CN115261387A - 特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用。所述siRNA含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1和2、SEQ IDNO.3和4、SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10、SEQID NO.11和12、SEQ ID NO.13和14、SEQ ID NO.15和16、SEQ ID NO.17和18或者SEQ ID NO.19和20中的任意一对所示。本发明还提供了该siRNA在制备药物中的应用。本发明提供的siRNA药物组合物可有效沉默LILRB4基因表达，抑制肿瘤细胞在正常组织器官中的浸润，并增强T细胞活性。

Description

特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
免疫疗法是当前肿瘤治疗领域最具前景的方向之一，然而临床上该疗法的响应率较低，仅为10-30％；肿瘤组织中T细胞活性被抑制是免疫疗法临床失败的重要原因。已有研究发现，白细胞免疫球蛋白样受体B4(Leukocyte immunoglobulin-like receptor B4，LILRB4)是白细胞Ig样受体(LILRs)的成员，在生理条件下，LILRB4通过在T细胞和浆细胞等多种免疫细胞上的表达，在免疫系统的功能中起着非常重要的作用。在病理条件下，LILRB4通过多种信号通路影响各种疾病的进程，如肿瘤和白血病的转化和浸润。
高表达LILRB4的肿瘤细胞通过ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号轴支持肿瘤细胞浸润到正常组织中，同时抑制T细胞活性。阻断LILRB4信号传导可以限制肿瘤的发展，并激活T细胞活性。因此，LILRB4是治疗肿瘤的重要靶点。
siRNA药物是最具战略前景的生物制药技术之一，近年来其获批上市的速度呈加速趋势，目前已有四款siRNA药获得FDA批准，分别是Alnylam公司的Onpattro、Givlaari、Oxlumo及Leqvio，且预计在未来几年里将会有更多siRNA药物进入市场。siRNA药物可从mRNA水平阻止致病蛋白的表达，具有效率高、特异性好及长效等优势。
但是，目前尚无利用RNA干扰技术(RNA interfering，RNAi)抑制LILRB4表达、阻止组织肿瘤细胞浸润到组织并增强T细胞活性的研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用，该siRNA的序列稳定性高，可有效沉默人LILRB4基因的表达，阻断ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路，阻止肿瘤细胞浸润并增强T细胞活性。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，所述siRNA含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20中的任意一对所示。
优选地，所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述正义链和/或所述反义链的至少一个核苷酸的核糖基上引入核糖修饰，所述正义链和/或所述反义链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基的至少一个为具有修饰基团的磷酸酯基。
优选地，所述核糖修饰为甲氧基修饰或氟代修饰，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
优选地，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；其中，所述氟代修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被氟取代而形成的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
优选地，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
本发明第二方面提供前述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞中LILRB4基因表达的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
本发明第三方面提供前述的siRNA在制备用于阻断肿瘤细胞中ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
本发明第四方面提供前述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞在正常组织中浸润的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
本发明第五方面提供前述的siRNA在制备用于增强肿瘤病灶处T细胞活性的药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为人白血病。
优选地，所述人白血病为人急性髓系白血病。
优选地，所述人急性髓系白血病为人M4或M5亚型急性髓系白血病。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明根据人LILRB4编码基因设计并合成siRNA，该siRNA不仅具有良好的稳定性，而且具有较高的基因抑制活性，能够有效抑制人急性髓系白血病THP-1细胞中LILRB4的mRNA与蛋白的表达；本发明提供的siRNA可进一步阻断ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路，从而阻止肿瘤细胞向正常组织浸润，同时提高T细胞活性。因此，本发明的siRNA在制备白血病治疗的药物制剂方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是实施例2中十对经稳定化修饰的siRNA对人白血病中LILRB4mRNA的表达水平的抑制率关系图；
图2是实施例4中经稳定化修饰的siLILRB4(4)和未修饰的siRNA-4的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3是实施例7中PBS对照组、PNP-siNC组和PNP-siLILRB4组处理后的小鼠Luciferase发光情况检测图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
需要解释的是，在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示核苷酸的碱基组成；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯基连接。所述“氟代修饰的核苷酸”指的是核苷酸的核糖基上2’-羟基被氟取代形成的核苷酸，所述“甲氧基修饰的核苷酸”指的是核苷酸的核糖基上2’-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
本发明中，需要说明的是，“反向互补”具有本领域技术人员周知的含义，即在双链核酸分子中，一条链的碱基与另一条链上的碱基以反向的、互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(G)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(C)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶，当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。
本发明第一方面提供一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，所述siRNA含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别为如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20中的任意一对所示。
根据本发明，siRNA以核苷酸作为基本结构单元，本领域技术人员公知，所述核苷酸含有磷酸、核糖和碱基。
根据本发明，siRNA正义链的核苷酸序列长度为19个核苷酸，siRNA反义链的核苷酸序列长度为21个核苷酸，且siRNA反义链从5’末端开始的19个核苷酸与相应的siRNA正义链的19个核苷酸完全反向互补；此时，siRNA反义链的3’末端连接有2个额外的核苷酸，从而在siRNA反义链互补配对后形成由2个核苷酸构成的3’突出端。
具体地，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
SEQ ID NO.1：5’-GGAGAUACCGCUGUUACUA-3’，
SEQ ID NO.2：5’-UAGUAACAGCGGUAUCUCCCU-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
SEQ ID NO.3：5’-GGGAGUACCGUCUGGAUAA-3’，
SEQ ID NO.4：5’-UUAUCCAGACGGUACUCCCGA-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
SEQ ID NO.5：5’-GUGAAACACUCCAGACCUA-3’，
SEQ ID NO.6：5’-UAGGUCUGGAGUGUUUCACCU-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
SEQ ID NO.7：5’-GAGGACAGACAGAUGGACA-3’，
SEQ ID NO.8：5’-UGUCCAUCUGUCUGUCCUCUU-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
SEQ ID NO.9：5’-GAGUCCUCUUGUGACCUCA-3’，
SEQ ID NO.10：5’-UGAGGUCACAAGAGGACUCGG-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
SEQ ID NO.11：5’-GAGACAGGCUGAUUUCCAA-3’，
SEQ ID NO.12：5’-UUGGAAAUCAGCCUGUCUCUG-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
SEQ ID NO.13：5’-GGGUCUUGGUGGUCUCCAU-3’，
SEQ ID NO.14：5’-AUGGAGACCACCAAGACCCCG-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
SEQ ID NO.15：5’-CAAGGCCAGAUUCUCCAUC-3’，
SEQ ID NO.16：5’-GAUGGAGAAUCUGGCCUUGUU-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
SEQ ID NO.17：5’-CAUCCCCUACUGCAUCUGA-3’，
SEQ ID NO.18：5’-UCAGAUGCAGUAGGGGAUGGG-3’；
或者，siRNA正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，siRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
SEQ ID NO.19：5’-CCUGGAGCUCAUAGUCUCA-3’，
SEQ ID NO.20：5’-UGAGACUAUGAGCUCCAGGGG-3’。
根据本发明，特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA的设计方法包括如下步骤：
(1)在人LILRB4基因组中选择序列保守的编码基因作为siRNA的靶标；
(2)综合利用多种siRNA设计软件生成抗LILRB4的待选siRNA；
(3)对待选siRNA的序列进行同源分析，排除siRNA的非特异性抑制情况，最终选择两个或两个以上软件设计的siRNA重合或位置相近的siRNA序列，筛选出理论上高效的siRNA。
根据本发明，进一步优选地，siRNA的所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
根据本发明，siRNA的设计过程还包括对siRNA的正义链和/或反义链进行稳定化修饰，以基因抑制率和稳定性为指标，筛选出最优的siRNA分子。
根据本发明，所述正义链和/或所述反义链的至少一个核苷酸的核糖基上引入核糖修饰。优选情况下，正义链和反义链的每一个核苷酸的核糖基上均引入核糖修饰。
根据本发明，所述核糖修饰为甲氧基修饰或者氟代修饰，发明人发现，在该优选的具体实施方式下，siRNA能够获得稳定性和基因表达抑制效率的高度平衡。
根据本发明，所述氟代修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被氟取代而形成的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
具体地，本发明提供的siRNA为具有以下修饰的siRNA：按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸。
根据本发明，所述正义链和/或所述反义链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基的至少一个为具有修饰基团的磷酸酯基。优选情况下，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。发明人发现，在该优选的具体实施方式下，硫代磷酸修饰能够有效稳定siRNA的双链结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
根据本发明，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
具体地，正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，以及反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间均具有修饰基团的磷酸酯基。
根据本发明，siRNA的修饰可以通过使用具有相应修饰的核苷单体来将修饰的核苷酸基团引入相应的siRNA中，其中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法及将修饰的核苷酸基团引入siRNA的方法可采用本领域常规的方法，相应修饰的核苷单体均可以商购得到或者采用已知方法制备得到。
基于前述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，本发明第二方面提供前述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞中LILRB4基因表达的药物中的应用。
根据本发明，抑制肿瘤细胞中LILRB4基因表达的方法，包括将有效量的上述siRNA和/或药物给予有需要的受试者。给予siRNA和/或药物的方式可采用本领域已知的任何合适的途径，包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，如静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药、肺部给药、鼻部给药、直肠给药和局部给药。siRNA和/或药物的使用剂量可为本领域常规的剂量，可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。
根据本发明，优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
本发明第三方面提供前述的siRNA在制备用于阻断肿瘤细胞中ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路的药物中的应用。
根据本发明，优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
根据本发明，阻断肿瘤细胞中ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路的方法，包括将有效量的上述siRNA和/或药物给予有需要的受试者。
本发明第四方面提供前述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞在正常组织中浸润的药物中的应用。
根据本发明，抑制肿瘤细胞向正常组织浸润的方法，包括将有效量的上述siRNA和/或药物给予有需要的受试者。
根据本发明，优选地，所述肿瘤细胞为人白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人白血病细胞为人急性髓系白血病细胞。
根据本发明，优选地，所述人急性髓系白血病细胞为人M4或M5亚型急性髓系白血病细胞。
本发明第五方面提供前述的siRNA在制备用于增强肿瘤病灶处T细胞活性的药物中的应用。
根据本发明，增强肿瘤病灶处T细胞活性的方法，包括将有效量的上述siRNA和/或药物给予有需要的受试者。
根据本发明，优选地，所述肿瘤为人白血病。
根据本发明，优选地，所述人白血病为人急性髓系白血病。
根据本发明，优选地，所述人急性髓系白血病为人M4或M5亚型急性髓系白血病。
基于前述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA的应用，本发明前述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA能够用于制备治疗肿瘤的药物，该药物为含有前述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA的药物组合物。
根据本发明，药物组合物还含有药学上可接受的载体和/或药学上可接受的其它辅料。所述药学上可接受的载体可以是siRNA给药领域常规使用的载体，例如但不限于脂质体、纳米囊泡、聚合物、磁性纳米粒、碳纳米管、介孔硅、磷酸钙纳米粒等；辅料可以为本领域常规采用的各种制剂或化合物的一种或多种，例如，pH缓冲液、保护剂、渗透压调节剂等。
根据本发明，所述药物组合物中，对siRNA和药学上可接受的载体、辅料的含量没有特别的要求，能够使得siRNA发挥相应的药学作用即可。所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，人急性髓系白血病细胞THP-1、THP-1-Luc以及人T淋巴细胞购自中国医学科学院基础医学研究所，转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司、货号为11668019，逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司、货号为R323-01，CFDA-S细胞增殖与示踪检测试剂盒、PCR反应体系的试剂以及CFSE染料购自翌圣生物科技股份有限公司、货号分别为40714ES76、11201ES03，BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司、货号为CW0014，NTG小鼠购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，Luciferase底物购自普洛麦格生物(北京)生物技术有限公司、货号为E1501，其余试剂均为常规的市售品。
以下实施例中，在没有特别说明的情况下，所述室温为25±5℃。
实施例1siRNA序列的设计与合成
(1)根据生物信息学方法在Genebank中获取人LILRB4基因的mRNA序列(GenebankID:NM_001278427.3)，选择序列保守的编码基因作为siRNA的靶标；
(2)根据siRNA设计原则，利用siDESIGN Center软件(https://horizondiscovery.com/products/tools/siDESIGN-Center)、siDirect软件(http://sidirect2.rnai.jp/)、DSIR(http://www.bioinfo.ensmp.fr/dsir/)、GenScript siRNATarget Finder软件(https://www.genscript.com/tools/sirna-target-finder)及Block-iT RNAi Designer软件(https://rnaidesigner.invitrogen.com/rnaiexpress/setOption.do？designOption＝sir na)等siRNA在线设计软件生成抗LILRB4的待选siRNA序列；
(3)根据siRNA的设计原则，对序列进行同源分析，排除siRNA的非特异性抑制情况，最终选择两个或两个以上软件设计的siRNA重合或位置相近的siRNA序列，得到十对siRNA设计序列，其序列信息如下：
siRNA-1设计序列
正义链(SEQ ID NO.1)：5’-GGAGAUACCGCUGUUACUA-3’，
反义链(SEQ ID NO.2)：5’-UAGUAACAGCGGUAUCUCCCU-3’；
siRNA-2设计序列
正义链(SEQ ID NO.3)：5’-GGGAGUACCGUCUGGAUAA-3’,
反义链(SEQ ID NO.4)：5’-UUAUCCAGACGGUACUCCCGA-3’；
siRNA-3设计序列
正义链(SEQ ID NO.5)：5’-GUGAAACACUCCAGACCUA-3’，
反义链(SEQ ID NO.6)：5’-UAGGUCUGGAGUGUUUCACCU-3’；
siRNA-4设计序列
正义链(SEQ ID NO.7)：5’-GAGGACAGACAGAUGGACA-3’，
反义链(SEQ ID NO.8)：5’-UGUCCAUCUGUCUGUCCUCUU-3’；
siRNA-5设计序列
正义链(SEQ ID NO.9)：5’-GAGUCCUCUUGUGACCUCA-3’，
反义链(SEQ ID NO.10)：5’-UGAGGUCACAAGAGGACUCGG-3’。
siRNA-6设计序列
正义链(SEQ ID NO.11)：5’-GAGACAGGCUGAUUUCCAA-3’，
反义链(SEQ ID NO.12)：5’-UUGGAAAUCAGCCUGUCUCUG-3’；
siRNA-7设计序列
正义链(SEQ ID NO.13)：5’-GGGUCUUGGUGGUCUCCAU-3’,
反义链(SEQ ID NO.14)：5’-AUGGAGACCACCAAGACCCCG-3’；
siRNA-8设计序列
正义链(SEQ ID NO.15)：5’-CAAGGCCAGAUUCUCCAUC-3’，
反义链(SEQ ID NO.16)：5’-GAUGGAGAAUCUGGCCUUGUU-3’；
siRNA-9设计序列
正义链(SEQ ID NO.17)：5’-CAUCCCCUACUGCAUCUGA-3’，
反义链(SEQ ID NO.18)：5’-UCAGAUGCAGUAGGGGAUGGG-3’；
siRNA-10设计序列
正义链(SEQ ID NO.19)：5’-CCUGGAGCUCAUAGUCUCA-3’，
反义链(SEQ ID NO.20)：5’-UGAGACUAUGAGCUCCAGGGG-3’。
上述十对siRNA设计序列由苏州贝信生物技术有限公司合成，对siRNA设计的正义链和反义链进行稳定化修饰，包括：按照5'末端到3'末端的方向，正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，反义链的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，以及反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间，3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间、第2个核苷酸和第3个核苷酸之间均具有修饰基团的磷酸酯基。
修饰后的siRNA序列信息如表1所示：
表1
Figure BDA0003677740210000141
Figure BDA0003677740210000151
实施例2基因沉默效率验证
(1)细胞培养：人急性髓系白血病细胞THP-1接种至含10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的1640培养基中，在温度为37℃、CO2含量为5％体积的饱和湿度环境中进行培养。
(2)荧光定量PCR考察LILRB4的mRNA表达水平
将步骤(1)中培养获得的人急性髓系白血病细胞THP-1以2×105/孔接种于6孔板中，在温度为37℃、CO2含量为5％体积的培养箱中过夜培养；将培养基换成opti-MEM培养基，将实施例1中表1所示的十对siRNA，即siLILRB4(1)、siLILRB4(2)、siLILRB4(3)、siLILRB4(4)、siLILRB4(5)、siLILRB4(6)、siLILRB4(7)、siLILRB4(8)、siLILRB4(9)、siLILRB4(10)，分别按照转染试剂Lipofectamine 2000说明书进行转染，siRNA终浓度为50nM，最后收集细胞，用预冷PBS洗3遍，加入trizol提取总RNA；
采用逆转录试剂盒将每组细胞的总RNA逆转录为cDNA，具体操作如下，首先配制下列反应体系以去除基因组DNA，即4×g DNA wiper Mix：4.0μL；Total RNA：1000ng，无核酸酶水加至16μL，混匀后获得的混合物于42℃孵育2min，然后将5×qRT SuperMix II：4μL加入上述的混合物中，混匀后，于50℃孵育15min，85℃孵育5sec，即可；
逆转录完成后，配制PCR反应体系：
Figure BDA0003677740210000161
qPCR
Figure BDA0003677740210000162
Green Master Mix：10μL；PCR Forward Primer(10μM)：0.5μL；PCR Reverse Primer(10μM)：0.5μL；cDNA模板：1μL；无核酸酶水加至20μL；
PCR所用的引物序列如下：
LILRB4基因：
上游(SEQ ID NO.21)：5’-CCTACAGTAAACCCACCCTTTCA-3’，
下游(SEQ ID NO.22)：5’-GATCTCAGATGCAGTAGGGGATG-3’；
GAPDH基因
上游(SEQ ID NO.23)：5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，
下游(SEQ ID NO.24)：5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’；
PCR循环的程序为：①95℃，5min，1cycle；②95℃，10s，40cycle；③55℃，20s，40cycle；④72℃，20s，40cycles；⑤95℃，1s，1cycle。
以GAPDH基因为内参，采用PCR仪检测LILRB4基因及GAPDH基因的Ct值，最后将空白处理组(Mock)设为对照，以对照组细胞中LILRB4mRNA的表达量为100％，计算出每组细胞中LILRB4 mRNA的相对百分含量，结果见图1。
如图1所示，十对经稳定化修饰的siRNA(siLILRB4(1)、siLILRB4(2)、siLILRB4(3)、siLILRB4(4)、siLILRB4(5)、siLILRB4(6)、siLILRB4(7)、siLILRB4(8)、siLILRB4(9)、siLILRB4(10))均能够一定程度上有效沉默LILRB4 mRNA的表达，其中，siLILRB4(4)在沉默LILRB4 mRNA的表达的效果最为明显，沉默效率为45.3％。
实施例3 Western blot考察LILRB4蛋白表达水平
利用实施例1中表1所示的十对siRNA，按照实施例2中的步骤(2)所示的方法转染人急性髓系白血病细胞THP-1，siRNA终浓度为100nM，转染结束后，用RIPA裂解液(含1重量％的苯甲基磺酰氟PMSF)裂解细胞，用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行定量；将蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂牛奶封闭，与LILRB4一抗于4℃过夜孵育，结束后用TBST缓冲液(2.42g Tris，8g NaCl，1mL吐温20溶解于1L超纯水中)洗膜，室温孵育二抗，继续用TBST缓冲液洗膜，将ECL发光液均匀地涂抹于PVDF膜后，用5200multi天能凝胶成像系统成像，用ImageJ软件对蛋白条带进行定量，定量结果见表2所示。
表2
Figure BDA0003677740210000171
Figure BDA0003677740210000181
从表2的数据可以看出，十对经稳定化修饰的siRNA均具有对LILRB4蛋白表达的抑制作用，其中，siLILRB4(4)对LILRB4蛋白表达的抑制率最高，该结果与荧光定量PCR的结果一致，因此siLILRB4(4)是更为优选的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA。
实施例4聚丙烯酰胺凝胶电泳考察siRNA稳定性
将实施例1中表1所示的经稳定化修饰的siLILRB4(4)和未修饰的siRNA-4，分别与10％胎牛血清混合后，在温度为37℃的条件下孵育2h、4h、8h、24h、48h及72h，取10μL样品于20％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，采用5200multi天能凝胶成像系统进行成像，进一步分析siRNA稳定性，结果见图2。
如图2所示，聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果表明，经稳定化修饰的siLILRB4(4)与10％胎牛血清于37℃孵育72h后均仍能被检测到，而未经修饰的siRNA-4与血清孵育2h后开始降解，表明经稳定化修饰后的siRNA稳定性得到显著提高，即在siRNA序列的核苷酸糖环上引入2’-甲氧基修饰或2’-氟代修饰，在磷酸骨架上进行硫代磷酸修饰可明显提高siRNA抵抗核酸酶的降解。
实施例5 Western blot考察LILRB4沉默后对ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路的影响
利用实施例1中表1所示的siLILRB4(4)，按照实施例2中的步骤(2)所示的方法转染人急性髓系白血病细胞THP-1，siRNA终浓度为100nM，转染结束后，用细胞核蛋白提取试剂盒提取细胞核蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行定量后，按照实施例3所述的方法进行Western blot考察，检测细胞内LILRB4及磷酸化的SHP-2(p-SHP-2)的蛋白水平，以β-微管蛋白作为内参，用ImageJ对结果进行定量，定量结果如表3所示。
表3
组别 蛋白抑制率(％)
Mock 0±1.3
p-SHP-2 31±3.0
LILRB4 46±2.6
如表3所示，与Mock组相比，包载siLILRB4(4)的脂质纳米颗粒制剂可有效抑制人急性髓系白血病THP-1细胞内LILRB4及磷酸化的SHP-2蛋白的表达水平，表明LILRB4沉默后可有效阻断ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路，降低磷酸化SHP-2蛋白水平。
实施例6流式细胞仪检测T细胞活性情况
利用实施例1中表1所示的siLILRB4(4)，按照实施例2中的步骤(2)所示的方法转染人急性髓系白血病细胞THP-1，siRNA终浓度为100nM，转染结束后，继续培养24h，得到沉默LILRB4基因的THP-1细胞(THP-1LILRB4-)；将T细胞(人T淋巴细胞)进行CFSE荧光标记，分别进行如下处理：
(1)荧光标记的T细胞(4×104个)不进行任何处理；
(2)将THP-1细胞(104个)与荧光标记的T细胞(4×104个)按照1：4的数量比进行共孵育；
(3)将THP-1LILRB4-(104个)与荧光标记的T细胞(4×104个)按照1：4的数量比进行共孵育；
处理48h后，通过流式细胞仪检测T细胞的增殖情况，定量结果如表4所示。
表4
组别 T细胞活性(％)
T 100±2.3
THP-1/T 42±1.6
THP-1<sup>LILRB4-</sup>/T 79±2.7
通过表4的数据可以看出，本发明提供的siLILRB4(4)能够有效增强肿瘤病灶处的T细胞活性。
实施例7LILRB4体内治疗急性髓系白血病
(1)包载阴性对照siRNA的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siNC)和包载siLILRB4(4)的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siLILRB4)的制备：
将A1-D1-5、DSPC、Chol、DMG-PEG-2000四个脂质组分分别溶解于无水乙醇，使各组分的终浓度为20mg/ml，按照A1-D1-5、DSPC、Chol、DMG-PEG-2000的摩尔比为54:12:60:2.5进行混匀，并匀速注入柠檬酸钠缓冲液中，随后通过与siRNA孵育，获得脂质纳米颗粒制剂(PNP-siRNA)；
其中，siRNA采用NC时，得到包载阴性对照siRNA的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siNC)，siRNA采用实施例1中表1所示的经稳定化修饰的siLILRB4(4)时，得到包载siLILRB4(4)的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siLILRB4)；
siRNA药物NCsiRNA的正义链(SEQ ID NO.25)为：
CCUUGAGGCAUACUUCAAAdTdT；
siRNA药物NC siRNA的反义链(SEQ ID NO.26)为：
UUUGAAGUAUGCCUCAAGGdTdT；
(2)急性髓系白血病细胞模型的建立：将THP-1-Luc细胞悬浮于PBS缓冲液中，按照每只NTG小鼠8×106个细胞进行尾静脉注射接种，建立人源化小鼠白血病模型；
(3)接种细胞7天后，每只小鼠腹腔注射Luciferase底物(150mg/kg)，检测发病情况；
(4)将小鼠随机分为3组，分别进行如下处理：(a)PBS对照组；(b)包载阴性对照siRNA的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siNC)组；(c)包载siLILRB4(4)的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siLILRB4)组，siRNA尾静脉给药剂量为1mg/kg，，继续治疗3周后(第28天)，再次通过Luciferase发光情况检测小鼠白血病进程，结果见图3。
如图3所示，与PBS及包载阴性对照siRNA-4的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siNC)相比，包载siLILRB4(4)的脂质纳米颗粒制剂(PNP-siLILRB4)显著抑制白血病细胞浸润，有效地阻止了白血病的进程，具有良好的应用前景。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京理工大学 天津医科大学
<120> 特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA及其应用
<130> 2022.6.2
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggagauaccg cuguuacua 19
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
uaguaacagc gguaucuccc u 21
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
gggaguaccg ucuggauaa 19
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uuauccagac gguacucccg a 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
gugaaacacu ccagaccua 19
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
uaggucugga guguuucacc u 21
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaggacagac agauggaca 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
uguccaucug ucuguccucu u 21
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaguccucuu gugaccuca 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 10
ugaggucaca agaggacucg g 21
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagacaggcu gauuuccaa 19
<210> 12
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
uuggaaauca gccugucucu g 21
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggucuuggu ggucuccau 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
auggagacca ccaagacccc g 21
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
caaggccaga uucuccauc 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
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gauggagaau cuggccuugu u 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
cauccccuac ugcaucuga 19
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<212> RNA
<213> 人工序列
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ucagaugcag uaggggaugg g 21
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<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
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ccuggagcuc auagucuca 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
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ugagacuaug agcuccaggg g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cctacagtaa acccaccctt tca 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gatctcagat gcagtagggg atg 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccuugaggca uacuucaaat t 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
uuugaaguau gccucaaggt t 21

Claims (10)

1.一种特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA含有完全反向互补的正义链和反义链，所述正义链和所述反义链的核苷酸序列分别为如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20中的任意一对所示。
2.根据权利要求1所述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，所述正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1或2所述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，所述正义链和/或所述反义链的至少一个核苷酸的核糖基上引入核糖修饰，所述正义链和/或所述反义链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基的至少一个为具有修饰基团的磷酸酯基。
4.根据权利要求3所述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，所述核糖修饰为甲氧基修饰或氟代修饰，所述具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸二酯键中的氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基。
5.根据权利要求4所述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，按照5'末端到3'末端的方向，所述正义链的第5、7、8、9位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述正义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸，所述反义链的第2、6、8、9、14、16位的核苷酸为氟代修饰的核苷酸，所述反义链中其余位置的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；其中，所述氟代修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被氟取代而形成的核苷酸，所述甲氧基修饰的核苷酸为核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。
6.根据权利要求3所述的特异性抑制LILRB4基因表达的siRNA，其特征在于，所述具有修饰基团的磷酸酯基存在于由以下位置所组成的组中的至少一处：
所述正义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述正义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；
所述反义链的5'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间；
所述反义链的3'末端端部第1个核苷酸和第2个核苷酸之间；以及
所述反义链的3'末端端部第2个核苷酸和第3个核苷酸之间。
7.权利要求1至6中任意一项所述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞中LILRB4基因表达的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤细胞为人急性髓系白血病细胞。
8.权利要求1至6中任意一项所述的siRNA在制备用于阻断肿瘤细胞中ApoE/LILRB4/SHP-2/uPAR/Arginase-1信号通路的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤细胞为人急性髓系白血病细胞。
9.权利要求1至6中任意一项所述的siRNA在制备用于抑制肿瘤细胞在正常组织中浸润的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤细胞为人急性髓系白血病细胞。
10.权利要求1至6中任意一项所述的siRNA在制备用于增强肿瘤病灶处T细胞活性的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤为人急性髓系白血病。
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