和MetaXpress影像分析軟體(MDS分析技術公司)分析所拍下的照片。利用MetaXpress的內建形態測量分析功能定量該細胞病變效應。利用MS Excel(微軟)分析數值資料。此試驗中獲得的結果顯示miR-141拮抗劑與任一陰性對照RNA比較，明顯減弱EV71於RD細胞內誘發的細胞病變效應。
藉由代謝標示法在EV71感染後的不同時間點檢測該模擬轉染、陰性對照轉染和miR-141拮抗劑轉染的RD細胞的細胞蛋白合成濃度。簡言之，感染EV71之後第4、8、12或16小時，將該RD細胞於補充2mM L-麩胺酸的無甲硫胺酸DMEM培養基(Invitrogen)內培養20分鐘。將20μCi/mL[35 S]甲硫胺酸(NEN)加入培養基，以標示原始合成蛋白。於15分鐘之後，收集該細胞然後藉由12% SDS-PAGE分析該標示蛋白。在模擬轉染和陰性對照轉染的RD細胞中，於EV71感染後4小時明顯抑制細胞蛋白的合成。意外地，以miR-141拮抗劑轉染的RD細胞內明顯降低此抑制的程度，此表示miR-141拮抗劑可回復EV71造成的細胞蛋白合成抑制作用。
藉由西方墨點法檢測上述RD細胞內的病毒蛋白濃度，即外殼蛋白VP1和VP3。簡言之，收集RD細胞並懸浮於RIPA裂解液(50 mM Tris-HCl(pH 7.4),150 mM NaCl,1 mM EDTA,1% Triton X-100,0.1% SDS,1%去氧膽酸鈉,1 mM PMSF,及蛋白酶抑制劑混合液)內。藉由BCA蛋白檢測液(BioRad)，測量細胞裂解液內的蛋白濃度。藉由月桂基硫酸鈉聚丙醯胺凝膠電泳法(12.5%)再次溶解裂解液內所含蛋白然後轉移於硝化纖維素薄膜。於Tris-緩衝液(20mM Tris-HCl(pH 7.5),150 mM NaCl,0.5% Tween-20)內以5%脫脂乳阻斷該薄膜後，清洗，然後與β-肌動蛋白(1：5000；Sigma)、VP1(1：2000；Chemicon)和VP3(1：2000；Chemicon)特異性初級抗體共同培養。在清洗數次之後，將該薄膜與HPR-共軛抗小鼠IgG抗體(1：5000；Santa Cruz)共同培養。獲得的結果顯示，miR-141拮抗劑轉染的RD細胞內的VP1和VP3濃度明顯較低於模擬轉染或陰性對照轉染的RD細胞者。這些資料證明miR-141拮抗劑可降低病毒蛋白的產生。
最後，依如下方法測定EV71感染RD細胞內的病毒效價。將RD細胞接種於6孔盤內，然後以每孔100 μL經稀釋的病毒儲備液感染細胞。一小時之後，清洗該經感染的細胞、將細胞懸浮於新鮮培養液內，然後置於含0.3%瓊脂的培養皿上。培養三天之後，以甲醛固定該細胞，並以結晶紫染色而使其產生菌斑。該菌斑的數目代表病毒的效價。結果顯示，miR-141拮抗劑與陰性對照RNA比較可使病毒效價降低約1,000倍。參見圖2第A幅。
亦在如下的天然細胞內，檢測miR-141拮抗劑對病毒增殖的抑制效應。在補充1mM L-麩胺酸、100單位/mL青黴素、100 ug/mL鏈黴素和10%胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640培養基內，培養人類膠質母細胞瘤SF-268細胞。根據製造商指示，藉由siPORTNeoFX 轉染試劑(Ambion)，以miR-141拮抗劑或陰性對照RNA轉染該SF-268細胞。以無血清培養基內的EV71感染該轉染細胞以及模擬轉染對照細胞。依照上述方法檢測EV71感染造成的細胞病變效應。藉由西方墨點法檢測感染後各時間點(即8、16、24、32、40、48和56小時)的細胞eIF4E濃度。結果顯示，EV71感染可導致內源性eIF4E濃度的降低及藉由miR-141拮抗劑可回復eIF4E的降低，但是對照RNA則否。
藉由習知的菌斑形成檢測法，測定EV71-感染SF-268細胞的病毒效價。如圖2第B幅顯示，感染24小時之後miR-141拮抗劑可降低EV71的增殖以及降低感染後48小時的尖峰濃度。
實施例3：藉由靶向EGR1的小干擾RNAs抑制病毒的增殖
EGR1被鑑定為是調節miR-141表現的轉錄因子。在感染EV71的RD細胞內，藉由即時PCR和西方墨點法分別檢測EGR1的mRNA和蛋白的含量。結果顯示，感染4和8小時之後，相對於模擬感染細胞，EGR1的mRNA和蛋白的含量，均增加高達100倍。此顯示病毒感染可誘發EGR1的表現以及因而向上調節miR-141。
已鑑定出在miR-141基因之5'調節區內的可能EGR1結合位點。依照Updated Biotechnology提供的方法進行染色質免疫沉澱法，以測定EGR1是否直接結合至該兩個可能的結合位點。將編碼具有V5標籤之EGR1的DNA片段插入pcDNA3.1，然後導入RD細胞內。轉染48小時之後，在37℃以1%甲醛將該細胞處理10分鐘及以含蛋白酶抑制劑的冰冷磷酸鹽緩衝液(1mM PMSF,1μg/ml抑肽酶和1μg/ml抑肽素A)清洗兩次。將該細胞沈澱，然後將其溶解於SDS裂解液(Upstate Biotechnology)內，將獲得的裂解樣本以超音波振盪，使DNA被剪切至200和1000鹼基對之間的長度。藉由瓊脂凝膠電泳法分析經剪切DNA的等份樣本，以檢測該經剪切DNA的長度和數量。將該經剪切DNA在4℃與小鼠抗-V5單株抗體(Invitrogen)培養隔夜。藉由塗佈鮭魚精DNA-牛血清白蛋白的瓊脂糖凝膠珠捕捉免疫複合體及以無DNase和RNase的蛋白酶K處理，以苯酚和氯仿萃取，然後沈澱。收集該DNA沈澱物及利用側接上述該兩個可能EGR1結合位點的引子進行PCR分析。結果顯示，在上述PCR分析中，該兩個EGR1結合位點均被擴增，因此可證明該兩個位點係結合至EGR1-V5。
亦藉由即時PCR和西方墨點分析法，檢測轉染pcDNA-EGR1-V5構築體之RD細胞內的miR-141和eIF4E濃度。獲得的資料顯示，在表現EGR1-V5的細胞內，miR-141的濃度明顯較高於其於對照細胞(模擬感染細胞或載體轉染細胞)內的濃度，以及eIF4E濃度明顯較低於其於對照細胞內的濃度。
總而言之，上述結果證明EV71感染可向上調節EGR1的表現，其即誘發miR-141的表現以及降低eIF4E的濃度，因而抑制感染細胞內的蛋白合成。
接著，進行RNA干擾分析，以研究抑制EGR1表現是否可抑制病毒增殖。將三種靶向EGR1的siRNAs，siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3、其分別具有5’-AAAGGUUGCUGUCAUGUCCga(SEQ ID NO: 2),5’-AAUGGGACUGCUGUCGUUga(SEQ ID NO: 3)和5’-UUAGGGUAGUUGUCCAUGGtg(SEQ ID NO: 4)的核苷酸序列，藉由Lipofectamine 2000試劑(Introgen)導入RD細胞內，以及在24小時之後，以EV71病毒感染該轉染的RD細胞。感染後4或8小時收集細胞培養的上清液，然後藉由上述菌斑檢測法的分析測定病毒的效價。亦收集該細胞；從該細胞萃取總RNAs以及藉由SYBR green即時PCR儀(Applied Biosystems)的分析，以測定該EGR1的表現量。
如圖3所示，全部siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3可降低感染後4小時EV71-感染RD細胞內的EGR1濃度，以及在感染8小時後降低程度達到高峰。這些siRNAs與對照RNA比較，在感染後4或8小時，亦使上清液內病毒效價降低3至20倍。在ELISA檢測中，轉染該三種靶向EGR1的siRNAs及對照RNA的細胞內，未發現α干擾素的產生。序列比對分析顯示siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3均未以EV71基因組為目標。
其他具體實施例
可利用任何的組合方式組合披露於此專利說明書中的全部特性。披露於此專利說明書中的每一種特性可被用於相同、等效或類似目的之另類特性所取代。因此，除非另有說明，否則披露的每一種特性僅為一系列普通等效或類似特性的實施例。
從上述的描述一位熟習該技術者可輕易地確認本發明的主要特徵，以及在不偏離本發明的精神和範圍之下可作出各種的改變和修飾以適應各種的用途和狀況。因此，其他具體實施例亦在該申請專利範圍之內。
首先說明該圖式的內容。
圖1顯示形成於hsa-miR-141(SEQ ID NO: 5)和真核起始因子4E(eIF-4E)基因之3'UTR(SEQ ID NO: 6)之間的鹼基對。
圖2顯示miR-141拮抗劑對病毒增殖的抑制效應。第A幅：人類橫紋肌肉瘤細胞內miR-141拮抗劑對EV71病毒增殖的抑制作用。第B幅：人類膠質母細胞瘤SF-268細胞內miR-141拮抗劑對EV71病毒增殖的抑制作用。
圖3顯示三種小干擾RNAs(siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3)靶向轉錄因子早期生長反應蛋白1(EGR1)的抑制效應。第A幅：人類橫紋肌肉瘤細胞內siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3對EV71病毒增殖的抑制作用。第B幅：感染EV71的人類膠質母細胞瘤細胞內siEGR1-1、siEGR1-2和siEGR1-3可降低EGR1的濃度。

Claims (8)

  1. 一種miR-141抑制劑在製備用於治療腸病毒感染之醫藥組合物之用途，其中該miR-141抑制劑是選自miR-141之反義寡核苷酸；以及其中該腸病毒係選自由腸病毒71、小兒麻痺病毒3及柯沙奇病毒B3所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該反義寡核苷酸是反義RNA。
  3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該反義RNA為CCAUCUUUACCAGACAGUGUUA(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。
  4. 一種miR-141抑制劑在製備用於減少腸病毒蛋白產生的醫藥組合物之用途，其中該miR-141抑制劑是選自miR-141之反義寡核苷酸，以及該腸病毒係選自由腸病毒71、小兒麻痺病毒3及柯沙奇病毒B3所組成的群組。
  5. 如申請專利範圍第4項之用途，其中該miR-141抑制劑是含有SEQ ID NO：1之核苷酸序列的miR-141反義RNA。
  6. 一種鑑定抗腸病毒候選藥物的方法，其包含：提供感染腸病毒的細胞，其中該細胞與未感染細胞比較顯現較低濃度的eIF-4E；使該細胞接觸化合物；檢測細胞內miR-141的活性；以及判定該化合物是否為可用於治療導因於腸病毒之感染的候選藥物，其中於接觸步驟之後細胞內miR-141的活性降低表示該化合物是候選藥物，其中，該腸病毒係選自由腸病毒71、小兒麻痺病毒3及柯沙奇病毒B3所組成的群組。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該檢測步驟是藉由測定細胞內miR-141的含量或miR-141之目標基因的表現量而進行。
  8. 一種用於治療腸病毒感染之經分離的核酸，其係選自具SEQ ID NO：1之核苷酸序列的miR-141反義RNA，其中該腸病毒選自由腸病毒71、小兒麻痺病毒3及柯沙奇病毒B3所組成的群組。
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