CN110114463A

CN110114463A - 丝胺酸蛋白酶抑制剂A1 iRNA组合物及其使用方法

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Publication number: CN110114463A
Application number: CN201780074650.2A
Authority: CN
Inventors: M·K·施勒加尔; M·贾纳斯; V·R·贾达夫; D·福斯特; M·马诺哈兰; K·G·拉杰夫; A·V·凯尔因; K·查里斯; J·K·奈尔; M·A·迈尔; 松田茂大; M·贾亚拉曼; A·塞加尔; C·布朗; K·费兹杰拉德; S·米尔斯泰恩
Original assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2019-08-09
Also published as: IL266746A; CR20190294A; RU2021126115A; RU2019119242A; CL2019001388A1; CA3044562A1; BR112019010342A2; WO2018098117A8; ZA202103080B; RU2761667C2; UY37494A; KR20190082317A; DOP2019000132A; US20210269796A1; US11725207B2; PH12019550076A1; CO2019005992A2; TW201829443A; TWI788312B; MX2019005898A

Abstract

本发明涉及以Serpina1基因为靶向的RNAi剂，如双链RNAi剂，以及使用此类RNAi剂以抑制Serpina1的表达的方法及治疗患有Serpina1相关疾病如肝脏病变的受试者的方法。

Description

丝胺酸蛋白酶抑制剂A1 iRNA组合物及其使用方法

相关申请

本申请要求于2016年11月23日提交的美国临时申请号62/425,907(代理人案号ALN-260PRO1)、于2017年8月22日提交的美国临时申请号62/548,589(代理人案号ALN-260PRO2)、于2017年8月23日提交的美国临时申请号62/549,099(代理人案号ALN-273PRO1)、及于2017年9月21日提交的美国临时申请号62/561,514(代理人案号ALN-260PRO3)的优先权。前述申请各自的整体内容通过引用特此并入本文。

本申请与于2013年5月22日提交的美国临时申请号61/826,125；于2013年11月1日提交的美国临时申请号61/898,695；于2014年4月15日提交的美国临时申请号61/979,727；于2014年5月6日提交的美国临时申请号61/989,028；美国专利申请号14/284,745，现已于2017年2月21日公告为美国专利号9,574,192；于2017年1月6日提交的美国专利申请号15/399,820；以及于2014年5月22日提交的国际专利申请号PCT/US 2014/039109有关。前述申请各自的整体内容通过引用特此并入本文。

序列表

本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式进行电子版提交，并特此通过引用以其全文特此并入。所述ASCII复本于2017年11月16日创建，名为121301-07820_SL.txt，并且大小为129,236字节。

背景技术

Serpina1编码α-1-抗胰蛋白酶，该α-1-抗胰蛋白酶主要与肝细胞、单核细胞、肺泡巨噬细胞、肠细胞、及骨髓细胞所产生的中性粒细胞弹性蛋白酶复合并抑制后者的活性。在该Serpina1基因中的一个或两个复本中具有变异的受试者可能患有α-1-抗胰蛋白酶缺乏，且由于肺及肝脏内超过正常的弹性蛋白酶活性，处在发展出肺气肿和/或慢性肝病的风险下。

在受到影响的受试者中，该α-1-抗胰蛋白酶的缺乏是野生型、功能性α-1-抗胰蛋白酶的缺乏。在一些情形中，在该Serpina1基因中的一个或两个复本中具有变异的受试者携带无效等位基因。在其他情形中，在该Serpina1基因中的一个或两个复本中具有变异的受试者携带缺陷性等位基因。

例如，具有Serpina1的缺陷性等位基因如PIZ等位基因的受试者，可能产生错误折叠蛋白，该错误折叠蛋白不能被适当地从合成位点运送至身体内作用位点。此类受试者典型是处于发展出肺病和/或肝病的风险。具有Serpina1无效等位基因，如PINULL(GraniteFalls)，的受试者典型仅处于发展出肺病的风险。

由α-1-抗胰蛋白酶缺乏导致的肝病是于肝脏细胞内产生变体形式的α-1-抗胰蛋白酶的结果，该变体形式的α-1-抗胰蛋白酶是错误折叠且因此不容易被运送出该细胞。这导致错误折叠的蛋白在该肝脏细胞内的堆积，且可造成肝脏中的一个或多个疾病或病变，包括但不限于，慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌。

当前，对于治疗患有由α-1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肝病的患者的选择非常有限，这些治疗包括肝炎疫苗、支持性照顾、及避免使用有害的剂(如，醇及NSAID)。尽管可使用替代的α-1-抗胰蛋白酶疗法，但此治疗对于这些受试者体内的肝病无作用，并且尽管肝脏移植可能有效，但肝脏移植是困难、昂贵且有风险的过程，且肝脏器官不容易取得。

因此，在本领域中存在对于Serpina1相关疾病如慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌的有效治疗存在需求。

发明内容

如下文中更详细描述的，本文披露包含以Serpina1为靶向的剂的组合物，该剂如RNAi剂，如双链iRNA剂。还披露使用本发明的组合物来抑制Serpina1表达以及治疗Serpina1相关疾病如慢性肝病、肝炎、肝硬化、和/或肝细胞癌的方法。

本发明是至少部分地基于对以Serpina1为靶向的dsRNA剂的有效的核苷酸或化学基序的发现，这些dsRNA剂在抑制靶标基因表达方面有优势，且同时具有降低的脱靶基因沉默效应，以及包含这些适用于治疗性用途的剂的组合物。更具体地说，尤其已经发现，其中反义链在该种子区域内(即，在该反义链的5’端的自5’端计数的位置2-9)包含至少一个该双链的热去稳定修饰的以Serpina1为靶向的dsRNA剂和/或解链温度为约40℃至约80℃的范围的dsRNA剂，在介导RNA干扰方面可能比缺失该去稳定修饰的亲代dsRNA剂更为有效。

因此，在一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂无唾液酸糖蛋白包含正义链及反义链，其中该反义链与靶标序列具有足够的互补性，以介导RNA干扰；其中所述反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰或其前体；其中所述正义链包含受体(ASGPR)配体；并且其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸。

在另一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含形成双链区域的正义链与反义链，其中该正义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；且该反义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ IDNO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；其中所述反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰或其前体；其中所述正义链包含无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)配体；并且其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸。

在又另一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含形成双链区域的正义链与反义链，所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA互补的区域，其中该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；其中所述反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰或其前体；

其中所述正义链包含无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)配体；其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸。

在一个实施例中，该dsRNA剂包含至少4个包含2’-氟修饰的核苷酸。

在一个实施例中，该dsRNA剂具有以下特征：a)该热去稳定修饰位于该反义链的5’区域的位置4-8；b)以及该正义链与该反义链是各自独立包含至少2个包含2’-氟修饰的核苷酸；以及c)附接于该正义链的任一端的ASGPR配体。

在另一个实施例中，该反义链具有以下特征中的至少两个：a)该热去稳定修饰位于该反义链的位置4至8；b)至少2个核苷酸包含2’-氟修饰；c)核苷酸位置1与2(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；d)长度为18至35个核苷酸。

在一个实施例中，该正义链具有以下特征中的至少一个：

a)该ASGPR配体附接于该正义链的任一端；b)至少2个核苷酸包含2’-氟修饰；c)该正义链与该反义链形成跨越至少19个核苷酸位置的双链区域，并且其中该热去稳定修饰位于所述双链区域内。

在一个实施例中，该热去稳定修饰选自下列所组成的组：

其中B是核酸碱基。

在一个实施例中，该去稳定修饰位于该反义链的位置7。

在一个实施例中，该ASGPR配体是通过二价或三价支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。

在一个实施例中，该ASGPR配体是：

在一个实施例中，该dsRNA剂如下方案中所示共轭至该配体：

其中X是O或S。

在一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含正义链与反义链，其中该反义链与靶标序列具有足够的互补性，以介导RNA干扰；其中该反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰；其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸；并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在另一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含正义链与反义链，其中该正义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；且该反义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；其中该反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰；其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸；并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在又另一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含正义链与反义链，所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA互补的区域，其中该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；其中该反义链包含在5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰；其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸；并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在一个实施例中，该dsRNA剂的解链温度为约55℃至约67℃。在另一个实施例中，该dsRNA剂的解链温度为约60℃至约67℃。

在一个实施例中，该dsRNA剂进一步包含无唾液酸糖蛋白(ASGPR)配体。

在一个实施例中，该ASGPR配体是：

在一个实施例中，该dsRNA剂如下方案中所示共轭至该配体：

其中X是O或S。

在一个实施例中，该dsRNA剂进一步具有以下特征中的至少一个：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个包含2’-氟修饰的核苷酸；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个包含2’-氟修饰的核苷酸；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个包含2’-氟修饰的核苷酸；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；以及(viii)位于该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA剂的各链可具有15-30个核苷酸、19-30个核苷酸；或该正义链可具有21个核苷酸，且该反义链可具有23个核苷酸。

在一个实施例中，该反义链包含互补区域，该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480、或SEQ ID NO:1的核苷酸1441-1479、或SEQ ID NO:1的核苷酸1442-1478、或SEQ ID NO:1的核苷酸1443-1477、或SEQ IDNO:1的核苷酸1444-1476、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1475、或SEQ ID NO:1的核苷酸1446-1474、或SEQ ID NO:1的核苷酸1447-1473、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1473、或SEQID NO:1的核苷酸1448-1472、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1471、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1470、或SEQ ID NO:1的核苷酸1447-1469、或SEQ ID NO:1的核苷酸1446-1478、或SEQID NO:1的核苷酸1449-1471、或SEQ ID NO:1的核苷酸1450-1472、或SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1475、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1480、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1475相差不超过3个核苷酸。

在一个实施例中，该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与核苷酸序列5’-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO:419)相差不超过3个核苷酸。

在一个实施例中，该正义链包含核苷酸序列5’-CUUCUUAAUGAUUGAACAAAA-3’(SEQID NO:417)，且该反义链包含核苷酸序列5’-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO:419)。

在一个实施例中，该正义链包含核苷酸序列5’-csusucuuAfaUfGfAfuugaacaaaa-3’(SEQ ID NO:33)，且该反义链包含核苷酸序列5’-usUfsuugu(Tgn)caaucaUfuAfagaagsasc-3’(SEQ ID NO:34)，其中a、g、c、及u分别是2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C、及U；Af、Gf、Cf及Uf分别是2’-氟A、G、C及U；s是硫代磷酸酯键；并且(Tgn)是胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体。

在一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含形成双链区域的正义链与反义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’-csusucuuAfaUfGfAfuugaacaaaaL96-3’(SEQ ID NO:35)且该反义链包含核苷酸序列5’-usUfsuugu(Tgn)caaucaUfuAfagaagsasc-3’(SEQ ID NO:34)，其中a、g、c、及u分别是2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C、及U；Af、Gf、Cf及Uf分别是2’-氟A、G、C及U；s是硫代磷酸酯键；(Tgn)是胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体；并且，L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯胺醇。

在一方面，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的dsRNA剂，该双链RNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶标Serpina1序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在种子区域内(即，在该反义链的5’端的自该5’端计数的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)解链温度(T_m)为约40℃至约80℃；(ii)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该正义链与配体共轭；(v)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(vi)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；以及(ix)位于该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，本发明提供了一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的dsRNA剂，该双链RNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶标Serpina1序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在种子区域内(即，在该反义链的5’端的自该5’端计数的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或全部九个)：(i)解链温度(T_m)为约40℃至约80℃；(ii)该反义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(iii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iv)该正义链与配体共轭；(v)该正义链包含6、7、8、9、10、11或12个2’-OMe修饰；(vi)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vii)该dsRNA包含至少1、2、3、4或5个2’-脱氧修饰；(viii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；以及(ix)位于该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA的解链温度的范围下限为约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃，且该范围的上限为约70℃、75℃或80℃。在一些实施例中，该dsRNA的解链温度的范围为约55℃至约70℃。在一些实施例中，该dsRNA的解链温度的范围为约57℃至约67℃。在一些具体实施例中，该dsRNA的解链温度的范围为约60℃至约67℃。在一些另外的实施例中，该dsRNA的解链温度的范围为约62℃至约66℃。

已经发现，解链温度为至少60℃的dsRNA剂在体内及体外更为有效。因此，在一些实施例中，该dsRNA的解链温度的是至少60℃

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶标Serpina1序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在种子区域内(即，在该反义链的5’端的自该5’端计数的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，该dsRNA的解链温度(T_m)为约40℃至约80℃，且该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；以及(viii)位于该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为12-40核苷酸对的双链区域，其中该反义链包含在种子区域内(即，在该反义链的5’端的自该5’端计数的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，且该dsRNA的T_m为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；以及(vii)位于该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃(如，40℃、50℃、60℃、70℃或80℃)。

在一些具体实施例中，该双链的热去稳定修饰在该反义链的位置5、6、7、或8处，自该反义链的5’端计数。

在一些具体实施例中，该双链的热去稳定修饰在该反义链的位置6处，自该反义链的5’端计数。

在一些具体实施例中，该双链的热去稳定修饰在该反义链的位置7处，自该反义链的5’端计数。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在种子区域内(即，在该反义链的5’端的自该5’端计数的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度是约40℃至约80℃，且该反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：

(i)2、3、4、5或6个2’-氟修饰；以及

(ii)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且

该正义链包含以下特征中的一个、两个或三个：

(i)与该正义链共轭的配体；

(ii)2、3、4或5个2’-氟修饰；以及

(iii)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，且配体与该正义链共轭，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，配体与该正义链共轭，并且该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，所述正义链包含配体，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。在其一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自该5’端计数的位置4-8的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，其中该正义链与反义链各自包含至少2个2’-氟修饰，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。在其一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)该双链的热去稳定修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少2个2’-氟修饰；(iii)核苷酸位置1与2(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且反义链的长度是18至35个核苷酸。在一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，且该正义链具有以下特征中的至少一个：(i)该配体附接于该正义链的任一端；(ii)正义链包含至少2个2’-氟修饰；并且(iii)该正义链及该反义链是显示足够的互补性，以形成跨越至少19个核苷酸位置的双链区域，并且其中该双链的热去稳定修饰位于所述双链区域内。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该双链的热去稳定修饰选自下列所组成的组：

其中B是经修饰或未经修饰的核酸碱基，且在各结构的星号表示R、S或外消旋物。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自该5’端计数的位置4-8的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该正义链与反义链各自包含至少2个2’-氟修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该双链的热去稳定修饰选自下列所组成的组：

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含位于自该反义链的5’端计数的位置7的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自该反义链的5’端计数的位置7的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该正义链与反义链各自包含至少2个2’-氟修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该双链的热去稳定修饰选自下列所组成的组：

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该配体包含通过二价或三价的支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链及反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自该5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该配体是下述结构的ASGPR配体：

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0、1或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、核苷酸位置22与23之间、核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为18、19、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA包含在该正义链的5’端的钝端。在一些具体实施例中，正义链的长度为19、20或21或22个核苷酸，且反义链的长度为20、21或22个核苷酸。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、核苷酸位置22与23之间、核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该dsRNA之一端是钝端，而另一端具有突出端，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)并且该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域。在一些实施例中，该突出端是在该反义链的3’端，并且该钝端是在该反义链的5’端。在一些具体实施例中，该突出端的长度为2、3或4个核苷酸。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域，其中该dsRNA之一端是钝端并且另一端具有突出端，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰，且任选地，该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’端，且该钝端在该反义链的5’端。在一些实施例中，该突出端是在该反义链的3’端，并且该钝端是在该反义链的5’端。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂还可在该dsRNA双链的两端具有两个钝端。

在一些实施例中，该dsRNA在该双链的两端均具有钝端，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域，且在该双链的两端均具有钝端，其中该dsRNA之一端是钝端且另一端具有突出端，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含21个核苷酸(nt)的正义链与23个核苷酸(nt)的反义链，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸出现于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA的一端是钝端，而另一端包含2nt的突出端，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端。优选地，该2nt的突出端在反义链的3’端。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含正义链与反义链，其中：该正义链的长度为25-30个核苷酸残基，其中自该5’末端核苷酸(位置1)开始，所述正义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36-66个核苷酸残基，且自3’末端核苷酸开始，这些位置中的至少8个核糖核苷酸是与正义链的位置1-23中配对以形成双链；其中至少该反义链的3’末端核苷酸是未与正义链配对，且多达6个连续的3’末端核苷酸是未与正义链配对，从而形成1-6个核苷酸的3’单链突出端；其中该反义链的5’末端包含10-30个未与正义链配对的连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5’突出端；其中当将该正义链与反义链以最大互补性比对时，从而在正义链与反义链之间形成实质上双链的区域时，至少该正义链的5’末端核苷酸及3’末端核苷酸是未与反义链的核苷酸配对的碱基；且当将所述双链核酸引入哺乳动物细胞内时，该反义链是沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶标RNA足够互补，以降低Serpina1靶标基因表达；并且其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。例如，该热去稳定核苷酸出现在与该正义链的5’端的位置14-17相反或互补的位置之间，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-30核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含正义链与反义链，其中所述dsRNA剂包含长度为至少25且最多29个核苷酸的正义链，以及长度为最多30个核苷酸的反义链，且该正义链包含在自5’端的位置11处的对于酶促降解敏感的修饰核苷酸，其中所述正义链的3’端与所述反义链的5’端是形成钝端，且所述反义链在其3’端较该正义链长1-4个核苷酸，其中该双链区域的长度为至少25个核苷酸，且当将所述dsRNA剂引入哺乳动物细胞内时，所述反义链沿着所述反义链长度的至少19nt与Serina1靶标mRNA足够互补，以降低靶标基因表达；并且其中所述dsRNA的切丁酶(dicer)裂解优先导致包含所述反义链的所述3’端的siRNA，从而降低该靶标基因于该哺乳动物体内的表达，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-29核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，该反义链包含核苷酸位置21与22之间、及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该反义链包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该正义链与配体共轭；(iii)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该正义链包含核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该正义链包含核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，该反义链包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该正义链与配体共轭；(iii)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该正义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(vii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一方面，本发明提供了一种能抑制Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480的表达的dsRNA剂，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与该Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在该种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9，自该5’端计数)的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：

(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；

(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；

(iii)该正义链与配体共轭；

(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；

(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；

(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；

(vii)该dsRNA是包长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且

(viii)在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与靶标序列具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在该种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9，自该5’端计数)的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且该反义链进一步包含以下特征中的一个或两个：

(iii)2、3、4、5或6个2’-氟修饰；以及

(iv)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且

该正义链包含以下特征中的一个、两个或三个：

(iv)与该正义链共轭的配体；

(v)2、3、4或5个2’-氟修饰；以及

(vi)1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，并且其中该反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且配体与该正义链共轭。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体。在其一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自5’端计数的位置4-8的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该正义链与该反义链各自包含至少2个2’-氟修饰。在其一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该反义链进一步包含以下特征中的至少两个：(i)该双链的热去稳定修饰位于该反义链的位置4至8；(ii)至少2个2’-氟修饰；(iii)核苷酸位置1与2(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且反义链的长度是18至35个核苷酸。在一些另外的实施例中，该配体是ASGPR配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且该正义链复包含以下特征中的至少一个：(i)该配体附接于该正义链的任一端；(ii)正义链包含至少2个2’-氟修饰；并且(iii)该正义链及该反义链是显示足够的互补性，以形成跨越至少19个核苷酸位置的双链区域，并且其中该双链的热去稳定修饰位于所述双链区域内。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，并且其中该双链的热去稳定修饰选自由下列所组成的组：

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自5’端计数的位置4-8的该双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该正义链与该反义链各自包含至少2个2’-氟修饰，并且其中该双链的热去稳定修饰选自由下列所组成的组：

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含位于自该反义链的5’端计数的位置7的双链体的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中所述反义链包含位于自5’端计数的位置7的双链的至少一个热去稳定修饰，其中所述正义链包含配体，并且其中该正义链与该反义链各自包含至少2个2’-氟修饰，并且其中该双链的热去稳定修饰选自由下列所组成的组：

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该配体包含通过二价或三价的支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含正义链与反义链，各链具有14至40个核苷酸，其中该反义链与Serpina1靶标序列如SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480具有足够的互补性，以介导RNA干扰，其中该dsRNA包含至少4个2’-氟，其中所述反义链包含在自5’端计数的前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中所述正义链包含配体，其中该配体是下述结构的ASGPR配体：

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0、1或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含3、4、5或6个2’-氟修饰，包含2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含3或4个2’-氟修饰，且包含0或2个硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、核苷酸位置22与23之间、核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸；该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)；其中该正义链是与配体共轭，包含在位置7、10及11或在位置7、9、10及11(自该正义链的5’端计数)的2’-氟修饰，且任选地包含核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；其中该反义链包含在位置2、6、8、9、14或16，或在位置2、6、14或16，或在位置2、14及16的2’-氟修饰；其中该反义链包含核苷酸位置21与22之间、核苷酸位置22与23之间、核苷酸位置1与2之间、以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个或全部三个)：(i)该dsRNA包含长度为12-25核苷酸对的双链区域；(ii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端；以及(iii)该dsRNA在该反义链的3’端具有至少为两个核苷酸的突出端。

在具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)21个核苷酸的长度；

(ii)附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价的支链接头附接的三个GalNAc衍生物；以及

(iii)在位置7、10及11(自5’端计数)的2’-F修饰；

以及

(b)反义链，其具有：

(i)23个核苷酸的长度；

(ii)在位置2、6至8、9、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iii)核苷酸位置21与22之间、及核苷酸位置22与23(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；以及

(iv)在位置7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

其中该dsRNA剂具有在该反义链的3’端的包含2个核苷酸的突出端，以及位于该反义链的5’端的钝端。

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)21个核苷酸的长度；

(ii)附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价的支链接头附接的三个GalNAc衍生物；

(iii)在位置7、9、10及11(自5’端计数)的2’-F修饰；以及

(iv)核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；

以及

(b)反义链，其具有：

(i)23个核苷酸的长度；

(ii)在位置2、6、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iii)核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、及核苷酸位置22与23(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；以及

(iv)在位置7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)21个核苷酸的长度；

(iii)在位置7、9、10及11(自5’端计数)的2’-F修饰；以及

以及

(b)反义链，其具有：

(i)23个核苷酸的长度；

(ii)在位置2、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iv)在位置6或7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)21个核苷酸的长度；

(iii)在位置7、9、10及11(自5’端计数)的2’-F修饰；以及

以及

(b)反义链，其具有：

(i)23个核苷酸的长度；

(ii)在位置2、6、8、9、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iv)在位置7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)21个核苷酸的长度；

(iii)在位置7、9、10及11(自5’端计数)的2’-F修饰；以及

以及

(b)反义链，其具有：

(i)23个核苷酸的长度；

(ii)在位置2、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iv)在位置7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含反义链，该反义链具有：

(i)在位置2、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；以及

(2)在位置6或7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰。

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)ASGPR配体，其中所述ASGPR配体；

(ii)核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；

以及

(b)反义链，其具有：

(i)在位置2、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(ii)在位置6或7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在另一具体实施例中，本发明的dsRNA剂包含：

(a)正义链，其具有：

(i)附接于3’端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价的支链接头附接的三个GalNAc衍生物；

以及

(b)反义链，其具有：

(ii)在位置2、14、及16(自5’端计数)的2’-F修饰；

(iv)在位置6或7(自5’端计数)的该双链的热去稳定修饰；

在一些实施例中，该dsRNA剂进一步包含至少一个ASGPR配体。例如，该ASGPR配体是通过二价或三价的支链接头附接的一个或多个GalNAc衍生物，如：

在一个实例中，该ASGPR配体附接至该正义链的3’端。

由本文中描述的任何dsRNA剂靶向的Serpina1 mRNA的区域可是SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480、或SEQ ID NO:1的核苷酸1441-1479、或SEQ ID NO:1的核苷酸1442-1478、或SEQ ID NO:1的核苷酸1443-1477、或SEQ ID NO:1的核苷酸1444-1476、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1475、或SEQ ID NO:1的核苷酸1446-1474、或SEQ ID NO:1的核苷酸1447-1473、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1473、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1472、或SEQ IDNO:1的核苷酸1448-1471、或SEQ ID NO:1的核苷酸1448-1470、或SEQ ID NO:1的核苷酸1447-1469、或SEQ ID NO:1的核苷酸1446-1478、或SEQ ID NO:1的核苷酸1449-1471、或SEQID NO:1的核苷酸1450-1472、或SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1475、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1480、或SEQ ID NO:1的核苷酸1445-1475。

本发明还提供包含本发明的dsRNA剂的载体、细胞、及药物组合物。

本发明的药物组合物可是非缓冲溶液，如盐水或水；或缓冲溶液，如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白(prolamine)、碳酸盐、或磷酸盐或其任意组合的缓冲溶液，或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在一方面，本发明提供了一种抑制细胞内Serpina1表达的方法。该方法包括将该细胞与任何前述本发明的dsRNA剂或药物组合物接触，从而抑制该细胞内Serpina1基因的表达。

在一个实施例中，该细胞在受试者如人类受试者体内。

在一个实施例中，该Serpina1的表达被抑制至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、或约100％。

在一方面，本发明提供了一种治疗患有Serpina1相关疾病的受试者的方法。该方法包括对该受试者给予治疗有效量的任意前述本发明的dsRNA剂或药物组合物，从而治疗所述受试者。

在一个实施例中，该受试者是人。

在一个实施例中，该Serpina1相关疾病是肝脏病变。

在一个实施例中，该肝脏病变选自由慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌所组成的组。

在另一方面，本发明提供了一种于具有Serpina1缺陷性变体的受试者抑制肝细胞癌的发展的方法。该方法包括对该受试者给予治疗有效量的任意前述本发明的dsRNA剂或药物组合物，从而在该受试者抑制肝细胞癌的发展。

在又另一方面，本发明提供了一种于具有Serpina1缺陷性变体的受试者的肝脏内降低错误折叠的Serpina1积累的方法。该方法包括对该受试者给予治疗有效量的任意前述本发明的dsRNA剂或药物组合物，从而降低该受试者的肝脏内错误折叠的Serpina1的积累。

该dsRNA剂可以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量、或以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予至该个体。

该dsRNA剂可经皮下或经静脉给予至该个体。

该dsRNA剂可以两剂或更多剂给予至该受试者。

本发明借由前述详细说明及附图进一步例示性说明。

附图说明

图1A图式性描绘了AD-61444、AD-75994、及AD-75995的经修饰的正义链及反义链核苷酸序列。按出现的次序，图1A分别披露了SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:36及SEQ ID NO:39。

图1B是描绘了给予所标注的dsRNA剂对AAT(Serpina)表达水平的体内影响的图。所显示的AAT表达水平是相对于出血前的AAT表达水平。

图1C图式性描绘了AD-61444、AD-77404、及AD-77412的经修饰的正义链及反义链核苷酸序列。按出现的次序，图1C分别披露了SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:36及SEQ ID NO:39。

图1D是描绘了给予所标注的dsRNA剂对AAT(Serpina)表达水平的体内影响的图。

图2A是描绘了，治疗后16小时，AD-61444在以10nM的dsRNA剂转染的Hep3B细胞内的脱靶效应。

图2B是描绘了，治疗后16小时，AD-77412在以10nM的dsRNA剂转染的Hep3B细胞内的脱靶效应。

图3A是描绘了，在给予0.3mg/kg单剂的所标注的剂的非人灵长类动物(NHP)体内，AAT沉默的效能及耐久性。所显示的AAT表达水平是相对于给予前第-7天及第-1天测得的出血前的AAT表达水平。

图3B是描绘了在给予1mg/kg单剂的所标注的剂的非人灵长类动物体内AAT沉默的耐久性的图表。所显示的AAT表达水平是相对于给予前第-7天及第-1天测得的出血前的AAT表达水平。

图3C是描绘了在给予3mg/kg单剂的所标注的剂的非人灵长类动物体内AAT沉默的耐久性的图表。所显示的AAT表达水平是相对于给予前第-7天及第-1天测得的出血前的AAT表达水平。

图3D是描绘了在给予10mg/kg单剂的所标注的剂的非人灵长类动物体内AAT沉默的耐久性的图表。所显示的AAT表达水平是相对于给予前第-7天及第-1天测得的出血前的AAT表达水平。

具体实施方式

本发明提供了包含以Serpina1为靶向的剂如RNAi剂如双链iRNA剂的组合物。还披露了使用本发明的组合物来抑制Serpina1表达以及治疗Serpina1相关疾病如慢性肝病、肝炎、肝硬化、和/或肝细胞癌的方法。

I.定义

为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。此外，应注意，每当引用参数值的数值或范围时，其旨在位于所引用的数值之间的这些数值及范围也是本发明的一部分。

本中所使用的冠词“一个/种(a)和(an)”是指一个或超过一个(即，至少一个)的该冠词的语法对象。举例来说，“一个组件”是意指一个组件或超过一个组件，如多个组件。

本文中所使用的术语“包括”是意指短语“包括但不限于”，且可与该短语互换使用。

本文中所使用的术语“或”是意指术语“和/或”，且除非上下文另有明确说明，可与后者互换使用。

如本文所用，“Serpina1”是指丝胺酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂分支A成员1基因或蛋白。Serpina1也称为α-1-抗胰蛋白酶、AAT、蛋白酶抑制剂1、PI、PI1、抗弹性蛋白酶、及抗胰蛋白酶。

术语Serpina1包括人类Serpina1，其氨基酸序列及核苷酸序列可于，例如，基因银行登录号GI:189163524(SEQ ID NO:1)、GI:189163525(SEQ ID NO:2)、GI:189163526(SEQID NO:3)、GI:189163527(SEQ ID NO:4)、GI:189163529(SEQ ID NO:5)、GI:189163531(SEQID NO:6)、GI:189163533(SEQ ID NO:7)、GI:189163535(SEQ ID NO:8)、GI:189163537(SEQID NO:9)、GI:189163539(SEQ ID NO:10)、和/或GI:189163541(SEQ ID NO:11)中找到；恒河猕猴Serpina1，其氨基酸序列及核苷酸序列可于，例如，基因银行登录号GI:402766667(SEQ ID NO:12)、GI:297298519(SEQ ID NO:13)、和/或GI:297298520(SEQ ID NO:14)中找到；小鼠Serpina1，其氨基酸序列及核苷酸序列可于，例如，基因银行登录号GI:357588423和/或GI:357588426中找到；及大鼠Serpina1，其氨基酸序列及核苷酸序列可于，例如，基因银行登录号GI:77020249中找到。Serpina1 mRNA序列的其他实例可使用基因银行(GenBank)及OMIM轻易获取。

超过120个Serpina1的等位基因已经得以鉴定，且“M”等位基因是被认为是野生型或“正常”等位基因(如，“PIM1-ALA213”(也称为PI、M1A)、“PIM1-VAL213”(也称为PI、MIV)、“PIM2”、“PIM3”、及“PIM4”)。其他变体可于，例如，A(1)ATVar数据库中找到(参见，如，Zaimidou,S.等人(2009)Hum Mutat.[人类突变]230(3):308-13及www.goldenhelix.org/A1ATVar)。

如本文所用，术语“Serpina1缺陷性等位基因”是指产生蛋白的变体等位基因，该蛋白是不能适当地折叠且可能于细胞内集聚并因此不能被适当地自其在肝脏内的合成位点运输至身体内的作用位点。

示例性Serpina1缺陷性等位基因是包括，“Z等位基因”、“S等位基因”、“PIM(Malton)等位基因”、及“PIM(Procida)等位基因”。

如本文所用，术语“Z等位基因”、“PIZ”、及“Z-AAT”是指Serpina1的变体等位基因，其中该蛋白的位置342处的氨基酸是从谷氨酰胺变为赖氨酸，由于相关密码子从GAG变为AAG的结果。Z等位基因纯合的受试者可称为“PIZZ”。Z-AAT突变是占Serpina1缺陷性患者的95％，且估计存在于100,000美国人中，且全世界约300万个体中。该Z等位基因在高加索人种中达到多型性频率，而在黄种人及黑人中罕见或不存在。纯合ZZ表型与肺气肿和肝病的高风险相关。Z-AAT蛋白并未在内质网中正确折叠，导致环-片聚合物，该聚合物是集聚并降低分泌、未折叠蛋白应答的诱发、细胞凋亡、内质网过载应答、自体吞噬、线粒体应激、及肝细胞功能改变。

如本文所用，术语“PIM(Malton)”及“M(Malton)-AAT”是指Serpina1中的变体等位基因，其中在成熟蛋白的位置51或52处的相邻苯丙胺酸残基中的一个被删除。这一氨基酸的删除缩短了β-片层B6的一链，从而防止其在肝脏中的正常处理及分泌，此是与肝细胞包含物及该蛋白从肝脏中的分泌受损有关。

如本文所用，术语“PIS”是指Serpina1中的一种变体等位基因，其中位置264处的谷胺酸取代为缬胺酸。尽管这一变体蛋白的大部分是可经细胞内降解，但在高加索人种群中PIS等位基因出现的频率高，因此，具有Z等位基因或无效等位基因的化合物杂合子是常见的。

如本文所用，“靶标序列”是指在Serpina1基因的转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为主要转录产物的RNA处理产物的mRNA。

如本文所用，术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，该核苷酸链是借由使用标准核苷酸命名法所提及的序列来描述的。

通常，“G”、“C”、“A”及“U”各自分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。本文中，“T”与“dT”是可互换使用，且是指其中核糖碱基为胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸，如，脱氧核糖胸腺嘧啶、2’-脱氧胸苷、或胸苷。然而，应理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可是指如下文进一步详述的修饰核苷酸、或作为替代品的替换部分。技术人员很清楚，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、及尿嘧啶可由其他部分替换，而实质上并不改变包含带有此替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶、或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，本发明的核苷酸序列中的含有尿嘧啶、鸟嘌呤、或腺嘌呤的核苷酸可替换为含有诸如肌苷的核苷酸。包含这些替换部分的序列是本发明的实施例。

“多核苷酸”，也称为“寡核苷酸”，是通过相邻的核苷酸彼此共价键以形成线性聚合性寡核苷酸而形成。在该多核苷酸结构内，磷酸基团一般称为形成该多核苷酸的核苷酸间键。多核苷酸可是RNA或DNA，且例如，其长度小于约100、200、300、约400个核苷酸。

如本文中可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”，是指一种剂，其含有如本文中定义的术语的RNA，且其是经由RNA诱导沉默复合物(RISC)途径而介导RNA转录本的靶向裂解。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。该iRNA是调节如抑制细胞如受试者如哺乳动物受试者体内的细胞中Serpina1的表达。

如本文所用，短语“介导RNAi”是指以序列特异性方式沉默靶标RNA的能力。尽管不希望受理论束缚，据信，沉默使用该RNAi机构或过程、以及指导RNA如21至23个核苷酸的siRNA剂。

在一个实施例中，本发明的RNAi剂包括单链RNA，其与靶标RNA序列如Serpina1靶标mRNA序列相互作用以引导该靶标RNA的裂解。不希望受理论束缚，据信，被引入细胞内的长双链RNA是借由称为切丁酶的III型核酸内切酶而分解为siRNA(Sharp等人(2001)GenesDev.[基因与发育]15:485)。切丁酶，一种核糖核酸酶-III样酶，是将该dsRNA加工为19-23个碱基对的短干扰RNA，该短干扰RNA的特征是具备一含有2个碱基的3’突出端(Bernstein等人,(2001)Nature[自然]409:363)。随后，这些siRNA并入RNA诱导沉默复合物(RISC)，其中一个或多个螺旋酶将该siRNA双链解旋，令该互补性反义链能引导靶标识别(Nykanen等人,(2001)Cell[细胞]107:309)。一旦结合至适宜的靶标mRNA，该RISC内中的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:188)。因此，在一方面，本发明涉及单链RNA(sssiRNA)，该单链RNA在细胞内生成且促进RISC复合物的形成以影响靶标基因即Serpina1基因的沉默。因此，术语“siRNA”还用于本发明中以指如上所述的RNAi。

在另一个实施例中，该RNAi剂可是一种单链RNAi剂，其是经引入细胞或有机体内以抑制靶标mRNA。单链RNAi剂(ssRNAi)结合至RISC核酸内切酶Argonaute 2，该酶随后裂解该靶标mRNA。该单链siRNA通常为15-30个核苷酸且是经化学修饰的。单链RNAi剂的设计及测试描述于美国专利号8,101,348及Lima等人,(2012)Cell[细胞]150:883-894中，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。本文中描述的任何反义核苷酸序列可作为本文中描述的单链siRNA或作为借由Lima等人,(2012)Cell[细胞]150:883-894中描述的方法予以化学修饰者而使用。

在另一个实施例中，用于本发明的组合物及方法中的“iRNA”是双链RNA，且在本文中称为“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”、或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两条反平行且实质上互补的核酸链的双链结构，这两链称为具有相对于靶标RNA即Serpina1基因的“正义”及“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)是通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制而触发靶标RNA如mRNA的降解。

通常，dsRNA剂的各链的大部分核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中详细描述的，各链或两链还可包括一个或多个非核糖核苷酸如脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所使用的，“RNAi剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可包括在多个核苷酸的实质性修饰。如本文所用，术语“修饰核苷酸”是指独立具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键、和/或经修饰的核酸碱基的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖诸如核苷酸间键、糖部分、或核酸碱基的官能基团或原子的取代、添加或移除。适用于本发明的剂的修饰是包括本文中披露的或本领域中熟知的所有类型的修饰。出于本说明书及权利要求书的目的，任何此类修饰，如在siRNA类型分子中所使用的，是由“RNAi剂”所涵盖。

该双链区域的长度可是容许所希望靶标RNA通过RISC途径进行特异性降解的任意者，且长度范围可为约9至36碱基对，如，长度为约15-30碱基对，例如，长度为约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36碱基对，如长度为约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22碱基对。处于上文引用的范围及长度之间的范围及长度也视为本发明之的部分。

形成该双链结构的两链可是一个更长RNA分子的不同部位，或他们可是个别的RNA分子。若该两链是一个更大分子的部分，且因此借由在一链的3’端与形成该双链结构的相对另一链的5’端之间的不间断的核苷酸链而连接，则该连接的RNA链称为“发夹环”。发夹环可包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少20、至少23个或更多个未配对的核苷酸。

若dsRNA的两条实质上互补的链是由个别的RNA分子所构成，则那些分子无需但可以经共价连接。若该两链借由除了一链的3’端与形成该双连接构的相对另一链的5’端之间的不间断的核苷酸链外的手段而连接，则该连接结构称为“接头”。这些RNA链可具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数减去该双链中存在的任何突出端。除了该双链结构外，RNAi可包含一个或多个核苷酸突出端。

在一个实施例中，本发明的RNAi剂是dsRNA，其各链包含19-23个核苷酸，其是与靶标RNA序列如Serpina1靶标mRNA序列交互作用，以引导该靶标RNA的裂解。不希望受理论束缚，被引入细胞内的长双链RNA是由称为切丁酶的III型核酸内切酶分解为siRNA(Sharp等人(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:485)。切丁酶，一种核糖核酸酶-III样酶，是将该dsRNA加工为19-23个碱基对的短干扰RNA，该短干扰RNA的特征是具备一含有2个碱基的3’突出端(Bernstein等人,(2001)Nature[自然]409:363)。随后，这些siRNA并入RNA诱导沉默复合物(RISC)，其中一个或多个螺旋酶将该siRNA双链解旋，令该互补性反义链能引导靶标识别(Nykanen等人,(2001)Cell[细胞]107:309)。一旦结合至适宜的靶标mRNA，该RISC内中的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以诱导沉默(Elbashir等人,(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:188)。

如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指至少一个未配对的核苷酸，其从iRNA如dsRNA的双链结构突出端。例如，当dsRNA的一链的3’端延伸超过另一链的5’端时，或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可包含至少一个核苷酸的突出端；可替代地，该突出端可包含至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸或更多。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物或由核苷酸/核苷类似物组成，该核苷酸/核苷类似物是包括脱氧核苷酸/核苷。该突出端可位于正义链、反义链或其任意组合。另外，突出端中的核苷酸可存在于dsRNA的反义链或正义链的任一者的5’端、3’端或两端。

在一个实施例中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸，如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸，突出端在3’端和/或5’端。在一个实施例中，dsRNA的正义链具有1-10个核苷酸，如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸，突出端在3’端和/或5’端。在另一个实施例中，该突出端中的一个或多个核苷是替换为核苷酸硫代磷酸酯。

在某些实施例中，在正义链或反义链或二者的突出端可包括超过10个核苷酸，如长度为10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸的延伸长度。在某些实施例中，延伸的突出端在该双链的正义链上。在某些实施例中，延伸的突出端存在于该双链的正义链的3’端上。在某些实施例中，延伸的突出端存在于该双链的正义链的5’端上。在某些实施例中，延伸的突出端在该双链的反义链上。在某些实施例中，延伸的突出端存在于该双链的反义链的3’端上。在某些实施例中，延伸的突出端存在于该双链的反义链的5’端上。在某些实施例中，延伸的突出端中的一个或多个核苷酸替换为核苷硫代磷酸酯。

如本文所用，关于dsRNA的术语“钝的”或“钝端的”意指，在dsRNA的给定末端不存在未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，无核苷酸突出端。dsRNA中的一端或两端可是钝的。若dsRNA的两端皆为钝者，则称该dsRNA是钝端的。明确起见，“钝端的”的dsRNA是两端皆钝，即，该分子的任一端均无核苷酸突出端的dsRNA。通常来说，此分子在其整体长度将皆为双链。

术语“反义链”或“指导链”是指iRNA如dsRNA的链，该链包括实质上与靶标序列如Serpina1 mRNA互补的区域。

如本文所用，术语“互补的区域”是指该反义链与序列实质上互补的区域，例如，该序列是靶标序列，如如本文所用定义的Serpina1核苷酸序列。若该互补的区域并非与该靶标序列完全互补，则错配可在该分子的中部或末端区域。通常，最可容忍的错配是在末端区域，如在该iRNA的5’末端和/或3’末端的5、4、3、或2个核苷酸内。

如本文所用，术语“正义链”或“过客链”是指iRNA的链，其包括实质上与如本文所用定义的术语的反义链的区域互补的区域。

如本文所用，术语“裂解区域”是指定位于紧邻该裂解位点的区域。裂解位点是靶标的裂解出现处的位点。在一些实施例中，该裂解区域包含在该裂解位点的任一端且紧邻该裂解位点的3个碱基。在一些实施例中，该裂解区域包含在该裂解位点的任一端且紧邻该裂解位点的2个碱基。在一些实施例中，该裂解位点特异性地出现于由该反义链的核苷酸10及11界定的位点处，且该裂解区域包含核苷酸11、12及13。

如本文所用，且除非另有说明，当使用术语“互补”来相对于第二核苷酸序列而描述第一核苷酸序列时，该术语是指，在某些条件下，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如技术人员将会理解的。这些条件可是，例如，严苛的条件，其中严苛的条件可包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA，50℃或70℃，持续12-16小时，之后洗涤。可采用其他条件，如可与有机体内遇到的生理学相关条件。例如，互补序列是足以许可该核酸进行的相关功能如RNAi。技术人员将能确定最适用于根据该杂交核苷酸的独特应用而测试两个序列的互补性的成套条件。

当该第一核苷酸序列的核苷酸与该第二核苷酸序列的核苷酸在该第一及第二核苷酸序列的整体长度均存在碱基配对时，则这些序列相对于彼此可是“完全互补”。然而，本文中，若第一序列称为与第二序列“实质上互补”，则两个序列可是完全互补，或他们可于杂交时形成一个或多个但通常不超过4、3或2个错配碱基对，同时保持在与其独特应用最相关的条件下的杂交能力。然而，若两个寡核苷酸是设计为在杂交时形成一个或多个单链的突出端，则这些突出端在确定互补性时不应被视为错配。例如，包含一长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及另一长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中该较长的寡核苷酸包含与该较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，则出于本文中描述的目的，该dsRNA仍可称为“完全互补”。

如本文所用，“互补”序列还可包括非Watson-Crick碱基对和/或自非天然及经修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由非Watson-Crick碱基对和/或自非天然及经修饰的核苷酸形成的碱基对形成，只要满足上述关于其杂交能力的要求即可。此类非Watson-Crick碱基对包括，但不限于，G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。

本文中，术语“互补”、“完全互补”及“实质上互补”可关于dsRNA的正义链与反义链之间、或dsRNA的反义链与靶标序列之间的碱基匹配而使用，如自其使用情境可理解的。

如本文所用，与信使RNA(mRNA)的“至少一部分实质上互补”的多核苷酸是指一多核苷酸，其是实质上与感兴趣的mRNA(如，编码Serpina1的mRNA)的包括5’UTR、开放阅读框架(ORF)、或3’UTR的连续部位互补。例如，若该序列是与编码Serpina1的mRNA的非中断部位实质上互补，则多核苷酸是与Serpina1 mRNA的至少一部分互补。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂是与Serpina1靶标RNA如靶标mRNA“足够互补”，使得该dsRNA剂沉默由该靶标mRNA所编码的蛋白的产生。在另一个实施例中，本发明的dsRNA剂是与靶标RNA如该靶标mRNA“精确互补”或“完全互补”，并且该dsRNA双链剂退火，以诸如在精确互补的区域内形成仅仅由Watson-Crick碱基对制成的杂合体。“足够互补”的靶标RNA可包括与靶标RNA精确互补的内部区域(如，至少10个核苷酸)。此外，在一些实施例中，本发明的dsRNA剂特异性地区分单核苷酸差异。在此情形中，若在该单核苷酸差异区域中(如，该区域的7个核苷酸内)发现精确互补，则该dsRNA剂仅介导RNAi。

术语“BNA”是指桥接核酸，且一般是指为约束性或难接近的RNA。BNA可含有具备“固定”的C₃’内糖皱折的5元、6元、或甚至7元的桥接结构。该桥典型是并入核糖的2’位、4’位，以提供2’,4’-BNA核苷酸(如，LNA、或ENA)。BNA核苷酸的实例包括以下核苷酸：

术语“LNA”是指锁核酸，并且一般是指为约束性或难接近的RNA。LNA是经修饰的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分是用将2’羟基连接至相同核糖的4’碳之外接桥(如，亚甲基桥或伸乙基桥)修饰。例如，该桥可将该核糖“锁定”为3’内North)构象：

术语“ENA”是指伸乙基桥接的核酸，且一般是指为约束性或难接近的RNA。

如本文所用，术语“抑制”是与“降低”、“沉默”、“下调”、“阻抑”、及其他类似术语互换使用，且包括任何水平的抑制。

如本文所用，短语“抑制Serpina1的表达”包括对任何Serpina1基因(如，小鼠Serpina1基因、大鼠Serpina1基因、猴Serpina1基因、或人Serpina1基因)以及Serpina1基因的变体(如，天然出现的变体)或突变体的表达的抑制。因此，Serpina1基因可是野生型Serpina1基因、变体Serpina1基因、突变体Serpina1基因、或于遗传学操作的细胞、细胞组或有机体中的基因转殖Serpina1基因。

“抑制Serpina1基因的表达”包括对Serpina1基因的任何水平的抑制，如，对Serpina1基因的表达的至少部分阻抑，如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的抑制。

Serpina1基因的表达可基于任何与Serpina1基因表达相关的变量的水平如Serpina1 mRNA水平、Serpina1蛋白水平、或血清AAT水平予以评估。抑制可借由这些变量中的一个或多个的绝对值或相对值与对照水平相比的下降而评估。该对照水平可是本领域中使用的任意类型的对照水平，如，初始剂量基线水平、或从相似的受试者、细胞或未经处理或经对照(如，仅缓冲剂对照或非活性剂对照)处理的样本测得的水平。

如本文所用，短语“将细胞与双链RNAi剂接触”包括，借由任何可能的手段接触细胞。将细胞与双链RNAi剂接触包括，将细胞在体外与该RNAi剂接触或将细胞在体内与该RNAi剂接触。该接触可直接或间接完成。因此，例如，可借由个别施行该方法将该RNAi剂置于与该细胞物理接触，可替代地，可将该RNAi剂置于将会容许或造成其后续与该细胞接触的情况中。

例如，在体外接触细胞可借由用该RNAi剂孵育该细胞而进行。例如，在体内接触细胞可借由下述而进行：将该RNAi剂注射入该细胞所处的组织内或邻近该组织处，或借由将该RNAi剂注射入另一区域、血流或皮下空间内，使得该剂将随后到达待接触的细胞所处的组织。例如，该RNAi剂可含有配体和/或与配体偶合，如GalNAc3配体，该配体是引导该RNAi剂至感兴趣的位点如肝脏。体外及体内接触方法的组合也是可能的。对于本发明的方法，细胞还可在体外与RNAi剂接触，并随后移植入受试者体内。

如本文所用，“患者”或“受试者”是意图包括人类或非人的动物，优选地哺乳动物，如猴。最优选地，该受试者或患者是人。

如本文所用，“Serpina1相关疾病”是旨在包括与Serpina1基因或蛋白相关的任何疾病、病变、或病症。此疾病可能是由于，例如，Serpina1蛋白的错误折叠、Serpina1蛋白(如，错误折叠的Serpina1蛋白)的细胞内积累、Serpina1蛋白的过量产生、Serpina1基因变体、Serpina1基因突变、Serpina1蛋白的不正常裂解、Serpina1与其他蛋白或其他内源性或外源性物质之间的不正常交互作用。Serpina1相关疾病可是肝病和/或肺病。

如本文所用，“肝病”包括影响肝脏和/或其功能的疾病、病变、或病症。肝脏病变可是Serpina1蛋白于肝脏和/或肝脏细胞内积累的结果。肝脏病变的实例是包括源自病毒性感染、寄生虫感染、遗传预先倾向性、自体免疫疾病、曝露于辐射、曝露于肝毒性化合物、机械性损伤、多种环境性毒素、醇、乙酰胺酚、醇与乙酰胺酚的组合、吸入麻醉剂、烟酸、化学疗法、抗生素、镇痛药、止吐药及草药补充品卡瓦胡椒(herbal supplement kava)、及其组合的结果。

例如，与Serpina1缺陷相关的肝脏病变可更常出现于具有某些等位基因(如，PIZ、PiM(Malton)、和/或PIS等位基因)中的一种或多种复本的受试者。不希望受理论束缚，据认为，与α-1-抗胰蛋白酶肝病发展的较大风险相关的等位基因编码遭受错误折叠且不能适当地自肝细胞分泌的Serpina1的形式。对这些错误折叠的蛋白的细胞性应答可包括未折叠蛋白应答(UPR)、内质网相关的降解(ERAD)、细胞凋亡、ER过载应答、自体吞噬、线粒体应激及肝细胞功能改变。肝细胞的这些损伤可导致症状，例如但不限于，发炎、胆汁郁积、肝纤维化、肝硬化、梗阻性黄疸的延长、胺基转移酶的增加、门静脉高压和/或肝细胞癌。不希望受理论束缚，此疾病的高度可变的临床进程表现出变更或“二次发作(second hit)”，此造成发展出症状或严重性加重。

例如，携带PIZ等位基因的受试者可能对丙型肝炎感染或酗酒更敏感，且如果曝露于这些因子时更有可能发展出肝脏病变。携带PIZ等位基因的另外的囊性纤维化(CF)受试者处于发展出具有门静脉高压的严重肝病的较大风险。Serpina1的缺陷还可造成或造成早发性肺气肿、坏死性脂层炎、支气管扩张、和/或延长的新生儿黄疸的发展。当他们具有被α-1-抗胰蛋白酶缺陷影响的家族成员时，一些具有α-1-抗胰蛋白酶缺陷或处于具有该缺陷的风险的患者是借由筛选而得以鉴别。

示例性肝脏病变是包括，但不限于，肝炎、慢性肝病、肝硬化、肝纤维化、肝细胞癌、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积和/或减少、和/或肝细胞功能丧失。

“肝硬化”是与慢性肝受损相关的病理学状态，其包括广泛性纤维化及肝脏中的再生性结节。

“纤维化”是肝脏中纤维母细胞的增殖及疤痕组织的形成。

短语“肝功能”是指借由肝脏实施的众多生理学功能中的一种或多种。这些功能是包括，但不限于，调节血糖水平、内分泌调节、酶系统、代谢物的互变(如，酮体、固醇类、及类固醇与氨基酸)；制造血蛋白，如纤维蛋白原、血清白蛋白、及胆碱酯酶；红血球生成功能；解毒作用；胆汁形成；及维生素储存。若干用来检查肝功能的测试是本领域中熟知的，包括，例如，量测丙胺酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶、胆红素、凝血素、及白蛋白。

如本文所用，“治疗有效量”是意图包括，当将RNAi剂给予至患者用于治疗Serpina1相关疾病时，该剂的足以对该疾病进行有效治疗的量(如，借由衰减、缓解或维持现存疾病或疾病中的一种或多种症状)。该“治疗有效量”可依据该RNAi剂、该剂如何给予、疾病及其严重性、及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、借由Serpina1表达介导的病理学过程的阶段、先前或联合治疗的类型(若存在)、以及其他个体特征而改变。

如本文所用，“预防有效量”是意图包括，当将RNAi剂给予至尚未经历Serpina1相关疾病或显现该疾病症状但易罹患该疾病的患者时，该RNAi剂的足以预防或缓解该疾病或该疾病中的一种或多种症状的量。缓解该疾病包括减慢该疾病的进程或降低后来发展的疾病的严重性。该“预防有效量”可依据该RNAi剂、该剂如何给予、疾病风险的程度、及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、先前或联合治疗的类型(若存在)、以及待其他个体特征而改变。

“治疗有效量”或“预防有效量”还包括RNAi剂的量，该量是以适用于任何治疗的合理的效益/风险比而产生一些所希望局部或全身性效果。在本发明的方法中采用的RNAi剂可以足够的量给予，以产生使用于此类治疗的合理的效益/风险比。

如本文所用，术语“样本”包括自受试者分离的相似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞或组织。生物学流体的实例是包括血液、血清及浆膜液、血浆、尿液、淋巴、脑脊髓液、眼内液、唾液等。组织样本可包括来自组织、器官或局部区域的样本。例如，样本可是源自特定的器官、器官的部分、或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样本可是源自肝脏(如，整个肝脏或肝脏的某些片段或肝脏内的某些类型的细胞如肝细胞)。在优选的实施例中，“源自受试者的样本”是指自该受试者抽取的血液或血浆。在另外的实施例中，“源自受试者的样本”是指源自该受试者的肝脏组织(或其亚组分)。

II.本发明的iRNA

本文中描述了改善的双链RNAi剂，其抑制Serpina1基因于细胞中的表达，该细胞是例如受试者如哺乳动物如具有Serpina1相关疾病如肝病如慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌的人类体内的细胞。

因此，本发明提供了具有能于体内抑制靶标基因(即，Serpina1基因)的表达的化学修饰的双链RNAi剂。在本发明的某些方面，本发明的iRNA的核苷酸实质上全部经修饰。在本发明的其他实施例中，本发明的iRNA的核苷酸全部是经修饰。本发明的其中“核苷酸实质上全部经修饰”的iRNA是经大量但非完全修饰，且可包括不超过5、4、3、2、或1个未经修饰的核苷酸。

该RNAi剂包含正义链与反义链。该RNAi剂的各链的长度范围可为12-30个核苷酸。例如，各链长度可为14-30个核苷酸、长度为17-30个核苷酸、长度为19-30个核苷酸、长度为25-30个核苷酸、长度为27-30个核苷酸、长度为17-23个核苷酸、长度为17-21个核苷酸、长度为17-19个核苷酸、长度为19-25个核苷酸、长度为19-23个核苷酸、长度为19-21个核苷酸、长度为21-25个核苷酸、或长度为21-23个核苷酸。

该正义链与反义链典型是形成双链双链RNA(“dsRNA”)，本文中也称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链区域的长度可是12-30核苷酸对。例如，该双链区域的长度可为14-30核苷酸对、长度为17-30核苷酸对、长度为27-30核苷酸对、长度为17-23核苷酸对、长度为17-21核苷酸对、长度为17-19核苷酸对、长度为19-25核苷酸对、长度为19-23核苷酸对、长度为19至21核苷酸对、长度为21-25核苷酸对、或长度为21-23个核苷酸对。在另一实例中，该双链区域的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、及27个核苷酸。

在一个实施例中，该RNAi剂可于一链或两链的3’端、5’端或两端含有一个或多个突出端区域和/或封端基团。该突出端长度可是1-6个核苷酸，例如，长度为2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸、或长度为1-2个核苷酸。该突出端可是一链长于另一链的结果，或是相同长度的两链交错排列的结果。该突出端可与靶标mRNA形成错配，或其可与待作为靶标的序列互补，或可是另一序列。该第一链与第二链还可链接，如，借由另外的碱基连接以形成发夹圈，或借由其他非碱基接头连接。

在一个实施例中，该RNAi剂的突出端区域内的核苷酸可各自独立为经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于，经2’-糖修饰，如，2-F、2’-O-甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)、及其任意组合。例如，TT可是用于任一链的任一端的突出端序列。该突出端可与靶标mRNA形成错配，或其可与待作为靶标的序列互补，或可是另一序列。

在该RNAi剂的正义链、反义链、或两链的5’-或3’-突出端可经磷酸化。在一些实施例中，该突出端区域含有在其之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中该两个核苷酸可是相同或不同。在一个实施例中，该突出端是存在于该正义链、反义链、或两链的3’端。在一个实施例中，这一3’-突出端是存在于反义链中。在一个实施例中，这一3’-突出端是存在于正义链中。

该RNAi剂可仅含有单个突出端，其可强化该RNAi的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，该单链的突出端是定位于该正义链的3’末端或可替代地该反义链的3’末端。该RNAi还可具有位于该反义链的5’端(或正义链的3’端)的钝端，反之亦然。通常，该RNAi的反义链具有在3’端的核苷酸突出端，且5’端是钝的。然而不希望受理论束缚，在该反义链5’端与在该反义链3’端的突出端的不对称的钝端支持指导链加载到RISC过程中。

本发明提出的任意核酸可借由本领域中熟知的方法合成和/或修饰，该方法是诸如于Current protocols in nucleic acid chemistry[核酸化学中的当前方案],Beaucage,S.L.等人(编辑),约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约,纽约州,美国中描述的，该文献通过引用而特此并入本文。修饰是包括，例如，端修饰，如5’端修饰(磷酸化、共轭、反向键)或3’端修饰(共轭、DNA核苷酸、反向键等)；碱基修饰，如替换为稳定化碱基、去稳定化碱基、或与对方的扩展库进行碱基配对的碱基，碱基的移除(无碱基核苷酸)、或共轭的碱基；糖修饰(如，在2’-位或4’-位)或糖的替换；和/或主链修饰，包括磷酸二酯类键的修饰或替换。可用于本文中描述的实施例的iRNA化合物的具体实例是包括，但不限于，含有经修饰的主链或不含有天然核苷间键的RNA。具有经修饰的主链的RNA包括，尤其是那些于主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，且如本领域中有时所参照的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA还可视为寡核苷酸。在一些实施例中，经修饰的iRNA将在其核苷间主链中具有磷原子。

其内部不包括磷原子的经修饰的RNA主链具有下述主链：其是借由短链烷基或环烷基的核苷间键、混合的杂原子与烷基或环烷基的核苷间键、或一种或多种短链杂原子或杂环的核苷间键所形成。这些是包括具有下列的那些：吗啉基键(部分地自核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫醚、亚砜、及砜主链；甲酰基及硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基及硫代甲酰基主链；含有伸烷基的主链；胺基磺酸酯主链；亚甲基亚胺基及亚甲基肼基主链；磺酸酯及磺酰胺主链；酰胺主链；以及其他具有混合的N、O、S及CH₂组分组件的主链。

教示上述寡核苷酸的制备的代表性美国专利包括，但不限于，美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,64,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437、及5,677,439，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

在其他实施例中，适宜的RNA模拟物是预期用于iRNA中，其中该核苷酸单元的糖及核苷间键二者即主链替换为新颖的基团。这些碱基单元是被保持，用于与适宜的核酸靶标化合物杂交。已经显示为具有优异的杂交特性的一此类寡聚化合物—RNA模拟物，称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链是替换为含有酰胺的主链特别是氨基乙基甘胺酸主链。这些核酸碱基得以保留，且是直接或间接键结至该主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教示PNA化合物的制备的代表性美国专利是包括，但不限于，美国专利号5,539,082、5,714,331、及5,719,262，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。适用于本发明的iRNA中的其他PNA化合物是描述于，例如，Nielsen等人,Science[科学],1991,254,1497-1500中。

本发明提出中的一些实施例包括具有硫代磷酸酯主链的RNA及具有杂原子主链的寡核苷，且尤其是上文参考的美国专利号5,489,677的--CH₂--NH--CH₂-、--CH₂--N(CH₃)--O--CH₂--[称为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI主链]、--CH₂--O--N(CH₃)--CH₂--、--CH₂--N(CH₃)--N(CH₃)--CH₂-及--N(CH₃)--CH₂--CH₂--[其中原生磷酸二酯主链是表示为--O--P--O--CH₂--]，以及上文参考的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，本文提出的RNA具有上文参考的美国专利号5,034,506的吗啉主链结构。

经修饰的RNA还可含有一个或多个经取代的糖部分。本文中提出的iRNA如dsRNA可包括位于2’位置的以下中的一个：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基；O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基及炔基可是经取代或未经取代的C₁至C₁₀烷基或C₂至C₁₀烯基及炔基。示例性适宜的修饰包括O[(CH₂)_nO]_mCH₃、O(CH₂)_nOCH₃、O(CH₂)_nNH₂、O(CH₂)_nCH₃、O(CH₂)_nONH₂、及O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂，其中n与m是1至约10。在其他实施例中，dsRNA是包括位于2’位置的以下中的一个：C₁至C₁₀低级烷基、经取代的低级烷基、烷基芳基、芳基烷基、O-烷基芳基或O-芳基烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、经取代的硅基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入基团、用于改善iRNA的药物代谢动力学的基团、或用于改善iRNA的药效动力学特性的基团，以及其他具有相似特性的取代基。在一些实施例中，该修饰包括2’甲氧基乙氧基(2’-O--CH₂CH₂OCH₃，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报],1995,78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰是2’-二甲氨基氧乙氧基，即，O(CH₂)₂ON(CH₃)₂基团，也称为2’-DMAOE，如下文的实例中描述的；以及2’-二甲氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2’-O-二甲氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即，2’-O--CH₂--O--CH₂--N(CH₂)₂。另外，示例性修饰是包括：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-脱氧核苷酸(在这些三个家族中的R异构体及S异构体二者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。

其他修饰是包括2’-甲氧基(2’-OCH₃)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH₂CH₂CH₂NH₂)及2’-氟(2’-F)。类似的修饰还可于iRNA的RNA的其他位置处完成，特别是在3’末端核苷酸或2’-5’连接dsRNA中的糖的3’位、以及5’末端核苷酸的5’位。iRNA还可具有替代呋喃戊糖基糖的糖模拟物，如环丁基部分。教示这些经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利是包括，但不限于，美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、及5,700,920，其中的某些一般是由本申请所拥有。前述的各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

本发明的iRNA还可包括核酸碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未经修饰”或“天然”的核酸碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)及鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。经修饰的核酸碱基包括其他合成及天然的核酸碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤及鸟嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物；腺嘌呤及鸟嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、2-硫胞嘧啶；5-卤尿嘧啶及5-卤胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶及6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤、8-胺基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基及其他8-取代的腺嘌呤及鸟嘌呤；5-卤，特别是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤及7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤及8-氮杂腺嘌呤；7-去氮鸟嘌呤及7-去氮腺嘌呤；以及3-去氮鸟嘌呤及3-去氮腺嘌呤。其他核酸碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在ModifiedNucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine[生物化学、生物技术及医药中的修饰核苷酸],Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH,2008)中披露的那些、在The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering[聚合物科学与工程简明百科全书],第858-859页,Kroschwitz,J.L编辑威利父子公司(John Wiley&Sons),1990中披露的那些、由Englisch等人,(1991)Angewandte Chemie,International Edition[应用化学国际版],30:613披露的那些、以及由Sanghvi,Y S.在第15章,dsRNA Research andApplications[dsRNA研究与应用],第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑,CRC出版社(CRC Press),1993中披露的那些。这些核酸碱基中的某些是尤其可用于增加本发明中表征的寡聚化合物的结合亲和性。这些包括5-经取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6及O-6经取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。已经显示，5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编辑,dsRNA Research and Applications[dsRNA研究与应用],CRC出版社(CRCPress),波卡拉顿,1993,第276-278页)，且是示例性的碱基取代，当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时，该取代的效果尤其明显。

教示上文引述的经修饰的核酸碱基以及其他经修饰的核酸碱基的制备的代表性美国专利包括，但不限于，上文引述的美国专利号3,687,808、4,845,205、5,130,30、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941、5,750,692、6,015,886、6,147,200、6,166,197、6,222,025、6,235,887、6,380,368、6,528,640、6,639,062、6,617,438、7,045,610、7,427,672、及7,495,088，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

本发明的iRNA还可经修饰，以包括一种或多种锁核酸(LNA)。锁核酸具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连结2’碳与4’碳之外桥。这一结构有效地将该核糖“锁定”为3’内结构构象。已经显示，将锁核酸添加至siRNA增加血清中siRNA的稳定性，并降低脱靶效应(Elmen,J.等人,(2005)Nucleic Acids Research[核酸研究]33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)Mol Canc Ther[分子癌症治疗学]6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)Nucleic Acids Research[核酸研究]31(12):3185-3193)。

本发明的iRNA还可经修饰，以包括一种或多种双环的糖部分。“双环的糖”是借由两个原子的桥接而修饰的呋喃糖基环。“双环的核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，该糖部分包含连结该糖环的两个原子的桥，从而形成双环状环系统。在某些实施例中，该桥是连结该糖环的4’碳与2’碳。因此，在一些实施例中，本发明的剂可包括一种或多种锁核酸(LNA)。锁核酸具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连结2’碳与4’碳之外桥。换言之，LNA是包含双环状糖部分的核苷酸，该糖部分包含4'-CH2-O-2'桥。这一结构有效地将该核糖“锁定”为3’内结构构象。已经显示，将锁核酸添加至siRNA增加血清中siRNA的稳定性，并降低脱靶效应(Elmen,J.等人,(2005)Nucleic Acids Research[核酸研究]33(1):439-447；Mook,OR.等人,(2007)Mol Canc Ther[分子癌症治疗学]6(3):833-843；Grunweller,A.等人,(2003)Nucleic Acids Research[核酸研究]31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例是包括，但不限于，包含在4’核糖基环原子与2’核糖基环原子间的桥的核苷。在某些实施例中，本发明的反义多核苷酸剂包括一种或多种包含4’至2’桥的双环状核苷。此4’至2’桥接的双环状核苷的实例包括，但不限于，4′-(CH2)—O-2′(LNA)；4′-(CH2)—S-2′；4′-(CH2)2—O-2′(ENA)；4′-CH(CH3)—O-2′(也称为“约束的乙基”或“cEt”)及4′-CH(CH2OCH3)—O-2′(及其类似物；参见，如，美国专利号7,399,845)；4′-C(CH3)(CH3)—O-2′(及其类似物参见，如，美国专利号8,278,283)；4′-CH2—N(OCH3)-2′(及其类似物；参见，如，美国专利号8,278,425)；4′-CH2—O—N(CH3)-2′(参见，如，美国专利公开号2004/0171570)；4′-CH2—N(R)—O-2′，其中R是H、C1-C12烷基、或保护基团(参见，如，美国专利号7,427,672)；4′-CH2—C(H)(CH3)-2′(参见，如，Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2009,74,118-134)；以及，4′-CH2—C(═CH2)-2′(及其类似物；参见，如，美国专利号8,278,426)。前述的各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

教示锁核酸核苷酸的制备的另外的代表性美国专利及美国专利公开包括，但不限于，下列：美国专利号6,268,490、6,525,191、6,670,461、6,770,748、6,794,499、6,998,484、7,053,207、7,034,133、7,084,125、7,399,845、7,427,672、7,569,686、7,741,457、8,022,193、8,030,467、8,278,425、8,278,426、8,278,283、以及US 2008/0039618及US 2009/0012281，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

任何前述双环状核苷可制备为具有一种或多种立体化学糖构型，包括，例如，α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见，WO 99/14226)。

本发明的iRNA还可经修饰，以包括一种或多种约束的乙基核苷酸。如本文所用，“约束的乙基核苷酸”或“cEt”是包含双环状糖部分的锁定的核酸，该糖部分包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。在一个实施例中，约束的乙基核苷酸是S构型，本文中称为“S-cEt”。

本发明的iRNA还可包括一种或多种“构型限定的核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连结核糖的C2’碳与C4’碳或核糖的C3碳与C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将该核糖环锁定为稳定的构型，且增加与mRNA的杂交亲和性。该接头是足够长，以将氧置于对于稳定性及亲和性为最优的位置，导致更少的核糖环褶皱。

教示某些上文引述的CRN的制备的代表性出版物是包括，但不限于，美国专利公开号2013/0190383、及PCT公开WO 2013/036868，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

在一些实施例中，本发明的iRNA包含一种或多种作为UNA(未锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁非环状核酸，其中该糖的任一键是已经移除，形成未锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖在C1’-C4’间的键(即，C1’碳与C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)已经移除的单体。在另一实例中，该糖的C2’-C3’键(即，C2’碳与C3’碳之间的共价碳-碳键)已经移除(参见，Nuc.Acids Symp.Series[核酸研讨会丛刊],52,133-134(2008)即Fluiter等人,Mol.Biosyst.[分子生物系统],2009,10,1039，通过引用而特此并入)。

教示UNA的制备的代表性美国出版物包括，但不限于，美国专利号8,314,227、以及美国专利公开号2013/0096289、2013/0011922、及2011/0313020，其各自的整体内容通过引用而并入本文。

对RNA分子端的潜在稳定化修饰是包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-己酰基-4-羟基脯胺醇(Hyp-C6)、N-乙酰基-4-羟基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯胺醇(Hyp-C6-amino)、2-十二碳酰基-尿苷-3”-磷酸酯、反转碱基dT(idT)等。这一修饰的披露可在PCT公开号WO 2011/005861中发现。

本发明的iRNA的其他修饰包括5’-磷酸酯或5’-磷酸酯模拟物，如，RNAi剂的反义链的5’末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。适当的磷酸酯模拟物披露于，例如，美国专利公开案号2012/0157511中，其整体内容通过引用而并入本文。

A.包含热去稳定修饰的iRNA

如本文中描述，尤其已经发现，以Serpina1为靶向的dsRNA剂的脱靶效应可借由将热去稳定核苷酸合并于该dsRNA的反义链中的某些位置处而得以降低或抑制。在处于反义链某些位置的这些热去稳定修饰的情况下，该dsRNA剂能保持与亲代dsRNA相似的基因沉默活性，同时具有降低的脱靶基因沉默。另外，当与亲代dsRNA相比时，借由包含这些热去稳定修饰的dsRNA剂，还降低经下调或上调的脱靶基因的数目。

因此，在一方面，本发明提供了能抑制Serpina1靶标基因的表达的双链RNAi(dsRNA)剂。通常，本发明的dsRNA剂是显示高的上靶基因沉默，同时降低或最小化脱靶基因沉默和/或毒性。在没有限制的情况下，本发明的dsRNA剂可取代该dsRNA剂，且可用于基于基因沉默技术的RNA干扰，包括但不限于，体外或体内的应用。

通常，该dsRNA剂包含正义链(也称为过客链)及反义链(也称为指导链)。该dsRNA剂的各链的长度范围可为12-40个核苷酸。例如，各链长度可为14-40个核苷酸、长度为17-37个核苷酸、长度为25-37个核苷酸、长度为27-30个核苷酸、长度为17-23个核苷酸、长度为17-21个核苷酸、长度为17-19个核苷酸、长度为19-25个核苷酸、长度为19-23个核苷酸、长度为19-21个核苷酸、长度为21-25个核苷酸、或长度为21-23个核苷酸。在没有限制的情况下，该正义链与反义链可是相等的长度或不等的长度。

在一些实施例中，该反义链的长度是18至35个核苷酸。在一些方面中，该反义链的长度为21-25、19-25、19-21或21-23个核苷酸。在一些具体实施例中，该反义链的长度为23个核苷酸。与该反义链类似，在一些实施例中，该正义链的长度为18-35个核苷酸。在一些实施例中，该正义链的长度为21-25、19-25、19-21或21-23个核苷酸。在一些具体实施例中，该反义链的长度为21个核苷酸。

在一些实施例中，该正义链与该反义链的长度独立地为19、20、21、22、23、24或25个核苷酸，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为18、19、21、22、23、24或24个核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA包含在该正义链的5’端的钝端。在一些具体实施例中，正义链的长度为19、20或21或22个核苷酸，且反义链的长度为20、21或22个核苷酸。

该正义链与反义链典型是形成双链dsRNA。dsRNA剂的双链区域的长度可为12-40核苷酸对。例如，该双链区域可为14-40核苷酸对、长度为17-30核苷酸对、长度为25-35核苷酸、长度为27-35核苷酸对、长度为17-23核苷酸对、长度为17-21核苷酸对、长度为17-19核苷酸对、长度为19-25核苷酸对、长度为19-23核苷酸对、长度为19-21核苷酸对、长度为21-25核苷酸对、或长度为21-23核苷酸对。在另一实例中，该双链区域选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、及27核苷酸对的长度。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂具有长度为12-40核苷酸对的双链区域，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端。在一些具体实施例中，该双链区域的长度为18、19、20、21、22或23核苷酸对。在具体实施例中，该双链区域的长度为21核苷酸对。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含在一链的3’端、或5’端或两端的dsRNA剂的一个或多个突出端区域和/或dsRNA剂的封端基团。该突出端长度可为1-10个核苷酸、长度为1-6个核苷酸，例如，长度为2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸、或长度为1-2个核苷酸。该突出端可是一链长于另一链的结果，或是相同长度的两链交错排列的结果。该突出端可与靶标mRNA形成错配，或其可与待作为靶标的基因序列互补或可是另一序列。该第一链与第二链还可链接，如，借由另外的碱基连接以形成发夹圈，或借由其他非碱基接头连接。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂的突出端区域中的核苷酸可各自独立为经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于，2’-糖修饰，如，2-F、2’-O-甲基胸苷(T)；2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)；2’-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)；2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)；及其任意组合。例如，TT可是用于任一链的任一端的突出端序列。该突出端可与靶标mRNA形成错配，或其可与待作为靶标的基因序列互补或可是另一序列。

在本发明的dsRNA剂的正义链、反义链或两链的5’-或3’-突出端可经磷酸化。在一些实施例中，该突出端区域含有在其之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中该两个核苷酸可是相同或不同。在一些实施例中，该突出端是存在于正义链、反义链或两链的3’端。在一些实施例中，这一3’-突出端是存在于反义链中。在一些实施例中，这一3’-突出端是存在于正义链中。

本发明的dsRNA剂可仅包含单个突出端，其可强化该dsRNA的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，该单链的突出端定位于该正义链的3’末端，可替代地，位于该反义链的3’末端。该dsRNA还可具有位于该反义链的5’端(或该正义链的3’端)的钝段，反之亦然。通常，该dsRNA的反义链具有在3’端的核苷酸突出端，并且5’端是钝的。尽管不受理论束缚，在反义链的5’端的与该反义链的3’端突出端不对称的钝端支持指导链加载到RISC过程中。例如，该单个突出端的长度包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸。在一些实施例中，该dsRNA具有位于反义链的3’端的2个核苷酸，以及位于反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该dsRNA的一端是钝端并且另一端具有突出端，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)并且该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域。在一些实施例中，该突出端是在该反义链的3’端，并且该钝端是在该反义链的5’端。在一些具体实施例中，该突出端的长度为2、3或4个核苷酸。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域，其中该dsRNA的一端是钝端而另一端具有突出端，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰，且任选地，该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’端，且该钝端在该反义链的5’端。在一些实施例中，该突出端是在该反义链的3’端，并且该钝端是在该反义链的5’端。

在一些实施例中，该dsRNA具有位于该双链的两端的钝端，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，并且其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，该dsRNA剂具有长度为19、21、22或23个核苷酸碱基对的双链区域且于该双链的两端均具有钝端，其中该dsRNA之一端是钝端且另一端具有突出端，其中该反义链含有位于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)的该双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个或全部六个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰。

在一些实施例中，该反义链包含在该反义链5’区域前9个核苷酸位置内的该双链的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)热去稳定修饰。在一些实施例中，该双链的热去稳定修饰位于该反义链的自5’端计数的位置2-9，或优选地是位于位置4-8。在一些另外的实施例中，该双链的热去稳定修饰位于该反义链的自5’端计数的位置6、7或8。在仍一些另外的实施例中，该双链的热去稳定修饰位于该反义链的自5’端计数的位置7。术语“热去稳定修饰”包括将会导致具有较低的整体解链温度(Tm)(优选地比不具有此修饰的dsRNA的Tm低1、2、3或4度的Tm)的修饰。

该热去稳定修饰可包括，但不限于，无碱基的修饰；与相对链中的相核苷酸对的错配；以及糖修饰，如2’-脱氧修饰或非环状核苷酸，如，未锁核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)。

例示性无碱基的修饰是包括，但不限于下列：

其中R＝H、Me、Et或OMe；R’＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe，

其中B是经修饰或未经修饰的核酸碱基。

例示性糖修饰包括，但不限于下列：

其中B是经修饰或未经修饰的核酸碱基。

在一些实施例中，该双链的热去稳定修饰选自下列所组成的组：

其中B是经修饰或未经修饰的核酸碱基。

术语“非环状核苷酸”是指具有非环状核糖的任意核苷酸，例如，其中在核糖碳之间的任意键(如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’、或C1’-O4’)不存在和/或核糖碳或氧中的至少一个(如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地自该核苷酸缺失。在一些实施例中，非环状核苷酸是其中B是经修饰或未经修饰的核酸碱基，R¹与R²是各自独立为H、卤素、OR₃、或烷基；并且R₃是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。术语“UNA”是指未锁非环状核酸，其中该糖的任意键是已经移除，形成未锁“糖”残基。在一个实例中，UNA还涵盖C1’-C4’间的键(即，在C1’碳与C4’碳间的共价碳-氧-碳键)已经移除的单体。在另一实例中，该糖的C2’-C3’键(即，在C2’碳与C3’碳间的共价碳-碳键)已经移除(参见，Mikhailov等人,Tetrahedron Letters[四面体通讯],26(17):2059(1985)；以及Fluiter等人,Mol.Biosyst.[分子生物系统],10:1039(2009)，其通过引用而以其整体特此并入)。该非环状的衍生物提供了更大的主链灵活性，而不影响Watson-Crick配对。该非环状的核苷酸可经由2’-5’或3’-5’键连接。

术语“GNA”是指二醇核酸，其是类似于DNA或RNA但在“主链”组成上与DNA或RNA不同的聚合物，“GNA”的主链是由借由磷酸二酯键连接的重复的甘油单元构成：

该双链的热去稳定修饰可是该热去稳定核苷酸与dsRNA双链内相对链中的相核苷酸对间的错配(即，非互补性碱基对)。示例性错配碱基对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T、或其组合。本领域中已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。错配可出现于作为天然出现的核苷酸或经修饰的核苷酸的核苷酸之间，即，该错配碱基配对可出现于来自独立于该核苷酸的核糖的修饰的个别核苷酸的核酸碱基之间。在某些实施例中，该dsRNA剂在该错配中含有至少一个作为2’-脱氧核酸碱基的核酸碱基；如，该正义链中的2’-脱氧核苷酸。

在一些实施例中，该反义链的种子区域内的该双链的热去稳定修饰包括下述核苷酸，该核苷酸与靶标mRNA的互补碱基间的W-C H-键结受损，例如：

无碱基的核苷酸、非环状的核苷酸修饰(包括UNA及GNA)、和错配修饰的更多实例已经详细描述于WO 2011/133876中，其通过引用以其全文并入本文。

该热去稳定修饰还可包括具有经降低或废除的与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基、以及磷酸酯修饰。

在一些实施例中，该双链的热去稳定修饰包括具有非经典的碱基的核苷酸，例如，但不限于，具有受损或经不完全废除的与相对链中的碱基形成氢键的能力的核酸碱基修饰。已经评估这些核酸碱基修饰对于该dsRNA双链的中心区域的去稳定作用，如WO 2010/0011895中所描述，其通过引用以其全文并入本文。示例性核酸碱基修饰是：

在一些实施例中，在该反义链的种子区域内的双链的热去稳定修饰包括一种或多种与靶标mRNA的碱基互补的α-核苷酸，例如：

其中R是H、OH、OCH₃、F、NH₂、NHMe、NMe₂或O-烷基。

与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体的热稳定性的示例性磷酸盐修饰是：

用于R基团的烷基可以是C₁-C₆烷基。用于R基团的具体烷基是包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基及己基。

除了该包含热去稳定修饰的反义链之外，该dsRNA还可包含一种或多种稳定化修饰。例如，该dsRNA可包含至少2个(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)稳定化修饰。在没有限制的情况下，该稳定化修饰是可全部存在于一链中。在一些实施例中，该正义链及反义链二者皆包含至少2个稳定化修饰。该稳定化修饰可出现于正义链或反义链的任何核苷酸。例如，该稳定化修饰可出现于正义链和/或反义链上的每一核苷酸；每一稳定化修饰可以交替模式出现于正义链或反义链；或该正义链或反义链二者皆包含以交替模式出现的稳定化修饰。该正义链的稳定化修饰的交替模式可与反义链相同或不同，且正义链的稳定化修饰的全部交替模式可具有相对于反义链的稳定化修饰的交替模式的位移。

在一些实施例中，该反义链包含至少2个(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)稳定化修饰。在没有限制的情况下，该反义链中的稳定化修饰可存在于任意位置。在一些实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、6、8、9、14及16的稳定化修饰。在一些其他实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、6、14及16的稳定化修饰。在仍一些其他实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、14及16的稳定化修饰。

在一些实施例中，该反义链包含与该去稳定修饰相邻的至少一个稳定化修饰。例如，该稳定化修饰可是在该去稳定修饰的5’端或3’端，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置-1或+1，的核苷酸。在一些实施例中，该反义链包含在该去稳定修饰的5’端及3’端中的每一个，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置-1及+1，的稳定化修饰。

在一些实施例中，该反义链包含在该去稳定修饰的3’端，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置+1及+2，的至少2个稳定化修饰。

在一些实施例中，该正义链包含至少2个(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)稳定化修饰。在没有限制的情况下，该正义链中的稳定化修饰可存在于任何位置。在一些实施例中，该正义链包含位于自5’端计数的位置7、10及11的稳定化修饰。在一些其他实施例中，该正义链包含在自5’端计数的位置7、9、10及11的稳定化修饰。在一些实施例中，该正义链包含在与反义链的自该反义链5’端计数的位置11、12及15相对或互补的位置的稳定化修饰。在一些其他实施例中，该正义链包含在与反义链的自该反义链5’端计数的位置11、12、13及15相对或互补的位置的稳定化修饰。在一些实施例中，该正义链包含2、3或4个稳定化修饰的嵌段。

在一些实施例中，该正义链不包含在与反义链中双链的热去稳定修饰相对或互补的位置的稳定化修饰。

示例性热稳定化修饰是包括，但不限于，2’-氟修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA包含至少4个(如，4、5、6、7、8、9、10或更多个)2’-氟核苷酸。在没有限制的情况下，该2’-氟核苷酸可全部存在于一链中。在一些实施例中，该正义链及反义链二者皆包含至少2个2’-氟核苷酸。该2’-氟修饰可出现于正义链或反义链的任意核苷酸。例如，该2’-氟修饰可出现于正义链和/或反义链的每一核苷酸；各2’-氟修饰可以交替模式出现于正义链或反义链；或正义链或反义链二者皆包含以交替模式出现的2’-氟修饰。该正义链的2’-氟修饰的交替模式可与该反义链相同或不同，并且该正义链的2’-氟修饰的交替模式可具有相对于该反义链的2’-氟修饰的交替模式的位移。

在一些实施例中，该反义链包含至少2个(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)2’-氟核苷酸。在没有限制的情况下，该反义链中的2’-氟修饰可存在于任何位置。在一些实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、6、8、9、14及16的2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、6、14及16的2’-氟核苷酸。在仍一些其他实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置2、14及16的2’-氟核苷酸。

在一些实施例中，该反义链包含与该去稳定修饰相邻的至少1个2’-氟核苷酸。例如，该2’-氟核苷酸可是在该去稳定修饰的5’端或3’端，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置-1或+1，的核苷酸。在一些实施例中，该反义链包含在该去稳定修饰的5’端及3’端中的每一个，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置-1及+1，的2’-氟核苷酸。

在一些实施例中，该反义链包含在该去稳定修饰的3’端，即，在自该去稳定修饰的位置计数的位置+1及+2，的至少2个2’-氟核苷酸。

在一些实施例中，该正义链包含至少2个(如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)2’-氟核苷酸。在没有限制的情况下，该正义链中的2’-氟修饰可存在于任何位置。在一些实施例中，该反义链包含在自5’端计数的位置7、10及11的2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，该正义链包含在自5’端计数的位置7、9、10及11的2’-氟核苷酸。在一些实施例中，该正义链包含在与反义链的自该反义链5’端计数的位置11、12及15相对或互补的位置的2’-氟核苷酸。在一些其他实施例中，该正义链包含在与反义链的自该反义链5’端计数的位置11、12、13及15相对或互补的位置的2’-氟核苷酸。在一些实施例中，该正义链包含2、3或4个2’-氟核苷酸的嵌段。

在一些实施例中，该正义链不包含在与该反义链中双链的热去稳定修饰相对或互补的位置的2’-氟核苷酸。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含21个核苷酸(nt)的正义链及23个核苷酸(nt)的反义链，其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸出现于该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，其中该dsRNA中的一端是钝的，而另一端包含2nt的突出端，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含在该反义链的5’端的钝端。优选地，该2nt的突出端在反义链的3’端。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含正义链与反义链，其中：该正义链的长度为25-30个核苷酸残基，其中自该5’末端核苷酸(位置1)开始，所述正义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36-66个核苷酸残基，且自3’末端核苷酸开始，这些位置中的至少8个核糖核苷酸是与正义链的位置1-23中配对以形成双链；其中至少该反义链的3’末端核苷酸是未与正义链配对，且多达6个连续的3’末端核苷酸是未与正义链配对，从而形成1-6个核苷酸的3’单链突出端；其中该反义链的5’末端包含10-30个未与正义链配对的连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5’突出端；其中当将该正义链与反义链以最大互补性比对时，从而在正义链与反义链之间形成实质上双链的区域时，至少该正义链的5’末端核苷酸及3’末端核苷酸是未与反义链的核苷酸配对的碱基；且反义链是沿着该反义链长度的至少19个核糖核苷酸而与靶标RNA足够互补，以在将所述双链核酸引入哺乳动物细胞内时，降低靶标基因的表达；并且其中该反义链含有至少一个热去稳定核苷酸，其中该至少一个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链的5’端的位置2-9)，例如，该热去稳定核苷酸出现于与该正义链的5’端的位置14-17相对或互补的位置之间，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-30核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含正义链及反义链，其中所述dsRNA剂包含其长度为至少25个核苷酸且至多29个核苷酸的正义链以及其长度至多为30个核苷酸的反义链，其中该正义链包含易进行酶促降解的位于自5’端计数的位置11的经修饰的核苷酸，其中所述正义链的3’端与所述反义链的5’端是形成钝端，且所述反义链是于其3’端比该正义链长1-4个核苷酸，其中该双链区域的长度为至少25个核苷酸，并且所述反义链是沿着所述反义链长度的至少19nt与靶标mRNA足够互补，以在将所述dsRNA剂引入哺乳动物细胞内时，降低靶标基因的表达，并且其中所述dsRNA的切丁酶裂解优先产生包含所述反义链的3’端的siRNA，从而减少靶标基因在哺乳动物体内的表达，其中该反义链含有至少1个热去稳定核苷酸，其中该至少1个热去稳定核苷酸在该反义链的种子区域内(即，在该反义链5’端的位置2-9)，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；并且(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；并且(vii)该dsRNA包含长度为12-29核苷酸对的双链区域。

在一些实施例中，该dsRNA剂中的正义链及反义链中的每一个核苷酸均可经修饰。各核苷酸可经相同或不同的修饰进行修饰，该修饰可包括一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖的成分如核糖的2’羟基的改变；磷酸酯部分大规模替换为“去磷”接头；对天然出现的碱基的修饰或替换；以及，对核糖-磷酸主链的替换或修饰。

由于核酸是亚基的聚合物，多数修饰是存在于核酸内重复的位置，如，碱基、磷酸酯部分、或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在一些情形中，修饰将出现在该核酸的全部主题位置，但在多数情形中不会如此。举例而言，修饰可仅出现于3’或5’末端位置，可仅出现于末端区域内，如出现于末端核苷酸的位置或出现于链的最末2、3、4、5、或10个核苷酸中。修饰可出现于双链区域内、单链区域内、或二者中。修饰可仅出现于RNA的双链区域内，或可仅出现于RNA的单链区域内。例如，在非连接O位置的硫代磷酸酯修饰可仅出现于一个或两个末端；可仅出现于末端区域内，如出现于末端核苷酸的位置或出现于一链的最末2、3、4、5、或10个核苷酸中；或可出现于双链和单链区域中，特别在末端。5’端或两端可经磷酸化。

例如，可以提升稳定性、在突出端中包括特定的碱基、或在单链突出端如5’突出端或3’突出端或二者中包括经修饰的核苷酸或核苷酸替代品。例如，可能需要在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，3’突出端或5’突出端中的全部或一些碱基可用诸如本文中描述的修饰予以修饰。修饰可包括，如，使用本领域中熟知的修饰于核糖的2’位置进行修饰，如使用经脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)、或2’-O-甲基修饰者替代核酸碱基中的核糖；以及磷酸酯基团中的修饰，如，硫代磷酸酯修饰。突出端无需与该靶标序列同源。

在一些实施例中，该正义链及反义链的每一残基独立经LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、或2’-氟修饰。这些链可含有超过一种的修饰。在一些实施例中，该正义链及反义链的每一残基是独立经2’-O-甲基或2’-氟修饰。应理解，这些修饰是除存在于该反义链中的双链的至少一种热去稳定修饰以外。

该正义链及反义链上典型是存在至少两种不同的修饰。那两种修饰可是2’-脱氧、2’-O-甲基或2’-氟修饰；非环状的核苷酸；或其他。在一些实施例中，该正义链及反义链是各自包含两种选自2’-O-甲基或2’-脱氧的不同修饰的核苷酸。在一些实施例中，该正义链及反义链的每一残基是独立经2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-脱氧氟核苷酸、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)核苷酸、2’-O-二甲氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)核苷酸、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)核苷酸、或2’-芳基-F核苷酸修饰。此外，应理解，这些修饰是除存在于该反义链中的双链的至少一种热去稳定修饰以外。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含交替模式的修饰，尤其在B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’区域内。如本文所用，术语“交替基序”或“交替模式”是指一基序，其具有一种或多种修饰，每一修饰出现于一链的交替核苷酸。该交替核苷酸可是指每两个核苷酸中一个或每三个核苷酸中一个，或类似的模式。例如，若A、B及C各自代表一种类型的核苷酸修饰，则该交替基序可是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”、或“ABCABCABCABC…”等。

该交替基序中含有的修饰的类型可是相同或不同。例如，若A、B、C、D各自代表核苷酸上的一种类型的修饰，则该交替模式，即，每两个核苷酸上的修饰，可是相同者，但正义链或反义链可各自选自诸如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”、或“CDCDCD…”等交替基序内的修饰的若干种可能性。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含，用于正义链交替基序的修饰模式相对于用于反义链交替基序的修饰模式位移。该位移可是如此，以致正义链的核苷酸的经修饰基团对应于反义链的核苷酸的经不同修饰的基团，反之亦然。例如，当dsRNA双链中的正义链与反义链配对时，该正义链中的交替基序可自该链的5’-3’方向以“ABABAB”起始，且该反义链中的交替基序可于双链区域内自该链的3’-5’方向以“BABABA”起始。作为另一实例，该正义链中的交替基序可自该链的5’-3’方向以“AABBAABB”起始，且该反义链中的交替基序可于双链区域内自该链的3’-5’方向以“BBAABBAA”起始，使得该正义链与该反义链之间的修饰模式存在完全或部分的位移。

本发明的dsRNA剂可进一步包含至少一个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键。该硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰可出现于该正义链或反义链或二者的链任意位置的任意核苷酸。例如，该核苷酸间键修饰可出现于正义链和/或反义链的每一核苷酸；各核苷酸间键修饰可以交替模式出现于该正义链或反义链；或该正义链或反义链包含交替模式的两种核苷酸间键修饰。该正义链的核苷酸间键修饰的交替模式可与反义链相同或不同，且该正义链的核苷酸间键修饰的交替模式可具有相对于该反义链核苷酸间键修饰的交替模式的位移。

在一些实施例中，该dsRNA剂包含位于突出端区域中的硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。例如，该突出端区域包含在其之间具有硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的两个核苷酸。还可以进行核苷酸间键修饰以连接该突出端核苷酸与双链区域内的末端的配对的核苷酸。例如，至少2、3、4个或全部的突出端核苷酸可通过硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键得以连接，且任选地，可能存在连接该突出端核苷酸与紧邻该突出端核苷酸的配核苷酸对的另外的硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键。例如，可能在末端三个核苷酸之间存在至少2个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，且第三个是紧邻该突出端核苷酸的配对核苷酸。优选地，这些末端的三个核苷酸可在反义链的3’端。

在一些实施例中，该dsRNA剂的正义链包含1-10个嵌段，各嵌段为2至10个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述正义链与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的反义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的反义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含2个嵌段，各嵌段为2个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含2个嵌段，各嵌段为3个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含4个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含5个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含6个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含7个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3、4、5、6、7或8个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含8个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3、4、5或6个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，该dsRNA剂的反义链包含9个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键的2个嵌段，这些嵌段是借由1、2、3或4个磷酸酯核苷酸间键分隔的，其中这些硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键中的一个置于寡核苷酸序列的任意位置，且所述反义链是与包含硫代磷酸酯、磷酸甲酯及磷酸酯核苷酸间键的任意组合的正义链配对或与包含硫代磷酸酯或磷酸甲酯或磷酸酯键的正义链配对。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在该正义链和/或反义链1-10个的末端位置内中的一个或多个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可通过位于该正义链和/或反义链的一端或两端的硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键得以连接。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在该正义链和/或反义链各自的双链的内部区域的1-10内的一个或多个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可通过位于该正义链的双链区域自5’端计数的位置8-16的硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键得以连接；该dsRNA剂可任选地进一步包含在末端的1-10内的一个或多个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在该正义链(自5’端计数)的位置1-5的1至5个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23的1至5个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2以及位置18-23的1至5个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯或磷酸甲酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含在正义链(自5’端计数)的位置1-5的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及在反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在位置18-23内的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含位于正义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置20及21的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含位于正义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置20及21的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含位于正义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21及22的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含位于正义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21及22的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含含位于正义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置22及23的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂进一步包含位于正义链(自5’端计数)的位置1的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置21的1个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及位于反义链(自5’端计数)的位置1及2的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及位于位置22及23的2个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。

在一些实施例中，该反义链包含位于核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链种子区域内(即，位于该反义链5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该反义链包含在核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链种子区域内(即，位于该反义链5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该正义链与配体共轭；(iii)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该正义链包含位于核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有位于该反义链种子区域内(即，位于该反义链5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)该正义链与配体共轭；(iv)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(v)该正义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(viii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，该正义链包含在核苷酸位置1与2之间、及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，该反义链包含在核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间、及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该反义链含有在该反义链种子区域内(即，在该反义链5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰，并且其中该dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)该反义链包含2、3、4、5或6个2’-氟修饰；(ii)该正义链与配体共轭；(iii)该正义链包含2、3、4或5个2’-氟修饰；(iv)该正义链包含3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)该dsRNA包含至少4个2’-氟修饰；(vi)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；并且(vii)该dsRNA具有在该反义链的5’端的钝端。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂在双链内包含与靶标的错配或其组合。该错配可出现于突出端区域或双链区域内。该碱基配对可基于其促进解离或解链(如，在特定配对的联合或解离的自由能，最简单的途径是基于独立配对而检查这些配对，但还可使用下一邻近分析或相似分析)的优先性而排名。以促进解离的观点来看：A:U优于G:C；G:U优于G:C；且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，如非经典配对或除经典配对外(如本文中他处所描述)优于经典(A:T、A:U、G:C)配对；且包括通用碱基的配对优于经典配对。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂包含，该双链区域内自反义链5’端计数的前1、2、3、4、或5碱基对中的至少一个可独立选自下述组：A:U、G:U、I:C、及错配的配对，如，包括通用碱基的非典型配对或除经典配对之外，以促进该反义链在该双链的5’端解离。

在一些实施例中，在该反义链中该双链区域内自5’端计数的位置1的核苷酸选自下列所组成的组：A、dA、dU、U、及dT。可替代地，该双链区域内自反义链5’端计数的前1、2或3碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，该双链区域自该反义链5’端计数的第一碱基对是AU碱基对。

已经发现，将4’-修饰和/或5’-修饰的核苷酸引入单链寡核苷酸或双链寡核苷酸的任意位置处的二核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)、和/或二硫代磷酸酯(PS2)键的3’端，可赋予该核苷酸间键以三维效果，并因此保护或稳定化其不被核酸酶影响。

在一些实施例中，将5’-修饰的核苷引入单链或双链siRNA的任意位置处的二核苷酸的3’端。例如，可将5’-烷基化核苷引入单链或双链siRNA的任意位置处的二核苷酸的3’端。该位于核糖的5’位置的烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷是5’-甲基核苷。该5’-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。

在一些实施例中，将4’-修饰的核苷引入单链或双链siRNA的任意位置处的二核苷酸的3’端。例如，可将4’-烷基化核苷引入单链或双链siRNA的任意位置处的二核苷酸的3’端。该位于核糖的4’位置的烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷是4’-甲基核苷。该4’-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。可替代地，可将4’-O-烷基化核苷引入单链或双链siRNA的任意位置处的二核苷酸的3’端。该核糖的4’-O-烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷是4’-O-甲基核苷。该4’-O-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。

在一些实施例中，将5’-烷基化核苷引入dsRNA的正义链或反义链的任意位置，且此修饰是维持或改善该dsRNA的潜能。该5’-烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷是5’-甲基核苷。该5’-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。

在一些实施例中，将4’-烷基化核苷引入dsRNA的正义链或反义链的任意位置，且此修饰是维持或改善该dsRNA的潜能。该4’-烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷是4’-甲基核苷。该4’-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。

在一些实施例中，可将4’-O-烷基化核苷引入dsRNA的正义链或反义链的任意位置，且此修饰是维持或改善该dsRNA的潜能。该5’-烷基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷是4’-O-甲基核苷。该4’-O-甲基可是外消旋或手性纯的R或S异构体。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂可包含2’-5’键(具有2’-H、2’-OH及2’-OMe且具有P＝O或P＝S)。例如，该2’-5’键修饰可用来促进核酸酶抗性或用来抑制正义链至反义链的结合，或可用于正义链的5’端以避免正义链被RISC激活。

在另一个实施例中，本发明的dsRNA剂可包含L糖类(如，具有2’-H、2’-OH及2’-OMe的L-核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖类修饰可用来促进核酸酶抗性或用来抑制正义链至反义链的结合，或可用于正义链的5’端以避免正义链被RISC激活。

多种出版物描述了多体siRNA，该多体siRNA可全部与本发明的dsRNA一起使用。这些出版物是包括WO 2007/091269、美国专利号7858769、WO 2010/141511、WO 2007/117686、WO 2009/014887及WO 2011/031520，其是通过引用而以其整体特此并入。

如下文中详细讨论的，含有一个或多个碳水化合物部分与dsRNA剂的共轭的dsRNA剂可优化该dsRNA剂中的一种或多种特性。在多种情形中，该碳水化合物部分将附接至该dsRNA剂的经修饰的亚基。例如，dsRNA剂中的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖可替换为另一部分，如，其附接有碳水化合物配体的非碳水化合物(优选地环状)载体。本文中，其核糖已经如此替换的核糖核苷酸亚基是指为核糖替换修饰亚基(RRMS)。环状载体可是碳环系环系统，即，全部环原子皆为碳原子；或是杂环系环系统，即，一个或多个环原子可是杂原子，如，氮、氧、硫。该环状载体可是单环系环系统，或可含有两个或更多个环，如稠环。该环状载体可是完全饱和的环系统，或其可含有一个或多个双键。

该配体可经由载体而附接至该多核苷酸。这些载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选两个“主链附接点”；以及(ii)至少一个“系栓附接点”。如本文所用，“主链附接点”是指官能基团，如，羟基基团；或通常，可用于且适用于将载体并入主链，如，核糖核酸的磷酸酯，或经修饰的磷酸酯如含硫的磷酸酯主链。在一些实施例中，“系栓附接点”(TAP)是指该环状载体的构件环原子，如碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)，其连结所选择的部分。该部分可是，如，碳水化合物如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖及多糖。任选地，所选择的部分是借由介导系拴连结至该环状载体。因此，该环状载体一般将包括官能基团，如氨基基团，或通常，提供了适用于将另一化学整体如配体合并或系拴至该构件环的键。

在一实施例中，本发明的dsRNA剂是经由载体共轭至配体，其中该载体可是环状基团或非环状基团；优选地，该环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基及十氢萘；优选地，该非环状基团选自丝胺醇主链或二乙醇胺主链。

本发明的双链RNA(dsRNA)剂可任选地经共轭至一个或多个配体。该配体可附接至正义链、反义链或两链的3’端、5’端或两端。例如，该配体可共轭至正义链，尤其是正义链的3’端。

在一些实施例中，本发明的dsRNA剂是经5’磷酸化，或是包括位于5’首要终端的磷酰基类似物。5’-磷酸修饰是包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。适当的修饰是包括：5’-单磷酸酯((HO)₂(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷封帽(7-甲基化或非甲基化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷封帽(Appp)，以及任何经修饰或未经修饰的核苷酸封帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)₂(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫代磷酸酯((HO)₂(O)P-S-5’)；氧/硫经替换的单磷酸酯、二磷酸酯、及三磷酸酯的任何另外的组合(如，5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等)、5’-磷酰胺化物((HO)₂(O)P-NH-5’、(HO)(NH₂)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸酯(R＝烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，如，RP(OH)(O)-O-5’-、5’-烯基膦酸酯(即，乙烯基、经取代的乙烯基)、(OH)₂(O)P-5’-CH₂-)、5’-烷基醚膦酸酯(R＝烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH₂-)、乙氧基甲基等，如，RP(OH)(O)-O-5’-)。在一实例中，该修饰可置于dsRNA剂的反义链中。

III.共轭至配体的iRNA

本发明的iRNA的RNA的另一修饰牵涉将一个或多个提升该iRNA的活性、细胞分布、或细胞摄取如摄取入细胞的配体、部分或化学连接至该iRNA。这些部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1989,86:6553-6556)。在其他实施例中，该配体是胆酸(Manoharan等人,Biorg.Med.Chem.Let.[生物有机和药物化学快报],1994,4:1053-1060)；硫醚，如绿柱石-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],1992,660:306-309；Manoharan等人,Biorg.Med.Chem.Let.[生物有机和药物化学快报],1993,3:2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1992,20:533-538)；脂肪族链，如十二碳二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J[欧洲分子生物学杂志],1991,10:1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯],1990,259:327-330；Svinarchuk等人,Biochimie[生物化学],1993,75:49-54)；磷脂质，如，二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸三乙基铵(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体通讯],1995,36:3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究],1990,18:3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides[核苷和核苷酸],1995,14:969-973)；或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体通讯],1995,36:3651-3654)；棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],1995,1264:229-237)；或十八烷基胺或己基胺-羰氧基胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学和实验治疗学杂志],1996,277:923-937)。

在某些实施例中，配体变更其所并入的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施例中，配体提供了诸如较不存在此配体的物质提升的对所选靶标如分子、细胞或细胞类型、隔室如细胞或器官隔室、组织、器官或身体的区域。优选的配体并不参与双链核酸中的双链配对。

配体可包括天然出现的物质，如蛋白(如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(如，葡聚糖、支链淀粉、几丁质、几丁聚糖、菊糖、环糊精、N-乙酰基葡糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、或玻尿酸)；或脂质。该配体还可是重组或合成分子，如合成聚合物，如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚赖氨酸(PLL)、聚L天冬胺酸、聚L-谷胺酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、或聚膦嗪。聚酰胺的实例是包括：聚乙烯基亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、类肽聚胺、树枝状聚胺、精胺酸、脒、精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的四级盐、或α-螺旋肽。

配体还可包括靶向基团，如细胞或组织靶向剂，如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白，如抗体，其结合至具体的细胞类型如肾细胞。靶向基团可是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺、多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋白、双磷酸盐、聚谷胺酸盐、聚天冬胺酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。

在一个实施例中，该配体是去唾液酸糖蛋白受体配体。如本文所用，“去唾液酸糖蛋白受体配体”或“ASGPR配体”是一种配体，如碳水化合物配体(下文讨论)，其将本发明的dsRNA剂以肝细胞为靶标。在某些实施例中，该配体是一种或多种半乳糖，如，N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或一种或多种GalNAc衍生物。

配体的其他实例包括染料、插入剂(如，吖啶类)、交联剂(如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉类(TPPC4、塔克沙菲瑞(texaphyrin)、沙菲瑞(Sapphyrin))、多环芳香族烃类(如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(如，EDTA)、亲脂性分子(如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睪酮、1,3-双-O-(十六烷基)甘油、香叶基氧己基基团、十六烷基甘油、莰醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)及肽共轭物(如，黑复果蝇触足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]₂、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射标记的标记物、酶、半抗原(如，生物素)、运输/吸收促进因子(如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑共轭物、四氮杂大环类的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。

配体可是蛋白如糖蛋白，或肽如具有与共配体的特异亲和性的分子，或抗体如结合至具体的细胞类型如肝细胞的抗体。配体还可包括激素及激素受体。他们还可包括非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺、多价甘露糖、或多价海藻糖。该配体可是，例如，脂多糖、p38MAP激酶的活化因子、或NF-κB的活化因子。

该配体可是物质，如可借由诸如打断细胞的细胞骨架，如借由打断细胞的微管、微丝、或中间丝而增加该iRNA剂至细胞内的摄取的药物。该药物可是，例如，紫杉醇、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林(latrunculin)A、鬼笔环肽(phalloidin)、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)、或肌基质蛋白(myoservin)。

在一些实施例中，如本文中描述的附接至iRNA的配体充当药物动力学调节因子(PK调节因子)。PK调节因子包括亲脂物、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节因子包括，但不限于，胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂质、神经脂质、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素。还已知，包含大量硫代磷酸酯键的寡核苷酸结合至血清蛋白，使得在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短核苷酸如约5个碱基、10个碱基、15个碱基、或20个碱基的寡核苷酸还可作为本发明中的配体(如，作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(如，血清蛋白)的适配体还适合作为PK调节配体用于本文所描述的实施例中。

本发明的配体共轭的iRNA可借由使用承载侧链反应性官能基的寡核苷酸而合成，该寡核苷酸例如自附接连接分子于该寡核苷酸而衍生者(揭示于下)。这一反应性寡核苷酸可直接与可商购的配体、合成为承载多种保护基团中的任一者的配体、或具有附接于其的连接部分的配体反应。

在本发明的共轭物中使用的寡核苷酸可通过熟知的固相合成技术便利且常规地合成。用于此合成的设备是由若干供货商贩卖，该设备包括，例如，Applied(福斯特市,加利福亚洲)。可另外或另行采用本领域中已知的用于此合成的任何其他方法。还已知，使用相似的技术制备其他寡核苷酸，如该硫代磷酸酯及烷基化的衍生物。

在本发明的配体共轭的iRNA及承载配体分子的序列特异性连接的核苷酸中，可使用标准核苷酸或核苷前体、或已经承载连接部分的核苷酸或核苷共轭物前体、或已经承载该配体分子的配体-核苷酸或核苷共轭物前体、或承载非核苷配体的构件模块在适当的DNA合成器上组装该寡核苷酸及寡核苷。

当使用已经承载连接部分的核苷酸共轭物前体时，该序列特异性连接的核苷的合成典型是完全，且该配体分子随后与连接部分反应以形成配体共轭的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或经连接的核苷是借由使用自配体-核苷共轭物以及可商购且可于寡核苷酸合成中便利使用的标准亚磷酰胺及非标准亚磷酰胺的自动合成器合成。

A.脂质共轭物

在某些实施例中，该配体或共轭物是脂质或脂质基分子。此脂质或脂质基分子优选地结合至血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)。HAS结合配体容许共轭物分配至靶标组织，如身体的非肾脏靶标组织。例如，该靶标组织可是肝脏，包括肝脏的实质细胞。还可使用可结合HAS的其他分子作为配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或脂质基配体可(a)增加对于该共轭物的降解的抗性，(b)增加靶向或运输至靶标细胞或细胞膜内，或(c)可用以调节至血清蛋白如HAS的结合。

脂质基配体可用以抑制，如调控该共轭物与靶标组织的结合。例如，更强地结合至HAS的脂质或脂质基配体将会更不可能以肾脏为靶标，并因此更不可能从身体清除。不太强地结合至HAS的脂质或脂质基配体可用以将该共轭物以肾脏为靶标。

在某些实施例中，该脂质基配体结合HAS。优选地，其以足够的亲和性结合HAS，使得该共轭物优选将分配至非肾脏的组织。然而，优选地该亲和力不足够强，使得该HSA-配体结合不可逆。

在其他实施例中，该脂质基配体与HAS弱结合或完全不结合，使得该共轭物优选将分配至肾脏。其他以肾细胞为靶标的部分还可用来替换该脂质基配体，或除使用该脂质基配体外还使用该其他部分。

在另一方面，该配体是由靶标细胞如增殖细胞摄取的部分，如维生素。这些是尤其可用于治疗以非所希望细胞增殖如恶性或非恶性类型细胞如癌细胞的增殖为特征的病变。示例性维生素是包括维生素A、E、及K。其他示例性维生素是B族维生素，如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛、或其他维生素，或被靶标细胞如肝细胞摄取的其他维生素或营养物。还包括HAS及低密度脂蛋白(LDL)。

B.细胞渗透剂

在另一方面，该配体是细胞渗透剂，优选地螺旋状细胞渗透剂。优选地，该剂是两性。示例性剂是肽，如tat或果蝇触足肽(antennopedia)。若该剂是肽，其可经修饰，包括拟肽、反转异构体、非肽或假肽键，以及使用D-氨基酸。该螺旋状剂优选地α-螺旋状剂，其优选具有亲脂相及疏脂相。

该配体可是肽或拟肽。拟肽(本文中也称为寡拟肽)是能折叠为所定义的与天然肽类似的三维结构。肽及拟肽至iRNA剂的附接可影响iRNA的药物动力学的分配，如借由提升细胞识别及吸收。该肽或拟肽部分可是约5-50个氨基酸的长度，如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50个氨基酸的长度。

肽或拟肽可是，例如，细胞渗透肽、阳离子肽、两性肽、或疏水性肽(如，主要由Tyr、Trp、或Phe组成)。该肽部分可是二聚体肽、约束肽或交联肽。在另一选择中，该肽部分可包括疏水性膜转位序列(MTS)。示例性的含疏水性MTS的肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:29)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:30))还可是靶向部分。该肽部分可是“递送”肽，其可携带大的极性分子穿越细胞膜，该大的极性分子是包括肽、寡核苷酸、及蛋白。例如，已经发现，来自HIVTat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:31)及果蝇触足肽(DrosophilaAntennapedia)蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:32)能作为递送肽而发挥功能。肽或拟肽可借由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示库、或一珠一物(OBOC)组合库中鉴定的肽(Lam等人,Nature[自然],354:82-84,1991)。经由用于细胞靶向目的的合并的单体单元而系拴至dsRNA剂的肽或拟肽的实例是精胺酸-甘胺酸-天冬胺酸(RGD)肽，或RGD模拟物。肽部分的长度可为约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围。这些肽部分可具有结构性修饰，以诸如增加稳定性或引导构象性特性。可使用以下所述的任何结构性修饰。

在本发明的组合物及方法中使用的RGD肽可是线性或环状，且可经修饰，如糖基化或甲基化，以促进其至特定组织的靶向。含有RGD的肽及拟肽可包括D-氨基酸，以及合成性RGD模拟物。除RGD之外，人们还可使用以整合素配体为靶标的其他部分。此配体的共轭物优选地以PECAM-1或VEGF为靶标。

“细胞渗透肽”能渗透细胞，如，微生物细胞如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞如人细胞。微生物细胞渗透肽可是，例如，α-螺旋线性肽(如，LL-37或天蚕抗菌肽(Ceropin)P1)、含二硫键的肽(如，α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽(bactenecin))、或仅含有一种或两种支配性氨基酸的肽(如，PR-39或碱性抗菌肽(indolicidin))。细胞渗透肽还可包括核定位讯号(NLS)。例如，细胞渗透肽可是由两部分构成的两性肽，如MPG，其是衍生自HIV-1gp41的融合肽域及SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]31:2717-2724,2003)。

C.碳水化合物共轭物

在本发明的组合物及方法的在一些实施例中，iRNA进一步包含碳水化合物。该碳水化合物共轭的iRNA在核酸的体内递送方面有优势，且该组合物是适用在体内治疗用途，如本文所述。如本文所用，“碳水化合物”是指一化合物，其或为碳水化合物自身，由一个或多个具有至少6个碳原子(其可是线性、支链或环状)且氧、氮或硫原子结合至各碳原子的单糖单元制成；或其一部分为碳水化合物部分的化合物，由一个或多个各自具有至少6个碳原子(其可是线性、支链或环状)且氧、氮或硫原子结合至各碳原子的单糖单元制成。代表性碳水化合物是包括糖类(单糖、二糖、三糖、及含有约4、5、6、7、8、或9个单糖单元的寡糖)、及多糖如淀粉、糖原、纤维素及多糖胶。具体的单糖是包括C5及以上(如，C5、C6、C7、或C8)糖；二糖及三糖包括具有两个或三个单糖单元(如，C5、C6、C7、或C8)的糖。

在某些实施例中，用于本发明的组合物及方法中的碳水化合物共轭物是单糖。

在一个实施例中，用于本发明的组合物及方法中的碳水化合物共轭物选自下列所组成的组：

其中Y是O或S且n是3至6(式XXIV)；

其中Y是O或S且n是3-6(式XXV)；

其中X是O或S(式XXVII)；

在另一个实施例中，用于本发明的组合物及方法的碳水化合物共轭物是单糖。在一个实施例中，该单糖是N-乙酰基半乳糖胺，如

在本文中描述的实施例中使用的另一代表性碳水化合物共轭物包括，但不限于，

当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一者是氢。

在本发明的某些实施例中，该GalNAc或GalNAc衍生物是经由单价接头而附接至本发明的iRNA剂。在一些实施例中，该GalNAc或GalNAc衍生物是经由二价接头而附接至本发明的iRNA剂。在本发明的又其他实施例中，该GalNAc或GalNAc衍生物是经由三价接头而附接至本发明的iRNA剂。

在一个实施例中，本发明的双链RNAi剂包含一个GalNAc或GalNAc衍生物，其附接至该iRNA剂，如dsRNA剂的正义链的5’端、或双靶标RNAi剂中的一个或两个正义链的5’端，如本文中描述。在另一个实施例中，本发明的双链RNAi剂包含多个(如，2、3、4、5、或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其是通过多个单价接头而各自独立附接至双链RNAi剂的多个核苷酸。

在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA剂的两链是一个较大分子的一部分，该较大分子是借由不间断的核苷酸链而于一链的3’端与各自另一个的5’端之间连结以形成包含多个未配核苷酸对的发夹环圈时，该发夹环中每一未配对的核苷酸可独立包含经由单价的接头而附接的GalNAc或GalNAc衍生物。

在一些实施例中，该碳水化合物共轭物进一步包含一个或多个如上所述的其他配体，例如，但不限于，PK调节子或细胞渗透肽。

适用于本发明的另外的碳水化合物共轭物及接头包括那些于PCT公开号WO 2014/179620号及第WO 2014/179627中描述的，其各自的整体内容通过引用而并入本文。

D.接头

在一些实施例中，本文中描述的共轭物或配体可附接至iRNA寡核苷酸，该寡核苷酸具有多个可裂解或不可裂解的接头。

术语“接头”或“连接基团”意指连结化合物的两个部分的有机体，如，共价附接化合物的两个部分。接头典型包含直接键结或原子如氧或硫；单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO₂、SO₂NH或原子的链，例如，但不限于，经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可由O、S、S(O)、SO₂、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、或经取代或未经取代的杂环基中断或封端；其中R8是氢、酰基、脂肪族基、或经取代的脂肪族基。在一个实施例中，该接头是约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18、7-17、8-17、6-16、7-17、或8-16个原子。

可裂解的连接基团是于细胞外部足够稳定的那个，但其一旦进入靶标细胞即裂解以释放由该接头保持在一起的两个部分。在一个优选实施例中，该可裂解的基团在靶标细胞或在第一参考条件(其可例如经选择以模拟或代表细胞内条件)下的裂解比受试者的血液中或于第二参考条件(例如，其可经选择以模拟或代表于血液或血清中发现的条件)下的裂解快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、或更高、或至少100倍。

可裂解的连接基团是易受裂解剂，如pH、氧化还原电位、或降解性分子的存在的影响。通常，裂解剂在细胞内部比血清或血液中更普遍，或被发现在前者中具有更高的水平或活性。此类降解性剂的实例是包括：氧化还原剂，其是经选择用于特定的基质或其是不具有基质特异性，包括，如，细胞内存在的氧化性或还原性酶、或还原性剂如硫醇，其可借由还原反应而降解氧化还原可裂解的基团；酯酶；可创建酸性环境的核内体或剂，如，那些导致5或更低的pH；可借由充当一般性酸以水解或降解酸可裂解的基团的酶、肽酶(其可是基质特异性)、及磷酸酶。

可裂解的键基团，如二硫键，是易受pH的影响。人血清的pH是7.4，而细胞内的平均pH略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0；且溶酶体具有更酸性的pH，为约5.0。一些接头将会具有可裂解的连接基团，该链接基团于优选的pH裂解，从而将阳离子脂质从该配体释放入细胞内，或释放入该细胞的所希望隔室内。

接头可包括可借由特定酶而裂解可裂解的连接基团。并入接头中的可裂解的连接基团的类型可取决于待作为靶标的细胞。例如，肝靶向配体可通过包括酯基团的接头而连接至阳离子脂质。肝细胞是富含酯酶，并且因此，该接头于肝细胞中将会比在并非富含酯酶的细胞类型中更有效地裂解。其他富含酯酶的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞、及睪丸细胞。

当靶向细胞类型富含肽酶者如肝细胞及滑膜细胞时，可使用含有肽键的接头。

通常，可借由测试降解性剂(或条件)裂解候选的可裂解的连接基团的能力而评估该候选的连接基团的适用性。还期望也测试该候选的可裂解的连接基团于血液中或当与其他非靶标组织接触时对抗裂解的能力。因此，人们可测定第一条件与第二条件之间裂解的相对易感性，其中该第一条件是选择为标示靶标细胞中的裂解，而第二条件是选择为标示其他组织或生物流体如血液或血清中的裂解。该评估可于无细胞系统中、细胞内、细胞培养物中、器官或组织培养物中、或全动物体内进行。在无细胞或培养条件下进行初始评估并借由在全动物体内的进一步评估予以证实，可能是有用的。在优选的实施例中，可用的候选化合物与细胞内(或选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解比血液或血清中(或选择为模拟细胞外条件的体外条件下)的裂解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或100倍。

i.氧化还原可裂解的连接基团

在某些实施例中，可裂解的连接基团是氧化还原可裂解的链接基团，该链接基团于还原或氧化时裂解。还原性可裂解的连接基团的实例是二硫连接基团(-S-S-)。为了测定候选的可裂解的连接基团是否适用于“还原性可裂解的连接基团”，或例如，适用于与可预期用于本文中描述的方法的特定的iRNA部分及特定的靶向剂合用。例如，可借由用二硫苏糖醇(DTT)或使用本领域中已知的试剂的其他还原剂而评估候选者，其模拟将会在细胞如靶标细胞内观察到的裂解速率。这些候选者亦可于选择为模拟血液或血清条件的条件下评估。在一个实施例中，候选的化合物于血液中裂解至多约10％。其他实施例中，可用的候选化合物于细胞内(或选择为模拟细胞内条件的体外条件)的降解比血液中(或选择为模拟细胞外条件的体外条件下)的降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或约100倍。可使用标准酶动力学测定在选择为模拟细胞内介质中测定候选化合物的裂解速率，并与选择为模拟细胞外介质的条件比较。

ii.磷酸酯基可裂解的连接基团

其他实施例中，可裂解的接头包含磷酸酯基可裂解的连接基团。磷酸酯基可裂解的连接基团是借由降解或水解该磷酸酯基团的剂裂解。在细胞内裂解磷酸酯基团的剂的实例是酶，如细胞内的磷酸酶。磷酸酯基连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、及-O-P(S)(H)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-。这些候选者可使用与以上所述的那些类似的方法评估。

iii.酸可裂解的连接基团

在其他实施例中，可裂解的接头包含酸可裂解的连接基团。酸可裂解的连接基团是在酸性条件下裂解的连接基团。在优选的实施例中，酸可裂解的连接基团是在pH为约6.5或更低(如，约6.0、5.5、5.0、或更低)的酸性条件下裂解，或借由可充当一般性酸的剂如酶裂解。在细胞中，特异性低pH细胞器，如核内体及溶酶体，可向酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙、酯、及氨基酸的酯。酸可裂解的基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O、或-OC(O)。当碳附接至酯的氧(烷氧基)时，优选的实施例是芳基基团、经取代的烷基基团、或叔烷基基团如二甲基戊基或叔丁基。这些候选者可使用与以上所述的那些类似的方法评估。

iv.酯基连接基团

在其他实施例中，可裂解的接头包含酯基可裂解的连接基团。酯基可裂解的连接基团是借由细胞内的酶如酯酶及酰胺酶裂解。酯基可裂解的连接基团的实例包括，但不限于，亚烷基的酯、亚烯基的酯、及亚炔基的酯。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-、或-OC(O)-。这些候选者可使用与以上所述的那些类似的方法评估。

v.肽基可裂解基团

在又其他实施例中，可裂解的接头包括肽基可裂解的连接基团。肽基可裂解的连接基团借由细胞内的酶如肽酶及蛋白酶裂解。肽基可裂解的连接基团于氨基酸之间形成以获得寡肽(如，二肽、三肽等)及多肽的肽键。肽基可裂解的基团并不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。该酰胺基团可形成在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间。肽键是形成在氨基酸之间以获得肽及蛋白的具体类型的酰胺键。肽基可裂解基团通常限于在氨基酸之间形成的而获得肽及蛋白的肽键(亦即，酰胺键)且并不包括整个酰胺官能基团。肽基可裂解的连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选者可使用与以上所述的那些类似的方法评估。

在一些实施例中，本发明的iRNA是通过接头共轭至碳水化合物。本发明的组合物及方法的具有接头的iRNA碳水化合物共轭物的非限制性实例包括，但不限于，

当X或Y中的一个为寡核苷酸时，另一者是氢。

在本发明的组合物及方法的某些实施例中，配体是通过二价或三键的支链接头附接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。

在一个实施例中，本发明的dsRNA共轭至选自式(XLV)–(XLVI)中的任一者所示的结构所组成的组的二价或三价支链接头：

其中：

q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C于每次出现时独立表示0-20，并且其中该重复单元可是相同或不同；

P^2A、P^2B、P^3A、P^3B、P^4A、P^4B、P^5A、P^5B、P^5C、T^2A、T^2B、T^3A、T^3B、T^4A、T^4B、T^4A、T^5B、T^5C于每次出现时各自独立为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH₂、CH₂NH或CH₂O；

Q^2A、Q^2B、Q^3A、Q^3B、Q^4A、Q^4B、Q^5A、Q^5B、Q^5C于每次出现独立地为不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可借由O、S、S(O)、SO₂、N(R^N)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个中断或封端；

R^2A、R^2B、R^3A、R^3B、R^4A、R^4B、R^5A、R^5B、R^5C于每次出现是独立为不存在、NH、O、S、CH₂、C(O)O、C(O)NH、NHCH(R^a)C(O)、-C(O)-CH(R^a)-NH-、CO、CH＝N-O、或杂环基；

L^2A、L^2B、L^3A、L^3B、L^4A、L^4B、L^5A、L^5B及L^5C表示配体，即，于每次出现时各自独立为单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖、或多糖；并且R^a是H或氨基酸侧链。三价共轭GalNAc衍生物是尤其可用于与RNAi剂合用，用于抑制靶标基因的表达，例如，式(XLIX)的那些：

其中L^5A、L^5B及L^5C表示单糖，如GalNAc衍生物。

适当的共轭GalNAc衍生物的二价及三价支链接头基团的实例包括，但不限于，上文中作为式II、VII、XI、X、及XIII引用的结构。

教示RNA共轭物的制备的代表性美国专利是包括，但不限于，美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928、5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、6,783,931、6,900,297、7,037,646、及8,106,022，其各自的整体内容通过引用而特此并入本文。

并非给定化合物中全部位置必需经均匀修饰，且事实上，超过一种前述的修饰可并入单个化合物中，或甚至并入iRNA内的单个核苷处。本发明亦包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。

在本发明之前后文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，优选地dsRNAi剂，其含有两个或更多个化学上截然不同的区域，各区域是由至少一个单体单元作成，即，在dsRNA化合物的例子中的核苷酸。这些iRNA典型含有至少一个区域，其中该RNA是经修饰，以赋予该iRNA以增加的对于核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取、或增加的对于靶标核酸的结合亲和性。该iRNA的另外的区域可用作用于能裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的基质。举例而言，RNA酶H是细胞的核酸内切酶，其是裂解RNA:DNA双链的RNA链。因此，RNA酶H的活化导致该RNA靶标的裂解，从而极大增强对基因表达的RNA抑制的效率。结果，当使用嵌合dsRNA时，通常可使用较短的iRNA获得与硫代磷酸酯脱氧dsRNA杂交至相同靶标区域的相当的结果。RNA靶标的裂解可借由凝胶电泳以及，若需要，通过本领域已知的相关核酸杂交技术检测。

在某些情形中，iRNA的RNA可由非配体基团修饰。大量非配体分子已经共轭至iRNA，以增强该iRNA的活性、细胞分配或细胞摄取，且用于实施此共轭的过程是可于科学文献中获得。这些非配体部分具有所包括的脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.[生化和生物物理研究通讯],2007,365(1):54-61；Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机和药物化学快报],1994,4:1053)、硫醚如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],1992,660:306；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Let.,[生物有机化学与医药化学通讯]1993,3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究],1992,20:533)、脂肪族链如十二碳二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.[欧洲分子生物学杂志],1991,10:111；Kabanov等人,FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯],1990,259:327；Svinarchuk等人,Biochimie[生物化学],1993,75:49)、磷脂质如二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸三乙基铵(Manoharan等人,TetrahedronLett.[四面体通讯],1995,36:3651；Shea等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1990,18:3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides,[核苷与核苷酸]1995,14:969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体通讯],1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报],1995,1264:229)、或硬脂胺或己胺-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志],1996,277:923)。以上已经列出了教示此RNA共轭物的制备的代表性美国专利。典型的共轭策略牵涉于序列中的一个或多个位置承载氨基接头的RNA的合成。该氨基基团随后与使用适宜的耦合剂或活化剂共轭的分子反应。该结合反应可于溶液相中使用仍键结至固体支撑物的RNA实施，或于该RNA的裂解后实施。借由HPLC进行的RNA共轭物的纯化典型提供了纯共轭物。

IV.本发明的iRNA的递送

本发明的iRNA至细胞如受试者如人受试者体内的细胞内的递送，可以大量不同途径达成。例如，递送可借由将细胞与本发明的iRNA在体外或体内接触而实施。体内递送也可借由给予包含iRNA如dsRNA的组合物至受试者而直接实施。可替代地，体内递送可借由给予编码并引导该iRNA的表达的一种或多种载体而间接实施。以下进一步讨论了这些选择。

通常，任何(体外或体内)递送核酸分子的方法可令其适应于与本发明的iRNA一起使用(参见，如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.[细胞生物学的趋势]2(5):139-144以及WO 94/02595，其通过引用而以其整体并入本文)。对在体内递送，为了递送iRNA分子而虑及的因素包括，例如，所递送的分子的生物学稳定性、非特异性效应的预防、以及所递送的分子于靶标组织内的积累。iRNA的非特异性效应可借由局部给予而得以最小化，例如，借由直接注射或植入组织内或局部给予该制剂。局部给予至治疗位点最大化该剂的局部浓度，限制该剂曝露于可能反而受害于该剂或可降解该剂的全身性组织，并容许待给予的iRNA分子的较低总剂量。若干研究已经显示，当局部给予dsRNAi剂时，成功敲除了基因产物。例如，借由对食蟹猴进行行玻璃体内注射(Tolentino,MJ等人(2004)Retina[视网膜]24:132-138)以及对小鼠进行视网膜下注射完成的VEGF dsRNA的眼内递送(Reich,SJ.等人(2003)Mol.Vis.[分子视觉]9:210-216)，二者皆显示预防了年龄相关性黄斑变性的实验模型中的新血管形成。此外，在小鼠体内的dsRNA的直接肿瘤内注射缩小了肿瘤体积(Pille,J.等人(2005)Mol.Ther.[分子疗法]11:267-274)，且可延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,WJ.等人(2006)Mol.Ther.[分子疗法]14:343-350；Li,S.等人(2007)Mol.Ther.[分子疗法]15:515-523)。借由直接注射的CNS的局部递送(Dorn,G.等人(2004)NucleicAcids[核酸]32:e49；Tan,PH.等人(2005)Gene Ther.[基因治疗]12:59-66；Makimura,H.等人(2002)BMC Neurosci.[BMC神经科学]3:18；Shishkina,GT.等人(2004)Neuroscience[神经系统科学]129:521-528；Thakker,ER.等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家图书馆院刊]101:17270-17275；Akaneya,Y.等人(2005)J.Neurophysiol.[神经生理学杂志]93:594-602)以及借由鼻内给予至肺(Howard,KA.等人(2006)Mol.Ther.[基因治疗]14:476-484；Zhang,X.等人(2004)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]279:10677-10684；Bitko,V.等人(2005)Nat.Med.[自然医学]11:50-55)，RNA干扰亦已经显示成功。对于全身性给予iRNA用于预防感染，该RNA可经修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法皆起到防止dsRNA被核酸内切酶及核酸外切酶在体内快速降解。RNA或该药学载体的修饰还可容许该iRNA以靶标组织为靶向并避免非所希望脱靶效应。iRNA分子可借由化学共轭至亲脂性基团如胆固醇而修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将引导对抗ApoB共轭至亲脂性胆固醇部分的iRNA全身性注射入小鼠体内，并导致肝脏及空肠二者内的apoB mRNA的敲除(Soutschek,J.等人(2004)Nature[自然]432:173-178)。iRNA与适配体的共轭已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(McNamara,JO.等人(2006)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]24:1005-1015)。在一可替代的实施例中，可使用药物递送系统如纳米颗粒、树状聚合物、聚合物、在或脂质体、或阳离子递送系统来递送该iRNA。正电荷的阳离子递送系统促进iRNA分子(负电荷)的结合，并且亦提升在负电荷的细胞膜处的相互作用，以容许iRNA被细胞有效摄取。阳离子脂质、树状聚合物、或聚合物可键结至iRNA、或经诱导以形成环绕iRNA的囊泡或微胞(参见，如，Kim SH等人(2008)Journal ofControlled Release[控制释放期刊]129(2):107-116)。当全身给予时，囊泡或微胞的形成进一步防止iRNA的降解。用于制备及给予阳离子-iRNA复合物的方法在本领域技术人员的能力范围内(参见，如，Sorensen,DR等人(2003)J.Mol.Biol[分子生物学杂志]327:761-766；Verma,UN等人(2003)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]9:1291-1300；Arnold,AS等人(2007)J.Hypertens.[高血压杂志]25:197-205，其通过引用而以其整体并入本文)。可用于iRNA的全身性递送的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,DR.等人(2003)，如前；Verma,UN等人(2003)，如前)、Oligofectamine，“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,TS等人(2006)Nature[自然]441:111-114)、心磷脂(Chien,PY等人(2005)Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]12:321-328；Pal,A等人(2005)Int J.Oncol.[国际肿瘤学杂志]26:1087-1091)、聚亚乙基亚胺(Bonnet ME等人(2008)Pharm.Res.[药物研究]8月16日电子版先于印刷版；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.[生物医学和生物技术杂志]71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.[分子药物]3:472-487)、及聚酰胺基胺(Tomalia,DA等人(2007)Biochem.Soc.Trans.[生化学会交易]35:61-67；Yoo,H.等人(1999)Pharm.Res.[药物研究]16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成复合物用于全身性给予。用于给予的方法及iRNA及环糊精的药物组合物可于美国专利号7,427,605中找到，其通过引用以其全文并入本文。

A.编码本发明的iRNA的载体

以Serpina1基因为靶向的iRNA可从插入至DNA或RNA载体内的转录单元表达(参见，如，Couture,A等人,TIG.(1996),12:5-10；Skillern,A等人,国际PCT公开号WO 00/22113；Conrad,国际PCT公开号WO 00/22114；以及Conrad,美国专利号6,054,299)。表达可是暂时(几小时至几周的时段)或持续(几周至几个月或更久)，取决于所使用的具体构建体及靶标组织或细胞类型。这些转基因可作为线性构建体、环状质粒、或病毒载体而引入，该载体可是整合或非整合载体。该转基因亦可构建为容许其作为染色体外质粒而被继承(Gassmann等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊](1995)92:1292)。

iRNA的独立链或多链可从位于表达载体的启动子转录。其中两个独立的链是经表达以生成诸如dsRNA，两个独立的表达载体可共引入(如，借由转染或感染)至靶标细胞内。可替代地，dsRNA的各独立链可借由启动子而转录，二者启动子位于相同的表达质粒。在一个实施例中，dsRNA表达为借由接头聚核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，使得该dsRNA具有茎环结构。

iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，优选地与脊椎动物细胞兼容的那些，可用来产生用于表达本文中描述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域中熟知的，且可自大量商业来源获得。典型地，这些载体提供为含有便利的用于插入所希望核酸节段的限制性位点。iRNA表达载体的递送可是全身性，如借由静脉内或肌肉内给予、借由给予至从该患者外植的靶标细胞并随后再次引入至该患者体内、或借由任何允许引入至所希望靶标细胞内的其他手段而递送。

可与本文中描述的方法及组合物合用的病毒载体系统包括，但不限于，(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于，慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳突淋瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如天花如牛痘病毒载体或禽痘如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒载体；以及(j)辅助病毒依赖性腺病毒载体或裸腺病毒载体。复制缺陷型病毒亦可具有优势。不同的载体将变为或不变为并入该细胞的基因组中。若必要，该构建体可包括用于转染的病毒序列。可替代地，该构建体可并入能进行游离基因复制的载体如EPV载体及EBV载体中。用于iRNA的重组表达的构建体通常将需要调节组件如启动子、增强子等，以确保该iRNA于靶标细胞内的表达。用于载体或构建体而虑及的其他方面是该领域中已知的。

V.本发明的药物组合物

本发明还包括药物组合物及配制品，其包括本发明的iRNA。在一个实施例中，本文提供了含有本文中描述的iRNA、以及药学可接受的载体的药物组合物。该含有iRNA的药物组合物可用于治疗与Serpina1基因的表达或活性相关的疾病或病变，如，与Serpina1缺陷相关的病变，如Serpina1缺陷型肝病。这些药物组合物是基于递送模式而配制。一个实例是配制为用于经由肠胃外递送如借由静脉内(IV)递送行全身性给予的组合物。另一实例是配制为用于直接递送至脑实质的组合物，如借由输液如借由连续泵输液至脑部。

包含本发明的RNAi剂的药物组合物可是，例如，具有或不具有缓冲剂的溶液，或含有药学可接受的载体的组合物。这些组合物是包括，例如，水性或结晶性组合物、脂质配制品、微胞配制品、乳液、及基因治疗载体。

在本发明的方法中，该RNAi剂可于溶液中给予。游离的RNAi剂可于非缓冲溶液中如于盐水或水中给予。可替代地，该游离的siRNA也可于适当的缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白(prolamine)、碳酸盐、或磷酸盐，或其任意组合。在优选的实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。该含有RNAi剂的缓冲溶液的pH及渗透压可经调解，使得其是适用于给予至受试者。

在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含用于调控该溶液的渗透压的剂，使得该渗透压维持在所希望值，如人血浆的生理学的值。可加至该缓冲溶液以控制渗透压的溶质是包括，但不限于，蛋白、肽、氨基酸、非经代谢的聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质、或盐。在一些实施例中，该用于调控该溶液的渗透压的剂是盐。在某些实施例中，该用于调控该溶液的渗透压的剂是氯化钠或氯化钾。

本发明的药物组合物是以足以抑制Serpina1基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适当剂量的范围是约0.001至约200.0毫克每千克接受者体重每天，通常范围为约1至50mg每千克体重每天。例如，该dsRNA可以每单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、或约50mg/kg量给予。

该药物组合物可每天给予一次，或该iRNA可在全天时间内以适宜之间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或甚至使用连续输液或通过控释配制品递送。在这种情况下，则为了达成日总剂量，每一亚剂量中含有的iRNA必须相应地较小。该剂量单位亦可复配为用于若干天内递送，如，使用在若干天内提供iRNA的持续释放的传统持续释放配制品。持续释放配制品是本领域中熟知的，且是尤其可用于特定部位释放剂，如将与本发明的剂合用的。在此实施例中，该剂量单位含有相应的多个日剂量。

在其他实施例中，单剂量的药物组合物可是长效，使得后续的剂量是以不超过3、4、或5天之间隔给予，或以不超过1、2、3、或4周之间隔给予。在本发明的一些实施例中，单剂量的本发明的药物组合物每周给予一次。在本发明的其他实施例中，单剂量的本发明的药物组合物是每两个月给予一次。

熟练的技术人员将知悉，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量及给予时机，这些因素包括但不限于，疾病或病变的严重性、先前的治疗、该受试者的一般健康情况和/或年龄、及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的组合物治疗受试者可包括单个治疗或一系列治疗。对本发明所涵盖的个别iRNA的有效剂量及体内半衰期的评估可使用传统的方法或基于使用适宜动物模型的体外测试而完成，如本文中他处所描述的。

小鼠遗传性的进展已经生成大量用于研究多种人类疾病如将会受益于Serpina1表达下降的肝病的小鼠模型。这些模型可用于iRNA的体内测试，以及用于测定治疗有效的剂量。适当的小鼠模型是本领域中已知的，且包括，例如，含有表达人Serpina1的转基因的小鼠。

本发明的药物组合物可以多种途径给予，取决于局部或全身性治疗是否是所希望的以及取决于待治疗的面积。给予可是局部的(如，借由透皮贴剂)；肺部给予，如借由粉末或气溶胶的吸入或吹入，包括借由喷雾器；气管内给予；鼻内给予；表皮给予及透皮给予；口服或肠胃外给予。肠胃外给予包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输液；皮下给予，如经由植入的装置给予；或颅内给予，如借由薄壁组织内、囊内或心室内给予。该iRNA可以特定组织如肝脏(如，肝脏的肝细胞)为靶标的模式递送。

用于局部给予的药物组合物及配制品可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂及粉末剂。传统的药学载体、水性、粉末或油性基、增稠剂等可能是必需的或所希望的。经涂覆的避孕套、手套等亦可是有用的。适当的局部配制品包括下述的那些：其中本发明中表征的iRNA是与局部递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂及表面活性剂混合。适当的脂质及脂质体包括中性(如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明提出的iRNA可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可与脂质尤其是阳离子脂质复合。适当的脂肪酸及酯包括但不限于，花生四烯酸、油酸、二十酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、乙酰基肉毒碱、乙酰基胆碱、或C_1-20烷基酯(如，肉豆蔻酸异丙酯(IPM))、甘油单酯、甘油二酯、或其药学可接受的盐。局部配制品详细描述于美国专利号6,747,014中，其通过引用而并入本文。

A.包含膜性分子组装体的iRNA配制品

用于本发明的组合物及方法中的iRNA可配制为用于膜性分子组装体如脂质体或微胞中递送。如本文所用，术语“脂质体”是指由排列为至少一个双层如一个双层或多个双层的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层及多层的囊泡，其具有自亲脂性材料形成的膜及亲水性的内腔。该水性部分含有该iRNA组合物。该亲脂性材料将该水性内腔与水性外部隔离，该外部典型不包括该iRNA组合物，但在一些实例中，该外部可包括该iRNA组合物。脂质体可用于转移并递送活性成分至作用位点。因为该脂质体膜在结构上类似于生物膜，当将脂质体应用至组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着该脂质体与细胞的合并的进行，包括该iRNA的内部水性内容物被递送至细胞内，其中该iRNA可特异性结合至靶标RNA并可介导RNAi。在一些情形中，脂质体亦可是靶标特异性，例如，以引导该iRNA至特定的细胞类型。

含有RNAi剂的脂质体可借由多种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解于洗涤剂中，使得与该脂质组分形成微胞。例如，该脂质组分可是两亲性阳离子性脂质或脂质共轭物。该洗涤剂可具有高临界微胞浓度且可是非离子性。示例性洗涤剂是包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、及月桂酰基肌胺酸。随后将该RNAi剂制剂添加至包括该脂质组分的微胞中。该脂质的阳离子性基团与该RNAi剂交互反应，并密集环绕该RNAi剂以形成脂质体。缩合后，借由诸如渗析移除该洗涤剂，以获得RNAi剂的脂质体制剂。

若必要，在该缩合反应过程中，可添加辅助缩合的载体化合物，如通过受控添加。例如，该载体化合物可是除核酸之外的聚合物(如，精胺或亚精胺)。亦可调节pH以支持缩合。

用于生产稳定的多核苷酸递送载体的方法进一步描述于例如WO96/37194中，其整体内容通过引用而并入本文，该方法是将多核苷酸/阳离子脂质复合物作为结构性组分并入该递送载体中。脂质体成形也可包括下列中描述的示例性方法的一方面或多方面：Felgner,P.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国国家科学院院刊]8:7413-7417,1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等人M.Mol.Biol.[微生物学和分子生物学]23:238,1965；Olson等人Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]557:9,1979；Szoka等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]75:4194,1978；Mayhew等人Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]775:169,1984；Kim等人Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]728:339,1983；以及，Fukunaga等人Endocrinol.[内分泌学杂志]115:757,1984。用于制备适宜尺寸的用作递送载体的脂质聚集体的常用技术包括超音波处理及冻融加上挤压(参见，如，Mayer等人Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]858:161,1986)。当所希望的是始终小(50至200nm)且相对均匀的一致性聚集体时，可使用微流化技术(Mayhew等人Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]775:169,1984)。这些方法已经适用于将RNAi剂制剂封装入脂质体中。

脂质体分为两个大类。阳离子脂质体是正电荷的脂质体，其与负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。该正电荷的核酸/脂质体复合物结合至负电荷的细胞表面，且内化于核内体中。由于核内体内的酸性pH，该脂质体被破坏，将其内容为释放入细胞的细胞质内(Wang等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化和生物物理研究通讯],1987,147,980-985)。

pH敏感性或荷负电的脂质体入陷核酸而非与之复合。由于核酸及脂质二者皆荷有相似电荷，出现排斥而非形成复合物。然而，一些核酸被入陷于这些脂质体的水性内腔中。pH敏感性脂质体已经用以递送编码胸苷激酶基因的核酸至培养物中的细胞单层。在靶标细胞内检测到外源性基因的表达(Zhou等人,Journal of Controlled Release[控释杂志],1992,19,269-274)。

一种主要类型的脂质组合物包括除天然衍生的磷脂酰胆碱之外的磷脂质。中性脂质体组合物，例如，可自二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子性脂质体组合物通常是自二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油形成，而阴离子性膜融合(fusogenic)脂质体是主要自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一类型的脂质体组合物是自磷脂酰胆碱(PC)如，例如，大豆PC及卵PC形成。另一类型是自磷脂质和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。

用以在体外及体内将脂质体引入细胞的其他方法的实例是包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:2550,1994；Nabel,Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]90:11307,1993；Nabel,Human Gene Ther.[人类基因治疗]3:649,1992；Gershon,Biochem.[生物化学]32:7143,1993；以及，Strauss EMBO J.[欧洲分子生物学杂志]11:417,1992。

还已经检查非离子性脂质体系统，尤其包含非离子性表面活性剂及胆固醇的系统，以确定其在递送药物至皮肤中的可用性。包含Novasome^TM I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome^TM II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子性脂质体配制品是用以递送环孢菌素A至小鼠皮肤的真皮内。结果表明，这些非离子性脂质体系统有效于促进环孢菌素A分解进入皮肤的不同层中(Hu等人S.T.P.Pharma.Sci.[S.T.P.制药科学],1994,4(6)466)。

脂质体还包括“空间稳定化的”脂质体，如本文所用，该术语是指包含一种或多种具化的脂质的脂质体，当将其并入脂质体中时，导致其该脂质体的循环寿命相对于缺少这些具化的脂质的脂质体增强。空间稳定化的脂质体的实例是下述的那些：其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂质，如单唾液酸神经节苷脂G_M1，或(B)是用一种或多种亲水性聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生。尽管不希望受任何特定的理论束缚，本领域中认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂、或PEG衍生的脂质的空间稳定化的脂质体，这些空间稳定化的脂质体的增强的循环半衰期是缘于网状内皮系统(RES)的细胞对其的摄取减少(Allen等人,FEBS Letters[欧洲生物化学学会联盟通讯],1987,223,42；Wu等人,Cancer Research,[癌症研究]1993,53,3765)。

多种包含一种或多种糖脂质的脂质体是本领域中已知的。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年报],1987,507,64)报道了单唾液酸神经节苷脂G_M1、硫酸半乳糖脑苷脂及磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半衰期的能力。这些发现是由Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],1988,85,6949)详细说明。美国专利号4,837,028及WO 88/04924，二者均颁予于Allen等人，披露了包含(1)鞘磷脂及(2)神经节苷脂G_M1或硫酸半乳糖脑苷脂的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。包含1,2-sn-二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱的脂质体披露于WO 97/13499(Lim等人)中。

在一个实施例中，使用阳离子性脂质体。阳离子性脂质体具有能融合至细胞膜的优点。尽管非阳离子性脂质体不能如与质膜融合一样有效地融合，但能被巨噬细胞在体外摄取且可用以递送RNAi剂至巨噬细胞。

脂质体的其他优点是包括：自天然磷脂质获得的脂质体是生物相容且生物可降解；脂质体可合并多种水溶性及脂溶性药物；脂质体可保护封装于其内部隔室内的RNAi剂免于代谢和降解(Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型]，Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,第1卷,第245页)。在脂质体配制品的制备中的重要考虑是该脂质表面电荷、囊泡大小及该脂质体的水性体积。

一种正电荷的合成性阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)，可用以形成小脂质体，该小脂质体自发地与核酸交互作用以形成能与组织培养细胞的细胞膜的负电荷的脂质融合的脂质-核酸复合物，导致RNAi剂的递送(参见，如，Felgner,P.L.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国国家科学院院刊]8:7413-7417,1987及美国专利号4,897,355，用于揭示DOTMA及其与DNA的用途)。

一种DOTMA类似物，1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)，可与磷脂质组合以形成DNA复合囊泡。Lipofectin^TM(Bethesda Research Laboratories[贝塞斯达研究实验室],盖瑟斯堡,马里兰州)是用于将高度阴离子化核酸递送到活体组织培养细胞中的有效的剂，其包含正电荷的DOTMA脂质体，这些脂质体自发地与负电荷的多核苷酸交互作用以形成复合物。当使用荷有足量正电荷的脂质体时，所得复合物的净电荷亦为正。以此途径制备的正电荷的复合物是自发地附接至负电荷的细胞表面，与质膜融合，且将功能性核酸有效地递送至例如组织培养细胞内。另一可商购的阳离子脂质，1,2-双(油酰基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(德国宝灵曼公司(Boehringer Mannheim),印第安纳波利斯,印第安纳州)与DOTMA的不同之处在于，油酰基部分是借由酯而非醚键而连接。

其他报道的阳离性脂质化合物包括已经共轭至多种部分的那些，这些部分包括，例如，羧基精胺，其已经共轭至一种或两种类型的脂质，且包括化合物如5-羧基精胺基甘胺酸二-八油酰基酰胺(DOGS)(Transfectam^TM,普洛麦格公司(Promega),麦迪逊,威斯康星州)及二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基-酰胺(DPPES)(参见，如，美国专利号5,171,678)。

另一阳离子性脂质共轭物包括用胆固醇(“DC-Chol”)衍生脂质，其已经配制为脂质体与DOPE组合(参见,Gao,X.和Huang,L.,Biochim.Biophys.Res.Commun.[生化和生物物理研究通讯]179:280,1991)。借由将聚赖氨酸共轭至DOPE而制成的脂质聚赖氨酸，已经被报道其有效于血清存在下的转染(Zhou,X.等人,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1065:8,1991)。对于某些细胞系，这些含有经共轭的阳离子脂质的脂质体，据称是显现较低毒性且提供比含有DOTMA的组合物更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE及DMRIE-HP(维考公司(Vical),拉荷亚,加利福尼亚州)以及Lipofectamine(DOSPA)(生命科技公司(Life Technology,Inc.),盖瑟斯堡,马里兰州)。其他适用于递送寡核苷酸的阳离子脂质描述于WO 98/39359及WO 96/37194中。

脂质体配制品是尤其适用于局部给予，相比其他配制品，脂质体存在若干优势。这些优势包括，与所给予的药物的高度全身性吸收有关的副作用减少、所给予的药物于所希望靶标处的积累增加、以及将RNAi剂给予至皮肤内的能力。在一些实施中，脂质体用于递送RNAi剂至表皮细胞，且还用以增强RNAi剂至真皮组织如皮肤内的渗透。例如，这些脂质体可局部应用。将配制为脂质体的药物局部递送至皮肤已经有文献报道(参见，如，Weiner等人,Journal of Drug Targeting[药物靶向杂志],1992,第2,405-410卷及du Plessis等人,Antiviral Research[抗病毒研究],18,1992,259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,Biotechniques[生物技术]6:682-690,1988；Itani,T.等人Gene[基因]56:267-276.1987；Nicolau,C.等人Meth.Enz.[酶学方法]149:157-176,1987；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.Meth.Enz.[酶学方法]101:512-527,1983；Wang,C.Y.和Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]84:7851-7855,1987)。

还已经检查非离子性脂质体系统，尤其包含非离子性表面活性剂及胆固醇的系统，以确定其在递送药物至皮肤中的可用性。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子性脂质体配制品是用以递送药物至小鼠皮肤的真皮内。这些具有RNAi剂的配制品可用于治疗皮肤病。

包括iRNA的脂质体可作成高度可变形。此可变形性可令脂质体渗透通过小于该脂质体平均半径的孔。例如，传递体是一种类型的可变形的脂质体。传递体可借由将表面边缘活化因子，通常为表面活性剂，添加标准脂质体组合物中而制成。为了将RNAi剂递送至皮肤的角质细胞，可借由诸如感染而经皮下递送包括RNAi剂的传递体。为了跨越完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适当的经皮梯度的影响下穿过一系列各自的直径是小于50nm的细孔。此外，由于脂质的特性，这些传递体可经自优化(适应于孔如皮肤内的孔的形状)、自修复，且可频繁到达其靶标而不碎裂，且一般是自负载。

其他遵从本发明的配制品描述于2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,611；2008年3月26日提交的美国临时申请序列号61/039,748；2008年4月22日提交的美国临时申请序列号61/047,087号以及2008年5月8日提交的美国临时申请序列号61/051,528中。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US 2007/080331也描述了遵从本发明的配制品。

传递体是又另一类型的脂质体，且是高度可变形的脂质聚集体，其是药物递送载体的引人注目的候选者。传递体可描述为脂质液滴，其可变形性如此的高，以至于他们容易地能渗透通过小于该液滴的孔。传递体是适应于其所使用的环境，如，其是自优化(适应于孔如皮肤内的孔的形状)、自修复，且可频繁到达其靶标而不碎裂，且一般是自负载。为了制成传递体，可将表面边缘活化因子，通常为表面活性剂，添加标准脂质体组合物中。传递体已经用以递送血清白蛋白至皮肤。已经显示，血清白蛋白的该传递体介导的递送与含有血清白蛋白的皮下注射同样有效。

表面活性剂于配制品如乳液(包括微乳液)及脂质体中具有广泛应用。对天然和合成的许多不同类型的表面活性剂的性质进行分类和分级的最常用方法是通过使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水性基团(也称为“头部”)的特性提供了用于将配制品中使用的不同表面活性剂分类的最有用的手段(Rieger,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,1988,第285页)。

若该表面活性剂分子未经离子化，其归类为非离子性表面活性剂。非离子性表面活性剂在制药产品及化妆品中具有广泛应用，且在宽的pH值范围内可用。通常，其HLB值范围是2至约18，取决于其结构。非离子性表面活性剂包括非离子性酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、失水山梨醇酯、蔗糖酯、及乙氧基化的酯。非离子性烷醇酰胺及醚如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化的醇、及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括于此类中。聚氧乙烯类表面活性剂是非离子性表面活性剂类别中最常见的成员。

若当表面活性剂分子溶解或分散于水中时是携带负电荷，则该表面活性剂是归类为阴离子性。阴离子性表面活性剂包括羧基化物，如皂；酰基乳酸酯；氨基酸的酰基酰胺；硫酸酯，如硫酸烷基酯及硫酸乙氧基化烷基酯；磺酸酯，如苯磺酸烷基酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯及磺酰基琥珀酸酯；以及磷酸酯。阴离子性表面活性剂类别的最重要的成员是硫酸烷基酯及皂。

若当表面活性剂分子溶解或分散于水中时携带正电荷，则该表面活性剂是归类为阳离子性。阳离子性表面活性剂包括四级铵盐及乙氧基化的胺。四级铵盐是此类别中最常用的成员。

若当表面活性剂分子具有携带或正电荷或负电荷的能力时，则该表面活性剂是归类为两性。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱及磷脂。

已经综述表面活性剂在药物产品、配制品及乳液中的用途(Rieger,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,1988,第285页)。

用于本发明的方法中的iRNA亦可提供为微胞配制品。本文中，“微胞”定义为特定类型的分子组装体，其中两性分子是以球形结构排列，使得这些分子的所有疏水性部分是朝内，留下亲水性部分与周围的水相接触。若环境为疏水性，则存在逆向排列。

可借由混合siRNA组合物的水溶液、碱金属C₈至C₂₂烷基硫酸盐、及微胞形成化合物，制备适用于通过透皮膜递送的混合微胞配制品。示例性微胞形成化合物包括卵磷脂、玻尿酸、玻尿酸的药学可接受的盐类、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘胺酸及其药学可接受的盐类、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、甘油三油酸酯、聚氧乙烯醚类及其类似物、聚多卡醇烷基醚类及其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯、及其混合物。这些微胞形成化合物可于相同时间添加或于添加碱金属烷基硫酸盐后添加。为了提供较小尺寸的微胞，混合的微胞将与这些成分以实质上任何种类的混合除剧烈混合之外形成。

在一种方法中，是制备含有该siRNA组合物以及至少一种碱金属烷基硫酸盐的第一微胞组合物。该第一微胞组合物随后与至少三种微胞形成化合物混合，以形成混合的微胞组合物。在另一方法中，该微胞组合物是借由下述制备：混合该siRNA组合物、该碱金属烷基硫酸盐及至少一种微胞形成化合物，之后于剧烈混合下添加剩余的微胞形成混合物。

可将苯酚和/或间甲酚加至该混合的微胞组合物中，以稳定化该配制品并保护其对抗细菌生长。可替代地，苯酚和/或间甲酚可与该微胞形成组分同时添加。也可于该混合的微胞组合物形成后，添加等渗剂如甘油。

对于该微胞配制品作为喷雾剂的递送，可将该配制品置于气溶胶分配器内，且该分配器是充有推进剂。该推进剂是于压力下以液体形成存在于该分配器内。调节这些组分的比，使得该水性与推进剂向变为一相，亦即，仅存在一相。若存在两相，则必需在如通过计量阀分配该内容物的部分之前振荡该分配器。经分配的剂量的药剂是以细雾的形式从该计量阀被推进。

推进剂可包括含氢的氯氟碳、含氢的氟碳、二甲基醚及乙醚。在某些实施例中，可使用HFA 134a(1,1,1,2-四氟乙烷)。

可借由相对直接的实验测得主要成分的具体浓度。对于经由口腔的吸收，一般所希望的是增加，如通过注射或通过胃肠道给予剂量的至少2倍或3倍。

B.脂质颗粒

本发明的iRNA如dsRNA可完全封装在脂质配制品中，如LNP或其他核酸-脂质颗粒。

如本文所用，术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP含有阳离子脂质、非阳离子脂质、以及防止该颗粒聚集的脂质(如，PEG-脂质共轭物)。LNP极其可用于全身性应用，因其显现于静脉(i.v.)注射后的延长的循环寿命且于远程位点(如，与给予位点物理上分离的位点)积累。LNP包括“pSPLP”，其包括封装的浓缩剂-核酸复合物，如PCT公开号WO 00/03683中所述。本发明的颗粒典型具有约50nm至约150nm，更典型约60nm至约130nm，更典型约70nm至约110nm，最典型约70nm至约90nm的平均直径；且是实质上非毒性。此外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中对抗核酸酶造成的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法是披露于例如美国专利号5,976,567、5,981,501、6,534,484、6,586,410、6,815,432中；美国公开号2010/0324120中及PCT公开号WO 96/40964中。

在一个实施例中，该脂质与药物的比(质量/质量比)(如，脂质与dsRNA的比)的范围将为约1:1至约50:1、自约1:1至约25:1、自约3:1至约15:1、自约4:1至约10:1、自约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1。在上文引述范围之间的范围也预期为本发明的一部分。

该阳离子脂质可是，例如，N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油酰基氧基)丙胺(DODMA)、1,2-二亚麻油酰基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻油酰基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚麻油基氨基甲酰基氧-3-二甲氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚麻油酰氧基-3-(二甲氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚麻油酰氧基-3-(吗啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚麻油酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油酰基硫基-3-二甲氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚麻油酰基-2-亚油酰基氧基-3-二甲氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-亚麻油酰基氧基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚麻油酰基-3-三甲氨基丙烷氯盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油酰基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油酰基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油酰基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油酰基侧氧基-3-(2-N,N-二甲氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻油酰基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烷-5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯(MC3)、1,1’-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二-十二碳-2-醇(Tech G1)、或其混合物。该阳离子脂质可包含该颗粒中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％或约40mol％。

在另一个实施例中，化合物2,2-二亚麻油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷可用以制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚麻油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，该申请通过引用而并入本文。

在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％的2,2-二亚麻油烯基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷、10％的DSPC、40％的胆固醇、及10％的PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，其中颗粒大小为63.0±20nm，且具有0.027的siRNA/脂质比。

该可离子化的/非阳离子性脂质可是阴离子性脂质或中性脂质，包括，但不限于，二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1–反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇、或其混合物。若包括胆固醇，则该非阳离子性脂质可是该颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10mol％、或约58mol％。

抑制颗粒的聚集的经共轭的脂质可是，例如，聚乙二醇(PEG)-脂质，包括而不限于，PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂质、PEG-神经酰胺(Cer)、或其混合物。该PEG-DAA共轭物可是，例如，PEG-二月桂基氧基丙基(C₁₂)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(C₁₄)、PEG-二棕榈基氧基丙基(C₁₆)、或PEG-二硬脂基氧基丙基(C₁₈)。防止颗粒的聚集的经共轭的脂质可是该颗粒中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2mol％。

在一些实施例中，该核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，其量为诸如该颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％。

在一个实施例中，该类脂质ND98·4HCl(MW 1487)(参见，2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，其通过引用而并入本文)、胆固醇(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、及PEG-神经酰胺C16(阿文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))可用以制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。各自于乙醇中的原料溶液可制备如下：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。该ND98、胆固醇、及PEG-神经酰胺C16原料溶液随后可以如42:48:10的摩尔比合并。经合并的脂质溶液可与水性dsRNA(如，于pH 5的乙酸钠溶液中)混合，使得最终的乙醇浓度为约35％-45％，且最终的乙酸钠浓度为约100-300mM。脂质-dsRNA纳米颗粒典型在混合时即自发形成。依据所希望颗粒尺寸分布，所得纳米颗粒混合物可使用例如热筒挤压机如Lipex挤压机(北部脂质公司(NorthernLipids,Inc))通过聚碳酸酯膜(如，100nm截留)挤压。在一些情形中，该挤压步骤可省略。例如，可借由渗析或正切流动过滤完成乙醇的移除及同步的缓冲剂交换。缓冲剂可与例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)于约pH 7，如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3、或约pH 7.4下交换。

LNP01配制品描述于例如国际专利公开号WO 2008/042973中，其通过引用而特此并入。

另外的示例性脂质-dsRNA配制品描述于表A中。

表A

DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱

DPPC：二棕榈酰基磷脂酰胆碱

PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻酰基甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(PEG的平均分子量为2000)

PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(PEG的平均分子量为2000)

PEG-cDMA：PEG-胺基甲酰基-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基胺(PEG的平均分子量为2000)

包含LNP(1,2-二亚麻油酰基氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA))的配制品描述于2009年4月15日提交的国际申请号WO 2009/127060中，其通过引用而并入本文。

包含XTC的配制品描述于例如2009年1月29日提交的美国专利临时序列号61/148,366中；2009年3月2日提交的美国专利临时序列号61/156,851中；2009年6月10日提交的美国专利临时序列号中；2009年7月24日提交的美国专利临时序列号61/228,373中；2009年9月3日提交的美国专利临时序列号61/239,686中；以及，2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US 2010/022614中，这些申请通过引用而特此并入。

包含MC3的配制品描述于例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120中，其整体内容通过引用而特此并入。

包含ALNY-100的配制品描述于例如2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933中，其通过引用而特此并入。

包含C12-200的配制品描述于例如2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777中，其通过引用而特此并入。

可离子化的/阳离子性脂质的合成

本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物如阳离子性脂质等，均可借由已知的有机合成技术包括实例中更详细描述的方法制备。除非明确排除，所有取代基是如下文定义。

“烷基”意指含有1至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状、饱和脂肪族烃。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包括环戊烯基及环己烯基等。

“烯基”意指含有至少一个位于相邻碳原子间的双键的上文定义的烷基。烯基包括顺式及反式两种异构体。代表性直链及支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。

“炔基”意指另外含有至少一个位于相邻碳间的三键的上文定义的任意烷基或烯基。代表性直链及支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

“酰基”意指任何烷基、烯基或炔基，其中位于附接点的碳是经氧代基团取代，如下文定义。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基、及-C(＝O)炔基是酰基基团。

“杂环”意指5元至7元至单环、或7元至10元至双环的杂环状环，其可是饱和、不饱和、或芳香族，且其含有独立选自氮、氧及硫的1或2个杂原子，并且其中该氮及硫杂原子可任选地经氧化，且该氮杂原子可任选地经季铵化，杂环系包括其中任何上述杂环系稠合至苯环的双环。该杂环可经由任何杂原子或碳原子附接。杂环系包括如下述定义的杂芳基。杂环系包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。

术语“任选地经取代的烷基”、“任选地经取代的烯基”、“任选地经取代的炔基”、“任选地经取代的芳基”、及“任选地经取代的杂环”意指，当取代时，至少一个氢原子被取代基替代。在氧代取代基(＝O)的情形中，两个氢原子被替代。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、–SOnRx及-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx与Ry是相同或不同且独立为氢、烷基或杂环，且所述烷基及杂环取代基各自可进一步经氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx及-SOnNRxRy中的一个或多个取代。

“卤素”意指氟、氯、溴及碘。

在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基团。保护基团方法是本领域技术人员所熟知的(参见，例如，Protective Groups in Organic Synthesis[有机合成中的保护基团],Green,T.W.等人,威利跨科学出版社(Wiley-Interscience),纽约市,1999)。简言之，本发明的上下文中的保护基团是降低或消除官能基团的非所希望反应性的任意基团。可将保护基团添加至官能基团，以屏蔽其在某些反应过程中的反应性，并且随后移除以透露原始的官能基团。在一些实施例中，使用“醇保护基团”。“醇保护基团”是降低或消除醇官能基团的非所希望反应性的任意基团。可使用本领域中熟知的技术添加及移除保护基团。

用于口服给予的组合物及配制品包括粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、袋剂、片剂或小片剂。增稠剂、芳香剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或黏合剂可是所希望的。在一些实施例中，口服配制品是下述的那些：其中本发明提出的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂及螯合剂协同给予。适当的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。适当的胆汁酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)及熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、去氢胆酸、脱氧胆酸、谷胺胆酸(glucholicacid)、甘胺胆酸(glycholic acid)、甘胺脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠及甘胺二氢梭链孢酸钠。适当的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、乙酰肉毒碱、乙酰胆碱、或甘油单酯、甘油二酯或其药学可接受的盐(如，钠盐)。在一些实施例中，使用渗透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐组合。一种示例性组合是月桂酸的钠盐、癸酸与UDCA的组合。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明提出的DsRNA可以包括喷雾干燥的颗粒的粒状形式或经复合以形成微粒或纳米颗粒形式经口给予。DsRNA复合剂是包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化的明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；经DEAE衍生的聚亚胺、支链淀粉、纤维素及淀粉。适当的复合剂包括几丁聚糖、N-三甲基几丁聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组胺酸、聚鸟胺酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯(P(TDAE))、聚氨基苯乙烯(如，聚对氨基苯乙烯)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(氰基丙烯酸异己酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白及DEAE-葡聚糖、聚丙烯酸记载、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸盐、及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备详细描述于美国专利6,887,906、美国公开号20030027780、及美国专利号6,747,014中，其各自通过引用而并入本文。

用于肠胃外给予、实质内(进入脑)给予、鞘内给予、心室内给予或肝内给予的组合物及配制品可包括无菌水溶液，其也可含有缓冲剂、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于，渗透增强剂、载体化合及其他药学可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括，但不限于，溶液、乳液、及含有脂质体的配制品。这些组合物可自包括但不限于，预成型液体、自乳化固体及自乳化半固体的多种组分生成。当治疗肝脏病变如肝癌时，特别优选的是以肝脏为靶标的配制品。

可便利地以单位剂型存在的本发明的医药组合物，可根据医药工业中熟知的传统技术制备。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂的步骤。通常，这些配制品是借由下述而制备：使活性组分与与液体载体或精细分散的固体载体或二者均匀且密切地结合，并且随后，若需要，将产物塑形。

本发明的组合物可配制为任何多种可能的剂型，例如但不限于，片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆、软胶囊剂、栓剂、及灌肠剂。本发明的组合物还可配制为水性、非水性或混合介质中的悬浮剂。水性悬浮剂可进一步含有增加该悬浮剂的黏性的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可含有稳定剂。

C.另外的配制品

i.乳液

本发明的组合物可制备及配制为乳液。乳液通常是一种液体分散在另一种液体中的非均相体系，其液滴形式通常直径超过0.1μm(参见，如，Ansel's PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Idson,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第199页；Rosoff,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第245页；Block在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第2卷,第335页；Higuchi等人,在Remington's Pharmaceutical Sciences[雷明顿的制药科学],马克出版有限公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿,宾夕法尼亚州,1985,第301页)。乳液一般是包含两个不互混的液相的双相系统，该两相是密切混合且分散于彼此之中。通常，乳液可是油包水(w/o)种类或水包油(o/w)种类中的任一者。当水相是精细分散并作为小液滴分散于大体积的油相中时，所得组合物称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相是精细分散并作为小液滴分散于大体积的水相中时，所得组合物称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含有另外的组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如需要，药学赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料、及抗氧化剂也可存在于乳液中。药学乳液亦可是由超过两相组成的多重乳液，例如，在油包水包油(o/w/o)及水包油包水(w/o/w)乳液的情形中。这些复杂配制品一般提供了简单双相乳液并不具备的某些优势。其中o/w乳液的独立的油液滴围绕小水滴的多重乳液构建w/o/w乳液。同样，在连续油相中稳定化的水球所围绕油滴的系统提供了o/w/o乳液。

乳液的特征在于小或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相良好分散于外部或连续相中，且通过乳化剂或配制品的黏度的手段维持为此形式。乳液的任一相可是半固体或固体，如乳液型油膏基质及乳霜的情形下。其他稳定化乳液的手段需要使用可并入该乳液的任一相中的乳化剂。广义上，乳化剂可分为四类：合成性表面活性剂、天然出现的乳化剂、吸收基质、及细分散的固体(参见，如，Ansel's Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Idson,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第199页)。

合成性表面活性剂，还称为表面活性剂，已经广泛应用于乳液的配制品中，且已经于文献中综述(参见，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Rieger,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第285页；Idson,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,1988,第1卷,第199页)。表面活性剂典型是两性，且包含亲水性部分及疏水性部分。表面活性剂中亲水特性与疏水特性的比已经表述为术语亲水/亲油平衡(HLB)，且是于配制品的制备中归类并选择表面活性剂的有价值的工具。基于亲水基团的特性，表面活性剂可归类为不同的类别：非离子性、阴离子性、阳离子性及两性(参见，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州Rieger,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第285页)。

用于乳液配制品中的天然出现的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂类、卵磷脂及阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性质，使得他们可吸取水以形成w/o乳液而仍保持其半固体一致性，如无水羊毛脂及亲水性石蜡脂。精细分散的固体也已经用作优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合以及于黏性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非膨胀性黏土如皂土、绿坡缕石、水辉石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝及胶体硅酸镁铝、颜料及非极性固体如碳或甘油三硬脂酸酯。

大量非乳化材料亦包括于乳液配制品中且造成乳液的性质。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水性胶体、防腐剂及抗氧化剂(Block,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第335页；Idson,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第199页)。

亲水性胶体或水凝胶包括天然出现的胶及合成性聚合物如多糖(例如，阿拉伯树胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐胶、及黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素及羧丙基纤维素)、及合成性聚合物(例如，卡波姆、纤维素醚、及羧基乙烯基聚合物)。这些分散或溶胀于水中以形成胶体溶液，其借由形成环绕分散相液滴的强的界面膜且借由增加外部相的黏度而稳定乳液。

由于乳液通常含有可容易支持微生物生长的大量成分，如碳水化合物类、蛋白类、固醇类及磷脂类，这些配制品一般是合并有防腐剂。一般于该乳液配制品中使用的防腐剂包括对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、季铵盐、氯化苯甲烃铵、对羟基苯甲酸的酯类、及硼酸。抗氧化剂一般也添加至乳液配制品中，以防止该配制品的变质。所使用的抗氧化剂可是自由基捕捉剂，如生育酚、五倍子酸烷基酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯；或还原剂如抗坏血酸及焦亚硫酸钠；以及抗氧化剂增效剂，如柠檬酸、酒石酸、及卵磷脂。

乳液配制品经由护肤、口服及肠胃外途径的应用及其制造方法已经于文献中综述(参见，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Idson,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第199页)。用于口服递送的乳液配制品已经广泛使用，因其易于配制以及在吸收剂生物利用性观点的效能(参见，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Rosoff,在PharmaceuticalDosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第245页；Idson,在Pharmaceutical DosageForms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(MarcelDekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第199页)。矿物油基轻泻剂、油溶性维生素及高脂肪营养制剂属于一般作为水包油乳液经口给予的材料。

ii.微乳液

在本发明的一实施例中，该iRNA与核酸的组合物配制为微乳液。微乳液可定义为水、油及两亲分子的系统，其是单一光学各向同性且热力学稳定的溶液(参见，如，Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Rosoff,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第245页)。典型地，微乳液是借由下述者制备的系统：将油分散于表面活性剂水溶液中；并且随后添加足量的第四组分，通常是中等链长的醇，以形成透明的系统。因此，微乳液亦已经描述为两种不互混的液体的热力学稳定、各向同性的澄清分散液，其是借由表面活性分子的界面膜而予以稳定化(Leung和Shah,在:Controlled Releaseof Drugs:Polymers and Aggregate Systems[控制释放药物：聚合物和聚集体系],Rosoff,M.编辑,1989,VCH出版商(VCH Publishers),纽约,第185-215页)。微乳液一般是经由将包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂及电解质的三至五种组分组合而制备。该微乳液是否为油包水(w/o)或水包油(o/w)类型，取决于所使用的油及表面活性剂的性质以及该表面活性剂分子的极性头部与烃尾部的结构及几何封装(Schott,在Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿的制药科学],马克出版有限公司(Mack PublishingCo.),伊斯顿,宾夕法尼亚州,1985,第271页)。

使用相图的现象学研究途径已经得以广泛研究，且本领域技术人员已经获得如何配制微乳液的全面知识(参见，如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems[Ansel的药物剂型和药物递送系统],Allen,LV.,Popovich NG.,以及Ansel HC.,2004,威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins)(第8版),纽约,纽约州；Rosoff,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第245页；Block,在Pharmaceutical Dosage Forms[药物剂型],Lieberman,Rieger和Banker(编辑),1988,马塞尔·德克公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,纽约州,第1卷,第335页)。与传统的乳液相比，微乳液提供了将水不溶性药物溶解于自发形成的热力学稳定液滴的配制品中。

于微乳液的制备中使用的表面活性剂包括，但不限于，离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，单独使用或与助表面活性剂合用。该助表面活性剂通常是短链醇，如乙醇、1-丙醇、及1-丁醇，用以借由渗透入该表面活性剂膜内，并因为在表面活性剂分子之间产生孔洞空间而创建混乱的膜，因此增加界面流动性。然而，微乳液可不使用助表面活性剂而制备的，且不含醇的自乳化微乳液系统是本领域中已知的。水相典型可是，但不限于，水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、及乙二醇衍生物。油相可包括，但不限于，材料如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单酸甘油酯、中链(C8-C12)二酸甘油酯、中链(C8-C12)三酸甘油酯、聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚二醇化的甘油酯、饱和聚二醇化的C8-C10甘油酯、植物油及硅油。

自药物溶解及增强药物吸收的观点看来，微乳剂是特别令人感兴趣的。脂质基微乳液(o/w及w/o二者)已经被提议增强包括肽在内的药物的口服生物利用性(参见，如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等人,Pharmaceutical Research[药学研究],1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.[实验和临床药理学方法和研究结果],1993,13,205)。微乳液提供了下述优势：改善的药物溶解性、保护药物不被酶水解、由于表面活性剂引发的膜流动性及渗透性的改变而可能增强药物吸收、易于制备、易于以固体剂型口服给予、改善临床潜能、以及降低的毒性(参见，如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等人,Pharmaceutical Research[药物研究],1994,11,1385；Ho等人,J.Pharm.Sci.[药学科学杂志],1996,85,138-143)。通常，当将微乳液的组分于室温带至一起时，可自发形成微乳液。当配制热不稳定的药物、肽或iRNA时，这尤其具有优势。微乳液也已经在化妆品及医药应用中有效地经皮递送活性组分。人们希望，本发明的微乳液组合物及配制品将会促进对iRNA及核酸从胃肠道进行的全身性吸收，以及将会改善对iRNA及核酸的局部细胞摄取。

本发明的微乳液也可含有另外的组分及添加剂，如失水山梨醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol及渗透增强剂，以改善该配制品的性质并提升对本发明的iRNA及核酸的吸收。本发明的微乳液中使用的渗透增强剂可归类为属于下述五大类别之一：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、及非螯合非表面活性剂(Lee等人,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems[治疗性药物载体系统的重要评论],1991,第92页)。这些类别各自上文已经讨论。

iii.微粒

本发明的RNAi剂可并入颗粒如微粒中。微粒可借由喷洒干燥而生产，但亦可借由其他方法包括冻干、蒸发、流动床干燥、真空干燥或这些技术的组合而生产。

iv.渗透增强剂

在一个实施例中，本发明是采用多种渗透增强剂以影响核酸，尤其是iRNA，至动物皮肤的有效递送。大多数药物是以离子化及非离子化的形式存在于溶液中。然而，通常仅脂质可溶性或亲脂性药物容易地穿过细胞膜。已经发现，若待穿过的细胞膜经渗透增强剂处理时，甚至非亲脂性药物也可穿过该细胞膜。除了有助于非亲脂性药物的扩散穿过细胞膜外，渗透增强剂还提升亲脂性药物的渗透性。

渗透增强剂可归类为属于下述五大类之一：即，表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、及非螯合非表面活性剂(参见，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery[药物递送中的表面活性剂和聚合物],Informa Health Care[信息保健],纽约,纽约州,2002；Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页)。上述渗透增强剂类别各自更详细描述于下。

表面活性剂(或“表面活性剂”)是一化学整体，当将其溶解于水溶液时，其降低该溶液的表面张力或该水溶液与另一液体之间的界面张力，结果提升通过黏膜的对iRNA的吸收。这些渗透增强剂除了胆汁盐及脂肪酸外，还包括，例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚)(参见，如，Malmsten,M.Surfactants and polymersin drug delivery[药物递送中的表面活性剂和聚合物],Informa Health Care[信息保健],纽约,纽约洲,2002；Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页)；及全氟化学乳液，如FC-43(Takahashi等人,J.Pharm.Pharmacol.[药学与药理学杂志],1988,40,252)。

充当渗透增强剂的多种脂肪酸及其衍生物包括，例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯(1-单油酰基-外消旋-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、乙酰基肉毒碱、乙酰基胆碱、其C_1-20烷基酯类(如，甲酯、异丙酯及第三丁酯)、及其单甘酯及双甘酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚麻酸酯等)(参见，如，Touitou,E.等人Enhancement in Drug Delivery[药物递送的增强],CRC出版社(CRC Press),丹弗斯,马萨诸塞州,2006；Lee等人,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1990,7,1-33；El Hariri等人,J.Pharm.Pharmacol.[药学与药理学杂志],1992,44,651-654)。

胆汁的生理学角色包括促进脂质及脂溶性维生素的分散及吸收(参见，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery[药物递送中的表面活性剂和聚合物],Informa Health Care[信息保健],纽约,纽约州,2002；Brunton,第38在:Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics[治疗的药理学基础],第9版.,Hardman等人编辑,麦格劳希尔集团(McGraw-Hill),纽约,1996,第934-935页数)。多种天然胆汁盐及其合成性衍生物，用作渗透增强剂。因此，术语“胆汁盐”包括任何天然出现的胆汁组分以及任何其合成性衍生物。适当的胆汁盐包括，例如，胆酸(或其药学可接受的钠盐，胆酸钠)、去氢胆酸(去氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、谷胺胆酸(glucholic acid)(谷胺胆酸钠)、甘胺胆酸(glycholic acid)(甘胺胆酸钠)、甘胺脱氧胆酸(甘胺脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、乌索脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、甘胺二氢梭链孢酸钠及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见，如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery[药物递送中的表面活性剂和聚合物],Informa Health Care[信息保健],纽约,纽约州,2002；Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页；Swinyard,第39章在:Remington'sPharmaceutical Sciences[雷明顿的制药科学],第18版,Gennaro,编辑,马克出版有限公司(Mack Publishing Co.),伊斯顿,宾夕法尼亚州,1990,第782-783页；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1990,7,1-33；Yamamoto等人,J.Pharm.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志],1992,263,25；Yamashita等人,J.Pharm.Sci.[药学杂志],1990,79,579-583)。

与本发明结合使用的的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于他们作为渗透增强剂于本发明中的用途，螯合剂已经增加也用作DNA酶抑制剂的优势，因大多数经表征的DNA核酸酶需要用于催化的二价金属离子并因此被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.[色谱杂志],1993,618,315-339)。适当的螯合剂包括但不限于，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、柳酸盐(如，柳酸钠、5-甲氧基柳酸盐及均香兰酸盐(homovanilate))、胶原的N-乙酰基衍生物、月桂醇聚醚-9及β-二酮的N-氨基乙酰基衍生物(烯胺)(参见，如，Katdare,A.等人,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery[药物，生物技术和药物递送的辅料开发],CRC出版社(CRC Press),丹弗斯,马萨诸塞州,2006；Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页；Muranishi,Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1990,7,1-33；Buur等人,J.Control Rel.[控释杂志],1990,14,43-51)。

如本文所用，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可定义为下述化合物：其证明无关紧要的作为螯合剂或作为表面活性剂的活性，但尽管如此，其仍提升通过消化道黏膜的对iRNA的吸收(参见，如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1990,7,1-33)。此类渗透增强剂包括，例如，不饱和的环状脲、1-烷基-氮杂环-烷酮衍生物及1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等人,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems[治疗药物载体系统的关键性回顾],1991,第92页)；以及非类固醇抗炎剂如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)及苯基丁氮酮(Yamashita等人,J.Pharm.Pharmacol.[药学与药理学杂志],1987,39,621-626)。

提升对iRNA的细胞水平的摄取的剂亦可加至本发明的药学及其他组合物中。例如，阳离子性脂质如脂质体(Junichi等人,美国专利号5,705,188)、阳离子性甘油衍生物、及聚阳离子性分子如聚赖氨酸(Lollo等人,PCT申请WO 97/30731)，也已知增强dsRNA的细胞摄取。可商购的转染试剂的实例包括，例如，Lipofectamine^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、Lipofectamine 2000^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、293fectin^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州),Cellfectin^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、DMRIE-C^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、FreeStyle^TMMAX(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、Lipofectamine^TM 2000CD(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、Lipofectamine^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、RNAiMAX(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、Oligofectamine^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、Optifect^TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德,加利福尼亚州)、X-tremeGENE Q2转染试剂(罗氏公司(Roche)；Grenzacherstrasse,瑞士)、DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,瑞士)、DOSPER脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse,瑞士)、或Fugene(Grenzacherstrasse,瑞士)、试剂(普洛麦格公司(Promega)；麦迪逊,威斯康星州)、TransFast^TM转染试剂(普洛麦格公司(Promega)；麦迪逊,威斯康星州)、Tfx^TM-20试剂(普洛麦格公司(Promega)；麦迪逊,威斯康星州)、Tfx^TM-50试剂(普洛麦格公司(Promega)；麦迪逊,威斯康星州)、DreamFect^TM(OZ生物科学公司(OZ Biosciences)；马赛市,法国)、EcoTransfect(OZ生物科学公司(OZBiosciences)；马赛市,法国)、TransPass^a D1转染试剂(新英格兰生物实验室(NewEngland Biolabs)；伊普斯威奇,马萨诸塞州,美国)、LyoVec^TM/LipoGen^TM(英杰公司(Invitrogen)；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、PerFectin转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、GenePORTER转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、GenePORTER2转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、Cytofectin转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、TroganPORTER^TM转染试剂(Genlantis；圣迭哥,加利福尼亚州,美国)、RiboFect(Bioline；陶顿,马萨诸塞州,美国)、PlasFect(Bioline；陶顿,马萨诸塞州,美国)、UniFECTOR(B桥国际公司(B-Bridge International)；山景城,加利福尼亚州,美国)、SureFECTOR(B桥国际公司(B-Bridge International)；山景城,加利福尼亚州,美国)、或HiFect^TM(B桥国际公司(B-Bridge International),山景城,加利福尼亚州,美国)等。

其他剂可用以提升所给予的核酸的渗透，包括二醇如乙二醇及丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮、及萜如柠檬烯及薄荷酮。

v.载体

本发明的某些组合物亦将载体化合物并入配制品中。如本文所用，“载体化合物”或“载体”可是指核酸或其类似物，其是惰性(即，本身不具有生物学活性)但是作为核酸而被体内过程识别，该体内过程是借由例如降解生物学活性核酸或促进该核酸从循环移除而降低核酸的生物应用性。将核酸和载体化合物(一般后一种物质过量)共同给予，可导致于肝脏、肾脏或循环系统外的其他存储器官中回收的核酸量的实质性下降，这可能是由于该载体化合物与该核酸之间对于共同受体的竞争。例如，当将部分硫代磷酸酯化的dsRNA与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、多胞苷酸(polycytidic acid)或4-乙酰胺基-4’-异硫氰基-茋-2,2’-二磺酸共同给予时，在肝组织中回收的该部分硫代磷酸酯化的dsRNA的量减少(Miyao等人,DsRNA Res.Dev.[DsRNA发展研究],1995,5,115-121；Takakura等人,DsRNA&Nucl.AcidDrug Dev.[DsRNA和核酸药物开发],1996,6,177-183)。

vi.赋形剂

与载体化合物对照，“药学载体”或“赋形剂”是药学可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他用于将一种或多种核酸递送至动物的药理学惰性载体。该赋形剂可是液体或固体，并且考虑到计划的给予方式而选择，以当与核酸及给定药物组合物的其他组分混合时，提供所希望的体积、一致性等。典型的药学载体是包括，但不限于，黏合剂(如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填料(如，乳糖及其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石、氧化硅、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(如，淀粉、羟基乙酸淀粉钠等)；以及，润湿剂(如，十二烷基硫酸钠等)。

适用于非肠胃外给予的不与核酸进行有害反应的药学可接受的有机或无机赋形剂还可用以配制本发明的组合物。适当的药学可接受的载体是包括，但不限于，水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石硅酸、黏性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

用于核酸之局部给予的配制品可包括无菌及非无菌的水溶液、在一般溶剂如醇中的非水溶液、或核酸于液体或固体基质中的溶液。这些溶液亦可含有缓冲剂、稀释剂及其他适当的添加剂。可使用适用于非肠胃外给予的不与核酸进行有害反应的药学可接受的有机或无极赋形剂。

适当的药学可接受的赋形剂包括，但不限于，水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、黏性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等。

vii.其他组分

本发明的组合物可另外含有传统上以其领域确定的用量发现于药物组合物中的其他佐剂组分。因此，例如，该组合物可含有另外的、可相容、药学活性的材料如，例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂；或可含有可用于物理上配制的本发明的组合物的多种剂型的另外的材料，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂、及稳定剂。然而，当添加这些材料时，这些材料不应过度影响本发明的组合物的组分的生物学活性。这些配制品可经无菌化，且若需要，与不与该配制品的核酸进行有害相互作用的助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、芳香剂和/或芳族物质等混合。

水性悬浮液可含有增加该悬浮液黏性的物质，例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可含有稳定剂。

在一些实施例中，本发明提出的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物及(b)一种或多种借由非RNAi机制而发挥功能且可用于治疗出血病变的剂。这些剂的实例是包括，但不限于，抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒和/或抗纤维化剂。此外，一般用以保护肝脏的其他物质如水飞蓟素也可用于与本文中描述的iRNA结合使用。其他可用于治疗肝病的剂包括替比夫定(telbivudine)、恩替卡韦(entecavir)、及蛋白酶抑制剂如特拉匹韦(telaprevir)及其他如在Tung等人，美国专利公开号2005/0148548、2004/0167116、及2003/0144217中披露的；以及在Hale等人，美国专利公开号2004/0127488中披露的。

这些化合物的毒性及疗效可借由标准药学过程在如用于测定LD50(对群体的50％致死的剂量)及ED50(对群体的50％治疗上有效的剂量)的细胞培养物或实验动物中测定。毒性与疗效之间的剂量比是治疗指数，其可表达为LD50/ED50比。显现高治疗指数的化合物是优选的。

自细胞培养物测定及动物研究获得的资料可用于配制用于人的一系列剂量。本发明提出的组合物的剂量通常是处于包括ED50且具有低毒或无毒的循环浓度范围内。该剂量可于此范围内依据所采用的剂型及所使用的给予途径而变。对于本发明所提出的方法中使用的任意化合物，治疗有效剂量最初可自细胞培养物测定预估。可以在动物模型中配制一种剂量以实现包括化合物或(当适宜时)靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现所述多肽浓度降低)，所述血浆浓度包括如在细胞培养物中所测定的IC₅₀(即，试验化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)。此讯息可用以更准确地测定可用于人的剂量。例如，可借由高效液相色谱量测血浆中的水平。

除了如上文讨论的给予之外，本发明提出的iRNA可与其他已知的有效于治疗由Serpina1表达介导的病理学过程的剂合用。在任何情况下，基于使用本领域中已知或本文中描述的标准效能量测所观察到的结果，给予医师可调整iRNA给予的量及时机。

VI.抑制Serpina1表达的方法

本发明提供了抑制Serpina1于细胞内的表达的方法。该方法包括将细胞与有效抑制该细胞内的Serpina1表达的量的RNAi剂如双链RNAi剂接触，从而抑制Serpina1于该细胞内的表达。

细胞与双链RNAi剂的接触可在体外或体内进行。将细胞在体内与RNAi剂接触包括，将受试者如人类受试者体内的细胞或细胞组与该RNAi剂接触。体外及体内接触方法的组合也是可能的。接触可是直接或间接，如上文讨论的。另外，与细胞的接触可经由靶向配体予以实施，该配体是包括本文中描述或本领域中已知的任意配体。在优选的实施例中，该靶向配体是碳水化合物部分，如GalNAc3配体，或将该RNAi剂引导至感兴趣的位点如受试者的肝脏的任意其他配体。

如本文所用，术语“抑制”是与“降低”、“沉默”、“下调”及其他类似术语互换使用，且包括任意水平的抑制。

短语“抑制Serpina1的表达”旨在是指对任何Serpina1基因(例如，小鼠Serpina1基因、大鼠Serpina1基因、猴Serpina1基因、或人Serpina1基因)以及Serpina1基因的变体或突变体的表达的抑制。因此，在经基因性操作的细胞、细胞组或有机体的上下文中，Serpina1基因可是野生型Serpina1基因、突变Serpina1基因、或转基因Serpina1基因。

“抑制Serpina1基因的表达”包括对Serpina1基因的任意水平的抑制，如，对Serpina1基因的表达的至少部分阻抑。可基于与Serpina1基因表达有关的任意变量的水平或水平的变化如Serpina1 mRNA水平、Serpina1蛋白水平、或脂质水平而评估Serpina1基因的表达。这一水平可于单个细胞内或细胞组，包括，如源自受试者的样品内评估。

可借由一个或多个与Serpina1表达相关的变量的绝对或相对水平相对于对照水平的降低而评估抑制。该对照水平可是本领域中使用的任意类型的对照水平，如，初始剂量基线水平、或从相似的受试者、细胞或未经处理或经对照(如，仅缓冲剂对照或非活性剂对照)处理的样本测得的水平。

在本发明的方法的一些实施例中，Serpina1基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

对Serpina1基因表达的抑制可借由第一细胞或细胞组(这些细胞可存在于例如源自受试者的样本内)内所表达的mRNA量的下降而得以证明，在该细胞或细胞组中，Serpina1基因被转录，且该细胞或细胞组已经处理(如，借由将细胞与本发明的RNAi剂接触，或借由给予本发明的RNAi剂至体内存在或曾经存在这些细胞的受试者)，使得与实质上与该第一细胞或细胞组一致但未经如此处理的第二细胞或细胞组(对照细胞)相比，Serpina1基因的表达得以抑制。在优选的实施例中，该抑制是借由使用下式将经处理细胞内的mRNA水平表达为对照细胞内mRNA水平的百分比而评估的：

可替代地，对Serpina1基因表达的抑制可以参数的下降方面评估，该参数是与Serpina1基因表达如Serpina1蛋白表达如ALT、碱性磷酸酶、胆红素、凝血素及白蛋白功能性相关。借由本领域中已知的任意测定，可于任何或结构性地或借由基因工程而表达Serpina1的细胞内测得Serpina1基因沉默。肝脏是Serpina1表达的主要位点。其他表达的显著位点包括肺及肠。

对Serpina1蛋白表达的抑制可借由细胞或细胞组所表达的Serpina1蛋白水平(如，在源自受试者的样本内所表达的蛋白水平)的下降而得以证明。如上文对于mRNA阻抑评估的解释，对经处理的细胞或细胞组内蛋白表达水平的抑制可以类似地表示为对照细胞或细胞组中蛋白水平的百分比。

可用以评估对Serpina1基因表达抑制的对照细胞或细胞组包括尚未与本发明的RNAi剂接触的细胞或细胞组。例如，该对照细胞或细胞组可源自使用RNAi剂治疗个别受试者之前的该受试者(如，人或动物受试者)。

细胞或细胞组所表达的Serpina1 mRNA的水平可使用本领域中已知的用于评估mRNA表达的任意方法测得。在一个实施例中，样本中Serpina1表达的水平是借由检测所转录的多核苷酸或其部分如Serpina1基因的mRNA而测得。可使用RNA提取技术从细胞提取RNA，这些技术包括，例如，使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis公司)、RNeasyRNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytiX，瑞士)。使用核糖核酸杂交的典型测定格式包括核连缀分析(nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNA酶保护测定(Melton等人，Nuc.Acids Res.[核酸研究]12:7035)、RNA印迹法、原位杂交、及微数组分析。

在一个实施例中，使用核酸探针测得Serpina1表达的水平。如本文所用，术语“探针”是指能选择性结合至特定Serpina1的任意分子。探针可由本领域技术人员合成，或是源自适宜的生物学制剂。探针可经特异性设计以待标记。可用作探针的分子的实例是包括，但不限于，RNA、DNA、蛋白、抗体及有机分子。

分离的mRNA可用于杂交及扩增测定中，这些测定是包括，但不限于，DNA或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析及探针数组。用于测定mRNA水平中的一种方法包括，将该分离的mRNA与可杂交至Serpina1 mRNA的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，该mRNA固定于固体表面且与探针接触，例如，借由将该分离的mRNA于琼脂糖凝胶上跑动，并将该mRNA自该凝胶转移至膜如硝基纤维素。在可替代的实施例中，该探针固定于固体表面，且该mRNA与该探针接触，例如，于Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可轻易适应将已知的mRNA检测方法用于Serpina1 mRNA水平的测定中。

可替代的用于测定样本中Serpina1表达的水平的方法包括核酸扩增过程和/或诸如样本中的mRNA的逆转录酶过程(用以制备cDNA)，如，借由RT-PCR(在Mullis于1987年的美国专利号4,683,202中所述的实验实施例)、连接酶链反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:189-193)、自维持序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Bio/Technology[生物/技术]6:1197)、滚环复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，之后使用该领域技术人员所熟知的技术检测所扩增的分子。如果这些分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对核酸分子的检测特别有用。在本发明的特别方面中，借由定量荧光RT-PCR(即，TaqMan^TM系统)测定Serpina1表达的水平。

可使用膜印迹(如用于杂交分析如RNA印迹法、DNA印迹法及斑点印迹法等)、或微孔、样本管、凝胶、珠或纤维(或包含经键结的核酸的任意固体支撑物)监控Serpina1 mRNA的表达水平。参见，美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195及5,445,934中，其通过引用而并入本文。Serpina1表达水平的测定还可包含于溶液中使用核酸探针。

在优选的实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达的水平。这些方法的使用是描述并例示于本文中存在的实例中。

可使用本领域中已知的用于量测蛋白水平的任意方法测定Serpina1蛋白表达的水平。这些方法包括，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、高扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱、比色测定、分光亮度测定、流式细胞分析、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹法、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸收测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。

如本文所用，术语“样本”是指从受试者分离的相似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞或组织。生物学流体的实例包括血液、血清及浆膜液、血浆、淋巴、尿液、脑脊髓液、唾液、眼内液等。组织样本可包括来自组织、器官或局部区域的样本。例如，样本可是源自特定的器官、器官的部分、或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样本可源自肝脏(如，整个肝脏或肝脏的某些片段或肝脏内的某些类型的细胞如肝细胞)。在优选的实施例中，“源自受试者的样本”是指自该受试者抽取的血液或血浆。在另外的实施例中，“源自受试者的样本”是指源自该受试者的肝脏组织。

在本发明的方法的在一些实施例中，RNAi剂给予至受试者，使得该RNAi剂递送至该受试者体内的特定位点。可使用源自来自该受试者体内特定位点的体液或组织的样本中Serpina1 mRNA或Serpina1蛋白的水平或水平的变化的测量，来评估对Serpina1表达的抑制。在优选的实施例中，该位点是肝脏。该位点还可是来自前述位点中任一个的细胞的小分区或小群。该位点还可包括表达特定类型的受体的细胞。

VII.治疗或预防Serpina1相关疾病的方法

本发明还提供治疗或预防可借由下调Serpina1基因表达而予以调整的疾病及病症的方法。例如，本文中描述的组合物可用以治疗Serpina1相关疾病，如肝病，如慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌、以及其他可能与这些病变相关的病理状况如肺炎、肺气肿、及COPD。

本发明还提供了抑制受试者体内如具有Serpina1缺陷性变体的受试者体内肝细胞癌的发展的方法。这些方法包括将治疗有效量的本发明的组合物给予至该受试者，从而抑制该受试者体内肝细胞癌的发展。

本发明还提供了本发明的组合物用于降低错误折叠的Serpina1在受试者如具有Serpina1缺陷性变体的受试者的肝脏中积累的方法及用途。这些方法包括，给予治疗有效量的本发明的组合物至该受试者，从而降低错误折叠的Serpina1在该受试者的肝脏中的积累。

如本文所用，“受试者”包括人或非人动物，优选地脊椎动物，更佳是哺乳动物。受试者可包括转基因的有机体。最优选地，该受试者是人，如患有或易发展与Serpina1相关的疾病的人。在一个实施例中，该患有或易发展与Serpina1相关的疾病的人具有一种或多种Serpina1缺陷等位基因，如PIZ、PIS、或PIM(Malton)等位基因。

在本发明的另外的实施例中，本发明的iRNA剂是与另外的治疗剂组合给予。该iRNA剂及另外的治疗剂可于同一组合物中组合给予如肠道外给予，或该另外的治疗剂可作为独立组合物之一部分给予或借由本文中描述的另一方法给予。

适用于本发明的方法的另外的治疗剂的实例包括那些已知用以治疗肝脏病变如肝硬化的剂。例如，本发明所提出的iRNA剂可与诸如下列者同时给予：乌索脱氧胆酸(UDCA)、免疫阻抑剂、甲氨蝶呤、皮质类固醇、环孢菌素、秋水仙碱、止痒治疗如抗组胺、消胆胺(cholestyramine)、考来替泊(colestipol)、利福平(rifampin)、屈大麻酚(dronabinol(Marinol))、及血浆去除(plasmaphesesis)、预防性抗生素、紫外光、锌补充剂、甲肝疫苗、流感疫苗及肺炎双球菌疫苗。

在本发明的方法的一些实施例中，Serpina1表达降低持续延长的持续时间，如至少1周、2周、3周、或4周或更久。例如，在某些实例中，借由给予本文中描述的iRNA剂，Serpina1基因的表达被阻抑至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或55％。在一些实施例中，借由给予该iRNA剂，Serpina1基因被阻抑至少约60％、70％、或80％。在一些实施例中，借由给予该iRNA剂，Serpina1基因被阻抑至少约85％、90％、或95％。

本发明的iRNA剂可使用本领域中已知的任意给予模式给予至受试者，该模式包括但不限于，皮下给予、静脉给予、肌肉给予、眼内给予、支气管给予、胸膜给予、腹膜给予、动脉给予、淋巴管给予、脑脊髓给予、及其任意组合。在优选的实施例中，该iRNA剂是经皮下给予。

在一些实施例中，该给予是经由积存注射完成。积存注射可于较长的时间段内以一致的方式释放iRNA剂。因此，积存注射可减少获得所希望效果如所希望对Serpina1的抑制、或治疗或预防效果所需的给药频率。积存注射还可提供更一致的血清浓度。积存注射可包括皮下注射或肌肉注射。在优选的实施例中，该积存注射是皮下注射。

在一些实施例中，该给予是经由泵进行。该泵可是外部泵或经外科手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是经皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是输液泵。输液泵可用于静脉输液、皮下输液、动脉输液或硬膜外输液。在优选的实施例中，该输液泵是皮下输液泵。在其他实施例中，该泵是经外科手术植入的将该RNAi剂递送至肝脏的泵。

其他给予模式包括硬膜外给予、脑内给予、脑室内给予、鼻腔给予、动脉给予、心内给予、骨内输液、鞘内给予、以及玻璃体内给予、及肺内给予。给予的模式可基于所希望的是否为局部或全身性治疗以及基于待治疗的面积而选择。可选择给予的路径及位点以提升靶向性。

本发明的方法包括以足以阻抑/降低Serpina1 mRNA水平持续至少5天，更优选7、10、14、21、25、30或40天的剂量给予iRNA剂；以及，任选地，给予第二次单剂的该iRNA剂，其中该第二次单剂是于第一次单剂给予后至少5天，更优选7、10、14、21、25、30或40天后给予，从而抑制受试者体内Serpina1基因的表达。

在一个实施例中，多剂的本发明的iRNA剂的给予不超过每四周一次、不超过每三周一次、不超过每两周一次、或不超过每周一次。在另一个实施例中，该给予可维持1、2、3、或6个月，或1年或更久。

通常，该iRNA剂并不激活免疫系统，如，其并不增加细胞因子水平，如TNF-α或IFN-α水平。例如，当借由测定如本文中描述的体外PBMC测定进行量测时，TNF-α或IFN-α水平的增加少于以对照iRNA剂如不以Serpina1为靶标的iRNA剂处理的对照细胞的30％、20％或10％。

例如，可对受试者给予治疗量的iRNA剂，如0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、或2.5mg/kg dsRNA。该iRNA剂可借由静脉输液给予，给予时长为例如5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、或25分钟。该给予是重复进行，例如，基于规律间隔，如每双周一次(即，每两周一次)，持续1个月、2个月、3个月、4个月或更久。

在初始的治疗方案后，该治疗可以较低频率进行。例如，每双周给予一次，持续3个月后，给予可每个月重复一次，持续6个月或一年或更久。该iRNA剂的给予可将诸如细胞、组织、血液、尿液、器官(如，肝脏)或该患者的其他部位内的Serpina1水平降低至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

在给予全剂量的iRNA剂之前，可对患者给予较小的剂量，并监控副反应，如过敏反应，或监控提高的脂质水平或血压。在另一实例中，可监控患者的非所希望免疫刺激效果，如增加的细胞因子(如，TNF-α或INF-α)水平。示例性较小剂量是导致小于或等于5％的输液反应发生的剂量。

例如，可借由量测疾病进展、疾病缓解、症状严重性、疼痛减轻、生活质量、持续治疗效果所需的药物剂量、疾病标记物的水平或适用于待治疗或待作为预防靶标的给定疾病的任意其他可量测的参数，而评估疾病的治疗或预防效能。借由量测这些参数中的任一者或参数的任意组合而监控治疗或预防的效能完全处于本领域技术人员的能力范围内。例如，借由周期性监控肝纤维化标记物：a-2-巨球蛋白(a-MA)、运铁蛋白、载脂蛋白Al、玻尿酸(HA)、层黏连蛋白、N-端原胶原III(PIIINP)、7S胶原IV(7S-IV)、总胆红素、间接胆红素、丙胺酸氨基转移酶(ALT)、天冬胺酸氨基转移酶(AST)、AST/ALT、g-谷胺酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白、白蛋白/球蛋白、血尿素氮(BUN)、肌酸酐(Cr)、甘油三酸酯、胆固醇、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白、及肝脏穿刺活体组织切片，可评估对肝纤维化或肝纤维化改善的治疗效能。可在治疗前(初始读数)及治疗方案过程中之后续(后来读数)量测肝纤维化标记物和/或施行肝脏穿刺活体组织切片。

将后续读数与初始读数比较，向医师提供了治疗是否有效的指示。借由量测这些参数中的任一者或参数的任意组合而监控治疗或预防的效能完全处于本领域技术人员的能力范围内。与以Serpina1为靶向的iRNA剂或其药物组合物的给予相关联，“有效对抗”与Serpina1相关的疾病如肝病如肝纤维化病症，表明，以临床适宜的方式给予本发明的iRNA剂导致对至少统计学显著分数的患者的有益效果，如症状的改善、治愈、疾病负荷的减轻、肿瘤质量或细胞数目的下降、生命的延长、生活质量的改善、或通常被熟悉肝病治疗的医生认为积极的其他效果。

在本发明的方法中，如本文中描述的iRNA剂可用以治疗具有与Serpina1相关疾病如肝病如肝炎、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌的迹象、症状和/或标记物、或被诊断患有该疾病、或处于罹患该疾病风险的个体。本领域技术人员可容易地监控接受用如本文中描述的iRNA剂治疗的受试者体内这些病变的迹象、症状、和/或标记物，并测定这些迹象、症状和/或标记物的至少10％的下降，且优选地下降至代表肝病低风险的临床水平。

当疾病状态中的一个或多个参数存在统计学显著改善时，或者由于未能恶化或在其他情况下预期会出现症状时，治疗或预防效果是明显的。作为实例，疾病的可量测参数(如前文所述的肝功能)向有利方向变化至少10％，优选至少20％、30％、40％、50％或更高，可表明治疗有效。

对于本发明的给定iRNA剂或该iRNA剂的配制品的效能还可使用用于本领域中已知的给定疾病的实验动物予以判断。当使用实验动物模型时，当观察到标记物或症状的统计学显著的下降时，则证实治疗的效能。

当一种或多种症状被降低或缓解时，也证实治疗或预防的效果。例如，当虚弱、疲惫、体重减轻、恶心、呕吐、腹部肿胀、肢端肿胀、极度瘙痒、及眼和/或皮肤的黄疸中的一个或多个得以降低或缓解时，则治疗或预防有效。

对于某些适应症，可借由Serpina1蛋白的血清水平的增加而量测该效能。作为实例，正确折叠的Serpina1的血清水平增加至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％或更高可表明治疗有效。

可替代地，可借由疾病严重性的减轻而量测该效能，该减轻是借由本领域技术人员基于临床接受的疾病严重性分级量表诊断而测得，该分级量表例如CP评分(Child-Pughscore)(有时为CTP评分(Child-Turcotte-Pugh score))。在此实例中，借由五个临床测量值：胆红素、血清白蛋白、INR、腹水、及肝性脑病，来量测慢性肝病，主要是肝硬化的预后。每一标记物赋值1-3，且总值是用以提供分类为A(5-6个点)、B(7-9个点)、或C(10-15个点)的评分，该评分可能与一年及两年存活率相关联。测定及分析CP评分的方法是本领域中熟知的(Farnsworth等人,Am J Surgery[美国外科杂志]2004 188:580-583；Child和Turcotte.Surgery and portal hypertension.[手术和门静脉高压症]在:The liver andportal hypertension.[肝脏和门静脉高压症]由CG Child.编辑费城:桑德斯公司(Saunders)1964:50-64；Pugh等人,Br J Surg[英国外科杂志]1973；60:648-52)。在此实例中，可借由患者从例如“B”至“A”的移动而量测效能。任何导致例如使用适宜评分量测的疾病严重性减轻的积极变化，皆表示使用如本文中描述的iRNA或iRNA配制品的治疗是充分的。

在一个实施例中，该RNAi剂以如下剂量给予：约0.25mg/kg至约50mg/kg之间，如，约0.25mg/kg至约0.5mg/kg之间、约0.25mg/kg至约1mg/kg之间、约0.25mg/kg至约5mg/kg之间、约0.25mg/kg至约10mg/kg之间、约1mg/kg至约10mg/kg之间、约5mg/kg至约15mg/kg之间、约10mg/kg至约20mg/kg之间、约15mg/kg至约25mg/kg之间、约20mg/kg至约30mg/kg之间、约25mg/kg至约35mg/kg之间、或约40mg/kg至约50mg/kg之间。

可调整给予至受试者的RNAi剂的剂量，以平衡特定剂量的风险与利益的平衡，例如，以达成所希望Serpina1基因阻抑水平(如基于诸如Serpina1 mRNA阻抑、Serpina1蛋白表达而评估的)或所希望治疗性或预防性效果，同时避免非所希望副作用。

在一些实施例中，该RNAi剂是以两剂或更多剂给予。若所希望的是促进重复或频繁的输液，则可采取递送装置如泵、半永久性支架(如，静脉内支架、腹膜内支架、脑池内支架、或囊内支架)、或蓄积池的植入。在一些实施例中，后续剂量的数目或量取决于所欲效果如对Serpina1基因的阻抑的达成，或治疗性或预防性效果如减少肝病症状的达成。在一些实施例中，该RNAi剂是根据时间表给予。例如，该RNAi剂可给予每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、或每周五次。在一些实施例中，该时间表包括规律间隔的给予，如每小时、每4小时、每6小时、每8小时、每12小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每双周、或每月。在其他实施例中，该时间表包括短间隔的给予，之后为不给予该剂的较长时间段。在一些实施例中，该RNAi剂是以下述给药方案给予，该方案包括短间隔给予的“负载期”，其后可为该RNAi剂以较长的时间间隔给予的“维持期”。

任何这些时间表可任选地重复一次或多次迭代。重复的次数可取决于所希望效果如对Serpina1基因的抑制的达成，和/或治疗性或预防性效果如减轻与Serpina1相关疾病如肝病的症状的达成。

在另一方面，本发明提出指导终端用户如护理者或受试者如何给予本文中描述的iRNA剂的方法。该方法包括，任选地，向终端用户提供一剂或多剂的iRNA剂，指导该终端用户以本文中描述的方案给予该iRNA剂，从而指导该终端用户。

遗传易感性于靶标基因相关疾病如肝病的发展中起作用。因此，需要siRNA的患者可借由家族病史而鉴别，或，例如，借由筛查一种或多种遗传标记物或变体而鉴别。因此，在一方面，本发明提供了借由基于患者具有Serpina1缺陷性或Serpina1缺陷性基因变体如PIZ、PIS、或PIM(Malton)等位基因中的一种或多种选择患者而治疗该患者的方法。该方法包括对该患者给予治疗有效量的iRNA剂。

健康护理提供者如医生、护士、或家庭成员，可于开药或给予本发明的iRNA剂前取得家族病史。此外，可施行测试以测定基因型或表型。例如，对来自该患者的样本如血液样本可施行DNA测试，以于将Serpina1dsRNA给予至患者之前鉴别Serpina1基因型和/或表型。

VIII.试剂盒

本发明还提供使用任意该iRNA剂和/或实施本发明的任意方法的试剂盒。这些试剂盒包括一种或多种RNAi剂及其使用说明书，如借由将细胞与以有效易抑制Serpina1表达的量的该RNAi剂接触而抑制该细胞内Serpina1表达的使用说明书。这些试剂盒可任选地进一步包含将该细胞与该RNAi剂接触的手段(如，注射装置)、或量测对Serpina1的抑制的手段(如，量测对Serpina1 mRNA的抑制的手段)。这些量测对Serpina1的抑制的手段可包含从受试者获取样本如血浆样本的手段。本发明的试剂盒可任选地进一步包含给予该RNAi剂至受试者的手段，或确定治疗有效量或预防有效量的手段。

除非另有定义，本文中使用的所有科技术语皆具有与具有本发明所属领域的普通技术人员所一般理解的相同的意义。尽管与本文中描述的那些相似或等价的方法及材料可用于本发明提出的iRNA及方法的实践及测试中，但以下描述了适当的方法及材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利、及其他参考文献通过引用而以其整体并入本文。在矛盾的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，这些材料、方法、及实例是仅用于例示性说明，而非旨在限制。

实例

实例1.脱靶效应及体内毒性的减轻

RNA干扰或“RNAi”最初由Fire及其合作者创造，以描述双链RNAi(dsRNA)可阻断基因表达的观察结果(Fire等人(1998)Nature[自然]391,806-811；Elbashir等人(2001)Genes Dev.[基因与发育]15,188-200)。短dsRNA是于多种有机体包括脊椎动物体内导引基因特异性、转录后沉默，且已经提供用于研究基因功能的新的工具。RNAi是由RNA诱导沉默复合物(RISC)介导，该复合物是序列特异性、多组分的核酸酶，其摧毁与该沉默触发因子同源的的信使RNA。已知，RISC含有源自双链RNA触发因子的短RNA(大约22个核苷酸)，但此活性的蛋白组成仍是未知。

siRNA的脱靶效应之一是miRNA样效应，即，阿尔谷蛋白(argonaute protein)，其是RNA干扰中的核心效应子，其处理siRNA，而该siRNA是为了诱导RNA干扰而作为miRNA(microRNA)被人工引入的(Lam等人(2015)Molecular Therapy Nucleic Acids[分子疗法-核酸](2015)4,e252)。该miRNA主要通过种子区域(5’端的位置2-7)与用于基因阻抑的靶标mRNA间的碱基配对来识别靶标基因。由siRNA造成的脱靶源自siRNA的该加载有RISC的反义链的种子区域与一种或多种mRNA之间的碱基互补性。siRNA中的该miRNA样脱靶效应已经报道于若干研究中，且依据种子区域的序列而影响多数基因的表达，且其严重程度足以在基于siRNA的表型筛查中造成高达30％的阳性命中。此外，在miRNA的情形中，他们还被报道，当种子区域与靶标间的相互作用变弱时，他们通过其3’末端区域内的补偿性配对(3’-补偿性配对)而沉默靶标基因，暗示miRNA样脱靶效应有可能由此机制所介导。

如下文所述，已经发现，其中反义链包含在种子区域内(即，在反义链的自5’端计数的5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰的dsRNA剂和/或解链温度范围为自约40℃至约80℃内的dsRNA剂，在介导RNA干扰方面，可能比缺乏该去稳定修饰的亲本dsRNA剂更为有效。这些剂在抑制靶标基因表达方面具有优势，同时具有降低的脱靶基因沉默效应，且RNAi组合物适用于治疗性用途。

材料与方法

将以下材料与方法用于实例中。

siRNA设计

选择以丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)(AAT)为靶向的前导发展候选dsRNA剂用于本文中所描述的实验中的评估。如下文描述的，设计、合成且评估以Serpina1为靶向的dsRNA剂，该剂具有经修饰的亲本前导发展候选者的核苷酸序列，且具有包含该种子区域内(即，自反义链的5’端计数，在该5’端的位置2-9)的双链的至少一个热去稳定修饰的反义链，和/或具有范围约40℃至约80℃内的解链温度。

具体地，如2013年5月22日提交的美国临时申请号61/826,125；2013年11月1日提交的美国临时申请号61/898,695；于2014年4月15日提交的美国临时申请号61/979,727；于2014年5月6日提交的美国临时申请号61/989,028；美国专利申请号14/284,745，现已于2017年2月21日公告为美国专利号9,574,192；于2017年1月6日提交的美国专利申请号15/399,820；以及2014年5月22提交的国际专利申请号PCT/US 2014/039109所描述，AD-61444是经鉴别并显示在体外及体内有效且经久地抑制AAT。AD-61444的未经修饰的正义链核苷酸序列是5’-CUUCUUAAUGAUUGAACAAAA-3’(SEQ ID NO:417)，且AD-61444的未经修饰的核苷酸序列是5’-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO:419)。AD-61444的经修饰的正义链核苷酸序列是5’-csusucuuaauGfAfuugaacaaaaL96-3’(SEQ ID NO:418)，且AD-61444的经修饰的反义链核苷酸序列是5’-usUfsuUfgUfuCfaAfucaUfuAfaGfaAfgsasc-3’(SEQ ID NO:420)。

表B：表1：在核酸序列表述中使用的核苷酸单体的缩写。

应理解，当这些单体以寡核苷酸存在时，其是借由5’-3’-磷酸二酯键而相互连接。

合成及纯化

全部寡核苷酸是MerMade 192合成器上、以1μmol规格、使用通用或定制支撑物制备。全部亚磷酰胺是以100mM的浓度于100％乙腈或9:1乙腈:DMF中，在针对2-氰基乙基亚磷酰胺化物的标准方案下使用，但耦合时间延长至400秒。新形成的键的氧化使用了用以创建磷酸酯键的I₂于9:1乙腈:水中的50mM溶液以及用以创建硫代磷酸酯键的DDTT于9:1吡啶:乙腈中100mM溶液达成。在该脱三苯甲基合成之后，将柱在150μL的40％甲胺水溶液中孵育45分钟，且该溶液经由真空引流到96孔板中。使用新鲜的甲胺水溶液部分重复该孵育及引流后，将该含有粗制寡核苷酸溶液的板密封，并于室温再振荡60分钟，以完全移除全部保护基团。经由向每孔添加1.2mL的9:1乙腈:乙醇，之后于-20℃孵育过夜，完成该粗制寡核苷酸的制备。该板随后以3000RPM离心45分钟，自每孔移除上清液，并将团块再悬浮于950μL的20mM NaOAc水溶液中。每一粗制溶液在GE Hi-Trap脱盐管柱(Sephadex G25Superfine)上使用水进行最终的脱盐，以洗出最终的寡核苷酸产物。所有同一性及纯度是分别使用ESI-MS及IEX HPLC证实。

温度依赖性UV光谱学

以1μM(由与未互补的未修饰的RNA有义链配对的修饰的反义链组成)的双链浓度，在0.33x PBS(3.3mM磷酸钠/磷酸钾缓冲液，pH 7.4，具有46mM NaCl及0.9mM KCl)中、在1cm光程石英比色器中、在配备程序升温器的Beckman DU800分光亮度计上实施解链研究。每一比色皿含有200μL的样本溶液，该样本溶液覆盖有125μL的轻质矿物油。在260nm监控解链曲线，以1℃/min的加热速度从15℃升温至90℃。从平滑的加热曲线的一阶导数计算解链温度(Tm)，且所报告的数值是至少两次独立量测的结果。

体外报告基因测定

COS-7细胞是在37℃、5％CO2下，在以10％胎牛血清(FBS)补充的杜尔贝科改进伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM))中培养。根据制造商的使用说明书，在96孔板(15,000细胞/孔)上，以10ng荧光素酶报告基因质粒及50fM至50nM siRNA在10倍稀释液中使用2μg/mL Lipofectamine 2000(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)质粒)转染细胞。转染48h后收获细胞，根据制造商的使用说明书，进行双荧光素酶测定(普洛麦格公司(Promega))。上靶报告基因质粒含有与3’未翻译(3’UTR)的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)中的反义链完美互补的单个位点。脱靶报告基因质粒在海肾阳光速卖的3’UTR中含有借由21至28个核苷酸分离的4个串联种子互补位点。两种质粒皆共表达作为转染对照的萤火虫荧光素酶。

基因表达分析

将冷藏保存的大鼠及人肝细胞(生物再生公司(Bioreclamation))在37℃、5％CO2下在具有Torpedo抗生素混合物的InVitroGRO CP培养基中培养。根据制造商的使用说明书，将细胞于96孔板(20,000细胞/孔)中以10nM的siRNA使用2μg/mL LipofectamineRNAiMAX(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))转染。转染后24小时，收获细胞，根据制造商的使用说明书，使用miRNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen)萃取RNA。使用TruSeq标准总RNA实验室制备试剂盒(依诺米那(Illumina))制备cDNA库，并于NextSeq 500(依诺米那(Illumina))测序。

体内小鼠研究及大鼠研究

全部研究是使用与地区、州及联邦法规相一致的适用且经实验动物管理及使用委员会(IACUC)批准的方案于奥尼蓝制药公司(Alnylam Pharmaceuticals)进行。

在小鼠药效动力学研究中，对雌性C57BL/6小鼠(查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories))经皮下于其上背部给予单剂的载体对照(0.9％氯化钠，生理盐水)或0.5或1mg/kg的siRNA。在第8天，收集肝脏，以冷盐水冲洗，立即于液氮中急速冷冻，并于-80℃储存以用于mRNA及siRNA分析。

在大鼠毒性研究中，对雄性Sprague Dawley大鼠(查尔斯河实验室(CharlesRiver Laboratories))经皮下于其上背部给予三次重复周剂量(qw x 3)的载体对照(0.9％氯化钠，生理盐水)或30mg/kg的siRNA。在第16天，收集血清进行临床病理学评估，并收集肝脏进行组织病理学评估及进行mRNA及siRNA分析。

mRNA及siRNA定量

根据制造商的使用说明书，以miRNeasy试剂盒(凯杰公司(Qiagen)萃取RNA，根据制造商的使用说明书，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))转化为cDNA，并且借由定量聚合酶链反应(qPCR)使用基因特异性Taqman探针(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))在罗氏(Roche)LightCycler 480II使用LightCycler 480Probes Master(罗氏公司(Roche))评估mRNA的水平。

为了定量对siRNA暴露，细胞团块是再悬浮于含有0.25％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，在95℃加热10min，以14,000rpm于4℃离心10min，并且根据制造商的使用说明书，使用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific))对该上清液施行逆转录。根据制造商的使用说明书，使用Roche LightCycler480Probes Master于Light Cycler 480II(罗氏公司(Roche))上施行qPCR。

结果

1.体外研究

体外报告基因测定的结果总结于表1中。如表1中的数据所示，在反义链的位置7的二醇核酸(GNA)修饰保存了体外上靶活性，同时减轻了体外脱靶活性。

表1：在反义链的位置7的GNA修饰的体外报告基因测定

将荧光素酶报告基因质粒与siRNA一起共转染入COS-7细胞内，且于第48小时施行荧光素酶测定。

2.基因表达分析

体外基因表达分析的结果总结于表2中。如表2所示，在该反义链的位置7的GNA修饰减轻了体外的脱靶活性。

表2：基因表达分析

以siRNA转染人肝细胞(AAT)，且于24小时收集RNA进行RNA测序。

3.小鼠体内研究

体内研究的结果总结于表3中。如所示，在反义链的位置7的GNA修饰保存体内潜能(表3)。

表3：小鼠的药效动力学数据

对小鼠以1mg/kg的剂量一次性给予以AAT为靶向的siRNA，且在第8天评估肝脏mRNA的敲除。

实例2.以Serpina1为靶向的dsRNA剂的体内及体外分析

为了进一步评估将GNA核苷酸并入AD-61444的体内效果，以GNA核苷酸在反义链位置6(AD-75994)或7(AD-75995)进一步修饰AD-61444(第1A图)，且将该剂以1mg/kg的剂量一次性经皮下给予至针对人AAT转基因小鼠。在给药之前，以及图1B中标注的时间点，获得血清用于循环AAT的定量。AAT蛋白水平是借由夹心酶联免疫分析测定，且将数据标准化为AAT蛋白水平的基线值

如图1B中描绘的，与亲代分子相比，将GNA核苷酸并入AD-61444的反义链的位置6或7的任一处导致活性的损失。

因此，AD-61444中经2’-氟修饰的核苷酸总数的下降，导致AD-77407；而将GNA核苷酸并入AD-77407的反义链的位置7，导致AD-77412(图1C)。将该剂以1mg/kg的剂量一次性经皮下给予至针对人AAT转基因小鼠。在给药之前，以及图1D中标注的时间点，获得血清用于循环AAT的定量。AAT蛋白水平是借由夹心酶联免疫分析测定，且将数据标准化为AAT蛋白水平的基线值

图1D是证明，降低AD-61444的2’-氟含量(即，AD-77407)，在小鼠体内导致所标示的活性改善。此外，将GNA核苷酸并入此情形(AD-77412)导致相对于亲代分子AD-61444的净改善。

为了测定AD-61444对于降低2’-氟的含量的效果以及将GNA核苷酸并入反义链的位置7对于脱靶的效果，使用Lipofectamine RNAiMax以10nM的AD-61444或AD-77412转染Hep3b细胞。16小时后，裂解细胞，并制备用于转录分析。如图2A及2B中描绘的，所得数据是经图形化，以黑色圆圈表示的转录物的表达系统计学上显著不同于模拟治疗细胞，而以灰色圆圈表示的转录物的表达统计学上并未显著不同于模拟治疗细胞。将该AAT转录物是得以指示并以圆圈高亮。

图2A及2B中描绘的数据证明，以AD-61444治疗细胞导致包括AAT在内的52种转录物的下调。相比的下，含有GNA的双链，AD-77412，导致包括AAT在内的仅3种转录物的下调转录物。因此，GNA核苷酸的并入实质上降低了体内由AD-61444下调的所观察到的脱靶数目。

还评估AD-77412在非人灵长类动物体内的效果。对食蟹猴单次经皮下给予0.3mg/kg、1.0mg/kg、3mg/kg、或10mg/kg剂量AD-61444或AD-77412。在给药之前、以及在图3A至3D中标注的时间点，获取血清用于循环AAT的定量。AAT蛋白水平是借由夹心酶联免疫分析测定，且将数据标准化为AAT蛋白水平的基线值

如图3A至3D中描绘的，全部剂量的AD-61444及AD-77412皆有效地令AAT表达沉默，具有相似的最大沉默水平。

总之，这些测定证明，将GNA核苷酸并入亲代分子AD-61444的反义种子区域内，与该亲体分子相比并未导致活性损失，且显著降低了脱靶效应。

Claims

1.一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA(dsRNA)剂包含形成双链区域的正义链和反义链，

其中该正义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；且该反义链包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸；

其中所述反义链包含在该5’区域的前9个核苷酸位置内的该双链区域的至少一个热去稳定修饰或其前体，

其中所述正义链包含ASGPR配体，并且

其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸。

2.一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)剂，该双链RNA剂包含形成双链区域的正义链和反义链，所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA互补的区域，其中该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸，

其中所述反义链包含在该5’区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰或其前体，

其中所述正义链包含ASGPR配体，

3.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该dsRNA剂包含至少4个包含2’-氟修饰的核苷酸。

4.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其具有以下特征：

a)该热去稳定修饰位于该反义链的5’区域的位置4-8；

b)该正义链与该反义链是各自独立包含至少2个包含2’-氟修饰的核苷酸；以及

c)附接于该正义链的任一端的ASGPR配体。

5.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该反义链具有以下特征中的至少两个：

a)该热去稳定修饰位于该反义链的位置4至8；

b)至少2个核苷酸包含2’-氟修饰；

c)核苷酸位置1与2(自5’端计数)之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；

d)长度为18至35个核苷酸。

6.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该正义链具有以下特征中的至少一个：

a)该ASGPR配体附接于该正义链的任一端；

b)至少2个核苷酸包含2’-氟修饰；

c)该双链区域横跨至少19个核苷酸位置，并且其中该热去稳定修饰位于所述双链区域内。

7.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该热去稳定修饰选自由下列所组成的组：

其中B是核酸碱基。

8.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该去稳定修饰位于该反义链的位置7。

9.根据权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该ASGPR配体是通过二价或三价的支链接头而附接的一个或多个GalNAc衍生物。

10.如权利要求9所述的dsRNA剂，其中该ASGPR配体是：

11.如权利要求10所述的双链RNAi剂，其中该RNAi剂如以下方案所示共轭至该配体：

其中X是O或S。

12.一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA分子，该双链RNA分子包含正义链和反义链，

其中该反义链包含在该5'区域的前9个核苷酸位置内的至少一个热去稳定修饰；

其中该正义链与该反义链的长度各自独立地为14至40个核苷酸；并且

其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

13.一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)靶标基因序列的表达的双链RNA分子，该双链RNA分子包含正义链和反义链，所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA互补的区域，其中该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:15的核苷酸序列相差不超过3个核苷酸，

其中该dsRNA的解链温度为约40℃至约80℃。

14.如权利要求12或13所述的dsRNA剂，其中该dsRNA的解链温度为约55℃至约67℃。

15.如权利要求14所述的dsRNA剂，其中该dsRNA的解链温度为约60℃至约67℃。

16.如权利要求12-14中任一项所述的dsRNA剂，其进一步包含ASGPR配体。

17.如权利要求16所述的dsRNA剂，其中该ASGPR配体是通过二价或三价的支链接头而附接的一个或多个GalNAc衍生物。

18.如权利要求17所述的dsRNA剂，其中该ASGPR配体是：

19.如权利要求18所述的双链RNAi剂，其中该RNAi剂如以下方案所示共轭至该配体：

其中X是O或S。

20.如权利要求1-19中任一项所述的dsRNA，其中该dsRNA进一步具有以下特征中的至少一个：

(i)该反义链包含2、3、4、5或6个包含2’-氟修饰的核苷酸；

(ii)该反义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；

(iii)该正义链与配体共轭；

(iv)该正义链包含2、3、4或5个包含2’-氟修饰的核苷酸；

(v)该正义链包含1、2、3或4个硫代磷酸酯核苷酸间键；

(vi)该dsRNA包含至少4个包含2’-氟修饰的核苷酸；

(vii)该dsRNA包含长度为12-40核苷酸对的双链区域；以及

(viii)位于该反义链的5’端的钝端。

21.如权利要求1-4或7-20中任一项所述的dsRNA剂，其中各链具有15-30个核苷酸。

22.如权利要求1-4或7-20中任一项所述的dsRNA剂，其中各链具有19-30个核苷酸。

23.如权利要求1-20中任一项所述的dsRNA剂，其中该正义链具有21个核苷酸，且该反义链具有23个核苷酸。

24.如权利要求2所述的dsRNA剂，其中该反义链包含互补区域，该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与SEQ ID NO:1的核苷酸1440-1480相差不超过3个核苷酸。

25.如权利要求2所述的dsRNA剂，其中该互补区域包含至少15个连续的核苷酸，这些连续的核苷酸与核苷酸序列5’-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO:419)相差不超过3个核苷酸。

26.如权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该正义链包含核苷酸序列5’-CUUCUUAAUGAUUGAACAAAA-3’(SEQ ID NO:417)，且该反义链包含核苷酸序列5’-UUUUGUUCAAUCAUUAAGAAGAC-3’(SEQ ID NO:419)。

27.如权利要求1或2所述的dsRNA剂，其中该正义链包含核苷酸序列5’-csusucuuAfaUfGfAfuugaacaaaa-3’(SEQ ID NO:33)，且该反义链包含核苷酸序列5’-usUfsuugu(Tgn)caaucaUfuAfagaagsasc-3’(SEQ ID NO:34)，

其中a、g、c、及u分别是2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C、及U；Af、Gf、Cf及Uf分别是2’-氟A、G、C及U；s是硫代磷酸酯键；并且(Tgn)是胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体。

28.一种抑制丝胺酸肽酶抑制剂分支A成员1(Serpina1)基因的表达的双链RNA(dsRNA)分子，该双链RNA分子包含形成双链区域的正义链和反义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’-csusucuuAfaUfGfAfuugaacaaaaL96-3’(SEQ ID NO:35)，且该反义链包含核苷酸序列5’-usUfsuugu(Tgn)caaucaUfuAfagaagsasc-3’(SEQ ID NO:34)，

其中a、g、c、及u分别是2’-O-甲基(2’-OMe)A、G、C、及U；Af、Gf、Cf及Uf分别是2’-氟A、G、C及U；s是硫代磷酸酯键；(Tgn)是胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体；并且，L96是N-[三(GalNAc-烷基)-酰胺基癸酰基)]-4-羟基脯胺醇。

29.一种载体，其含有如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂。

30.一种细胞，其含有如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂。

31.一种药物组合物，其包含如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂。

32.如权利要求31所述的药物组合物，其中RNAi剂是于非缓冲溶液中给予。

33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述非缓冲溶液是盐水或水。

34.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述RNAi剂与缓冲溶液一起给予。

35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐或其任意组合。

36.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

37.一种抑制细胞内Serpina1表达的方法，该方法包括将该细胞与如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂、如权利要求29所述的载体、或如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物接触，从而抑制该细胞内Serpina1基因的表达。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述细胞是在受试者体内。

39.如权利要求38所述的方法，其中该受试者是人。

40.如权利要求37-39中任一项所述的方法，其中该Serpina1表达被抑制至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、或约100％。

41.一种治疗患有Serpina1相关疾病的受试者的方法，该方法包括对该受试者给予治疗有效量的如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂、如权利要求29所述的载体、或如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。

42.如权利要求41所述的方法，其中该受试者是人。

43.如权利要求41所述的方法，其中该Serpina1相关疾病是肝脏病变。

44.如权利要求43所述的方法，其中该肝脏病变选自由慢性肝病、肝炎、肝硬化、肝纤维化、和/或肝细胞癌所组成的组。

45.如权利要求41所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

46.如权利要求45所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

47.如权利要求41所述的方法，其中该双链RNAi剂是经皮下给予。

48.如权利要求41所述的方法，其中该双链RNAi剂是经静脉给予。

49.如权利要求41所述的方法，其中所述RNAi剂是以两剂或更多剂给予。

50.一种抑制具有Serpina1缺陷性变体的受试者体内肝细胞癌的发展的方法，该方法包括对该受试者给予治疗有效量的如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂、如权利要求29所述的载体、或如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物，从而抑制该受试者体内肝细胞癌的发展。

51.如权利要求50所述的方法，其中该受试者是灵长类动物或啮齿类动物。

52.如权利要求50所述的方法，其中该受试者是人。

53.如权利要求50所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

54.如权利要求53所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

55.如权利要求50所述的方法，其中所述RNAi剂是以两剂或更多剂给予。

56.如权利要求50所述的方法，其中该双链RNAi剂是经皮下给予。

57.如权利要求50所述的方法，其中该双链RNAi剂是经静脉给予。

58.一种降低具有Serpina1缺陷性变体的受试者的肝脏内错误折叠的Serpina1的积累的方法，该方法包括对该受试者给予治疗有效量的如权利要求1-28中任一项所述的dsRNA剂、如权利要求29所述的载体、或如权利要求31-36中任一项所述的药物组合物，从而降低该受试者的肝脏内错误折叠的Serpina1的积累。

59.如权利要求58所述的方法，其中该受试者是灵长类动物或啮齿类动物。

60.如权利要求58所述的方法，其中该受试者是人。

61.如权利要求58所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

62.如权利要求61所述的方法，其中该双链RNAi剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

63.如权利要求58所述的方法，其中所述RNAi剂是以两剂或更多剂给予。

64.如权利要求58所述的方法，其中该双链RNAi剂是经皮下给予。

65.如权利要求58所述的方法，其中该双链RNAi剂是经静脉给予。