CN117230061A - 一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括由一条正义链和一条反义链组成的双链RNA分子；所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括siRNA‑1、siRNA‑2、siRNA‑3、siRNA‑4、siRNA‑5、siRNA‑6、siRNA‑7、siRNA‑8、siRNA‑9、siRNA‑10、siRNA‑11或siRNA‑12中的任意一种或至少两种的组合。所述siRNA有效抑制Smoothened基因的表达，在制备Smoothened基因介导的疾病的预防或治疗药物中具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物医学技术领域，尤其涉及一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
近年来，基因生物技术飞速发展，特别是核酸干扰(RNA interference，简称RNAi)的发现，为生命科学研究和医学治疗领域带来了革命性变革。RNAi是指广泛存在于真核生物、在进化过程中高度保守、由双链RNA诱发同源信使RNA(messenger RNA，简称mRNA)被高效特异性降解的一种现象，在生物进化过程中发挥抵御外来病毒感染及克服基因组不稳定的作用。Andrew Fire和Craig C.Mello等人于1998年在秀丽隐杆线虫中首次发现RNAi现象，并因此于2006年获得了诺贝尔生理学或医学奖。此后，关于RNAi的机制原理探究、基因功能探索和临床治疗应用方面都取得了一系列进展，核酸药物也因此成为继小分子化学药物、生物蛋白药物后的第三大新药类型。
小干扰核酸(small interference RNA，简称siRNA)属于寡核苷酸的一种，可以在哺乳动物中发挥RNAi作用。siRNA通过结合RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencingcomplex，简称RISC)，以碱基完全互补配对的方式识别与其反义链序列互补的靶mRNA，导致靶mRNA被切割降解，从而使该基因表达降低，属于转录后基因沉默机制。siRNA具有高特异性及高效性等特点，在药物研发领域具有广阔的应用前景，为药物开发带来了发展新机遇。其主要优势体现在：(1)可选择靶点多，理论上可针对任意致病基因设计并筛选siRNA分子对基因表达进行抑制，因靶向中心法则上游的mRNA水平，因此不会被蛋白质结合口袋的复杂结构影响；(2)研发周期短，基于与靶序列高特异性匹配的原理，理论上只需知道靶基因的序列，就可以设计出针对该序列的siRNA，比小分子药物的迭代筛选、前体药物化学优化或生物蛋白药物筛选都更为迅速，且特异性高，避免了脱靶效应发生；(3)药物效力高，可针对疾病相关多个基因设计出一套siRNA联合使用，有助于明显提高疗效，避免耐药性的发生。目前全球范围内共有四款siRNA药物被批准上市，包括Alnylam Pharmaceuticals的(patisiran)、/>(givosiran)和/>(lumasiran)，以及Novartis的/>(inclisiran)。
但siRNA药物的开发依旧面临许多挑战，由于siRNA是具有大分子量、负电荷、亲水性的寡核苷酸，如何高效地递送并通过细胞膜被靶细胞摄入是RNA治疗应用的难点。通过系统注射的核酸药物，需抵抗细胞外间隙的核糖核酸酶降解、避免免疫激活、绕过肾脏过滤清除、准确到达靶细胞并穿过细胞膜，在被降解或被胞吐重新排出前逃离内体系统，从而顺利在细胞内发挥RNAi作用。针对上述挑战，目前的解决方案主要包括：(1)优选适于局部给药的适应症进行药物开发，降低药物在循环中被清除的概率；(2)对靶基因序列的不同位点设计出多个siRNA，通过一系列生物学实验验证并筛选出抑制效率最高的序列，有助于减少药物剂量，有利于避开已知的耐药突变位点；(3)通过化学修饰，改善寡核苷酸的药代动力学、药效学和生物分布。
Sonic Hedgehog(简称SHH)信号通路以多种机制调控哺乳动物胚胎发育及成熟机体组织器官稳态。SHH配体结合PTCH1受体后，导致Smoothened(简称SMO)被解除抑制，从细胞内囊泡转移至纤毛部位募集，激活GLI转录因子入核，激活靶基因的转录和表达。SHH信号通路在成年机体中表达水平较低，但在皮肤、脑、前列腺以及胃肠道等恶性肿瘤中均发现SHH信号通路的持续性活化。该信号通路已成为极具吸引力的肿瘤治疗潜在靶点，其中临床应用最为广泛的是SMO抑制剂。
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种慢性炎症性自身免疫病，具有患病率高、致残率高的特点，表现为双侧对称性关节肿痛，严重者甚至出现软骨损害以及骨侵蚀等关节破坏。RA给患者带来沉重的负担，目前临床上的治疗药物尚不能完全满足其需求。临床常用药物包括糖皮质激素、非甾体类抗炎药、改善病情的抗风湿药和生物制剂等，但超过30％的患者对临床常用治疗方法反应不佳，且长期用药会产生副作用，如胃肠道反应、骨质疏松、机会性感染等，因此迫切需要开发针对特定靶点、高效、特异且有较高安全性的新型RA治疗药物。近期，研究人员在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞及关节滑膜组织中，发现存在SHH信号通路活化，SMO表达水平升高，导致关节滑膜炎症活跃，骨软骨破坏严重。而通过小分子SMO抑制剂，可明显抑制其中的成纤维样滑膜细胞的“类肿瘤样”行为，减轻关节炎症，从而达到缓解并治疗类风湿关节炎的目的。
但目前获美国食品药品监督管理局批准的SMO抑制剂药物，如Vismodegib、Erismodegib及Glasdegib，均是通过口服摄入，存在胃肠道反应、脱发等毒副作用；且在临床应用中也发现了肿瘤组织中存在的SMO突变体(SMO D473H及W535L)，改变了SMO蛋白结构，抑制小分子化合物进入跨膜区，导致患者对Vismodegib产生耐药。因此亟需开发针对该靶点的其他类型抑制剂，使其具有更好的疗效、特异性、靶向性和机体耐受性。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用，所述siRNA可在mRNA水平上抑制Smoothened基因的表达，并且可以通过化学修饰提高其稳定性，在制备Smoothened基因介导的疾病的治疗药物中具有重要的意义。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抑制Smoothened基因表达的siRNA，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括由一条正义链和一条反义链组成的双链RNA分子；
所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5、siRNA-6、siRNA-7、siRNA-8、siRNA-9、siRNA-10、siRNA-11或siRNA-12中的任意一种或至少两种的组合；
其中，所述siRNA-1的正义链包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.2所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-2的正义链包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-3的正义链包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-4的正义链包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-5的正义链包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-6的正义链包括SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-7的正义链包括SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.14所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-8的正义链包括SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.16所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-9的正义链包括SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.18所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-10的正义链包括SEQ ID No.19所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.20所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-11的正义链包括SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.22所示的核苷酸序列。
优选地，所述siRNA-12的正义链包括SEQ ID No.23所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.24所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：5’-CUACGUCAAUGCGUGCUUC-3’；
SEQ ID No.2：5’-GAAGCACGCAUUGACGUAG-3’；
SEQ ID No.3：5’-CGUCAAUGCGUGCUUCUUU-3’；
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SEQ ID No.7：5’-UGACUCUGUUCUCCAUCAA-3’；
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SEQ ID No.11：5’-UGCCCAAGUGUGAGAAUGA-3’；
SEQ ID No.12：5’-UCAUUCUCACACUUGGGCA-3’；
SEQ ID No.13：5’-UCGCUACCCUGCUGUUAUU-3’；
SEQ ID No.14：5’-AAUAACAGCAGGGUAGCGA-3’；
SEQ ID No.15：5’-GCCACUUCUACGACUUCUU-3’；
SEQ ID No.16：5’-AAGAAGUCGUAGAAGUGGC-3’；
SEQ ID No.17：5’-CAUGCCCAAGUGUGAGAAU-3’；
SEQ ID No.18：5’-AUUCUCACACUUGGGCAUG-3’；
SEQ ID No.19：5’-AGGACAUGCACAGCUACAU-3’；
SEQ ID No.20：5’-AUGUAGCUGUGCAUGUCCU-3’；
SEQ ID No.21：5’-UGGGAGGCUACUUCCUCAU-3’；
SEQ ID No.22：5’-AUGAGGAAGUAGCCUCCCA-3’；
SEQ ID No.23：5’-GCCUGGGCAUUUUUGGCUU-3’；
SEQ ID No.24：5’-AAGCCAAAAAUGCCCAGGC-3’。
本发明中，上述siRNA可有效抑制Smoothened基因表达，并且可进一步添加悬挂碱基以及进行化学修饰，进而提升其生物学性能，在制备预防和治疗Smoothened基因介导的疾病的药物或者制剂中具有重要的应用价值。
优选地，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA中的任意一条正义链或反义链还进行了化学修饰。
优选地，所述化学修饰包括核酸骨架的硫代磷酸(P-S键)修饰、核酸或脱氧核酸的2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-O-烷基修饰、2’-O-烯丙基修饰、2’-C-烯丙基修饰、2’-脱氧修饰、2’-羟基修饰、锁核酸(LNA)修饰、开环核酸(UNA)修饰、碱基的吲哚修饰、碱基的5’-甲基胞嘧啶修饰、碱基的5’-乙炔基尿嘧啶修饰、单链末端磷酸化修饰、单链末端胆固醇修饰、单链末端半乳糖修饰、单链末端多肽修饰、单链末端荧光探针标记修饰或配体修饰中的任意一种或至少两种的组合，优选为2’-O-甲基(2’-OMe)修饰、2’-氟(2’-F)修饰、单链5’-末端磷酸化修饰或单链3’-末端胆固醇修饰中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，对siRNA进行化学修饰可以改善其性能，有助于提高其对核糖核酸酶的抗性、提高稳定性、延长持续作用时间、保持较高的RNAi抑制活性、促进宿主细胞摄取以及提升干扰效果，并且能够促进siRNA分子穿过细胞膜进入细胞内，减轻了细胞毒性，且提高了对目的基因的抑制效果。
其中，2’-O-甲基修饰和2’-F修饰提高了siRNA对核糖核酸酶的抗性，增强了稳定性，延长了持续作用时间，并保持较高的RNAi抑制活性；对siRNA反义链种子区域核糖进行2’-O-甲基修饰，有助于明显降低脱靶效应，提高特异性；2’-O-甲基修饰阻断了siRNA对天然免疫的激活，显著降低了免疫原性，提高了安全性；正义链3’-末端共价结合胆固醇有助于利用脂质相溶促进其穿过细胞膜进入靶细胞发挥作用；反义链5’-末端的磷酸化修饰在防止siRNA被核酸外切酶降解的同时，增强了siRNA干扰活性。
优选地，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA的3’-末端还含有以两个超出双链互补结构的脱氧核苷组合形成的悬挂碱基。
优选地，所述悬挂碱基为dTdT。
本发明中，通过设计并添加悬挂碱基，提高了siRNA对核糖核酸酶的抗性，进一步增加了siRNA的稳定性，延长其在体内的半衰期，并保持较高的RNAi抑制活性，从而发挥更好的治疗效果。
第二方面，本发明提供了第一方面所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA在制备预防或治疗Smoothened基因介导的疾病的药物或制剂中的应用。
优选地，所述Smoothened基因介导的疾病包括免疫炎症性疾病或肿瘤性疾病。
优选地，所述免疫炎症性疾病包括类风湿关节炎、骨关节炎或炎症性肠病中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述肿瘤性疾病包括非小细胞肺癌、基底细胞癌、髓母细胞瘤、急性髓系白血病或横纹肌肉瘤中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、崩解剂、粘合剂、调味剂、润滑剂、着色剂或乳化剂中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊、冲剂或散剂。
优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、雾化吸入或涂抹。
优选地，所述注射包括静脉注射、肌肉注射或关节腔注射。
第四方面，本发明提供了一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的抑制Smoothened基因表达的方法，所述抑制Smoothened基因表达的方法包括将第一方面所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA转染到细胞内。
优选地，所述细胞包括表达Smoothened基因的哺乳动物细胞，优选为人细胞或小鼠细胞。
优选地，所述细胞来源于肺脏、滑膜、肝脏或皮肤。
优选地，所述细胞为肺癌细胞或成纤维样滑膜细胞，优选为人非小细胞肺癌细胞(A549细胞)或类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS细胞)。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明中的抑制Smoothened基因表达的siRNA可以有效抑制Smoothened基因的表达，并且可对其进行进一步修饰，经化学修饰的siRNA分子具有高稳定性、高特异性及高抑制活性，并可以降低免疫原性；经胆固醇修饰的siRNA分子在保持了较高的抑制活性和稳定性的同时，还具有较好的促进细胞内吞的能力，无需转染试剂即可进入靶细胞和靶组织，进一步提升了其对Smoothened基因的抑制效果，并且避免了因使用转染试剂带来的负性影响；
(2)本发明中的抑制Smoothened基因表达的siRNA具有良好的稳定性，因此可以选择多种给药方式，如经关节腔注射的局部给药方式，可以克服循环清除，延长药物半衰期，并降低其对其他器官或组织的影响，并且可以减少siRNA分子的使用量，从而达到减轻毒性和降低成本的目的；灵活的给药方式使之成为活体能够施用的有效药物，为靶向治疗提供了可能。
附图说明
图1是本发明提供的抑制Smoothened基因表达的siRNA对A549细胞SmoothenedmRNA干扰效果的结果图片；
图2是本发明提供的抑制Smoothened基因表达的siRNA对RA-FLS细胞SmoothenedmRNA干扰效果的结果图片；
图3是本发明提供的化学修饰后的抑制Smoothened基因表达的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片；
图4是本发明中化学修饰对siRNA血清稳定性影响的结果图片；
图5是本发明提供的胆固醇修饰的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片，其中，A图为胆固醇修饰的siRNA-29对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片，B图为胆固醇修饰的siRNA-30对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片；
图6是本发明提供的胆固醇修饰的siRNA-29对RA-FLS细胞增殖能力影响的结果图片(比例尺＝50μm)；
图7是本发明提供的胆固醇修饰的siRNA-29对RA-FLS细胞迁移能力影响的结果图片(比例尺＝200μm)；
图8是本发明提供的各组CIA小鼠关节炎评分的统计结果图片；
图9是本发明提供的各组CIA小鼠后爪Micro-CT检测的结果图片(比例尺＝2mm)；
图10是本发明提供的各组CIA小鼠后爪关节病理评估的结果图片(比例尺＝400μm)；
图11是本发明提供的各组CIA小鼠主要脏器HE染色的结果图片(比例尺＝100μm)。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1人源抑制Smoothened基因表达的siRNA的设计合成
本实施例根据siRNA设计的法则和规律，结合在线siRNA设计软件辅助设计出抑制Smoothened基因表达的siRNA，通过大量实验筛选出多条高效抑制Smoothened基因表达的siRNA。
通过美国国立生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，简称NCBI)的Genbank数据库，获取人源Smoothened mRNA的全长序列(序列号：NM_005631.5)。利用DNAMAN软件寻找mRNA进化保守区序列，通过Mfold、RNAstructure软件预测mRNA序列的二级结构，依据siRNA设计原则，如控制GC含量为35％～55％、避免连续单一序列降低双链内在稳定性、避免反向重复序列引起发夹状结构、避开二级结构复杂的mRNA作用位点等要求，使用BLOCK-iTTMRNAi Designer、siRNA Wizard、siDESIGN、siDirect等在线开放siRNA设计软件，选择Smoothened mRNA序列中基因编码区(coding sequences，简称CDS)的不同位点设计出多对抑制Smoothened基因表达的siRNA序列，挑选在不同设计软件中重复率高的siRNA作为候选siRNA用于后续进一步细胞生物学实验筛选。
最终共筛选出8对抑制Smoothened基因表达的siRNA，全部均能靶向靶基因的所有转录本，同时利用NCBI上的Basic Local Alignment Search Tool(简称BLAST)对目标序列进行比对同源性检索，发现均与其他非靶标基因序列有最低的同源性，避免了非特异性抑制的发生。此外，在末端设计悬挂碱基dTdT，以增加siRNA的稳定性。同时合成一条通用阴性对照siRNA，上述siRNA的序列如表1所示，其中，设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。
表1人源的抑制Smoothened基因表达的siRNA和阴性对照siRNA(si-NC)
实施例2人鼠共源抑制Smoothened基因表达的siRNA的设计合成
为了后续进一步通过小鼠等动物实验验证siRNA作用效果，因此需设计合成人鼠同源抑制Smoothened基因表达的siRNA。通过NCBI数据库，获取人源Smoothened mRNA的全长序列(序列号：NM_005631.5)和小鼠源Smoothened mRNA的全长序列(序列号：NM_176996.4)。
利用DNAMAN软件寻找人鼠Smoothened mRNA同源部分，将两者相同的CDS部分输入在线开放siRNA设计软件进行序列设计，并利用NCBI上的BLAST序列相似搜索程序对目标序列进行比对，共筛选4对人鼠共源的抑制Smoothened基因表达的siRNA。此外，在末端设计悬挂碱基dTdT，以增加siRNA的稳定性。上述siRNA的序列如表2所示。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。
表2人鼠共源的抑制Smoothened基因表达的siRNA
实施例3抑制Smoothened基因表达的siRNA对A549细胞Smoothened mRNA的干扰效果
抑制Smoothened基因表达的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成，A549细胞来源于实验室既往液氮冻存。
具体实验步骤如下：
(1)A549细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取6～10代的A549细胞，消化计数后，按每个孔为5×104个细胞的密度，接种于24孔培养板中，培养24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、转染试剂对照组(Mock Control)、阴性对照组(Negative Control，si-NC)和各抑制Smoothened基因表达的siRNA组(共12个样品)，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)根据LipofectamineTM3000(Lipo3000)转染试剂操作指南进行转染，转染的si-NC及各抑制Smoothened基因表达的siRNA的终浓度为50nM。
(4)转染并孵育48h后，向各孔细胞中加入Trizol，吹打混匀，转移至EP管中使细胞充分裂解；加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总RNA；所得RNA溶于40μL无RNA酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组RNA的含量和纯度；以1μg总RNA为模板，按照iScriptTMcDNA Synthesis Kit操作合成cDNA，并按照iQTM Green Supermix使用说明，以GAPDH基因作为内参基因，进行目标基因Smoothened mRNA的定量qPCR检测。
实验结果如图1所示。图1为抑制Smoothened基因表达的siRNA对A549细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片。结果显示，12个siRNA在不同程度上都能对A549细胞的Smoothened mRNA有干扰效果，其中siRNA-2、siRNA-5和siRNA-10效果最好，经过转染后Smoothened mRNA平均表达量分别只有18.0％、15.2％和23.0％。
实施例4抑制Smoothened基因表达的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA的干扰效果
抑制Smoothened基因表达的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成，RA-FLS细胞来源于实验室既往液氮冻存。
具体实验步骤如下：
(1)RA-FLS培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取3～5代的RA-FLS细胞，消化计数后，按每个孔为5×104个细胞的密度，接种于12孔培养板中，培养24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、转染试剂对照组(Mock Control)、阴性对照组(NegativeControl，si-NC)和各抑制Smoothened基因表达的siRNA组(共12个样品)，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)根据LipofectamineTM3000(Lipo3000)转染试剂操作指南进行转染，转染的si-NC及各抑制Smoothened基因表达的siRNA的终浓度为50nM。
(4)转染并孵育48h后，向各孔细胞中加入Trizol，吹打混匀，转移至EP管中使细胞充分裂解；加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总RNA；所得RNA溶于20μL无RNA酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组RNA的含量和纯度；以1μg总RNA为模板，按照iScriptTMcDNA Synthesis Kit操作合成cDNA，并按照iQTM Green Supermix使用说明，以GAPDH基因作为内参基因，进行目标基因Smoothened mRNA的定量qPCR检测。
实验结果如图2所示。图2为抑制Smoothened基因表达的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片。结果显示，12个siRNA在不同程度上都能对RA-FLS细胞的Smoothened mRNA有干扰效果，其中siRNA-5和siRNA-10效果最好，经过转染后Smoothened mRNA平均表达量分别只有18.1％和15.4％。
综合实施例3及实施例4的结果，可知siRNA-5和siRNA-10在A549细胞及RA-FLS细胞中均有显著的干扰效果。考虑到后续生物学实验及小鼠动物体内实验需求，选择siRNA-10进行下一步的化学修饰。根据siRNA-10序列，可知其靶序列为人源Smoothened mRNA(NM_005631.5)第1202～1220位的AGGACATGCACAGCTACAT(SEQ ID No.27)，查密码子表可知对应的氨基酸序列为第228～234位的QDMHSYI(SEQ ID No.28)；在鼠源Smoothened mRNA(NM_176996.4)中靶序列为第1209～1227位，对应的氨基酸序列为第232～238位，均有效避开了已知的Smoothened耐药突变位点。
实施例5化学修饰siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA的干扰效果
对寡核苷酸进行不同类型及不同程度的化学修饰有助于改善siRNA性能，如提高其对核糖核酸酶的抗性、提高稳定性、延长持续作用时间、保持较高的RNAi抑制活性、促进宿主细胞摄取以及提升干扰效果等。结合上述实施例中的前期筛选，对siRNA-10进行了不同的化学修饰组合以改善其性能。其中，化学修饰包括核糖2’-O-甲基修饰(2’-OMe)、核糖2’-氟修饰(2’-F)、磷酸化修饰以及胆固醇修饰等，修饰种类如表3所示，siRNA-10及对其进行化学修饰后的siRNA如表4所示。
表3 siRNA修饰种类
| 序号 | 修饰名称 | 修饰部位 | 表示方式 |
| 1 | 2’-O-甲基(2’-OMe) | 核糖或者脱氧核糖 | mA |
| 2 | 2’-氟(2’-F) | 核糖或者脱氧核糖 | fA |
| 3 | 磷酸化(phosphate) | 5’-末端 | p-A |
| 4 | 胆固醇(cholesterol) | 3’-末端 | A-chol |
表4 siRNA-10及对其化学修饰后的siRNA各链的序号及对应结构
具体实验步骤如下：
(1)RA-FLS培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取3～5代的RA-FLS细胞，消化计数后，按每个孔为5×104个细胞的密度，接种于12孔培养板中，培养24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、转染试剂对照组(Mock Control)、阴性对照组(NegativeControl，si-NC)和各抑制Smoothened基因表达的siRNA组(共16个样品)，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)根据LipofectamineTM3000(Lipo3000)转染试剂操作指南进行转染，转染的si-NC及各抑制Smoothened基因表达的siRNA的终浓度为50nM。
(4)转染并孵育48h后，向各孔细胞中加入Trizol，吹打混匀，转移至EP管中使细胞充分裂解；加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总RNA；所得RNA溶于20μL无RNA酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组RNA的含量和纯度；以1μg总RNA为模板，按照iScriptTMcDNA Synthesis Kit操作合成cDNA，并按照iQTM Green Supermix使用说明，以GAPDH基因作为内参基因，进行目标基因SMO mRNA的定量qPCR检测。
实验结果如图3所示。图3为化学修饰后的抑制Smoothened基因表达的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片。结果显示，16个siRNA在不同程度上都能对RA-FLS细胞的Smoothened mRNA有干扰效果，其中siRNA-15和siRNA-16效果最好，经过转染后Smoothened mRNA平均表达量分别只有16.2％和11.2％。
为进一步评估化学修饰对siRNA稳定性的影响，对上述siRNA分子进行了血清稳定性检测实验，具体实验步骤如下：
(1)将表4中17个siRNA分子经无RNA酶水稀释至20μM后，加入等体积的人血清混匀，在37℃环境中孵育。
(2)分别在0h、0.25h、0.5h、0.75h、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h各时间点，等量取样后，立即置于-80℃冰箱保存，待各时间点样品收集完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳实验，检测各siRNA在不同时间点的完整性。
实验结果如图4所示。图4为化学修饰对siRNA血清稳定性影响的结果图片。结果表明，在siRNA核苷酸序列完全一致的情况下，未经修饰的siRNA-10在3h后已明显降解，而各化学修饰的siRNA分子至少在6h内无明显降解，部分siRNA分子甚至可维持在72h内无明显降解。
根据上述实验结果综合可知，siRNA-15和siRNA-16在RA-FLS中有显著的干扰效果，其中，结合血清稳定性检测结果表明siRNA-15及siRNA-16的稳定性适中，综合性能最优，因此选其进行后续改性实验。
siRNA分子由于具有负电荷及亲水性，因此往往需要使用转染试剂将其转染至细胞内发挥作用。但是转染试剂存在一定的负性影响，如细胞或组织毒性，阻碍了其在体内的进一步应用。因此，对siRNA正义链3’-末端共价结合胆固醇，评估是否有助于促进其穿过细胞膜进入靶细胞发挥作用，在避免使用转染试剂的前提下，能否达到相似的干扰效果。对siRNA-15及siRNA-16进一步胆固醇修饰后的siRNA结构如表5所示。
表5进一步胆固醇修饰后的siRNA各链的序号及其对应结构
具体实验步骤如下：
(1)RA-FLS培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取3～5代的RA-FLS细胞，消化计数后，按每个孔为5×104个细胞的密度，接种于12孔培养板中，培养24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、转染试剂对照组(Mock Control)、阴性对照组(NegativeControl，si-NC)、阳性对照组(Positive Control)和各浓度抑制Smoothened基因表达的siRNA组(共8个浓度梯度样品)，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)根据LipofectamineTM3000(Lipo3000)转染试剂操作指南进行转染，转染的si-NC的终浓度为50nM。而各浓度抑制Smoothened基因表达的siRNA组则不使用Lipo3000转染试剂，直接按浓度稀释至细胞培养液中。
(4)孵育48h后，向各孔细胞中加入Trizol，吹打混匀，转移至EP管中使细胞充分裂解；加入氯仿和异丙醇按照常规方法抽提细胞总RNA；所得RNA溶于20μL无RNA酶水中，核酸蛋白检测仪上测定各处理组RNA的含量和纯度；以1μg总RNA为模板，按照iScriptTMcDNASynthesis Kit操作合成cDNA，并按照iQTM Green Supermix使用说明，以GAPDH基因作为内参基因，进行目标基因Smoothened mRNA的定量qPCR检测。
实验结果如图5所示。图5中A图为胆固醇修饰的siRNA-29对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片，图5中B图为胆固醇修饰的siRNA-30对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果的结果图片。结果显示，随着浓度提高，胆固醇修饰的siRNA对RA-FLS细胞Smoothened mRNA干扰效果逐渐增强，其中，siRNA-29在400nM及更高浓度下，可达到与转染试剂转染siRNA进行干扰相同的抑制效果，并且在800nM浓度下，显著优于转染试剂效果(Smoothened mRNA平均表达量分别只有13.5％VS 31.9％)。因此选择siRNA-29进行后续体内验证实验。
实施例6 siRNA-29对RA-FLS细胞功能影响
检测细胞增殖能力的具体实验步骤如下：
(1)RA-FLS培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取3～5代的RA-FLS细胞，消化计数后，按每个孔为1×104个细胞的密度，接种于玻璃底共聚焦皿中，培养24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、阴性对照组(si-Scramble)和siRNA-29组，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)孵育48h后，弃去培养液，使用冰冻PBS洗涤细胞3次，加入预冷的4％多聚甲醛固定细胞，Triton进行细胞通透，按照Cell-LightTM EdU Apollo567 In Vitro Kit说明书指示，检测各处理组细胞增殖能力，于共聚焦显微镜下拍摄，计数EdU阳性细胞比例。
实验结果如图6所示，相对于si-Scramble组而言，siRNA-29组EdU阳性细胞比例减少，表明细胞的增殖能力受到了影响。
检测细胞迁移能力的具体实验步骤如下：
(1)RA-FLS培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，置于5％CO2、37℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，待细胞处于对数生长期且状态良好时，用0.25％的胰蛋白酶消化传代。
(2)取3～5代的RA-FLS细胞，消化计数后，按每个孔为5×104个细胞的密度，接种于12孔培养板中，待24h后细胞密度为50％～70％时进行siRNA转染。其中，分别设置空白对照组(Blank Control)、阴性对照组(si-Scramble)和siRNA-29组，各组均设3个平行孔进行生物学重复。
(3)孵育48h后，胰酶消化收集细胞，DMEM重悬后，进行细胞计数，按照2×105个/mL的细胞密度，吸取100μL加至Transwell小室的上室，置于培养箱里静置12h。
(4)取出小室，4％多聚甲醛固定15min，结晶紫染色15min，显微镜下随机选取5个视野，计数穿膜细胞数。
实验结果如图7所示，相对于si-Scramble组而言，siRNA-29组穿过膜的细胞数明显减少，表明细胞的迁移能力受到了影响。
实施例7 siRNA-29对胶原诱导关节炎小鼠模型治疗效果
采用牛II型胶原诱导DBA/1小鼠形成的胶原诱导关节炎模型作为疾病模型，这种模型与人类类风湿性关节炎的病理过程十分相似，是进行药物开发的经典模型。实验步骤具体如下：
将24只7～8周龄DBA/1小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限责任公司)随机分为4组，分别为Normal组、CIA组、si-Scramble组及SMO siRNA-29组，每组6只小鼠。其中，CIA组、si-Scramble组及SMO siRNA-29组在第0天使用牛II型胶原/弗氏完全佐剂进行初次免疫，在第21天使用牛II型胶原/弗氏非完全佐剂进行加强免疫，而Normal组则在第0及第21天均使用生理盐水进行尾根部皮内注射作为对照。
从第7天起至第63天，每7天采用微量注射器对各组小鼠双侧踝关节进行注射，其中，Normal组及CIA组注射生理盐水作为对照，si-Scramble组注射溶解于等量生理盐水的si-Scramble作为阴性对照，SMO siRNA-29组注射溶解于等量生理盐水的siRNA-29作为实验组。
关节腔注射相应药物后，从第21天开始，每3天对小鼠四个爪子肿胀情况进行分别评分：0分，正常；1分：轻度但明确的踝/腕关节红肿，或个别(不考虑数目)指头明显红肿；2分：踝/腕关节中度红肿；3分：整个脚掌包括指头严重红肿；4分：累及肢体多个关节的最大程度炎症。对四个爪子分别进行评分后，累计相加为关节炎评分。
第63天脊髓离断处死小鼠，取各组小鼠肝脏、肾脏、脾脏、肺脏及心脏，经多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片并进行HE染色，评估各组给药方案对小鼠体内脏器的影响。与此同时，取各组小鼠双侧后爪，通过Micro-CT检测评估关节骨破坏程度；经多聚甲醛固定后，EDTA溶液脱钙，进行常规石蜡包埋切片，按试剂盒说明完成HE染色、番红O-固绿染色、TRAP染色以及免疫组化染色检测Smoothened及GLI1表达水平，对各组小鼠后爪关节进行观测评估。
小鼠动物实验结果如图8、图9、图10和图11所示。图8为各组CIA小鼠关节炎评分的统计结果图片。如图8所示，与Normal组相比，CIA组小鼠关节炎进展迅速，整体炎症程度高，经si-Scramble治疗后无明显改善，但SMO siRNA-29组关节炎进展缓慢，且疾病程度轻，显著延缓了CIA小鼠的疾病评分进展。图9为各组CIA小鼠后爪Micro-CT检测的结果图片。与对照组相比，SMO siRNA-29组后爪骨破坏程度明显减轻。图10为各组CIA小鼠后爪关节病理评估的结果图片。如图10所示，Normal组小鼠关节结构正常，无明显滑膜增生，软骨平滑，骨组织完整，未见成熟破骨细胞出现；CIA组小鼠关节破坏严重，滑膜增生，炎症细胞大量浸润，软骨破坏严重，骨侵蚀明显，可见大量成熟破骨细胞出现；si-Scramble组与CIA组相比无明显改变，关节病理可见关节破坏严重；SMO siRNA-29组与si-Scramble组相比，滑膜增生减缓，软骨破坏及骨侵蚀程度减轻，成熟破骨细胞数量减少，在一定程度上，明显延缓了胶原诱导关节炎模型关节炎症的进展。图11为各组CIA小鼠主要脏器HE染色的结果图片。如图11所示，通过对各组小鼠的主要脏器进行HE染色评估，未见各处理组间存在明显的器官毒性及药物副作用。
因此，综合实施例7各实验结果，表明siRNA-29可以显著减缓CIA小鼠的疾病评分进展，减轻滑膜炎症，降低软骨破坏及骨侵蚀程度，而且没有明显的器官毒性及药物副作用，是潜在的类风湿关节炎的病情缓解及治疗药物。
综上所述，本发明提供了12对能够抑制Smoothened基因表达的siRNA，通过实验证明，上述siRNA可有效抑制Smoothened基因表达，且可以通过化学修饰提高siRNA分子的稳定性，再经胆固醇修饰促进细胞的内吞能力，可用于制备预防和治疗Smoothened基因介导的疾病的药物或者制剂。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广州市丹树生物科技有限责任公司，中山大学附属第六医院
<120> 一种抑制Smoothened基因表达的siRNA及其应用
<130> 2022
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
cuacgucaau gcgugcuuc 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaagcacgca uugacguag 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgucaaugcg ugcuucuuu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaagaagcac gcauugacg 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgaggaguca ugacucugu 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
acagagucau gacuccucg 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
ugacucuguu cuccaucaa 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
uugauggaga acagaguca 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
ucuuugucau cguguacua 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
uaguacacga ugacaaaga 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
ugcccaagug ugagaauga 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
ucauucucac acuugggca 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
ucgcuacccu gcuguuauu 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
aauaacagca ggguagcga 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
gccacuucua cgacuucuu 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 16
aagaagucgu agaaguggc 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
caugcccaag ugugagaau 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 18
auucucacac uugggcaug 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 19
aggacaugca cagcuacau 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 20
auguagcugu gcauguccu 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 21
ugggaggcua cuuccucau 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 22
augaggaagu agccuccca 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 23
gccugggcau uuuuggcuu 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 24
aagccaaaaa ugcccaggc 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 25
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 26
acgugacacg uucggagaa 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人源
<400> 27
aggacatgca cagctacat 19
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人源
<400> 28
Gln Asp Met His Ser Tyr Ile
1 5
Claims (10)
1.一种抑制Smoothened基因表达的siRNA，其特征在于，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括由一条正义链和一条反义链组成的双链RNA分子；
所述抑制Smoothened基因表达的siRNA包括siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4、siRNA-5、siRNA-6、siRNA-7、siRNA-8、siRNA-9、siRNA-10、siRNA-11或siRNA-12中的任意一种或至少两种的组合；
其中，所述siRNA-1的正义链包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA-2的正义链包括SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-3的正义链包括SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.6所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-4的正义链包括SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.8所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-5的正义链包括SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.10所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-6的正义链包括SEQ ID No.11所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.12所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA-7的正义链包括SEQ ID No.13所示的核苷酸序列，反义链包括SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-8的正义链包括SEQ ID No.15所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.16所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-9的正义链包括SEQ ID No.17所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.18所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-10的正义链包括SEQ ID No.19所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.20所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-11的正义链包括SEQ ID No.21所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.22所示的核苷酸序列；
优选地，所述siRNA-12的正义链包括SEQ ID No.23所示的核苷酸序列，反义链包括SEQID No.24所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA，其特征在于，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA中的任意一条正义链或反义链还进行了化学修饰；
优选地，所述化学修饰包括核酸骨架的硫代磷酸修饰、核酸或脱氧核酸的2’-O-甲基修饰、2’-氟修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-O-烷基修饰、2’-O-烯丙基修饰、2’-C-烯丙基修饰、2’-脱氧修饰、2’-羟基修饰、锁核酸修饰、开环核酸修饰、碱基的吲哚修饰、碱基的5’-甲基胞嘧啶修饰、碱基的5’-乙炔基尿嘧啶修饰、单链末端磷酸化修饰、单链末端胆固醇修饰、单链末端半乳糖修饰、单链末端多肽修饰、单链末端荧光探针标记修饰或配体修饰中的任意一种或至少两种的组合，优选为2’-O-甲基修饰、2’-氟修饰、单链5’-末端磷酸化修饰或单链3’-末端胆固醇修饰中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1～4任一项所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA，其特征在于，所述抑制Smoothened基因表达的siRNA的3’-末端还含有以两个超出双链互补结构的脱氧核苷组合形成的悬挂碱基；
优选地，所述悬挂碱基为dTdT。
6.权利要求1～5任一项所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA在制备预防或治疗Smoothened基因介导的疾病的药物或制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA在制备预防或治疗Smoothened基因介导的疾病的药物或制剂中的应用，其特征在于，所述Smoothened基因介导的疾病包括免疫炎症性疾病或肿瘤性疾病；
优选地，所述免疫炎症性疾病包括类风湿关节炎、骨关节炎或炎症性肠病中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述肿瘤性疾病包括非小细胞肺癌、基底细胞癌、髓母细胞瘤、急性髓系白血病或横纹肌肉瘤中的任意一种或至少两种的组合。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1～5任一项所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂、崩解剂、粘合剂、调味剂、润滑剂、着色剂或乳化剂中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊、冲剂或散剂；
优选地，所述药物组合物的给药方式包括口服、注射、雾化吸入或涂抹；
优选地，所述注射包括静脉注射、肌肉注射或关节腔注射。
10.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的抑制Smoothened基因表达的方法，其特征在于，所述抑制Smoothened基因表达的方法包括将权利要求1～5任一项所述的抑制Smoothened基因表达的siRNA转染到细胞内；
优选地，所述细胞包括表达Smoothened基因的哺乳动物细胞，优选为人细胞或小鼠细胞；
优选地，所述细胞来源于肺脏、滑膜、肝脏或皮肤；
优选地，所述细胞为肺癌细胞或成纤维样滑膜细胞，优选为人非小细胞肺癌细胞或类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞。
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