CN117070583A - 抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法 - Google Patents

抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法 Download PDF

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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes

Abstract

本发明提供了一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法。其中，该制备方法中的siRNA为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；制备方法包括：将正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合，利用RNA连接酶催化正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得正义链和反义链，从而获得此种siRNA；正义链底物能够组成正义链，反义链底物能够组成反义链；上述正义链为SEQ ID NO：45所示的核酸序列，反义链为SEQ ID NO：46所示的核酸序列。能够解决现有技术中的制备此种siRNA纯度较低的问题，适用于药物生物合成领域。

Description

抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法
技术领域
本发明涉及药物生物合成领域，具体而言，涉及一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法。
背景技术
许多疾病是由基因异常表达及突变引起的，然而这些疾病往往不能够被传统的小分子药物所治愈，有效的基因表达干预成为治疗这类疾病的唯一方法。siRNA是一种双链RNA的寡核苷酸，大小为19~21个碱基对。在生物体中，siRNA介导的RNA干扰（RNAi）所引起的基因沉默，是一种重要的基因表达调控方式，其可特异性引发靶mRNA降解，抑制基因表达。RNA干扰（RNAi）现象被发现之后，该技术迅速被科研人员应用于疾病治疗领域，使基因治疗的发展迎来了巨大的契机。该技术通过导入小干扰RNA（siRNA）特异性抑制致病靶向基因的表达，起到治疗疾病的作用。2018年，美国FDA批准用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的周围神经疾病的siRNA药物，填补了siRNA药物延伸领域的空白，为接下来siRNA药物的发展开辟了先河。目前全球由5款获批上市的siRNA疗法，随着用于治疗高胆固醇血症的siRNA药物开发，siRNA药物正在成为药物治疗的标准模式。siRNA药物一般能够从源头进行干预，具有“治标治本”的特点，靶点筛选快、治疗效率高、药物毒性低、特异性强的优点，作用持续时间可达半年之久。可实现患者一年两次的用药频率，是非常有前景的治疗方式。
siRNA的合成主要依靠亚磷酰胺法进行合成，该方法包括去保护、偶联、加帽及氧化 4 个步骤。但随着链长的延长，化学反应效率、合成纯度以及产率下降严重，该方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸（nt），同时在合成过程中会使用大量的有机溶剂，极大的增加了反应成本和三废处理的成本，同时也增加了环境污染的负担。同时在反应的过程中会产生难于去除的N+1杂质和N-1杂质，随着链长的增加杂质的产生会急剧的增多，增加了后处理的难度，极大的降低了收率。随着siRNA用于治疗常见病的普及，对siRNA的需求将会极大的增加，但目前的合成方法由于设备受限，在放大生产上由较大的难度，因此需要开发一种更加高效绿色的siRNA的合成方法。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法，以解决现有技术中的制备此种siRNA纯度较低的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的第一个方面，提供了一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法，siRNA为为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；制备方法包括：将正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合，利用RNA连接酶催化正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得正义链和反义链，从而获得此种siRNA；正义链底物能够组成正义链，反义链底物能够组成反义链，正义链为SEQ ID NO：45所示的核酸序列，反义链为SEQ ID NO：46所示的核酸序列。
进一步地，正义链的5’端为羟基，3’端为L96基团，正义链的1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第11位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶；反义链的5’端为羟基，3’端为羟基，反义链的第1、3、7、9、11和13、15、17、19、20、21、22和23位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8、10、12、14、16和18位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第21和22位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第22和23位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
进一步地，RNA连接酶包括SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：13 ~ SEQ IDNO：40所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：4~ SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：40中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
进一步地，正义链底物包括2条或更多条底物，反义链底物包括2条或更多条底物；优选地，正义链底物的长度为2-19 nt，更优选为3-17 nt，进一步优选为6-15 nt；优选地，反义链底物的长度为2-21 nt，更优选为3-19 nt，进一步优选为6-15 nt。
进一步地，正义链底物和反义链底物均包括2条底物，正义链底物包括第一正义链底物和第二正义链底物，反义链底物包括第一反义链底物和第二反义链底物；制备方法包括：将第一正义链底物、第二正义链底物、第一反义链底物和第二反义链底物混合，利用RNA连接酶催化第一正义链底物和第二正义链底物连接形成正义链，催化第一反义链底物和第二反义链底物连接形成反义链，正义链和反义链互补配对形成此种siRNA；优选地，将正义链底物和反义链底物退火后与RNA连接酶混合，获得此种siRNA。
进一步地，第一正义链底物的3’端与第二正义链底物的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物的3’端与第二反义链底物的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，第一正义链底物的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为L96基团；优选地，第一反义链底物的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
进一步地，第一正义链底物为SEQ ID NO：41所示的核酸序列，第二正义链底物为SEQ ID NO：42所示的核酸序列；或第一正义链底物为SEQ ID NO：53所示的核酸序列，第二正义链底物为SEQ ID NO：54所示的核酸序列。
进一步地，第一反义链底物为SEQ ID NO：44所示的核酸序列，第二反义链底物为SEQ ID NO：43所示的核酸序列；或第一反义链底物为SEQ ID NO：56所示的核酸序列，第二反义链底物为SEQ ID NO：55所示的核酸序列。
进一步地，正义链底物和反义链底物均包括3条底物，正义链底物包括第一正义链底物、第二正义链底物和第三正义链底物；反义链底物包括第一反义链底物、第二反义链底物和第三反义链底物；优选地，第一正义链底物为SEQ ID NO：47所示的核酸序列；第二正义链底物为SEQ ID NO：48所示的核酸序列；第三正义链底物为SEQ ID NO：49所示的核酸序列；优选地，第一反义链底物为SEQ ID NO：52所示的核酸序列；第二反义链底物为SEQ IDNO：51所示的核酸序列；第三反义链底物为SEQ ID NO：50所示的核酸序列。
进一步地，正义链底物和反义链底物的浓度为1μm-1M；优选地，RNA连接酶的浓度为0.01-10mg/mL；优选地，在正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT；优选地，制备方法的反应温度为0-40℃，更优选为15-30℃；优选地，制备方法的反应时间为0.1-48 h，更优选为12-24 h。
应用本发明的技术方案，利用上述制备方法，通过RNA连接酶催化正义链底物之间连接形成此种siRNA的正义链，催化反义链底物之间连接形成此种siRNA的反义链，从而实现利用生物合成的方式制备此种结构复杂、带有多种修饰的siRNA。相较于利用化学合成制备此种siRNA，本申请的制备方法获得的产物纯度较高、杂质少，且反应条件温和，便于实现工业化放大生产。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明实施例的此种siRNA结构示意图。
图2示出了根据本发明实施例的L96基团结构示意图。
图3示出了根据本发明实施例2的SDS-PAGE凝胶电泳结果图。
图4示出了根据本发明实施例2的液相色谱和质谱检测结果图。
图5示出了根据本发明实施例2的液相色谱和质谱检测结果图。
图6示出了根据本发明实施例6的液相色谱检测结果图。
图7示出了根据本发明实施例7的液相色谱检测结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
术语解释：
N-1杂质：相较于目标合成序列具有单个碱基缺失的核酸杂质。
N+1杂质：相较于目标合成序列具有单个碱基额外添加的核酸杂质。
如背景技术所提到的，现有技术对于此种siRNA的制备采用化学合成的方式进行，不仅使用大量有机溶剂，不符合绿色化学的发展理念，也存在制备产物纯度低、杂质多、尤其存在难以去除的N+1杂质和N-1杂质，影响后续对于产物的纯化。在本申请中发明人尝试开发一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法，利用酶催化合成此种siRNA，因而提出了本申请的一系列保护方案。
在本申请第一种典型的实施方式中，提供了一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法，其中上述siRNA为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；制备方法包括：将正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合，利用RNA连接酶催化正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得正义链和反义链，从而获得此种siRNA；正义链底物能够组成正义链，反义链底物能够组成反义链；正义链为SEQ ID NO：45所示的核酸序列，反义链为SEQ ID NO：46所示的核酸序列。
在本申请中siRNA均指正义链为SEQ ID NO：45，反义链为SEQ ID NO：46的双链RNA序列。在上述制备方法中，正义链底物为能够组成正义链的2条或更多条核苷酸序列，即正义链底物的多条核苷酸序列能够拼接形成与正义链序列相同的序列，与正义链的区别在于正义链底物之间存在缺刻，未以磷酸二酯键相连接。同理利用RNA连接酶酶将2条或更多条反义链底物之间以磷酸二酯键相连接，获得此种siRNA的反义链。
在上述制备方法中，将正义链底物、反义链底物和RNA连接酶共同混合，一锅法直接制备获得此种siRNA。在一锅法的连接中，正义链底物和反义链底物之间能够进行碱基互补配对，形成双链结构，RNA连接酶识别此种双链结构后对双链结构中存在的缺刻进行连接，从而制备获得目标产物此种siRNA。此种目标产物siRNA的结构如图1所示。利用上述制备方法制备获得的此种siRNA，包括图1所示的核酸，也包括结合有离子的核酸，包括但不限于其钠盐形式。结合在核酸上的离子不影响上述制备方法的进行，离子与核酸的结合在反应体系中能够自发地进行。
在一种优选的实施例中，正义链的5’端为羟基，3’端为L96基团，正义链的1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第11位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶；反义链的5’端为羟基，3’端为羟基，反义链的第1、3、7、9、11和13、15、17、19、20、21、22和23位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8、10、12、14、16和18位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第21和22位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第22和23位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
在一种优选的实施例中，RNA连接酶包括SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：13 ~ SEQ ID NO：40所示的RNA连接酶中的一种或多种；或与SEQ ID NO：4~ SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：40中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化磷酸二酯键形成活性的酶。
上述RNA连接酶均能够识别底物互补配对形成的、带有缺刻的双链结构，从而实现催化磷酸基团与羟基基团形成磷酸二酯键。RNA连接酶对于不同的底物具有不同的活性，在上述制备方法中从大量的RNA连接酶中筛选获得了上述RNA连接酶，能够实现对于正义链为SEQ ID NO：45所示的核酸序列、反义链为SEQ ID NO：46所示的核酸序列的siRNA的连接和制备。
SEQ ID NO：1（E1，Salmonellaenterica）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYSLGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDKVTCAKRTGPILPAEDFFGYEIILKNYADSIKAVQDIMETSAVVTYQVFGEFAGPGIQKNVDYGDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCNTFKFKMAPLLGRGKFEELIKLPNDLDSVVQDYNFTVDHAGLVDANKCVWNAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPSWLPNRNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKTKVELSEADNKLMGILACYVTLNRVNNVISKIGEIGPKDFGKVMGLTVQDILEETSREGITLTQADNPSLIKKELVKMVQDVLRPAWIELVS。
SEQ ID NO：2（E2，YersiniaphagevB_YepM_ZN18）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYSLGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDKVTCAKRTGPILPAEDFFGYEIILKNYEDSIKAVQDIMETSAVVSYQVFGEFAGPGIQKNVDYGDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCNTFKFKMAPLLGRGKFEELIKLPNDLDSVVQDYNFTVDHAGLVDANKCVWKAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPSWLHNGNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAKVELSEADNKLVGILACYVTLNRVNNVISKIGEIGPKDFGKVMGLTVQDILEETSREGITLTQADNPSLVKKELVKMVQDVLRPAWIELVS。
SEQ ID NO：3（E3，Shigella phage pSs-1）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYSLGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDKVTCAKRTGPILPAEDFFGYEIILKNYADSIKAVQDIMETSAVVSYQVFGEFAGPGIQKNVDYGDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCNTFKFKMAPLLGRGKFEELIKLPNDLDSVVQDYNFTVDHAGLVDANKCVWNAEAKCEVFTAEGYVLKPCYPSWLPNRNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAKVELSEADNKLVGILACYVTLNRVNNVISKIGEIGPKDFGKVMGLTVQDILEETSREGITLTQADSPSLVKKELVKMVQDVLRPAWIELVS。
SEQ ID NO：4（E4，Bacteriophage，T4Rnl2）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYSLGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDKVTCAKRTGPILPAEDFFGYEIILKNYADSIKAVQDIMETSAVVSYQVFGEFAGPGIQKNVDYCDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCNTFKFKMAPLLGRGKFEELIKLPNDLDSVVQDYNFTVDHAGLVDANKCVWNAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPSWLRNGNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAKVELSEADNKLVGILACYVTLNRVNNVISKIGEIGPKDFGKVMGLTVQDILEETSRE GITLTQADNPSLIKKELVKMVQDVLRPAWIELVS。
SEQ ID NO：5（E5，Bacteriophage T7，T7 DNA）：
MNIKTNPFKAVSFVESAIKKALDNAGYLIAEIKYDGVRGNICVDNTANSYWLSRVSKTIPALEHLNGFDVRWKRLLNDDRCFYKDGFMLDGELMVKGVDFNTGSGLLRTKWTDTKNQEFHEELFVEPIRKKDKVPFKLHTGHLHIKLYAILPLHIVESGEDCDVMTLLMQEHVKNMLPLLQEYFPEIEWQAAESYEVYDMVELQQLYEQKRAEGHEGLIVKDPMCIYKRGKKSGWWKMKPENEADGIIQGLVWGTKGLANEGKVIGFEVLLESGRLVNATNISRALMDEFTETVKEATLSQWGFFSPYGIGDNDACTINPYDGWACQISYMEETPDGSLRHPSFVMFRGTEDNPQEKM。
SEQ ID NO：6（E6，Bacteriophage dhaeg）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLRTNGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDAVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKNYADSIKSIQDIMETSAAVSYQVFGEFAGTGIQKNVDYGDKDFYVFDIIVTTESGDVTYVDDYMMESFCKTFKFKMAPLLGRGKFEDLIKLPNDLDSVLPDYNFTVDNVGLAEANAHVWNAEAKGEVFTAEGYVLKPCYPLWLPNGNRVAIKCKNSKFSEKKKTDKPIKVAVVLSQDDLDLLQQFTDYVTVNRINNVISKIGEVSPKDFGKVMGLTVQDILEEAAREELELTDAENPVEVKKQLIECVKDTLRAVWIELVSK。
SEQ ID NO：7（E7，Klebsiella phage KP27）：
MFKKYSSLTNHYEGKFINGVIMNGLTGGVWVAREKIHGANFSFITDDGITVTPAKRTDVVKPAEDFYGCSAVVAKYSPGIRKMWETLKKTGTYDDLVIQVYGEFAGRGVQKDVDYGEKDFYVFDIRVNGEFLPDNLCSLISRSHGLKMAPLLGYGTFEEIKELPITFESVVNKANSGIGSDNTVYGEFVYPIMDVEEGNIAEGFVMKPVSPAFMPNGERVAIKCKTTKFTEKKAKKATRFNAPVSLSEKDKNQLDEFVCYLTENRVKNVLSKLDLASITAKDFGRIMGLTVQDAIEEISRNHGPFLEQFEDPAMAKKLFVTEAQNMIRPVWGKILNHEF。
SEQ ID NO：8（E8，Vibrio phage phi-ST2）：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVKEWVALEKIHGANFSFIVEFKPSTEEVPGEMSVTPAKRTSTIGANAMGDYDFYGCTSVVEAHIEKMQDISNWLFANDFIKNDETIIVYGELAGKGIQKEVNYGDKDFWAYDILCPETGEFLDWDVVLKACKFAGVKTTHEIARGTLDELLKIDPLFRSFHTPADVDSENVAEGFVVKQLKAEKRLHNGSRAILKVKNEKFKEKKNKQGKTPRAKVVLTEEQEKLHAAFSCYLTENRLRNVLSKIGKVEAKQFGMVSGLFVKDAKDEFERDERDEVAIPRDDWDVIKRSLVNVANEILRKNWLNIVDGTF。
SEQ ID NO：9（E9，Klebsiella phage KP15）：
MFKKYSSLTNHYEGKFINGVIMNGLTGGVWVAREKIHGANFSFITDDGITVTPAKRTDVVKPAEDFYGCSAVVAKYSPGIRKMWETLKKTGTYDDLVIQVYGEFAGRGVQKDVDYGEKDFYVFDIRVNGEFLPDNLCSLISRSHGLKMAPLLGYGTFEEIKELPITFESVVNKANSGIGSDNTVYGEFVYPIMDVEEGNIAEGFVMKPVSPAFMPNGERVAIKCKTTKFTEKKAKKATRFNAPVSLSEKDKNQLDEFVCYLTENRVKNVLSKLDLASITAKDFGRIMGLTVQDAIEEISRNHGPFIEQFEDPAMAKKLFVTEAQNMIRPVWGKILNHEF。
SEQ ID NO：10（E10，Vibrio phage JN02）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLYTNGLTTGVWVAREKIHGTNFSLIIERDNVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKKYDKAIKAVQEVMESISTSVPVSYQVFGEFAGGGIQKGVDYGEKDFYVFDIIINTESDDTYYMSDYEMQDFCNTFGFKMAPMLGRGTFDSLIMIPNDLDSVLAAYNSTASEDLVEANNCVFDANVIGDNTAEGYVLKPCFPKWLSNGTRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPVKTQVPLTEIDKNLLDVLACYVTLNRVNNVISKIGTVTPKDFGKVMGLTVQDILEETSREGIVLTSSDNPNLVKKELVRMVQDVLRPAWIELVS。
SEQ ID NO：11（E11，Bacteriophage RB69）：
MEKLYYNLLSLCKSSSDRKFFYSDDVSPIGKKYRIFSYNFASYSDWLLPDALECRGIMFEMDGETPLRIASRPMEKFFNLNENPFTLSIDLNDVKYLMTKEDGSLVSTYLDGNMVRFKGSIKSDQAASATSILLDINHKDLADRLLELCNDGFTANFEYVAPSNKIVLTYPEKRLILLNIRDNNTGKYIEYDDIYLDPVFRKYLVDRFEAPEGDWVPGVKSSTNIEGYVAVMKDGSHFKLKTDWYVALHTTRDSISSPEKLFLAIMNGASDDLKAMYADDEFSFKKVELFEKAYLDFLDRSFYICLDAYDKHKGKDRKTYAIEAQAICKGAQSPWLFGIIMNLYQGGSKEQMMTALESVFIKNHKNFIPEGY。
SEQ ID NO：12（E12，Aeromonas virus Aeh1）：
MIVGRYEKQIRQLHKCLVHLDMIDKEDSIGVFGEYAGIMSYGKWIQTGIEYGPQDFYVFDIIVQPLDGDQFMLEDLQVEELCKALGLKTAPLLKVGTFADIMKIPVDLQSVVMEVNAGKPIDIRVGTDNIAEGYVAKPNVPARFKNGNRVAIKCKNEKWSETGKGRAVQVEVKELSEKDKALVLDITRYITDNRLKNVLSKMDTPKTSEFGKVLGLMSKDVQKDYERDELDGVSVKEATDEAGRVMRMINTEIGNMIRPNWVSICDGDW。
SEQ ID NO：13（E13，Vibrio phage JS98）：
MFKKYSSLENHYNSKFIEKLRTNGLTGGEWVAREKIHGTNFSLIIERDAVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKNYADSIKSVQHLIESINYQSYQIYGELAGPGIQKNVDYGDKDFYVFDIRVTKEDGTESVLTDTLMEAFCIIHKFKVAPCLATGSFEDLIKLPNDFDSVIPDYNFAVDNAGLTIANSTDFIPKVEGKVFTAEGFVLKPDIPTWLPNGNRVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAAVVLSQDDMDLMWQFTDYVTVNRINNVISKIGEVSKKDFGKVMGLTVQDILEEAAREELELTDAENPVEVKKQLVECVKDTLRAVWIELVS。
SEQ ID NO：14（E14，Vibrio phage）：
MSFVKYTSLENSYRQAFVDKCDMLGVREWVALEKIHGANFSFIVEFKPNEAQDGAEFTVTPAKRTSTIGANVMGDYDFYGCTSVVEAHTAKMEAISNWLWARGIINVGETIIVYGELAGKGVQKEVNYGDKDFWAYDILLPETGKFLDWDVVLEACEFAKVKTTHEIARGTLDELLRIDPLFRSFHTPADVDGDNVAEGFVVKQLRNEKRLHNGSRAILKVKNDKFKEKKNKAGKTPRAAVVLTEEQEKLHAAFSCYLTENRLRNVLSKLETVTQKQFGMISGLFIKDAKDEFERDELNETAIARDDWDVIKRSLTNIANEILRKNWLDILDGNF。
SEQ ID NO：15（E15，Acidobacteriabacterium）：
MKQMYDNLKALTQKNDMFFSSIQTTPSNKPVEIFSYHIASYSDWLEPDAIECRGIMFDITDKENPVILSRPMEKFFNLGENPLALPEDVLPLVKTIEEKRDGSLISTYLDDGKLYTKSKGSLYSDQANDSNRFLMRSENKDFKQALKTLAELGYTANMEYTSPKNQIVLKYEKQELIVLNIRNTETGDYLTLDDLAELDAENPEHTIYTHIAERFVDYEEVDGMSDEDVERIRDMKGIEGYVLVGQNQRVKLKTDWYVNLHRLKDNINNNRRLVESVVESRTDDLRQLFEHDQGSIDKIKEFEQYVLSKIKSCLAEVRTVYERVKHLDRKHYAINAQRYVDYTPLFSVIMRQFDDYNEENVVENIKQIALKNVDDFIPMHYK。
SEQ ID NO：16（E16，Vibrio phage nt-1 rnlA）：
MNELYNNLMTLAESAEGKFFFADHLSPQGEKFRVFSYHIASYSDWLLPDALEARGIMFQLDENDEMIRIVSRPMEKFFNLGENPFTMDLDLTTTVQLMDKADGSLISTYLTGDNFALKSKTSIYSEQAVAANRYIKHVDNRDLWEFCDDCAAQNFTVNMEWCAPNNRIVLEYTEPKLIILNIRDNETGQYVSFDDIPIGALTRIKKWLVDEYDPMTAHVDDFVETLKAKKGIEGMILRLASGQSVKIKTTWYVDLHAQKDSVNSPKKLVTTILNKNHDDLYALFADDKPTIERIREFDDHVSKKVVESFHAVSQYYTKNRHLSRKDFAIAGQKALKPWEFGVAMIAYQNQTVEGVVTMLINAYLKRPELLIPEKYLSEV。
SEQ ID NO：17（E17，Streptomyces phage Wakanda）：
MVHVSEIFSTDDLEQAIENGYVRVNPHPTAPLAILGYTEKAQFDRMWNDVTLNCRGLIIDHDGFVVARPWKKFFNFGERPLMFDTDAPVEVTDKKDGSLGILYRDPVTGDYAISTRGSFTSDQAIHATELFNKKYSHIVTPFKETTFLFEIVYPKNRIVLNYGDMDDLILLGAVDNERGYYWGPRQAAGIMGWPGPVTEVFRYRSLNECFGVHRENAEGLVIRSGSDMVKLKQADYVELHRIVTNLNERSVWSQLKDGKAAYQICELIPDEWHEWVVDVAQALWTEYSSLENKVLGTYADLIGELPGGFTRKQFAMKATKTPYAGYLFALLDCKSISDMLWEAVKPEVNNK。
SEQ ID NO：18（E18，Morganella phage vB_MmoM_MP1）：
MFKKYNSIENIDNAKLVDKVRYEGFTDPSVQWIAQEKIHGANFSFMYDGKTLKCAKRSGDIKETESFFGYEIILAQYKKSVLDAWDILVEHFKGVEEINIFGEFAGPGIQKEVDYEHKDFYAFDILVNGRYIDKEIVNETCKLARIKLAPIIRYGSFDELCNMERAFDTLVPKYNEMLKKNTDAFDFIFGEQEEGKDNISEGYVISPVVPAHLTNGNRVIFKCKNAKFKEKGKIREVKPVKELSESDMKFVELATAYITEQRLSNVISHIGEIGPKDFGKVMGLMSKDVYEDMAKDGFDVLETTDIPLVKKTIQMEITTFIRKDWVNYVSR。
SEQ ID NO：19（E19，Flavobacterium terrae）：
MEFRKYNSIENTYQKTVLEQIIKHEFDAVEYVVQEKVHGANFAFYTNDIQVKIAKRSDFIEENDTFYNAHKVAQKYHAKVKSLFYEVKELFPNVQFIAVFGELFGGHYNHPEVPTVQGAIKVQKGIHYSPENDFYAFDIKVDNSHYLNVDLANKLFEKTDFFYAKTLFKGSLADCLKYPNDFNSLIPEWLDLPTLETNIVEGVIIRPVEALFFGNGSRVLLKNKNEKWAEKAKCDKSKKDLALVDFPIEAKPVWSKIKDYVTVNRLYNVLSKEGEFYPKIIGKLTGWMSQDVINDFKKENPSELDTLEKESQRAINKRLNTMVIKLIKEEFMTFEV。
SEQ ID NO：20（E20，Klebsiella phage vB_Kpn_F48）：
MFEKYSSLENHYNNRFIEKIRHHGYDVTEGWCAREKIHGTNFSIIIERDAVTCAKRTGPILPAEDFFGYTVILKKYNDSIKAVQHTIKEGSSMQIFGEFAGSGIQKGVDYGEKDFYVFDILVKTDKGTHQFVDDFMMEQMCCTFGFKVAPLMGRGSFDELAKLPNEFQINVNRYNEAAEVDLRNANTRVWPAEEATDNTAEGYVLKPNYPRFLANGSRVAIKCKNSKFSEKAKSDKPIKPKAVLSEIDQEVLQKFSEYVTIQRVNNVISKIGQVGPKDFGKVMGLTVQDILVEAGREGLEVIQAEQPDIVKKEITKLVQDVLRPAWIELVSN。
SEQ ID NO：21（E21，Escherichia phage EcS1）：
MTFEKYSSLENHYNGKFIEKIRFSGNDTGVWVAREKIHGTNFSLIISRDAVTPCKRTGPILPGESFFAHEIIMKKYDKSIKFLQDSICGTASSYQIFGEFAGGGIQKGMDYGEKDFYVFDILIKSEHDQEGTYADDFMVERMCCTFGFKVAPLIARGSFEELSQLVNDFDSVVNHYNELAVANGIEYANIAHFGFLPHGEKNIAEGYVLKPCYPVILANGNRVAIKCKNSKFSEKAKSDKPIKPAAVLSDQDKVALSTLAEYSTWNRVSNVLSHIGEVTAKDFGKVMGLTMQDIFVEAEREGIVLIDADQPNLVKKELQQIVMATIREKWHEVV。
SEQ ID NO：22（E22，Acinetobacter phage AbTZA1）：
MSFIKYSSLENHTNDKFIQKCFEAVANGEGTVNTEFVAREKIHGTNFSVIITPDSIQAAKRSGPIAITEKFFGYEDLMAELDDIFKEIQQDLVKNVPSFKSIQIFGEYAGGGIQKEVDYGPKSFYVFDIFMDAPDSGFSHGWWSDVNVQAFCDYRGLKIAPLVARGTLEQLLKLPVEFDSIVPSLTWENMYSVHAQPAPKDNVAEGLVIKPNSPMFLPNGSRLAIKYKTDKFKEKGKGKAPKIPVPLSDADKELLNKLSEFSTIARISNVASHIGELTPKMFGKLLGMTMHDLLTEAEREGISPKSAEAPSKVKNELQKIVQVDVREFWTSYDFPVVNVD。
SEQ ID NO：23（E23，Klebsiella phage KMI11）：
MFAKYSSLENHYNNKFIEKIRGAGFDMHTVEWVAREKIHGTNFSVIITPTEIVPAKRTGPILESESFFGHDIIMKKYKDSFVKMQNMLNAMDLVSVQIFGEFAGGGIQKGVDYGEKDFYVFDILSDSGNEKVYWDDYVVESFATGLGLKLAPLLGRGSFAELSQYVNDFKSIVNYYNELVDTTDLEHANKHVFGPQASSETGVAEGYVLKPVHPKFFNNGTRVAIKCKNSKFSEKAKSDKPIKAKVELTENDKRVLEIFSEYVTWNRVSNVLSHIGTVTAKDFGRVMGLTMKDIINEAAREGHDMLFADNPSAVKKEITTLIQNTIRSKWHEVLE。
SEQ ID NO：24（E24，Yasminevirus sp. GU-2018）：
MSTPPFLKYSSIESYTDVKHLEKIRQIFKSDQFTASEKVHGANFQFIVNEDASNNKISIACAKRTSILEDSEEFYDWRNVLSKHRASLEILYQKVKTDLNKYTGDSSTKNLAGVRVYGELFGGEYPGHGKKNLKPVQKWIYYNTDIDFIVFDVVVVINSDSPDHTSETFLSSDDVMDLICSCSSLKSDDDSVFSLKTVPILSRGSLDEVIEFCTKNVQFNTKIPHLYGLPDIENNFAEGYVVKANVRVNVGKHRGVVKVKNPKFDEIIGFVRHDKRDKKSTNDVSEEVKYHTEMIKPYLTQNRLDNVVSKIGPASVRPKIVGCFLNDAKIDYIKSFDDDDSVKDFEKVWKDVQKNLTPLCNTFVYP。
SEQ ID NO：25（E25，Enterobacter phage vB_EclM_CIP9）：
MFEKYSSLENHYNGKFIEKIRNAGFDVTEPWVAREKIHGTNFSIIIERDAVTCAKRTGPILAGEDFFGYEIVLKKYNDSIKAVQHTIKEGSSMQVFGEFAGGGIQKGVDYGEKDFYVFDILVKTAEGTNQFVDDYMMETICNTFGFKMAPLLGRGKFDDLIQLPNMLDVVVNDYNELAANEGIPVANKQVWKAVVAEDNIAEGYVLKPCYPKFFPNGSRVAIKCKNSKFSEKSKSDKPIKPKVELTEQDNKVYFDFESYINVNRINNVVSKIGKPGPKDFGKVMGLTVKDLLEEAEREGIVLTTADNPDLVKKAIIKTTQDVLRHVWQYLISDE。
SEQ ID NO：26（E26，Escherichia phage CJ20）：
MFKKYNSLENHYNNKFIEKIRLQGFTSGEWVAREKIHGTNFSLIIEQDNVTCAKRTGPILPAEDFYGYEIVLKNYADSIKSVQKLLQDINYQAYQIYGEFAGAGIQKNVDYGDKDFYVFDIRVTKEDGSESVLTDTLMEAFCIIHKFKVAPRLATGSFEDLIKLPNDLDSVVPDYNFTVDNAGLTTANTTDFDAKVEGKVFTAEGFVLKPDVPAWLPNGERVAIKCKNSKFSEKKKSDKPIKAAVVLSQEDLDILWKFTDYVTVNRINNVISKIGEVSPKDFGKVMGLTVQDILEEAGREGLELTQSENPVEVKKQLITNVRETLRHVWIALISE。
SEQ ID NO：27（E27，Cronobacter phage A24）：
MKFEKFQSLINESMKNVGGFLRDSSFGKRKAVVTEKIHGANFSVYFGCKDNVVGINFASRSQMLCPETNFMNCQRYFTEEKIQELLEHASTIMALDKCELRFIGEIYGGMDIAGIKPVQREVHYSGDIGFRVFHAQIANNETGEVFDYNWKNVKALASDFGFEVVPIVAEGLTFEQAYALDQKVKSALSDKDQICEGYCIRVDADGEEGQAPLIFKKRNTDFLETKGTVKAPQNTVEQTELGMEAMARIGSFITPQRVSNVNSHHGYSSPKDFQNLMAAVLEDVLDEYKKEYDVDLRNEPVWKEIKRSVGAQVVPLVREVLL。
SEQ ID NO：28（E28，Rotaria sp. Silwood1）：
MSEFEGYGKISESSSNWTLEKSDNTTFKRILWCVTEKVHGANFCFLCDNNGQRIQCGKRTSLLSDTDEFFGYKRRLFNEIIPKIQQIYQFVQNTFPNLEKLYVFGELFGGYYPHPDVPKLPNINAIQTGIWYCPDIEFYAFDLAISINDKQTYLDYEYAITAFQHVNLLYAEPLFIGKYEEALDFKLGFNSHIPGKLGLPPLHEDNKAEGIVIKPMHEIMIKTNKGSPIRAIVKKKIEEFAEDKYNQAQKQVFKNDEQFSNVDLLRFEIDALITDNRLNNALSKVGHVTRDDKEKLKELLNIYVKDIMDQLYENGNEDMWNNLSSNDRNLFTEELTLNAKKVILKYLKTNKC。
SEQ ID NO：29（E29，Acinetobacter phage Ac42）：
MPFVKYSSLENHTNSKFLEKIVEAITLGYCDNHFVAREKIHGTNFSVIITKDSIQPAKRSGPISETESFFGWQDLMAKYRKSFEVIQEKLIAGEYKQEIEGSPGFVPSVTVEKVQIFGEYAGGGIQKEVDYGEKDFYAFDVMFDDKYINDVAATGVASVAGLKMAPIIAIGTLEELLKLPVEFNTTVPTYNKLWDEAGNGFYDFVKPEAPTDNVGEGLVIKPVVPAFLGNGSRIAIKYKTDAFKEKGKGKAPKLPTPMTDKDIALATQFSEFITENRLSNVLSHIGEVTAKDFGKVMGLMMKDIFAEAKREEISIDVADSPSKVSKEIQHQVTTLIRSKWVDIISN。
SEQ ID NO：30（E30，Helcococcus kunzii ATCC 51366）：
MKFTRYPSLTNHYAIGKTRDLIGKLDDEYYATEKNHGTNIQLTVDKNLRVGVGKRSTFITDEKPYSDVFELSEDIIAELQGFIAENADIEQVTLYGELFGSGVQKTDYQANKDKERQVRFYDCFIHFTNGKIIASKKDLYELVKEEFVAKIIKTGKLIDLVKEELPKESTYGGNTFEGYVYKPNVDNYVLNSNNNGIYYPVVKHKTEDFSEVRNKVKIELGEEEIKLHNLVESYITKNRVVNVLSHGDIELIPQNIGEIIKLVQEDIKKELIKENPEVDKNLVYQIVRKKGSLIVPLIKKIMFEEVE。
SEQ ID NO：31（ E31，Vibrio phage CHOED）：
MLRPFEKYNSLTLIRENHEDELQKYIDLTQGQRFVVTEKIHGANFEVATDGQTVRYASRNQVLGEGADFYGYRFVAQFLTPKILAMFKDMKELIMEQHKACDYIEAKGDQANRPDIPRDFQEITIRGELAGGQYPNAPKVKEGNGQVGKGKIWYSQQKSFFAFEICVDGVPQDFYTLGTMCGSYGIPVAPVLTFGTFEECLEFSREHLEDITTVPNMTPLLNENGHPILNEDSSYCALHPIHNNTREGHVISSVNPVYLPNGKRMVFKHKGVKFMENKGEKKPKAKVEVILTPEQQVVFDTILPMITVARMEAVMSKEGTWEPKDFTKLCGKVLEDATDEAHGDAPNAFFAAWAHISTKERKVVMKQLGREAAERLRTAYFS。
SEQ ID NO：32（E32，Cronobacter phage S13）：
MFKKYNSLTNHTDKKFLNKILFAGLTDPKVLWVAREKIHGANFSFIVTSDSVSVGKRSGVIPEGENFYSHADIESRYRADVISVRRRLIDLGIATETSEIQIYGELAGVTSTGKLIQHGVDYGPSDFYVFDITVDGVYQDDTTCVLALTRTNITMAPFLKMGTFDELISMRNDFDSVVQRWKNDFNAIVWDKGEHLQYTETNTAEGFVMKPTEVHYVGMERVAIKHKNEKFSEKKNKVKNFKAPVPMTEKDQEVLDELLTFNTENRVRNVLSKTGTPDTKQFGMIMGLTVKDILEESKNILDTADAPATVKKTLIAEVSNLIRPHWVNICNGEF。
SEQ ID NO：33（E33，Thecamonas trahens ATCC 50062）：
MEGMVEAVAAAFVPYPKIPTAFSGSADDARRVRTIEWVATEKIHGANLTLMCDGQVVVPAKRRGVLADDEDFFGLRSSGLLASLARPAIELAQALGAGSGTSIAVSGELFGADVQPGIDYGPQLQFAVFDVALLAADGDRRFLAHDEMTAVATAAGFTVVHEVARGSYTKLLDTPIGFDSHWPALLGLEPLPPAGANTAEGIVLRPATTDDRFLVKIKDPSFADVEASGRAHKSMMVAADGSSSAAADAQNIFYELQLYLTPARAQSARDW。
SEQ ID NO：34（ E34，Acinetobacter phage vB_AbaM_phiAbaA1）：
MMKFIKYPSIKRLTERAIHELDKLPFDLPVFVVTEKLHGANMGIYCDGETIRIAKREGFQDECETKNFFDSARVAEKYSESILGLVRSWNLVKKSHGLEGYAYYIFLGELFGGGIHKGTPYSMEQDFALFNIFTVIDDTEANREYVKKLCAAYFEDEVNGKLVLMPQSRERIVNIAKYINCKVLDILFKGTLEECAQFANDFESHFVCPNRVRESGVEKHGDDAVKNLCITEGVIIEPFYYTNYKGNNFTYKSKNAKFEEKYATGYKPKVSLVQKAIDNLTEDQAEMLYTLNEYLVMPRYQSVVSKMGEVTIKDFSKVLKAFVEDVLKDAKEDFAEDGKEFVKPTKDMMMLFTNEVKSYIRPILLGE。
SEQ ID NO：35（E35，Klebsiella phage Mineola）：
MFAKYSSLENHYNGKFIEKIRGAGFDMHTVEWVAREKIHGTNFSVIITPTEIVPAKRTGPILESESFFGHDIIMKKYKDSFVKMQNMLNAMDLVSVQIFGEFAGGGIQKGVDYGEKDFYVFDILSDSGNEKVYWDDYVVESFATGLGLKLAPLLGRGSFAELSQYVNDFKSIVNYYNELVDTTDLEHANKHVFGPQASSETGVAEGYVLKPVHPKFFNNGTRVAIKCKNSKFSEKAKSDKPIKAKVELTENDKRVLEIFSEYVTWNRVSNVLSHIGTVTAKDFGRVMGLTMKDIINEAAREGHDMLFADNPSAVKKEITTLIQNTIRSKWHEVLE。
SEQ ID NO：36（ E36，Enterococcus phage 9181）：
MPFFKYPSLTNEYAVAKSRSILSKMNTIAYSTEKIHGSNVQYVFDDRDDVVNFGAFSRNGKKVGGKDDNGEHIVDTQFKLVMDIAFQMDLPNIASSIFTEFNHVDSINIYGEYFGSGVQRTQYFINERNERGFQVFDIFLHYKGDPQEVYRSMGLLELIDFVGRDKMVPIEDIVFLSNLIEKDIVERSHYGGEREGNVYKEIHGSWIDPVTKYCGIKHKRPEFLEVSKAPKQPKAKLSDEFLEVVERLSTYVTENRVRNIHSHGDIKFITKNIGAIMLEVKKDILKEFEDNEESIPNVDLSKAIRACDRDIALAVRKVIAEVGDMED。
SEQ ID NO：37（E37，Aeromonas phage Ahp1_CNU-2021）：
MIFKSYPEMENHSKSRIINAVIEQGHGAADVVWCAREKIHGTNFSLWYNGVDDVRAARRTDFLEFADKFYDFTNIERRYQLCVQALYLRLGLTTEVMAVYGEYAGIMSSGKWIQTGIEYGPQDFYAFDVMVDGVPIDDDVMESACLDCGMKTAPLLKVGTFKEVMGVPNDLQSVVMTKNETGTFEIVKGTDNIAEGYVAKPRVGRRFWNGARVAIKCKNEKWSETAKGKGVKIEVKDISDKDASILAMLGDYITENRLKNVLSKIGVPETKEFGKVMGMLSQDIIKDYESDTETLVKDADEPSRVCRMMNTAVGNFIRPLWVDICDGAW。
SEQ ID NO：38（E38，Megavirus chiliensis）：
MIIFWKDTYIYYDIIKNLKKNNIECTDYIIYIITTMNMEINQFFQKYFSIENLNARSFKSLQKNGLLSNNIEWIALEKIHGANFSFITNGEKLETAKRTGIISSEEYFFNYQIVVERYSQDVFNIFNKIKKNIDNLMSIQIYGELFGGAYPDMYVKDIKPIQKGVYYNPDIDFLIFDIKINYKTESGIPENNYSEFLSHDEVINYISKTNIRIVPEISRAIFTDIIKMDPVFHTKVPAMYGLPQINNNLAEGYVFKMNARHLCNIFRPIIKSKNDDIFGEVHKSSIKYDIKDLLLKNSEIGSSYEEIKCYLTKNRFDGIIGKIGPDNKPAKIIGCFIADALREYEITLDADKKIEYNKNKRNISKNITIYISNNPEIQSWFK。
SEQ ID NO：39（E39，Acanthamoeba polyphaga moumouvirus）：
MELAKNFQKYFSIENPKKIIKSLEKNDYTNDKYEWIVLEKIHGANFSFITNGETIYAAKRTAIIQPGEYFYDYESIVEKYKEDVFKVYNEIFYKTKNIMSIQIFGELFGGLYPNYNDKKINPIQTGIYYNPKIDFMVFDIKINYLTDNFNVQNDKSEFLSHDEVLFYLSTTKFKHVPIIGRGQFNDIIKMEPVFLLKYLEYMNYLMLIIIMLKGIYLN。
SEQ ID NO：40（E40，Salmonella phage S16）：
MFKKYSSLENHYNNKFISKIRFEGKDGGLWVAREKIHGTNFSIIVSKDSVSACKRSGPILPSESFYGHEIILKNYDESIKTIQRCMNANELGSVSSYQIFGEFAGQGIQKEVDYGEKDFYVFDILVNTQNGNVLYMDDMMMTSFCNEFGFKMAPFIGCGSFDELIQLPNNFTSVIKAYNEAAKDDLKEVNLCVFDPLVTDDNVAEGYVLKPVYPDFFNNGTRIAIKSKNSRFTEKKKSDKPIKPKAVLTSNDSTVLANLCEYSTWNRVSNVISHIGEVKAKDFGKVMGLTIQDIFIEAKREGVDIVHADNPDLVKRELQTVVSNTIREKWLEIVS。
本申请中的同一性（Identity）是指氨基酸序列或核酸序列之间的“同一性”，即氨基酸序列或核酸序列中的种类相同的氨基酸残基或核苷酸的比率的总计。氨基酸序列或核酸序列的同一性可以利用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）、FASTA等比对程序来确定。
70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%以上（比如85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%以上，甚至99.9%以上）同一性且具有相同功能的蛋白质，其活性位点、活性口袋、活性机制、蛋白结构等均和a）序列提供的蛋白质大概率相同。
如本文所用，氨基酸残基缩写如下：丙氨酸(Ala；A)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、精氨酸(Arg；R)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)，丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)和缬氨酸(Val；V)。
取代、替换等规则，一般情况下，哪些氨基酸性质类似，替换后的效果也类似。例如，在上述同源蛋白中，可发生保守的氨基酸替换。“保守的氨基酸替换”包括但不限于：
疏水性氨基酸（Ala、Cys、Gly、Pro、Met、Val、Ile、Leu）被其他疏水性氨基酸取代；
侧链粗大的疏水性氨基酸（Phe、Tyr、Trp）被其他侧链粗大的疏水性氨基酸取代；
侧链带正电的氨基酸（Arg、His、Lys）被其他侧链带正电的氨基酸取代；
侧链有极性不带电的氨基酸（Ser、Thr、Asn、Gln）被其他侧链有极性不带电的氨基酸取代。
本领域技术人员也可以根据现有技术中的“blosum62评分矩阵”等本领域技术人员熟知的氨基酸替换规则对氨基酸进行保守替换。
在一种优选的实施例中，正义链底物包括2条或更多条底物，反义链底物包括2条或更多条底物；优选地，正义链底物的长度为2-19 nt，更优选为3-17 nt，进一步优选为6-15 nt；优选地，反义链底物的长度为2-21 nt，更优选为3-19 nt，进一步优选为6-15 nt。
在一种优选的实施例中，正义链底物和反义链底物均包括2条底物，正义链底物包括第一正义链底物和第二正义链底物，反义链底物包括第一反义链底物和第二反义链底物；制备方法包括：将第一正义链底物、第二正义链底物、第一反义链底物和第二反义链底物混合，利用RNA连接酶催化第一正义链底物和第二正义链底物连接形成正义链，催化第一反义链底物和第二反义链底物连接形成反义链，正义链和反义链互补配对形成此种siRNA；优选地，将正义链底物和反义链底物退火后与RNA连接酶混合，获得此种siRNA。
在上述制备方法中，可以先将正义链底物和反义链底物进行混合进行退火，正义链底物和反义链底物之间能够通过碱基互补配对形成双链RNA结构，在该双链RNA结构中存在不同底物之间的缺刻。再将退火后的反应体系与RNA连接酶混合，利用RNA连接酶将缺刻两侧的磷酸基团和羟基基团以磷酸二酯键相连接，修复缺刻，从而获得双链结构完整的目标产物此种siRNA。
在一种优选的实施例中，第一正义链底物的3’端与第二正义链底物的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成正义链；第一反义链底物的3’端与第二反义链底物的5’端在RNA连接酶的催化下连接，形成反义链；优选地，在上述制备方法中，第一正义链底物的5’端为5’保护基团，3’端为羟基基团；第二正义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为L96基团（N-乙酰半乳糖胺基团衍生物）；第一反义链底物的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；第二反义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。上述L96基团的结构如图2所示。
在一种优选的实施例中，第一正义链底物为SEQ ID NO：41所示的核酸序列，第二正义链底物为SEQ ID NO：42所示的核酸序列；或第一正义链底物为SEQ ID NO：53所示的核酸序列，第二正义链底物为SEQ ID NO：54所示的核酸序列。
在一种优选的实施例中，第一反义链底物为SEQ ID NO：44所示的核酸序列，第二反义链底物为SEQ ID NO：43所示的核酸序列；或第一反义链底物为SEQ ID NO：56所示的核酸序列，第二反义链底物为SEQ ID NO：55所示的核酸序列。
利用上述制备方法和SEQ ID NO：41-44或53-56所示的底物，能够制备此种siRNA。但需要说明的是，对于底物的选择并非仅限于上述SEQ ID NO：41-44或53-56所示的底物，能够组合形成正义链和反义链的底物均能够应用于上述制备方法中，上述制备方法适用于此种siRNA的制备但不局限于底物连接位置的不同，上述制备对于此种siRNA的正义链序列和反义链序列的连接均具有较好的连接效果。正义链底物或反义链底物的数量包括但不限于2条、3条、4条乃至更多条。
在一种优选的实施例中，正义链底物和反义链底物均包括3条底物，正义链底物包括第一正义链底物、第二正义链底物和第三正义链底物；反义链底物包括第一反义链底物、第二反义链底物和第三反义链底物；优选地，第一正义链底物为SEQ ID NO：47所示的核酸序列；第二正义链底物为SEQ ID NO：48所示的核酸序列；第三正义链底物为SEQ ID NO：49所示的核酸序列；优选地，第一反义链底物为SEQ ID NO：52所示的核酸序列；第二反义链底物为SEQ ID NO：51所示的核酸序列；第三反义链底物为SEQ ID NO：50所示的核酸序列。
在一种优选的实施例中，正义链底物和反义链底物的浓度为1μm-1M；优选地，RNA连接酶的浓度为0.01-10mg/mL；优选地，在正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT；优选地，制备方法的反应温度为0-40℃，更优选为15-30℃；优选地，制备方法的反应时间为0.1-48 h，更优选为12-24 h。
下面将结合具体的实施例来进一步详细解释本申请的有益效果。
实施例1 RNA连接酶纯化制备
将能够表达RNA连接酶的基因构建与pET28a载体上，并转化入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株。表达菌株以0.1%的接种量接种至5mL LB培养基中（含50µg/mL），与37℃培养16h。得到的培养液以1%的接种量转接到500mL LB培养基中，与37℃培养至OD600=0.6时，加入0.1mM的IPTG，在20℃诱导16h。得到的诱导培养液经离心获得菌泥。菌泥用裂解缓冲液（50mM Tris-Cl pH8.0，0~500mM NaCl，10%甘油）重悬，使得菌体终浓度为10%，经超声破碎，离心后得到粗酶液。粗酶液中加入10mM咪唑，用0.22µm滤膜过滤后得到的酶液用镍柱进行纯化，经过脱盐换液后，用强阴离子柱进行二次纯化，得到的酶液经脱盐换液后储存与30%甘油中。
实施例2
将底物1~4加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，底物1~4的序列如表1所示。RNA片段1~4（即底物1~4）的浓度均为50µM，ATP浓度为1mM，Tris-HCl（pH7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，分别加入商业化连接酶T4RNA2（E4）、T7 DNA连接酶（E5）或其他连接酶（E1-E3，E6-E16），使酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，上清以SDS-PAGE进行检测，SDS-PAGE结果如图3所示。结果显示部分连接酶能催化终产品的合成，正义链理论分子量为8636.95±1，反义链的理论分子量为7694.20±1，进行质谱鉴定，结果显示分子量与终产品相符，液相和质谱检测结果如图4和图5所示，其中图4为此种siRNA的液相色谱图和siRNA正义链的质谱结果图，图5为此种siRNA的液相色谱图和siRNA反义链的质谱结果图。
图3中，泳道1为E1催化的反应体系，泳道2为核酸分子量标准，泳道3为E2催化的反应体系，泳道4为E3催化的反应体系，泳道5为E4催化的反应体系，泳道6为E5催化的反应体系，泳道7为E6催化的反应体系，泳道8为E7催化的反应体系，泳道9为E8催化的反应体系，泳道10为未添加酶的阴性对照反应体系，泳道11为E9催化的反应体系，泳道12为E10催化的反应体系，泳道13为E11催化的反应体系，泳道14为E12催化的反应体系，泳道15为E13催化的反应体系，泳道16为E14催化的反应体系，泳道17为E15催化的反应体系，泳道18为E16催化的反应体系。
表1
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰，f表示对于该核糖核苷酸的2’氟修饰，s表示硫代磷酸酯健，A、C、G或T前的d表示该核苷酸为脱氧核糖核苷酸，L96为图2所示的N-乙酰半乳糖胺基团衍生物。
底物1的第1、2、3、4、5、6、8、10、12、13和14位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第11位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶（T）。
底物2的第1-7位核糖核苷酸上均具有2'甲氧基修饰。
底物3的第2、4、6、7、8、9和10位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第1、3和5位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第8和9位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第9和10位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
底物4的第1、3、7、9、11和13位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8、10和12位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
制备获得的此种siRNA的正义链（Sense Strand，SS）为5’-CmsUmsAmGmAmCmCfUmGfUmdTUmUmGmCmUmUmUmUmGmUm-3’（SEQ ID NO：45）。
反义链（Antisense Strand，AS）为5’- AmsCfsAmAfAfAfGmCfAmAfAmAfCmAfGmGfUmCfUmAmGmsAmsAm -3’ （SEQ ID NO：46）。
上述正义链的5’端为羟基，3’端为L96基团，正义链的1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第11位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶（T）。
上述反义链的5’端为羟基，3’端为羟基，反义链的第1、3、7、9、11和13、15、17、19、20、21、22和23位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8、10、12、14、16和18位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第21和22位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第22和23位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
实施例3
将底物1~4加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，RNA片段1~4的浓度均为200µM，ATP浓度为1mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，加入商业化连接酶T4 RNA2、T7 DNA连接酶或上述RNA连接酶中一种或多种的连接酶，使酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，为了方便定量，开发了UPLC的方法以准确检测反应的情况，因此上清以UPLC进行检测。结果如表2所示，显示部分连接酶能催化终产品的合成。
表2
。/>
对于活性的表示中，“-”表示产品体系纯度为0.1~5%（不包括端点值5%），“+”表示产品体系纯度为5%~20%（不包括端点值20%），“++”表示产品体系纯度为20%~30%（不包括端点值30%），“+++”表示产品体系纯度为30%~50%，“×”表示无产品生成。在本申请中，“产品体系纯度”表示在反应体系中，目标产物与反应体系中总成分（目标产物+剩余底物）的比值，可通过液相色谱结果中不同成分的曲线下面积进行计算。
实施例4
将底物1~4加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100µL，RNA片段1~4的浓度相同，为50µM~1000µM，ATP浓度为1mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，加入连接酶，使酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，上清以UPLC进行检测。结果如表3所示，显示最优连接酶能催化底物浓度达到1mM，且远优于商业化酶T4 RNA ligase2。
表3
。
续表3
。
对于活性的表示中，“-”表示产品体系纯度为0.1~5%，“+”表示产品体系纯度为5%~20%（不包括端点值5%），“++”表示产品体系纯度为20%~30%（不包括端点值20%），“+++”表示产品体系纯度为30%~50%（不包括端点值30%），“×”表示无产品生成。
实施例5
将底物1~4加入到干净的试剂瓶中，配制反应体系，使得终体积为100mL，RNA片段1~4的浓度均为800µM，ATP浓度为2mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，加入连接酶，使酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系于16℃反应16h。得到的反应体系取部分经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，上清以UPLC进行检测，结果显示已经催化完全。对反应体系进行热失活，12000rpm离心30min以去除连接酶，反应体系经离子柱纯化得到纯化后的产品，产品经脱盐后进行冻干，得到终产品。终产品测定含水、内毒素残留、酶残留、溶剂残留、金属残留、宿主蛋白残留。经称重获得了1.4g产品，收率为80%，含水为9%，产品的变性方法纯度为96%，非变性方法纯度为96%，宿主蛋白残留为0.2PPM，酶残留为＜6ppm，金属残留为：Ni：7ppm; Cr：3ppm；Fe：43ppm；Ti：4ppm；Mn：1ppm； Na：31169ppm；As：ND；Cd：ND；Hg：ND；Pb：ND，各项检测均符合注射药品的质量标准。内毒素残留为9 EU/mg，由于是在非洁净实验环境中进行的操作，可能导致环境中的内毒素对产品的污染，因此对产品在洁净环境中除内毒素，最终内毒素残留为0.2 EU/mg，符合siRNA药品的质量标准，表明酶法合成此种siRNA药品的路线是可行的，且具有极高的产品收率和极其简单的工艺。
实施例6
将底物5~10加入到干净的试剂瓶中，底物5-10的序列如表4所示，配制反应体系，使得终体积为200µL，底物浓度均为500µM，ATP浓度为1mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，加入连接酶，使酶的浓度为0.2mg/mL。将反应体系与16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，上清以UPLC进行检测，结果如表5所示。结果显示能检查到产品的生成。
表4
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰，f表示对于该核糖核苷酸的2’氟修饰，s表示硫代磷酸酯健，A、C、G或T前的d表示该核苷酸为脱氧核糖核苷酸，L96代表N-乙酰半乳糖胺基团衍生物。
底物5的第1、2、3、4、5、6和8位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
底物6的第2、4、5、6、7和8位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第1位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第3位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶（T）。
底物7的第1、2、3、4和5位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰。
底物8的第1、3、4、5、6和7位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第2位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第5和6位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第6和7位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
底物9的第1、3、5和7位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第2、4、6和8位核糖核苷酸上具有2'氟修饰。
底物10的第1、3和7位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第2、4、5、6和8位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
表5
。
对于活性的表示中，“-”表示产品体系纯度为0.1~5%，“+”表示产品体系纯度为5%~20%（不包括端点值5%），“++”表示产品体系纯度为20%~30%（不包括端点值20%），“+++”表示产品体系纯度为30%~50%（不包括端点值30%），“×”表示无产品生成。
UPLC检测无酶体系和利用部分酶进行的催化的反应体系图谱如图6所示。
实施例7
将底物11~14加入到干净的试剂瓶中，底物11-14的序列如表6所示，配制反应体系，使得终体积为200µL，底物浓度均为500µM，ATP浓度为1mM，Tris-HCl（pH 7.5 @ 25℃）浓度为50 mM，MgCl2浓度为10 mM，DTT 浓度为1 mM，加入连接酶，使酶的浓度为0.2 mg/mL。将反应体系与16℃反应16h。得到的反应体系经80℃ 5min失活连接酶，经12000rpm离心去除沉淀，上清以UPLC进行检测，结果如表7所示。结果显示能检查到产品的生成。
表6
。
其中，A、C、G或U后的m表示对该核糖核苷酸的2’甲氧基修饰，f表示对于该核糖核苷酸的2’氟修饰，s表示硫代磷酸酯健，A、C、G或T前的d表示该核苷酸为脱氧核糖核苷酸，L96代表N-乙酰半乳糖胺基团衍生物。
底物11的第1、2、3、4、5、6和8位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
底物12的第2、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第1位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第3位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶（T）。
底物13的第1、3、5、7、9、11、12、13、14和15位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8和10位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第13和14位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第14和15位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
底物14的第1、3和7位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6和8位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间位硫代磷酸酯连接。
表7
。
对于活性的表示中，“-”表示产品体系纯度为0.1~5%（不包括端点值5%），“+”表示产品体系纯度为5%~20%（不包括端点值20%），“++”表示产品体系纯度为20%~30%（不包括端点值30%），“+++”表示产品体系纯度为30%~50%，“×”表示无产品生成。
UPLC检测的无酶对照体系和利用部分酶进行催化的反应体系图谱如图7所示。
对比例1
以现有技术中的固相法（固相合成仪）合成目标siRNA，检测产品纯度信息，并用质谱检测杂质信息，与利用E-7酶进行酶法合成的浓度相同的目标siRNA进行对比，发现酶法合成的产品的纯度更高。纯度数据参加表8。
表8
。
进一步地，利用UPLC和质谱检测杂质的含量，结果显示酶促合成的目标siRNA的N-1和N+1杂质远低于固相合成法合成的目标siRNA的杂质含量，杂质含量结果参加表9。表明酶法合成目标siRNA是更加有优势的。
表9
。
其中，ND表示未检测出。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：在本申请的制备方法中，通过RNA连接酶催化正义链底物之间连接形成目标siRNA的正义链，催化反义链底物之间连接形成目标siRNA的反义链，从而实现利用生物合成的方式制备此种结构复杂、带有多种修饰的siRNA。相较于利用化学合成制备目标siRNA，本申请的制备方法获得的产物纯度较高、杂质少、后续终产物纯化压力小，且反应条件温和、不使用大量有机试剂，能够降低生产成本，便于实现工业化放大生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种抑制PCSK9基因表达的siRNA的制备方法，其特征在于，
所述siRNA为由互补配对的正义链和反义链组成的双链RNA；
所述制备方法包括：
将正义链底物、反义链底物和RNA连接酶混合，利用所述RNA连接酶催化所述正义链底物之间和反义链底物之间以磷酸二酯键连接，获得所述正义链和所述反义链，从而获得所述siRNA；
所述正义链底物能够组成所述正义链，所述反义链底物能够组成所述反义链；
所述正义链为SEQ ID NO：45所示的核酸序列，所述反义链为SEQ ID NO：46所示的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述正义链的5’端为羟基，3’端为L96基团，所述正义链的1、2、3、4、5、6、8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰；第7和9位核糖核苷酸上具有2'氟修饰；第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接；第11位为脱氧核糖核苷酸，为胸腺嘧啶；
所述反义链的5’端为羟基，3’端为羟基，所述反义链的第1、3、7、9、11、13、15、17、19、20、21、22和23位核糖核苷酸上具有2'甲氧基修饰，第2、4、5、6、8、10、12、14、16和18位核糖核苷酸上具有2'氟修饰，第1和2位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第2和3位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第21和22位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接，第22和23位核糖核苷酸间为硫代磷酸酯连接。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ ID NO：4~SEQID NO：10或SEQ ID NO：13 ~ SEQ ID NO：40所示的RNA连接酶中的一种或多种；或
与SEQ ID NO：4~ SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：13~SEQ ID NO：40中所示的任一RNA连接酶具有70%以上同一性，且具有催化所述磷酸二酯键形成活性的酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物包括2条或更多条底物，所述反义链底物包括2条或更多条底物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物的长度为2-19 nt，所述反义链底物的长度为2-21 nt。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物和所述反义链底物均包括2条底物，所述正义链底物包括第一正义链底物和第二正义链底物，所述反义链底物包括第一反义链底物和第二反义链底物；
所述制备方法包括：将所述第一正义链底物、所述第二正义链底物、所述第一反义链底物和所述第二反义链底物混合，利用RNA连接酶催化所述第一正义链底物和所述第二正义链底物连接形成所述正义链，催化所述第一反义链底物和所述第二反义链底物连接形成所述反义链，所述正义链和所述反义链互补配对形成所述siRNA。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将所述正义链底物和所述反义链底物退火后与所述RNA连接酶混合，获得所述siRNA。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物的3’端与所述第二正义链底物的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述正义链；所述第一反义链底物的3’端与所述第二反义链底物的5’端在所述RNA连接酶的催化下连接，形成所述反义链。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二正义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为L96基团；
所述第一反义链底物的5’端为羟基基团，3’端为羟基基团；所述第二反义链底物的5’端为磷酸基团，3’端为羟基基团。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物为SEQ IDNO：41所示的核酸序列，所述第二正义链底物为SEQ ID NO：42所示的核酸序列；或
所述第一正义链底物为SEQ ID NO：53所示的核酸序列，所述第二正义链底物为SEQ IDNO：54所示的核酸序列。
11.根据权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，所述第一反义链底物为SEQ IDNO：44所示的核酸序列，所述第二反义链底物为SEQ ID NO：43所示的核酸序列；或
所述第一反义链底物为SEQ ID NO：56所示的核酸序列，所述第二反义链底物为SEQ IDNO：55所示的核酸序列。
12.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述正义链底物和所述反义链底物均包括3条底物，
所述正义链底物包括第一正义链底物、第二正义链底物和第三正义链底物；
所述反义链底物包括第一反义链底物、第二反义链底物和第三反义链底物。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述第一正义链底物为SEQ ID NO：47所示的核酸序列；
所述第二正义链底物为SEQ ID NO：48所示的核酸序列；
所述第三正义链底物为SEQ ID NO：49所示的核酸序列。
14.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述第一反义链底物为SEQ ID NO：52所示的核酸序列；
所述第二反义链底物为SEQ ID NO：51所示的核酸序列；
所述第三反义链底物为SEQ ID NO：50所示的核酸序列。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，
所述正义链底物和所述反义链底物的浓度均为1μM-1M；
所述RNA连接酶的浓度为0.01-10mg/mL。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，在所述正义链底物、所述反义链底物和所述RNA连接酶混合形成的反应体系中，还包括ATP、Tris-HCl、MgCl2和DTT。
17.根据权利要求15所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法的反应温度为0-40℃，
所述制备方法的反应时间为0.1-48 h。
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