CN108138182A - 甲状腺素运载蛋白（TTR）iRNA组合物及其治疗或预防TTR相关疾病的使用方法 - Google Patents

甲状腺素运载蛋白（TTR）iRNA组合物及其治疗或预防TTR相关疾病的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的iRNA剂，例如，双链iRNA剂，以及使用此类iRNA剂用于治疗或预防TTR相关疾病的方法。

Description

甲状腺素运载蛋白（TTR）iRNA组合物及其治疗或预防TTR相关 疾病的使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年7月31日提交的美国临时专利申请号62/199,563 和于2016年1月27日提交的美国临时专利申请号62/287,518的优先权权益。上述申请中的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
本申请涉及于2013年9月23日提交的美国临时专利申请号61/881,257 和于2014年9月23日提交的国际申请号PCT/US 2014/056923，其每一个的全部内容特此通过引用结合在此。此外，本申请涉及于2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710、于2012年11月16日提交的国际申请号 PCT/US 2012/065601、于2012年3月26日提交的美国临时申请号 61/615,618、于2012年8月6日提交的美国临时申请号61/680,098、于2014 年5月16日提交的美国申请号14/358,972、和于2012年11月16日提交的国际申请号PCT/US 2012/065691，其每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
序列表
本申请包含已经按ASCII格式以电子方式提交的序列表，并且其以其全文通过引用特此结合。所述创建于2016年7月8日的ASCII副本名称为 121301-03020_SL.txt，并且大小为68,289字节。
背景技术
甲状腺素运载蛋白(TTR)(也称为前白蛋白)发现于血清和脑脊髓液 (CSF)中。TTR运载工具视黄醇结合蛋白(RBP)和甲状腺素(T4)，也通过其与血液和CSF中的RBP缔合而作为视黄醇(维生素A)的载体起作用。甲状腺素运载蛋白是因其运载甲状腺素和视黄醇而得名。TTR也具有蛋白酶功能，并且可以切割蛋白质，包括apoA-I(主要的HDL载脂蛋白)、淀粉样蛋白β-肽和神经肽Y。参见Liz,M.A.等人(2010)IUBMB Life[IUBMB 生命]，62(6):429-435。
TTR是四个相同的127个氨基酸亚单位(单体)的四聚体，该亚单位富含β折叠结构。每个单体具有2个4-链β折叠和长椭球的形状。由反平行β折叠相互作用将单体连接成二聚体。来自每个单体的短环形成主要二聚体-二聚体相互作用。这两对环将二聚体的反向外凸β折叠分开以形成内部通道。
肝脏是TTR表达的主要部位。其他显著表达部位包括脉络丛、视网膜 (具体地视网膜色素上皮细胞)和胰脏。
甲状腺素运载蛋白是至少27种不同类型的蛋白质之一，其是淀粉样蛋白纤维形成中的前体蛋白。参见Guan,J.等人(2011年11月4日)Current perspectives on cardiacamyloidosis[心脏淀粉样变性的当前观点]，Am J Physiol Heart Circ Physiol[美国生理心脏和循环生理学杂志]， doi:10.1152/ajpheart.00815.2011。器官与组织中淀粉样蛋白纤维的细胞外沉积是淀粉样变性的特点。淀粉样蛋白纤维由错误折叠的蛋白质聚集体构成，其可能由前体蛋白的过量产生或特异性突变引起。TTR的促淀粉样蛋白生成的潜力可能与其广泛的β折叠结构有关；X-射光晶体学研究表明某些促淀粉样蛋白生成的突变会使蛋白质的四聚体结构失去平衡。参见，例如，Saraiva M.J.M.(2002)Expert Reviews inMolecular Medicine[分子医学专家评论]， 4(12):1-11。
淀粉样变性是一组特征在于淀粉样蛋白沉积物的淀粉样蛋白病的统称。淀粉样蛋白病基于其前体蛋白进行分类；例如，淀粉样蛋白(amyloid)名称以“A”开头，随后为前体蛋白的缩写，例如，促淀粉样蛋白生成的甲状腺素运载蛋白(amloidogenic transthyretin)的缩写ATTR。参见上述文献。
有许多种TTR相关疾病，其大多数为淀粉样蛋白病。正常序列TTR是与老年人的心脏淀粉样变性相关，并且被称为老年全身性淀粉样变性(senile systemic amyloidosis，SSA)(也被称为老年心脏淀粉样变性(senile cardiac amyloidosis，SCA)或心脏淀粉样变性)。SSA经常在许多其他器官中伴随出现显微沉积物。TTR淀粉样变性以各种形式表现。当周围神经系统受到更显著影响时，该疾病被称为家族性淀粉样变性多发性神经病(familial amyloidotic polyneuropathy，FAP)。当主要涉及心脏但未涉及神经系统时，该疾病被称为家族性淀粉样心肌病(familial amyloidotic cardiomyopathy， FAC)。TTR淀粉样变性的第三种主要形式是柔脑膜淀粉样变性，也被称为柔脑膜或脑膜脑血管淀粉样变性、中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、或淀粉样变性VII型。TTR突变也会造成淀粉样变性玻璃体混浊、腕管综合征、和甲状腺功能正常的高甲状腺素血症，其被认为是由于突变的TTR分子对甲状腺素的亲和力增加而引起甲状腺素与TTR的缔合增加所继发的非淀粉样变性病。参见，例如，Moses等人(1982)J.Clin.Invest.[临床研究杂志]，86, 2025-2033。
异常的促淀粉样蛋白生成蛋白质可能是遗传性的或通过体细胞突变获得的。Guan,J.等人(2011年11月4日)Current perspectives on cardiac amyloidosis[心脏淀粉样变性的当前观点]，Am J Physiol Heart Circ Physiol[美国生理心脏和循环生理学杂志]，doi:10.1152/ajpheart.00815.2011。甲状腺素运载蛋白相关的ATTR是遗传性全身性淀粉样变性的最常见形式。Lobato,L. (2003)J.Nephrol.[肾脏学杂志]，16:438-442。TTR突变加速TTR淀粉样蛋白形成的过程，并且是发展ATTR的最重要的风险因素。已知有超过85种促淀粉样蛋白生成的TTR变体会引起全身性家族性淀粉样变性。TTR突变通常产生全身性淀粉样蛋白沉积，其特别涉及周围神经系统，但是一些突变与心肌病或玻璃体混浊有关。参见上述文献。
V30M突变是最普遍的TTR突变。参见例如，Lobato,L.(2003)J Nephrol[肾脏学杂志]，16:438-442。3.9％非裔美国人口携带V122I突变，并且是FAC的最常见原因。Jacobson,D.R.等人(1997)N.Engl.J.Med.[新英格兰医学杂志]336(7):466-73。据估计，SSA影响超过25％的80岁以上人口。 Westermark,P.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院刊]87 (7):2843-5。
因此，该领域需要对TTR相关疾病的有效治疗。
发明内容
本发明提供靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的RNAi剂(例如，双链RNAi剂)和组合物。本发明也提供使用本发明的RNAi剂(例如，双链 RNAi剂)抑制TTR表达的方法以及治疗或预防受试者的TTR相关疾病的方法。本发明至少部分基于以下发现：在正义链上基本上所有的核苷酸和在反义链上基本上所有的核苷酸均为经修饰的核苷酸并且包含正义链上的不超过8 个2′-氟修饰、反义链上的不超过6个2′-氟修饰、正义链的5′-端的2个硫代磷酸酯键、反义链的5′-端的2个硫代磷酸酯键、和配体(例如，GalNAc3配体)的RNAi剂，在本文中显示可以在沉默TTR基因的活性方面有效。这些 RNAi剂显示惊人地增强的TTR基因沉默活性。在不旨在受理论限制的情况下，据信上述修饰与特异性靶标位点在这些RNAi剂中的组合或亚组合赋予本发明的RNAi剂改善的功效、稳定性、效能、和耐久性。
因此，在一个方面中，本发明提供双链核糖核酸(RNAi)剂，用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)的表达，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5′- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3′)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个实施例中，并且其中该双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Na′和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，该YYY基序出现在正义链的切割位点处或附近。在一个实施例中，该Y′Y′Y′基序出现在反义链从5′-端起位置11、12和13处。
在一个实施例中，该Y核苷酸包含2′-氟修饰。
在一个实施例中，该Y′核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
该双链区域可以是15-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、 17-25个核苷酸对的长度、23-27个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、或21-23个核苷酸对的长度。
该双链RNAi剂的每条链可以具有15-30个核苷酸或19-30个核苷酸。
在一个实施例中，这些核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：脱氧核苷酸、3′-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2’-C-烷基-修饰的核苷酸、2’-羟基-修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-无水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5′-磷酸酯的核苷酸、和包含5′-磷酸酯模拟物的核苷酸、及其组合。
在一个实施例中，这些核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
该正义链可以包含不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2 个2′-氟修饰。
该反义链可以包含不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰。
在一个实施例中，该双链RNAi剂进一步包含在反义链的5′核苷酸处的 5′-磷酸酯或5′-磷酸酯模拟物。在另一个实施例中，该双链RNAi剂进一步包含在反义链的5′核苷酸处的5′-磷酸酯模拟物。
在一个实施例中，该5′-磷酸酯模拟物是5′-乙烯基磷酸酯(5′-VP)。
在一个实施例中，该配体是通过二价或三价分支的连接体(linker)附接的一个或多个GalNAc衍生物。在另一个实施例中，该配体是
在一个实施例中，该配体附接在正义链的3′端。
在一个实施例中，该双链RNAi剂与如下图解所示的配体轭合
其中X是O或S。
在一个实施例中，该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)，
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)，和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf 是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
在一个实施例中，正义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中 a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf 是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。在另一个实施例中，正义链和反义链包含核苷酸序列5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，其中a、 c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是 2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。在又另一个实施例中，该 RNAi剂选自下组：表1与3中任一个表中所列出的任一种RNAi剂。在又另一个实施例中，该RNAi剂是AD-65492。
在一个方面中，本发明提供双链核糖核酸(RNAi)剂，用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)的表达，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQID NO:2(5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)完全互补的区域，其中各链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中正义链与至少一个配体轭合，其中该配体是通过二价或三价分支的连接体附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施例中，该双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Na′和Nb′独立地表示包含8-10个核苷酸的寡核苷酸序列，所述8-10个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序，并且其中该修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
本发明还提供包含本发明的双链RNAi剂的细胞、包含本发明的载体的细胞、和包含本发明的双链RNAi剂或本发明的载体的药物组合物。
在一个实施例中，该双链RNAi剂是在未缓冲的溶液(例如，盐水或水)中给予。
在另一个实施例中，该双链RNAi剂使用缓冲溶液给予。在一个实施例中，该缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐、或其任何组合。在另一个实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
在另一个方面中，本发明提供抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法。该方法包括：(a)使细胞与本发明的双链RNAi剂、本发明的载体、或本发明的药物组合物接触；和(b)使步骤(a)中产生的细胞维持足以达到TTR基因的mRNA转录物降解的一段时间，从而抑制在细胞中的TTR基因的表达。
在一个实施例中，该细胞是在受试者内。
在一个实施例中，该受试者是人类。
在一个实施例中，该受试者罹患TTR相关疾病。
在一个实施例中，TTR表达被抑制至少约10％、约15％、约20％、约 25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约 95％、约98％或约100％。
在又另一个方面中，本发明提供治疗患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的方法，其通过向该受试者给予治疗有效量的本发明的双链 RNAi剂、或本发明的载体、或本发明的药物组合物，从而治疗该受试者。
在又另一个方面中，本发明提供预防性治疗处于发展甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的风险的受试者的方法，其通过向该受试者给予预防有效量的本发明的双链RNAi剂、或本发明的载体、或本发明的药物组合物，从而预防性治疗该受试者。
在进一步的方面中，本发明提供治疗患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的双链 RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在进一步的方面中，本发明提供预防性治疗处于发展甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的风险的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予预防有效量的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA- 3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供降低、减慢或阻止患有甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS (mNIS+7)的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的双链RNAi剂、或本发明的载体、或本发明的药物组合物，从而降低、减慢或阻止该受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS(mNIS+7)。
在进一步的方面中，本发明提供降低、减慢或阻止患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS (mNIS+7)的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的双链RNAi 剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供增加患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的双链RNAi剂、或本发明的载体、或本发明的药物组合物，从而增加该受试者的6分钟步行测试(6MWT)。
在进一步的方面中，本发明提供增加患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者6分钟步行测试(6MWT)的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，其中每条链是约14 个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个实施例中，该双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Nb和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，该受试者是人类。
在一个实施例中，该受试者是罹患TTR相关疾病的受试者。在另一个实施例中，该受试者是处于发展TTR相关疾病风险的受试者。在一个实施例中，该处于发展TTR相关疾病风险的受试者携带与发展TTR相关疾病相关的TTR基因突变、或是具有TTR相关疾病的家族病史的受试者、或是具有表明发展出TTR淀粉样变性的体征或症状的受试者。
在一个实施例中，TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、柔脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、和高甲状腺素血症。
在一个实施例中，该受试者患有TTR相关的淀粉样变性，并且该方法减少受试者的淀粉样蛋白TTR沉积物。
在一个实施例中，该双链RNAi剂是通过选自下组的手段向受试者给予，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、脑脊髓、及其任何组合。在另一个实施例中，该双链 RNAi剂是经由皮下、肌内或静脉内给药向受试者给予的。在又另一个实施例中，该双链RNAi剂是经由皮下给药向受试者给予的。
在一个实施例中，这些方法进一步包括评估在来源于该受试者的样品中的TTRmRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
在一个实施例中，给予双链RNAi剂不会导致受试者的炎症反应，如基于来自受试者的样品中的细胞因子或趋化因子的水平所评估的，该细胞因子或趋化因子选自下组，该组由以下各项组成：G-CSF、IFN-γ、IL-10、IL- 12(p70)、IL1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、 TNFα、及其任何组合。
在一个方面中，本发明提供治疗患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约12.5mg至约 200mg(例如，约12.5mg、约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约 125mg、约150mg、约175mg、或约200mg)双链RNAi剂，其中该双链 RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2 (5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14 个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在另一个方面中，本发明提供预防性治疗处于发展甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍风险的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约12.5mg至约200mg(例如，约12.5mg、约25mg、约50mg、约75 mg、约100mg、约125mg、约150mg、约175mg、或约200mg)双链 RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与SEQ IDNO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中正义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中正义链包含不超过8 个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供治疗患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约0.15mg/kg至约2.5 mg/kg(例如，约0.15mg/kg、约0.3mg/kg、约0.6mg/kg、约1mg/kg、约 1.25mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、或约3mg/kg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个 2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供预防性治疗处于发展甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的风险的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约0.15mg/kg至约2.5mg/kg(例如，约0.15mg/kg、约0.3mg/kg、约0.6 mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、或约3 mg/kg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’) 互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中正义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在另一个方面中，本发明提供降低、减慢或阻止患有甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS (mNIS+7)的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约0.15mg/kg至约 2.5mg/kg(例如，约0.15mg/kg、约0.3mg/kg、约0.6mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、或约3mg/kg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8 个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在又另一个方面中，本发明提供增加患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约0.15mg/kg至约2.5mg/kg(例如，约0.15mg/kg、约0.3 mg/kg、约0.6mg/kg、约1mg/kg、约1.25mg/kg、约2mg/kg、约2.5 mg/kg、或约3mg/kg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供治疗患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约10mg至约600 mg、约25mg至约500mg、约50mg至约500mg、或约80mg至约500 mg、约25mg至约300mg、约50mg至约300mg、或约80mg至约300mg (例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120、约125、约130、约140、约150、约160、约170、约175、约180、约190、约200、约210、约220、约225、约230、约240、约250mg、约260、约270、约275、约280、约290、约300、约 310、约320、约325、约330、约340、约350、约360、约370、约375、约 380、约390、约400、约410、约420、约425、约430、约440、约450 mg、约460、约470、约475、约480、约490、约500、约510、约520、约 525、约530、约540、约550、约560、约570、约575、约580、约590、或约600mg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个方面中，本发明提供预防性治疗处于发展甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的风险的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约10mg至约600mg、约25mg至约500mg、约50mg至约500mg、或约80mg至约500mg、约25mg至约300mg、约50mg至约300mg、或约80mg至约300mg(例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约 70、约75、约80、约90、约100、约110、约120、约125、约130、约 140、约150、约160、约170、约175、约180、约190、约200、约210、约 220、约225、约230、约240、约250mg、约260、约270、约275、约 280、约290、约300、约310、约320、约325、约330、约340、约350、约 360、约370、约375、约380、约390、约400、约410、约420、约425、约 430、约440、约450mg、约460、约470、约475、约480、约490、约500、约510、约520、约525、约530、约540、约550、约560、约570、约 575、约580、约590、或约600mg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在另一个方面中，本发明提供降低、减慢或阻止患有甲状腺素运载蛋白 (TTR)相关障碍的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS (mNIS+7)的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约10mg至约 600mg、约25mg至约500mg、约50mg至约500mg、或约80mg至约500 mg、约25mg至约300mg、约50mg至约300mg、或约80mg至约300mg (例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120、约125、约130、约140、约150、约160、约170、约175、约180、约190、约200、约210、约220、约225、约230、约240、约250mg、约260、约270、约275、约280、约290、约300、约 310、约320、约325、约330、约340、约350、约360、约370、约375、约 380、约390、约400、约410、约420、约425、约430、约440、约450mg、约460、约470、约475、约480、约490、约500、约510、约520、约 525、约530、约540、约550、约560、约570、约575、约580、约590、或约600mg)的双链RNAi剂，其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2(5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在又另一个方面中，本发明提供增加患有甲状腺素运载蛋白(TTR)相关障碍的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法。这些方法包括向该受试者给予固定剂量约10mg至约600mg、约25mg至约500mg、约50mg至约500mg、或约80mg至约500mg、约25mg至约300mg、约50mg至约 300mg、或约80mg至约300mg(例如，约10、约20、约30、约40、约 50、约60、约70、约75、约80、约90、约100、约110、约120、约125、约130、约140、约150、约160、约170、约175、约180、约190、约200、约210、约220、约225、约230、约240、约250mg、约260、约270、约 275、约280、约290、约300、约310、约320、约325、约330、约340、约 350、约360、约370、约375、约380、约390、约400、约410、约420、约 425、约430、约440、约450mg、约460、约470、约475、约480、约490、约500、约510、约520、约525、约530、约540、约550、约560、约 570、约575、约580、约590、或约600mg)的双链RNAi剂，其中该双链 RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该反义链包含与SEQ ID NO:2 (5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)互补的区域，其中每条链是约14 个至约30个核苷酸的长度，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸，其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
在一个实施例中，该双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Nb和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)，
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)，和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中 a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf 是2′-氟A、C、G、或U；s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
在一个实施例中，正义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中 a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf 是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
在一个实施例中，该正义链和该反义链包含核苷酸序列
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、 Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。
该双链RNAi剂的固定剂量可以约每4周、每5周、每6周、每8周或每季度一次向该受试者给予。
该双链RNAi剂的剂量可以约每4周、每5周、每6周、每8周或每季度一次向该受试者给予。
在一个实施例中，该双链RNAi剂是约每季度一次向该受试者给予。
在一个实施例中，该双链RNAi剂是长期地向该受试者给予。
在一个实施例中，该受试者是人类。
在一个实施例中，该受试者是罹患TTR相关疾病的受试者。在另一个实施例中，该受试者是处于发展TTR相关疾病风险的受试者。在一个实施例中，该处于发展TTR相关疾病风险的受试者携带与发展TTR相关疾病相关的 TTR基因突变、或是具有TTR相关疾病的家族病史的受试者、或是具有表明发展出TTR淀粉样变性的体征或症状的受试者。
在一个实施例中，TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、柔脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、和高甲状腺素血症。
在一个实施例中，该受试者患有TTR相关的淀粉样变性，并且该方法减少受试者的淀粉样蛋白TTR沉积物。
在一个实施例中，该双链RNAi剂是通过选自下组的手段向受试者给予，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、脑脊髓、及其任何组合。在另一个实施例中，该双链 RNAi剂是经由皮下、肌内或静脉内给药向受试者给予的。在又另一个实施例中，该双链RNAi剂是经由皮下给予(例如，经由自我给予，例如，经由预填充的针筒或自动注射器针筒)向受试者给予。
在一个实施例中，这些方法进一步包括评估在来源于该受试者的样品中的TTRmRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
在一个实施例中，给予双链RNAi剂不会导致受试者的炎症反应，如基于来自受试者的样品中的细胞因子或趋化因子的水平所评估的，该细胞因子或趋化因子选自下组，该组由以下各项组成：G-CSF、IFN-γ、IL-10、IL- 12(p70)、IL1β、IL-1ra、IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、 TNFα、及其任何组合。
在一个实施例中，适合用于本发明的方法中的药剂是AD-65492。AD- 65492可以每4周、每5周、或每6周、或每季度长期地向该受试者给予。
在一个方面中，本发明提供用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR) 表达的双链核糖核酸(RNAi)剂。这些RNAi剂包括与反义链互补的正义链，其中该正义链和反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成：表5中任何核苷酸序列。
在另一个方面中，本发明提供用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白 (TTR)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂。这些RNAi剂包括与反义链互补的正义链，该反义链包含含有与表6中的任一个反义序列的差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸的互补区域，其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸为经修饰的核苷酸；并且其中该正义链与至少一个配体轭合。
该正义链和反义链可以包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成：表6或表7中的任何核苷酸序列。
在一个方面中，本发明提供用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR) 表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)并且该反义链包含核苷酸序列5’- usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，其中a、c、g、和u 是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、 C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。
在另一个方面中，本发明提供治疗罹患TTR相关疾病的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约50mg至约300mg的双链RNAi剂，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ IDNO:10)并且该反义链包含核苷酸序列5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ IDNO:7)，其中a、 c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是 2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键，从而治疗该罹患TTR相关疾病的受试者。
在又另一个方面中，本发明提供预防性治疗处于发展TTR相关疾病风险的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约50mg至约300mg的双链RNAi剂，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)并且该反义链包含核苷酸序列5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO: 7)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、 Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键，从而预防性治疗该处于发展TTR相关疾病风险的受试者。
在一个方面中，本发明提供降低、减慢或阻止罹患TTR相关疾病或处于发展TTR相关疾病风险的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的 NIS(mNIS+7)的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约50mg至约300 mg的双链RNAi剂，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQID NO:10) 并且该反义链包含核苷酸序列5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U； Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键，从而降低、减慢或阻止该受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS (mNIS+7)。
在另一个方面中，本发明提供增加罹患TTR相关疾病或处于发展TTR 相关疾病风险的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法。这些方法包括向该受试者给予剂量约50mg至约300mg的双链RNAi剂，其中该RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链包含核苷酸序列5’- usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)并且该反义链包含核苷酸序列5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，其中a、 c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是 2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键，从而增加罹患TTR相关疾病或处于发展TTR相关疾病风险的受试者的6分钟步行测试(6MWT)。
通过以下详细说明和附图进一步阐明本发明。
附图说明
图1是描绘指定的RNAi剂在二十四小时去污溶酶体(tritosome)稳定性测定中的稳定性的图。
图2A是描绘指定的RNAi剂在二十四小时大鼠胞液稳定性测定中的稳定性的图，并且图2B是描绘指定的RNAi剂在二十四小时去污溶酶体稳定性测定中的稳定性的图。
图3是描绘在表达人类TTR的V30M变体(V30M hTTR)的转基因小鼠中给予单次皮下剂量1mg/kg的指定的RNAi剂后TTR蛋白质抑制的图。
图4是描绘在表达hTTR V30M的转基因小鼠中给予单次皮下剂量2.5 mg/kg的指定的RNAi剂后TTR蛋白质抑制的图。
图5是描绘在表达hTTR V30M的转基因小鼠中给予每周一次2mg/kg剂量的AD-65492持续3周(QWx3)后TTR蛋白质抑制的图。
图6A是描绘在表达hTTR V30M的转基因小鼠中皮下给予每月一次0.3 mg/kg剂量的指定的RNAi剂持续四个月(QMx4@0.3mg/kg)后TTR蛋白质抑制的图。图6B是描绘在表达hTTR V30M的转基因小鼠中皮下给予每月一次1mg/kg剂量的指定的RNAi剂持续四个月(QMx4@1mg/kg)后TTR 蛋白质抑制的图。图6C是描绘在表达hTTR V30M的转基因小鼠中皮下给予每月一次3mg/kg剂量的指定的RNAi剂持续四个月(QMx4@3mg/kg)后 TTR蛋白质抑制的图。
图7描绘了向食蟹猴(Cynomologous monkey)皮下给予AD-65492和 AD-66017的研究设计。
图8A是描绘在食蟹猴中给予单次皮下剂量0.3mg/kg的指定的RNAi剂后TTR蛋白质抑制的图。图8B是描绘在食蟹猴中给予单次皮下剂量1mg/kg 的AD-65492、单次皮下剂量1mg/kg的AD-66017、或单次皮下剂量2.5 mg/kg的AD-51547后TTR蛋白质抑制的图。图8C是描绘在食蟹猴中给予单次皮下剂量3mg/kg的AD-65492、单次皮下剂量3mg/kg的AD-66017、或单次皮下剂量5mg/kg的AD-51547后TTR蛋白质抑制的图。
图9A是描绘在食蟹猴中给予每月一次皮下剂量1mg/kg持续四个月 (QMx4)的AD-65492、每月一次皮下剂量1mg/kg持续四个月(QMx4)的 AD-66017、或者给予日剂量5mg/kg持续五天、接着每周一次5mg/kg剂量持续四周(QDx5、QWx4)的AD-51547后TTR蛋白质抑制的图。图9B是描绘在食蟹猴中给予每月一次皮下剂量3mg/kg持续四个月(QMx4)的指定的RNAi剂后TTR蛋白质抑制的图。
图10A是描绘在食蟹猴中与给予单次1mg/kg皮下剂量的AD-65492(虚线)后的TTR抑制相比皮下给予每月一次1mg/kg剂量的AD-65492持续四个月(QMx4；实线)后TTR抑制的维持的图。
图10B是描绘在食蟹猴中与给予单次皮下剂量1mg/kg的AD-66017(虚线)相比皮下给予每月一次1mg/kg剂量的AD-66017持续四个月(QMx4；实线)对TTR蛋白质抑制的加成效应的图。
图11是描绘与单次皮下给予1mg/kg剂量的AD-65492或单次皮下给予 0.3mg/kg剂量的AD-65492相比每月一次皮下给予1mg/kg剂量的AD-65492 持续四个月(QMx4)、或每月一次皮下给予3mg/kg剂量的AD-65492持续四个月(QMx4)后在食蟹猴中的持续的血清TTR抑制的图。
图12描绘了向食蟹猴皮下给予AD-65492的研究设计。
图13是描绘在食蟹猴中每月一次皮下给予0.3mg/kg剂量的AD-65492 持续六个月(QMx6)、或每月一次皮下给予0.6mg/kg剂量的AD-65492持续六个月(QMx6)、或给予单次1mg/kg初始剂量的AD-65492(QMx1)后接着在初始剂量后第28天开始给予每月一次0.3mg/kg剂量的AD-65492持续五个月(QMx5)的稳健的血清TTR抑制的图。
具体实施方式
本发明提供靶向甲状腺素运载蛋白(TTR)基因的RNAi剂(例如，双链RNAi剂)和组合物。本发明也提供使用本发明的RNAi剂(例如，双链 RNAi剂)抑制TTR表达的方法以及治疗或预防受试者的TTR相关疾病的方法。本发明至少部分基于以下发现：在正义链上基本上所有核苷酸和在反义链上基本上所有核苷酸均为经修饰的核苷酸，并且包含正义链上的不超过8 个2′-氟修饰(例如，不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5 个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′- 氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)、以及反义链上的不超过6个2′-氟修饰(例如，不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)、在正义链5′-端的2个硫代磷酸酯键、在反义链5′-端的2个硫代磷酸酯键、和配体(例如，GalNAc3配体)的RNAi剂，在本文中显示可以在选择性沉默TTR基因的活性方面有效。这些RNAi剂显示惊人地增强的TTR基因沉默活性。在不旨在受理论限制的情况下，据信上述修饰与特异性靶标位点在这些RNAi剂中的组合或亚组合赋予本发明的RNAi剂改善的功效、稳定性、效能、和耐久性。
以下详细说明披露如何制造和使用包含iRNA的组合物来选择性抑制 TTR基因表达，以及用于治疗罹患可能受益于抑制和/或降低TTR基因表达的疾病和障碍的受试者的组合物、用途和方法。
I.定义
为了更容易地理解本发明，首先定义某些术语。此外应注意，不论何时叙述的参数数值或数值范围，其均意指这些叙述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
本文所使用的冠词“一种”和“一个”是指该冠词上受词(grammatical object)的一个(种)或超过一个(种)(也即至少一个(种))。举例来说，“一个元素”意指一个元素或超过一个元素，例如，复数个元素。
本文所使用的术语“包括”意指短语“包括但不限于”，并且与其可互换使用。
本文所使用的术语“或”意指“和/或”，并且与其可互换使用，除非另有说明。
本文所使用的术语“约”意指在本领域中典型的容许范围内。例如，“约”可以理解为在平均值的约2个标准偏差范围内。在某些实施例中，约意指+10％。在某些实施例中，约意指+5％。当约出现在一系列数字或范围之前时，据了解“约”可以修饰该系列数字或范围内的数字中的每一个。
本文所使用的“甲状腺素运载蛋白”(“TTR”)是指熟知的基因和蛋白质。TTR也被称为前白蛋白、HsT2651、PALB、和TBPA。TTR的功能为视黄醇结合蛋白(RBP)、甲状腺素(T4)和视黄醇的运载蛋白，并且它也作为蛋白酶作用。肝脏分泌TTR到血液中，并且脉络丛分泌TTR到脑脊髓液中。TTR也在胰脏和视网膜色素上皮细胞中表达。TTR的最大临床相关性为正常和突变TTR蛋白质均可以形成淀粉样蛋白纤维，其聚集为细胞外沉积物，造成淀粉样变性。关于综述，参见例如，Saraiva M.J.M.(2002)Expert Reviews in Molecular Medicine[分子医学专家评论]，4(12):1-11。大鼠甲状腺素运载蛋白的分子克隆和核苷酸序列、以及mRNA表达的分布已描述于 Dickson,P.W.等人(1985)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260(13)8214-8219。人类TTR的X-射光晶体结构描述于Blake,C.C.等人(1974)J Mol Biol[分子生物学杂志]88,1-12。人类TTR mRNA转录物的序列可以发现于国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)RefSeq登录号NM_000371(例如，SEQ ID NO:1和5)。小鼠TTR mRNA的序列可以发现于RefSeq登录号NM_013697.2，并且大鼠TTR mRNA的序列可以发现于RefSeq登录号NM_012681.1。使用公开可获得的数据库(例如， GenBank、UniProt、和OMIM)可很容易获得TTR mRNA序列的另外的实例。
本文所使用的“靶序列”是指在TTR基因转录期间所形成的mRNA分子的核苷酸序列中的连续部分，包括作为主要转录产物的RNA处理产物的 mRNA。在一个实施例中，该序列的靶标部分至少足够长以充当在TTR基因转录期间所形成的mRNA分子的核苷酸序列部分处或附近进行iRNA-引导的切割的底物。在一个实施例中，该靶序列是在TTR基因的蛋白质编码区内。在另一个实施例中，该靶序列是在TTR基因的3′UTR内。
该靶序列可以为约9-36个核苷酸的长度，例如，约15-30个核苷酸的长度。例如，该靶序列可以为约15-30个核苷酸、15-29、15-28、15-27、15- 26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18- 30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18- 20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19- 21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20- 22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或 21-22个核苷酸的长度。在一些实施例中，该靶序列为约19个至约30个核苷酸的长度。在其他实施例中，该靶序列为约19个至约25个核苷酸的长度。在仍其他实施例中，该靶序列为约19个至约23个核苷酸的长度。在一些实施例中，该靶序列为约21个至约23个核苷酸的长度。上述范围和长度之间的范围和长度也涵盖为本发明的一部分。
在本发明的一些实施例中，TTR基因的靶序列包含SEQ ID NO:1的核苷酸615-637或SEQ ID NO:5的核苷酸505-527(即：5’- GATGGGATTTCATGTAACCAAGA-3’；SEQ ID NO:4)。
本文所使用的术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸，其通过参考使用标准核苷酸命名法的序列描述。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自一般表示分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，据了解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以是指经修饰的核苷酸，如下文中进一步描述，或替代的置换部分体(参见例如，表2)。技术人员非常了解，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以在不实质上改变包含带有这些置换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质的情况下被其他部分体置换。例如，但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本发明中起重要作用的dsRNA的核苷酸序列中，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被包含例如肌苷的核苷酸置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶均可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶置换，以形成与靶标mRNA配对的G-U摇摆碱基(Wobble base)。包含此类置换部分的序列适合于在本发明中起重要作用的组合物和方法。
本文所使用的术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”在本文中可互换使用，是指包含如本文中定义该术语的RNA的药剂，并且该药剂经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径来介导靶向切割RNA 转录物。iRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。该iRNA调节(例如，抑制)细胞(例如，受试者(如哺乳动物受试者)内的细胞)中的TTR基因表达。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂包括与靶标RNA序列(例如，TTR 靶标mRNA序列)相互作用的单链RNA，以指导切割靶标RNA。在不希望受理论限制的情况下，据信引入细胞中的长双链RNA会被称为Dicer的III型内切核酸酶分解成包含正义链和反义链的双链短的干扰RNA(siRNA) (Sharp等人(2001)Genes Dev.[基因与发育]15:485)。Dicer是类似核糖核酸酶-III的酶，其将这些dsRNA处理成特征在于两个碱基的3′突出的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等人(2001)Nature[自然]409:363)。这些 siRNA然后掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解螺旋酶解开siRNA双螺旋，使互补反义链能够引导靶标识别(Nykanen等人(2001)Cell[细胞]107:309)。当与适当靶标mRNA结合时，RISC内的一种或多种内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人(2001)Genes Dev. [基因与发育]15:188)。因此，在一个方面中，本发明涉及在细胞内产生的单链RNA(siRNA)，并且其促进形成RISC复合物以实现靶基因(即TTR基因)沉默。因此，本文中还使用的术语“siRNA”是指如上所述的RNAi。
在另一个实施例中，RNAi剂可以是引入细胞或生物体中抑制靶标 mRNA的单链RNA。单链RNAi剂与RISC内切核酸酶Argonaute 2结合，其然后切割靶标mRNA。单链siRNA通常为15-30个核苷酸，并且是经化学修饰的。单链siRNA的设计和试验描述于美国专利号8,101,348和Lima等人 (2012)Cell[细胞]150:883-894，其每一者的完整内容特此通过引用结合在此。本文描述的任何反义核苷酸序列均可以作为本文描述的单链RNA使用或可以通过在Lima等人(2012)Cell[细胞]150:883-894中描述的方法进行化学修饰。
在另一个实施例中，用于在本发明的组合物、用途和方法中使用的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中被称为“双链RNAi剂”、“双链 RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，其具有双螺旋结构，包含两个反向平行且基本上互补的核酸链，相对于靶标RNA(即TTR基因)具有“正义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(本文中被称为RNA干扰或RNAi)引发靶标RNA(例如，mRNA)的降解。
通常，dsRNA分子的每条链的大多数核苷酸为核糖核苷酸，但是如在本文中详细描述的，每条链或两条链也可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。此外，本说明书中所使用的“RNAi剂”可能包括经化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可能在多个核苷酸处包括实质修饰。
本文所使用的术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键、和/或经修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖在核苷间键、糖部分、或核碱基上取代、增加或移除例如官能团或原子。适合用于本发明的药剂的修饰包括本文所披露或该领域已知的所有修饰类型。出于本说明书和权利要求书的目的，“RNAi剂”涵盖如在 siRNA型分子中使用的任何此类修饰。
双螺旋区域可以是允许所希望的靶标RNA通过RISC途径进行特异性降解的任何长度，并且可能在从约9个至36个碱基对的长度范围内，例如，约 15-30个碱基对的长度，例如，约9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、或36个碱基对的长度，例如：约15-30、15-29、15-28、15-27、15- 26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18- 30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18- 20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19- 21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20- 22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或 21-22个碱基对的长度。上述范围和长度之间的范围和长度也涵盖为本发明的一部分。
形成双螺旋结构的两条链可能是一个较大RNA分子的不同部分，或其可能是单独的RNA分子。在两条链是一个较大RNA分子的一部分，且因此通过形成该双螺旋结构的其中一条链的3′-端与另一条链的5′-端之间未中断的核苷酸链连接的情况下，该连接的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以包含至少2 个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个、或更多个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以是10个或更少个核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以是8个或更少个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以是4-10个未配对的核苷酸。在一些实施例中，该发夹环可以是4-8个核苷酸。
在dsRNA的两个基本上互补链包含在单独的RNA分子上的情况下，那些分子不必但可以共价连接。在这两条链通过除了形成该双螺旋结构的其中一条链的3′-端与另一条链的5′-端之间未中断的核苷酸链以外的其他连接方式连接的情况下，该连接结构被称为“连接体”。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA中最短链的核苷酸数量减去双螺旋中存在的任何突出数量。除了双螺旋结构外，RNAi也可以包含一个或多个核苷酸突出。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂为每条链长度为24-30个核苷酸的 dsRNA，其与靶标RNA序列(例如，TTR靶标mRNA序列)相互作用，以指导切割靶标RNA。在不希望受理论限制的情况下，据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型内切核酸酶分解成siRNA(Sharp等人(2001) Genes Dev.[基因与发育]15:485)。Dicer是类似核糖核酸酶-III的酶，其将 dsRNA处理成特征在于两个碱基的3′突出的19-23个碱基对的短干扰RNA (Bernstein等人(2001)Nature[自然]409:363)。siRNA然后掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解螺旋酶解开siRNA双螺旋，使互补反义链能够引导靶标识别(Nykanen等人(2001)Cell[细胞] 107:309)。当与适当靶标mRNA结合时，RISC内的一种或多种内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人(2001)Genes Dev.[基因与发育] 15:188)。在RNAi剂的一个实施例中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3′突出。在另一个实施例中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如，2、3、 4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、或15个核苷酸的3′突出。在其他实施例中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5′突出。在某些实施例中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、 11、12、13、14、或15个核苷酸的5′突出。在仍其他实施例中，RNAi剂的一条链的3′端和5′端都包含至少1个核苷酸的突出。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂是dsRNA剂，其每条链包含与TTR RNA序列相互作用的19-23个核苷酸以指导切割靶标RNA。在不希望受理论限制的情况下，据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型内切核酸酶分解成siRNA(Sharp等人(2001)GenesDev.[基因与发育]15:485)。 Dicer是类似核糖核酸酶-III的酶，其将dsRNA处理成特征在于两个碱基的3′突出的19-23个碱基对的短干扰RNA(Bernstein等人(2001)Nature[自然]409:363)。siRNA然后掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解螺旋酶解开siRNA双螺旋，使互补反义链能够引导靶标识别 (Nykanen等人(2001)Cell[细胞]107:309)。当与适当的靶标mRNA结合时，RISC内的一种或多种内切核酸酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等人 (2001)Genes Dev.[基因与发育]15:188)。在一个实施例中，本发明的RNAi剂是24-30个核苷酸的dsRNA剂，该dsRNA剂与TTR RNA序列相互作用以指导切割靶标RNA。
本文所使用的术语“核苷酸突出”是指至少一个从iRNA双螺旋结构 (例如，dsRNA)中突出的未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3′- 端延伸超出另一条链的5′-端，或反之亦然时，存在核苷酸突出。dsRNA可能包含至少一个核苷酸的突出；可替代地，该突出可能包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个。核苷酸突出可能包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。这个或这些突出可能位于正义链、反义链或其任何组合。此外，突出的一个或多个核苷酸可能出现在dsRNA的反义链或正义链的5′-端、3′-端或两端。在dsRNA 的一个实施例中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3′突出。在另一个实施例中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、 11、12、13、14、或15个核苷酸的3′突出。在其他实施例中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5′突出。在某些实施例中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14、或15 个核苷酸的5′突出。在仍其他实施例中，RNAi剂的一条链的3′端和5′端都包含至少1个核苷酸的突出。
在一个实施例中，dsRNA的反义链在3′-端和/或5′-端具有1-10个核苷酸，例如，0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10个，例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、或10个核苷酸的突出。在一个实施例中，dsRNA的正义链在3′-端和/或5′-端具有1-10个核苷酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的突出。在另一个实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯置换。
在某些实施例中，在正义链或反义链或二者上的突出可以包括超过10个核苷酸的延伸长度，例如，1-30个核苷酸、2-30个核苷酸、10-30个核苷酸、或10-15个核苷酸的长度。在某些实施例中，延伸的突出是在双螺旋的正义链。在某些实施例中，延伸的突出出现在双螺旋正义链的3′端。在某些实施例中，延伸的突出出现在双螺旋正义链的5′端。在某些实施例中，延伸的突出是在双螺旋的反义链。在某些实施例中，延伸的突出出现在双螺旋的反义链3′端。在某些实施例中，延伸的突出出现在双螺旋的反义链5′端。在某些实施例中，突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯置换。在某些实施例中，突出包括自身互补部分，这样使得该突出能够在生理条件下形成稳定的发夹结构。
“钝的”或“钝端”意指该双链RNAi剂的端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出。“钝端的”RNAi剂是dsRNA的整个长度均为双链，即该分子的任一端均没有核苷酸突出。本发明的RNAi剂包括在一端具有核苷酸突出的RNAi剂(即具有一个突出和一个钝端的药剂)或两个端均具有核苷酸突出的RNAi剂。
术语“反义链”或“引导链”是指包括与靶序列(例如，TTR mRNA) 基本上互补的区域的iRNA(例如，dsRNA)链。本文所使用的术语“互补区域”是指与如本文所定义的序列(例如，靶序列，例如，TTR核苷酸序列) 基本上互补的反义链上的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，可能在分子内部或末端区域发生错配。通常，最能忍受的错配是在末端区域内，例如，在iRNA的5′-末端和/或3′-末端的5、4、3、2或1个核苷酸内。在一个实施例中，本发明的双链RNAi剂在反义链中包括核苷酸错配。在另一个实施例中，本发明的双链RNAi剂在正义链中包括核苷酸错配。在一个实施例中，该核苷酸错配是在例如，从iRNA的3′-末端起5、4、3、2、或1 个核苷酸内。在另一个实施例中，该核苷酸错配是在例如，iRNA的3′-末端核苷酸内。
本文所使用的术语“正义链”或“随从链(passenger strand)”是指包括与如本文所定义的反义链区域基本上互补的区域的iRNA链。
本文所使用的术语“切割区域”是指位于紧邻切割位点的区域。切割位点是在发生切割的靶标上的位点。在一些实施例中，切割区域包含在切割位点任一端上且在紧邻该切割位点的三个碱基。在一些实施例中，切割区域包含在切割位点任一端上且在紧邻切割位点的两个碱基。在一些实施例中，切割位点明确发生在被反义链的核苷酸10和11结合的位点处，且该切割区域包含核苷酸11、12和13。
除非另有说明，否则本文使用的术语“互补”当用于描述第一核苷酸序列与第二核苷酸序列的关系时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双螺旋结构的能力，如技术人员将理解的。此类条件可能是例如，严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA，50℃或70℃下持续12-16小时，然后洗涤(参见例如，“Molecular Cloning：ALaboratory manual[分子克隆：实验室手册]，Sambrook等人 (1989)Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社]”)。可以应用其他条件，例如可能在有机体中遇到的生理学相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于测试两个序列的互补性的条件集合。
iRNA(例如，如本文描述的dsRNA)内的互补序列包括，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸沿着其中一个或两个核苷酸序列的整个长度的碱基配对。此类序列在本文中可以被称为彼此“完全互补”。然而，在本文中第一序列被称为相对于第二序列“基本上互补”的情况下，这两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交时形成一个或多个，但是通常不多于5个、4个、3个或2个错配的碱基对，同时保留了在与它们的最终应用(例如经由RISC途径抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链悬突时，此类悬突不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于本文描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及另一个长度为 23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸序列。
如本文所使用，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于 G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。
本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以相对于在 dsRNA的有义链与反义链之间、或iRNA剂的反义链与靶标序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文中理解的。
如本文所使用，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码TTR基因的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。举例来说，如果多核苷酸与编码TTR基因的mRNA 的非中断部分基本上互补，那么该序列与TTR mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施例中，本文所披露的反义多核苷酸与靶标TTR序列完全互补。在其他实施例中，本文所披露的反义多核苷酸与SEQ ID NO:2(5’- UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)完全互补。在一个实施例中，反义多核苷酸序列是5’-UCUUGGUUACAUGAAAUCCCAUC-3’(SEQ ID NO:3)。
在其他实施例中，本文所披露的反义多核苷酸与靶标TTR序列基本上互补，并且包含连续的核苷酸序列，该连续的核苷酸序列沿着其总长度与SEQ ID NO:2(5’-UGGGAUUUCAUGUAACCAAGA-3’)的任一者的核苷酸序列、或SEQ ID NO:1、2和5的任一者的片段的同等区域至少约80％互补，例如约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸(其进而与靶标TTR序列互补)基本上互补的正义链，并且其中该正义链多核苷酸包含连续的核苷酸序列，该连续的核苷酸序列沿着其总长度与表1、3、5、6、和7 中的任一序列的核苷酸序列的同等区域至少约80％互补，例如约85％、约 86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约 94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在另一个实施例中，本发明的RNAi剂包括与靶标TTR序列基本上互补的反义链，并且包含连续的核苷酸序列，该连续的核苷酸序列沿着其总长度与表1和3中的任一序列的核苷酸序列的同等区域至少约80％互补，例如约 85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约 93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、或约99％互补。
在一些实施例中，每一条链的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但如本文中的详细描述的，每条链或两条链也可能包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。此外，“iRNA”可能包括具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可能包括本文所披露或该领域已知的所有修饰类型。出于本说明书和权利要求书的目的，“iRNA”涵盖如在iRNA分子中使用的任何此类修饰。
在本发明的一个方面中，本发明的方法和组合物所使用的药剂是经由反义抑制机制来抑制靶标mRNA的单链反义核酸分子。单链反义RNA分子与靶标mRNA内的序列互补。单链反义寡核苷酸可以按化学计量方式通过与 mRNA进行碱基配对来抑制翻译，并且在物理上阻碍翻译机器，参见Dias,N. 等人(2002)Mol Cancer Ther[分子癌症疗法]1:347-355。单链反义RNA分子可以是约15个至约30个核苷酸的长度并且具有与靶序列互补的序列。例如，单链反义RNA分子可能包含如下序列，该序列是来自本文所描述的任一个反义序列的至少约15、16、17、18、19、20、或更多个连续的核苷酸。
本文所使用的“TTR相关疾病”旨在包括与TTR基因或蛋白质相关的任何疾病。这样的疾病可能由例如，过量产生TTR蛋白质、TTR基因突变、 TTR蛋白质异常切割、在TTR与其他蛋白质或其他内源性或外源性物质之间的异常相互作用引起。“TTR相关疾病”包括任何类型的TTR淀粉样变性 (ATTR)，其中TTR在异常细胞外聚集体或淀粉样蛋白沉积物的形成中起作用。TTR相关疾病包括老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病 (FAC)、柔脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、淀粉样变性玻璃体混浊、腕管综合征、和高甲状腺素血症。TTR淀粉样变性的症状包括感觉神经病变(例如，感觉异常、远端肢体感觉减退)、自主神经病变(例如，胃肠功能失调，例如胃溃疡、或体位性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍、和角膜格子状营养不良。
II.本发明的iRNA
本发明提供选择性抑制一种或多种TTR基因表达的iRNA。在一个实施例中，iRNA剂包括在细胞(例如罹患TTR相关疾病的受试者(例如，哺乳动物，如人类)内的细胞中抑制TTR基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。dsRNA包括具有互补区域的反义链，该互补区域与在TTR基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补。该互补区域是约30个或更少个核苷酸的长度 (例如，约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个或更少个核苷酸的长度)。当接触到表达TTR基因的细胞时，该iRNA选择性抑制TTR基因(例如，人类、灵长类、非灵长类、或鸟类TTR基因)的表达至少约10％，如通过例如基于PCR或分支DNA(bDNA)的方法、或通过蛋白质的方法(例如通过免疫荧光分析)、使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术分析测定的。
dsRNA包括两条的RNA链，其是互补的并且在使用dsRNA的条件下杂交以形成双螺旋结构。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补 (且通常完全互补)的互补区域。该靶序列可能衍生自TTR基因表达期间所形成的mRNA序列。另一条链(正义链)包括与反义链互补的区域，这样使得当在合适的条件下组合时，这两条链杂交并形成双螺旋结构。如本文所描述且如该领域中已知的，也可包括dsRNA的互补序列作为单一核酸分子的自身互补区域，与出现在单独的寡核苷酸上相反。
通常，双螺旋结构是在15个至30个碱基对之间的长度，例如，在15- 29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15- 19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18- 23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19- 24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20- 25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21- 25、21-24、21-23、或21-22个碱基对之间的长度。上述范围和长度之间的范围和长度也涵盖为本发明的一部分。
类似地，靶序列的互补区域是在15个至30个核苷酸之间的长度，例如，在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、 15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、 18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、 20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、 21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸之间的长度。上述范围和长度之间的范围和长度也涵盖为本发明的一部分。
在一些实施例中，dsRNA是约15个至约20个核苷酸的长度、或约25 个至约30个核苷酸的长度。通常，dsRNA是足够作为Dicer酶的底物的长度。例如，该领域熟知的是超过约21-23个核苷酸长度的dsRNA可以作为 Dicer的底物。技术人员也将认识到，作为切割靶标的RNA区域最常为较大的RNA分子(经常为mRNA分子)的一部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“一部分”是mRNA靶标的连续序列，其长度应足以作为RNAi指导的切割(即通过RISC途径切割)的底物。
技术人员还将认识到，双螺旋区域是dsRNA的主要功能部分，例如，约 9至36个碱基对的双螺旋区域，例如，约10-36、11-36、12-36、13-36、14- 36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、15-35、9-34、10- 34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13- 33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、15-31、15-30、15-29、15-28、15- 27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15- 17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18- 21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19- 22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21- 23、或21-22个碱基对的双螺旋区域。因此，在一个实施例中，达到其变得可处理为例如15-30个碱基对的功能性双螺旋(该功能性双螺旋靶向供切割的所希望的RNA)的程度以致具有超过30个碱基对的双螺旋区域的RNA分子或 RNA分子的复合物是dsRNA。因此技术人员将认识到，在在一个实施例中 miRNA是dsRNA。在另一个实施例中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施例中，可用于靶向TTR基因表达的iRNA剂不会在靶细胞中通过切割较大dsRNA而产生。
本文所描述的dsRNA可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出，例如，1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出的dsRNA可以出人意外地具有比其钝端的对应物更优异的抑制性质。核苷酸突出可能包含核苷酸/ 核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。这个或这些突出可能位于正义链、反义链或其任何组合。此外，突出的一个或多个核苷酸可能出现在 dsRNA的反义链或正义链的5′-端、3′-端或两端。在某些实施例中，可能有更长的延长突出。
dsRNA可以通过如在下文进一步讨论的、本领域内已知的标准方法来进行合成，例如通过使用自动化的DNA合成仪，例如从例如生物研究公司 (Biosearch)、应用生物系统公司(Applied Biosystems，Inc)可商购的合成仪。
本发明的iRNA化合物可采用两个步骤制程制备。首先，单独制备双链 RNA分子的各个链。然后，组成链退火。siRNA化合物的各个链可以使用溶液相或固体相有机合成或二者进行制备。有机合成的优点在于可以容易制备包含非天然或经修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固体相有机合成法或二者来制备。
在一个方面中，本发明的dsRNA包括至少两个核苷酸序列：正义序列和反义序列。正义链是选自表1、3、5、6和7中任一个表所提供的序列的组，并且该正义链的相应反义链是选自表1、3、5、6和7中任一个表所提供的序列的组。在这个方面中，两个序列中的一个序列是与这两个序列中另一个序列互补，其中一个序列基本上与在TTR基因表达所产生的mRNA序列互补。因此，在这个方面中，dsRNA将包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸是如表1、3、5、6和7中任一个表的正义链所述，并且第二个寡核苷酸为是如表 1、3、5、6和7中任一个表中的正义链的对应反义链。在一个实施例中， dsRNA的基本上互补序列是包含在单独的寡核苷酸上。在另一个实施例中， dsRNA的基本上互补序列是包含在单一寡核苷酸上。
据了解，虽然表1、3、5、6和7中所描述的一些序列为经修饰和/或轭合的序列，但是本发明的iRNA(例如本发明的dsRNA)的RNA可能包含表 1、3、5、6和7中所示的任一个序列，其是未经修饰的、未轭合的、和/或不同于本文所描述的修饰和/或轭合。
技术人员充分意识到，具有约20至23个之间的碱基对(例如，21个碱基对)的双螺旋结构的dsRNA已声称在诱导RNA干扰方面特别有效 (Elbashir等人，EMBO 2001,20:6877-6888)。然而，其他人已发现较短或较长RNA双螺旋结构也可能是有效的(Chu和Rana(2007)RNA 14:1714- 1719；Kim等人(2005)Nat Biotech[自然生物技术]23:222-226)。在上述实施例中，由于表1、3、5、6和7中任一个表中提供的寡核苷酸序列的性质，本文描述的dsRNA包括至少一个长度为最少21个核苷酸的链。合理预期，具有表1、3、5、6和7中任一个表中的一个序列的较短双螺旋仅在其中一端或两端减去几个核苷酸，可能与上述dsRNA相比具有类似的有效性。因此，本发明范围也涵盖如下dsRNA，该dsRNA具有衍生自表1、3、5、6和7中任一个表中的一个序列的至少15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列，并且其抑制TTR基因表达的能力与包含完整序列的dsRNA相比差异不超过约5％、10％、15％、20％、25％或30％的抑制性。
此外，表1、3、5、6和7中任一个表中提供的RNA识别TTR转录物中对RISC所介导的切割敏感的一个或多个位点。因此，本发明的进一步特征在于靶向这些位点之一的iRNA。如果iRNA促进特定位点内的转录物的切割，则称如本文所使用的iRNA靶向RNA转录物的该特定位点。这样的iRNA通常将包括来自表1、3、5、6和7中任一个表中提供的序列之一的至少约15个连续核苷酸，该连续核苷酸与来自TTR基因中选择的序列的邻接的区域的另外的核苷酸序列偶合。
虽然靶序列通常为约15-30个核苷酸的长度，但是为了指导任何指定靶标RNA的切割，特定序列仍会随其适宜性在此范围内有很大变化。各种软件包与本文所陈述的指南为任何给定的基因靶标鉴定最佳靶序列提供指导，但是也可以采取实证研究法，其中将给定大小(其非限制性实例为21个核苷酸)的“窗口”或“遮蔽”是事实上或表象上(包括例如，经由计算机模拟)置于靶标RNA序列上，以便在该大小范围内鉴定可以作为靶序列的序列。通过从初始靶序列位置上游或下游渐进地移动一个核苷酸而移动该序列“窗口”，可以鉴定下一个可能的靶序列，直到针对选择的任何给定靶标大小鉴定整组的可能序列为止。这个过程与系统合成法偶联并且测试已鉴定的序列(使用本文描述或该领域已知的测定法)以鉴定表现最佳的那些序列，这可以鉴定当用iRNA剂靶标时介导靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。因此，虽然在例如，表1、3、5、6和7中任一个表中鉴定的序列表示有效的靶序列，但是预计通过给定序列上游或下游渐进地移动一个核苷酸来“移行窗口”，以鉴定具有相同或更佳的抑制特性的序列可以实现抑制效率的进一步优化。
此外，预计对于在例如表1、3、5、6和7中任一个表中鉴定的任何序列，通过系统性添加或移除核苷酸来产生较长或较短序列并且通过从这一点开始移行靶标RNA上游或下游的较长或较短大小的窗口来测试所产生的那些序列可以实现进一步的优化。此外，偶联产生新的候选靶标的这种方法和在本领域已知的和/或本文所描述的抑制性测定中基于那些靶序列测试iRNA的有效性，可以导致抑制有效性的进一步改善。仍而且，作为表达抑制剂，此类优化序列，可以例如通过引入如本文所描述或本领域已知的经修饰的核苷酸、添加或改变突出、或本领域已知和/或本文所讨论的进一步优化分子的其他修饰法(例如，增加血清稳定性或循环半衰期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向特定位置或细胞类型、增加与沉默途径酶的相互作用、增加从核内体释放)来进行调整。
本文描述的iRNA可以包含与靶序列的一个或多个错配。在一个实施例中，本文描述的iRNA包含不超过3个错配。如果iRNA的反义链包含与靶序列的错配，最好是错配的区域不位于互补区域的中心。如果iRNA的反义链包含与靶序列的错配，最好是错配局限于从互补区域的5′-端或3′-端起的最后 5个核苷酸内。例如，对23个核苷酸的iRNA剂而言，域TTR基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不包含任何错配。可以使用本文描述的方法或该领域已知的方法来确定包含与靶序列错配的iRNA是否可以有效抑制TTR基因的表达。尤其是如果TTR基因中的特定互补区域已知在群体内具有多态序列变异，具有错配的iRNA在抑制TTR基因表达方面的有效性考虑很重要。
III.本发明的经修饰iRNA
在一个实施例中，本发明的iRNA(例如，dsRNA)的RNA是未经修饰的，且不包含例如本领域已知和本文描述的化学修饰和/或轭合。在另一个实施例中，本发明的iRNA(例如，dsRNA)的RNA是经化学修饰，以增强稳定性或其他有益特征。在本发明的某些实施例中，本发明的iRNA的基本上所有核苷酸均经修饰。在本发明的其他实施例中，本发明的iRNA的所有核苷酸均经修饰。在一些实施例中，本发明的iRNA的基本上所有核苷酸均经修饰，并且该iRNA包含在正义链上的不超过8个2′-氟修饰(例如，不超过 7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′- 氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)，以及在反义链上的不超过6个2′-氟修饰(例如，不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)。在其他实施例中，本发明的iRNA的所有核苷酸均经修饰，并且该iRNA包含在正义链上的不超过 8个2′-氟修饰(例如，不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过 5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个 2′-氟修饰)，以及在反义链上的不超过6个2′-氟修饰(例如，不超过5个2′- 氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)。
本发明中表征的核酸可以通过本领域已建立好的方法合成和/或修饰，如在“核酸化学实验室指南(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，毕克奇(Beaucage,S.L.)等人(编辑)，约翰威利父子出版公司(John Wiley& Sons,Inc.)，美国纽约州纽约市(New York,NY,USA)中描述的那些方法，该文献因此通过引用结合在此。修饰包括例如，端修饰，例如，5′-端修饰 (磷酸化、轭合、反向键)或3′-端修饰(轭合、DNA核苷酸、反向键等)；碱基修饰，例如使用稳定的碱基、去稳定化的碱基或与配偶体的扩张区的碱基配对的碱基置换、移除碱基(无碱基核苷酸)、或轭合碱基；糖修饰(例如，位于2’-位置或4’-位置)或糖置换；和/或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。可用于本文所述的实施例的iRNA化合物的具体实例包括但不限于，包含经修饰主链或没有天然核苷间键的RNA。具有经修饰主链的RNA 尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的并且如有时本领域中所提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰RNA也可以被认为是寡核苷。在一些实施例中，经修饰的iRNA将在其核苷间主链中具有一个磷原子。
修饰的RNA主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亚膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物、和具有反转极性的那些酯，其中相邻的核苷单位对为3′-5′至5′-3′连接或2′-5′至5′-2′连接。还包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。
教导制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号 3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897； 5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676； 5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126； 5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361； 5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209； 6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590； 6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805； 7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE 39464，将其每一个的全部内容特此通过引用结合在此。
其中不包含磷原子的修饰的RNA主链具有由短链烷基或环烷基核苷酸间键合、混合杂原子和烷基或环烷基核苷酸间键合或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷酸间键合形成的主链。这些包括具有N-吗啉代键的那些(一部分从核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫醚、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基 (formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃主链；氨基磺酸根主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸根和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合N、O、S和CH2组成部分其他那些。
教导制备以上寡核苷的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号 5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033； 5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967； 5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046； 5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和 5,677,439，其每一者的完整内容特此通过引用结合在此。
在其他实施例中，考虑将合适的RNA模拟物用于iRNA，其中核苷酸单位的糖和核苷间键(即主链)二者均被新颖基团置换。保持碱基单元以与适当的核酸靶标化合物杂交。一种这样的低聚化合物，已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物，被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含有酰胺的主链替换，具体是氨基乙基甘氨酸主链。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备 PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082； 5,714,331；和5,719,262，其每一者的完整内容特此通过引用结合在此。适合用于本发明的iRNA的其他PNA化合物描述于例如，Nielsen等人，Science [科学]，1991，254，1497-1500。
本发明中起重要作用的一些实施例包括：具有硫代磷酸酯主链的RNA 和具有杂原子主链的寡核苷，并且尤其是上文所引用的美国专利号5,489,677 的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--、和-- N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯主链表示为--O--P--O--CH2--]，以及上文所引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，本文中起重要作用的RNA具有上述美国专利号5,034,506的N-吗啉代主链结构。
修饰的RNA还可能含有一个或多个经取代的糖部分。本文中起重要作用的iRNA(例如，dsRNA)在2′-位置包括下列之一：OH；F；O-、S-、或 N-烷基；O-、S-、或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是经取代的或未经取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、 O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsRNA在2′-位置包括下列之一：C1至C10低级烷基、经取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或 O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、 SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善iRNA的药物代谢动力学特性的基团或用于改善iRNA的药效特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。在一些实施例中，修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人，Helv.Chim.Acta[瑞士化学学报]，1995，78:486-504)，即，烷氧基-烷氧基基团。另一种示例性修饰是2’-二甲基氨基氧基乙氧基，即 O(CH2)2ON(CH3)2基团，如在本文以下实例中所描述的也称作2′-DMAOE，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，即2′-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。
其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’- OCH2CH2CH2NH2)以及2’-氟代(2’-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsRNA中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。iRNA还可以具有糖模拟物，例如代替戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导制备此类修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044； 5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811； 5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873； 5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些与本申请为共同拥有。上述中的每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
本发明的iRNA的RNA还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如本文所使用，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)、以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成和天然的核碱基，例如脱氧-胸腺嘧啶(dT)；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟基甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤代、8- 氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代、尤其5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7- 甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤；以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。进一步的核碱基包括披露于美国专利号3,687,808中的那些、披露于“Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine[生物化学、生物技术和医学中经修饰的核苷], Herdewijn.P编辑，Wiley-VCH[威利出版社]，2008”中的那些；披露于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering[聚合物科学与工程的简明百科全书]，第858-859页，Kroschwitz,J.L编辑，John Wiley&Sons [约翰威利父子公司]，1990中的那些；由Englisch等人，Angewandte Chemie, InternationalEdition[应用化学，国际版]，1991，30，613披露的那些；以及由Sanghvi,Y S.，dsRNAResearch and Applications[dsRNA研究与应用]，第 15章，第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.，编辑，CRC出版社，1993 披露的那些。这些核碱基中的某些对于提高在本发明中出现的低聚化合物的结合亲和力特别有用。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N- 6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃ (Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T和Lebleu,B.，编辑，dsRNA Research and Applications[dsRNA研究与应用]，CRC出版社，波卡拉顿，1993，第276- 278页)并且是示例性碱基取代，甚至更具体地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于，上述美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30； 5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255； 5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121； 5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200； 6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062； 6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个二环糖部分。“二环糖”是通过两个原子的桥接修饰的呋喃糖基环。“二环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，其包含连接糖环的两个碳原子的桥基(bridge)，从而形成二环系统。在某些实施例中，该桥基连接糖环的4′-碳与2′-碳。因此，在一些实施例中，本发明的药剂可能包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连接2′碳和4′碳的额外桥基。换言之，LNA是包含具有4′-CH2-O-2′桥基的二环糖部分的核苷酸。此结构有效地“锁住”3′-内部结构构型中的核糖。向siRNA添加锁核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性并减少脱靶效应(Elmen,J.等人，(2005) Nucleic Acids Research[核酸研究]33(1):439-447；Mook,OR.等人，(2007) Mol Canc Ther[分子癌症疗法]6(3):833-843；Grunweller,A.等人，(2003) Nucleic Acids Research[核酸研究]31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸的二环核苷的实例包括但不限于，包含在4′和2′核糖基环原子之间的桥基的核苷。在某些实施例中，本发明的反义多核苷酸剂包括一个或多个包含4′至2′桥基的二环核苷。此类4′至2′桥接的二环核苷的实例包括但不限于，4′- (CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(ENA)；4′-CH(CH3)- O-2′(也称为“约束性乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(及其类似物；参见，例如美国专利号7,399,845)；4′-C(CH3)(CH3)-O-2′(及其类似物；参见，例如美国专利号8,278,283)；4′-CH2-N(OCH3)-2′(及其类似物；参见，例如美国专利号8,278,425)；4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见，例如美国专利公开号2004/0171570)；4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R是H、C1-C12烷基、或保护基团(参见例如，美国专利号7,427,672)；4′-CH2-C(H)(CH3)-2′ (参见例如，Chattopadhyaya等人J.Org.Chem.[有机化学杂志]，2009,74, 118-134)；以及4′-CH2-C(═CH2)-2′(及其类似物；参见例如，美国专利号 8,278,426)。上述中的每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
教导制备锁核酸核苷酸的另外的代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下各项：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748； 6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845； 7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425； 8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；和US 2009/0012281，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
可以将任何上述二环核苷均制备成具有一个或多个立体化学糖构型，包括例如，α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
iRNA的RNA也可以被修饰以包括一个或多个约束性乙基核苷酸。本文所使用的“约束性乙基核苷酸”或“cEt”是包含二环糖部分(其包含4′- CH(CH3)-0-2’桥基)的锁核酸。在一个实施例中，约束性乙基核苷酸是处于S 构型，其在本文中被称为“S-cEt”。
本发明的iRNA也可以包括一个或多个“构象限制性核苷酸” (“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’碳和C4’碳或核糖的C3碳和-C5′碳的连接体的核苷酸类似物。CRN锁住核糖环形成稳定构型，并增加与 mRNA的杂交亲和性。连接体的长度足以让氧置入针对稳定性和亲和性的最佳位置，从而产生较少的核糖环折皱。
教导制备某些上述CRN的代表性公开包括但不限于，美国专利公开号 2013/0190383；和PCT公开WO 2013/036868，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
本发明的iRNA的一个或多个核苷酸也可以包括经羟基甲基取代的核苷酸。“经羟基甲基取代的核苷酸”是无环2’-3′-开环-核苷酸，也称为“非锁核酸”(“UNA”)修饰。
教导制备UNA的代表性美国公开包括但不限于，美国专利号8,314,227；和美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和 2011/0313020，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
RNA分子端的可能稳定化修饰包括：N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟脯氨醇 (Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2′-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇 (Hyp-C6-氨基)、2-二十二碳烷酰基-尿苷-3"-磷酸酯、反向碱基dT(idT) 等。该修饰的披露内容可以发现于PCT公开号WO 2011/005861。
本发明的iRNA的核苷酸的其他修饰包括5′磷酸酯或5′磷酸酯模拟物，例如，RNAi剂的反义链上的5′-末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物披露于例如，美国专利公开号2012/0157511，其完整内容特此通过引用结合在此。
A.包含本发明的基序的经修饰iRNA
在本发明的某些方面中，本发明的双链RNAi剂包括如披露于例如，于 2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710或于2012年11月16日提交的PCT/US 2012/065691中的化学修饰，其每一个的完整内容通过引用结合在此。
更具体地，已惊讶地发现，当双链RNAi剂的正义链和反义链被修饰而在RNAi剂的至少一条链的切割位点处或附近具有在三个连续核苷酸的三个相同修饰的一个或多个基序时，可优异地增强该RNAi剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供可能抑制靶基因(即，TTR基因)在体内表达的双链 RNAi剂。该RNAi剂包含正义链和反义链。该RNAi剂的每条链可以在从 12-30个核苷酸的长度范围内。例如，每条链可以是在14-30个核苷酸的长度、17-30个核苷酸的长度、25-30个核苷酸的长度、27-30个核苷酸的长度、 17-23个核苷酸的长度、17-21个核苷酸的长度、17-19个核苷酸的长度、19- 25个核苷酸的长度、19-23个核苷酸的长度、19-21个核苷酸的长度、21-25个核苷酸的长度、或21-23个核苷酸的长度。
正义链和反义链通常形成双螺旋双链RNA(“dsRNA”)，在本文中也被称为“RNAi剂”。该RNAi剂的双螺旋区域可以是12-30个核苷酸对的长度。例如，该双螺旋区域可以是在14-30个核苷酸对的长度、17-30个核苷酸对的长度、27-30个核苷酸对的长度、17-23个核苷酸对的长度、17-21个核苷酸对的长度、17-19个核苷酸对的长度、19-25个核苷酸对的长度、19-23个核苷酸对的长度、19-21个核苷酸对的长度、21-25个核苷酸对的长度、或21-23 个核苷酸对的长度。在另一个实例中，该双螺旋区域是选自15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸的长度。
在一个实施例中，该RNAi剂可以在一条链或二条链的3′-端、5′-端、或两端包含一个或多个突出区域和/或封端基团。该突出可以是1-6个核苷酸的长度，例如，2-6个核苷酸的长度、1-5个核苷酸的长度、2-5个核苷酸的长度、1-4个核苷酸的长度、2-4个核苷酸的长度、1-3个核苷酸的长度、2-3个核苷酸的长度、或1-2个核苷酸的长度。该突出可以是其中一条链比另一条链长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。突出可以与靶标mRNA形成错配，或其可以与所靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一条链和第二条链也可以例如通过另外的碱基结合形成发夹或通过其他非碱基连接体结合。
在一个实施例中，RNAi剂突出区域的核苷酸可以各自独立地是经修饰或未经修饰的核苷酸，包括但不限于，2’-糖修饰，例如2-F、2’-O甲基、胸苷(T)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2’-O-甲氧基乙基腺苷 (Aeo)、2’-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。例如，TT 可以是任一条链的任一端的突出序列。突出可以与靶标mRNA形成错配，或其可以与所靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。
RNAi剂的正义链、反义链或两条链的5′-突出或3′-突出可以被磷酸化。在一些实施例中，一个或多个突出区域包含两个核苷酸，其在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯，其中这两个核苷酸可以相同或不同。在一个实施例中，突出存在于正义链、反义链或两条链的3′-端。在一个实施例中，该3′-突出存在于反义链中。在一个实施例中，该3′-突出存在于正义链中。
RNAi剂可能仅包含单个突出，其可以加强RNAi的干扰活性，而不会影响其总体稳定性。例如，单链突出可能位于正义链的3′-末端，或者，可替代地位于反义链的3′-末端。RNAi也可能具有钝端，其位于反义链的5′-端(或正义链的3′-端)，或反之亦然。通常RNAi的反义链在3′-端具有核苷酸突出，且5′-端是钝的。在不希望受理论限制的情况下，反义链的5′-端的不对称钝端和反义链的3′-端突出有利于该引导链进入RISC过程。
在一个实施例中，RNAi剂包含21个核苷酸正义链和23个核苷酸反义链，其中该正义链包含从5′端起在位置9、10、11处的三个连续核苷酸上的三个2’-F修饰的至少一个基序；该反义链包含从5′端起在位置11、12、13处的三个连续核苷酸上的三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序，其中该RNAi剂的一端是钝的，而另一端包含2个核苷酸突出。优选地，该2个核苷酸突出位于反义链的3′-端。
当该2个核苷酸突出位于反义链的3′-端时，可能在末端三个核苷酸之间有两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中该三个核苷酸中有两个是突出核苷酸，且该第三个核苷酸是在该突出核苷酸附近的配对核苷酸。在一个实施例中， RNAi剂另外在正义链5′-端和反义链5′-端两者处的末端三个核苷酸之间具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施例中，RNAi剂的正义链和反义链中的每一个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)均为经修饰的核苷酸。在一个实施例中，例如，在交替基序中，各个残基独立地被2’-O-甲基或3′-氟修饰。在一个实施例中，本发明的iRNA的所有核苷酸均被修饰，并且该 iRNA包含在正义链上的不超过8个2′-氟修饰(例如，不超过7个2′-氟修饰、不超过6个2′-氟修饰、不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)，以及在反义链上的不超过6 个2′-氟修饰(例如，不超过5个2′-氟修饰、不超过4个2′-氟修饰、不超过3 个2′-氟修饰、或不超过2个2′-氟修饰)。任选地，该RNAi剂进一步包含配体(优选地GalNAc3)。
在一个实施例中，RNAi剂的正义链包含在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在正义链中的切割位点处。
在一个实施例中，该RNAi剂的反义链也可以包含在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在该反义链中的切割位点处或附近。
对于具有长度为17-23个核苷酸的双螺旋区域的RNAi剂，该反义链的切割位点通常约在从5′-端起的位置10、11和12。因此，三个相同修饰的基序可能出现在反义链的位置9、10、11；位置10、11、12；位置11、12、 13；位置12、13、14；或位置13、14、15，计数是从反义链5′-端起的第一个核苷酸开始，或计数是从反义链5′-端起在双螺旋区域内的第一对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可能随RNAi从5′-端起的双螺旋区域长度而变化。
RNAi剂的正义链可能包含在该链的切割位点处的三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序；且反义链可能具有在该链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序。当正义链和反义链形成dsRNA双螺旋时，正义链和反义链可以这样对齐以致于在正义链上的三个核苷酸的一个基序和在反义链上的三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即在正义链中的基序的三个核苷酸的至少一个和在反义链中的基序的三个核苷酸的至少一个形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可能重叠，或所有三个核苷酸可能重叠。
在一个实施例中，RNAi剂的正义链和反义链中的每一个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)可能是经修饰的。每个核苷酸可能被相同或不同的修饰进行修饰，该相同或不同的修饰可以包括一个或全部两个非连接的磷酸态氧和/或一个或多个连接的磷酸态氧的一种或多种改变；核糖的组成的改变，例如，核糖上的2′羟基的改变；以“去磷酸”连接体完全置换磷酸酯部分；天然碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯主链的置换或修饰。
由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰会出现在核酸内的重复位置，例如，碱基或磷酸酯部分或磷酸酯部分的非连接的O的修饰。在一些情况中，将在核酸的所有主题位置出现修饰，但是在许多情况中并未出现修饰。举例来说，可能仅在3′或5′末端位置出现修饰，可能仅在一个末端区进行，例如，在末端核苷酸的位置处或在一条链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。可能在双链区域、单链区域或二者中出现修饰。可能仅在RNA的双链区域或可能仅在RNA的单链区域出现修饰。例如，在非连接的O位置的硫代磷酸酯修饰可能仅在一个或两个末端出现、可能仅在末端区域(例如，在一条链的末端核苷酸位置或最后2、3、4、5、或10个核苷酸)出现、或可能在双链和单链区域(具体地在末端)出现。一个或多个5′端可以被磷酸化。
可能例如，增强稳定性，在突出中包括特定碱基，或在单链突出(例如，在5′或3′突出中或在二者中)包括经修饰的核苷酸或核苷酸替代物是有可能的。例如，可能令人希望的是在突出中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，在3′或5′突出中所有或一些碱基可以被例如本文所描述的修饰进行修饰。这些修饰可以包括，例如，使用具有本领域已知的修饰的核糖的2’位置处的修饰，例如，使用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2′-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰替代核碱基的核糖；和磷酸酯基团中的修饰，例如，硫代磷酸酯修饰。突出不一定与靶序列同源。
在一个实施例中，正义链和反义链的每个残基独立地被LNA、CRN、 cET、UNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C- 烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基、或2′-氟修饰。这些链可以包含超过一个修饰。在一个实施例中，正义链和反义链的每个残基独立地被2’-O-甲基或2′-氟修饰。
在正义链和反义链上通常出现至少两种不同修饰。这两种修饰可能是2’- O-甲基或2′-氟修饰，或其他。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。本文所使用的术语“交替基序”是指具有一种或多种修饰的基序，每种修饰出现在一条链的交替核苷酸上。该交替核苷酸可能是指每隔一个核苷酸的一个修饰或每三个核苷酸的一个修饰，或类似模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种类型的修饰，则该交替基序可能是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”、或“ABCABCABCABC…”等。
交替基序中包含的修饰类型可能是相同或不同的。例如，如果A、B、 C、D各自表示核苷酸上的一种类型的修饰，交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰类型)可能是相同的，但是正义链或反义链中的每种交替模式可能选自数种交替基序内修饰的可能性，例如：“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂包含在正义链的交替基序的修饰模式相对于反义链上的交替基序的修饰模式出现位移。该位移可能是这样的以致于正义链核苷酸的经修饰基团对应于反义链核苷酸的经不同修饰的基团，且反之亦然。例如，正义链当与dsRNA双螺旋中的反义链配对时，在双螺旋区域内正义链中的交替基序可能从该链的5′-3′开始于“ABABAB”，且反义链的交替基序可能从该链的5′-3′开始于“BABABA”。作为另一个实例，在双螺旋区域内正义链的交替基序可能从该链的5′-3′开始于“AABBAABB”，且反义链的交替基序可能从该链的5′-3′开始于“BBAABBAA”，因此在正义链和反义链之间的修饰模式存在完全或部分位移。
在一个实施例中，该RNAi剂包含在初始正义链上的2′-O-甲基修饰和 2’-F修饰的交替基序的模式相对于在初始反义链上的2′-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式具有位移，即在正义链上的2′-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2′-F修饰的核苷酸形成碱基配对，且反之亦然。正义链的位置1可能开始于2′-F修饰，且反义链的位置1可能开始于2′-O-甲基修饰。
向正义链和/或反义链中引入在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序，打断了存在于正义链和/或反义链的初始修饰模式。通过向正义链和/或反义链中引入在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个或多个基序对正义链和/或反义链的修饰模式的这种打断，惊人地增强该基因对靶基因的沉默活性。
在一个实施例中，当在任一条链中引入在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序时，在该基序附近的核苷酸修饰是与该基序修饰不同的修饰。例如，包含该基序的序列部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示在基序“YYY”附近的核苷酸的修饰，其不同于Y的修饰，且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。可替代地，当有翼修饰存在时，Na和/或Nb可能存在或不存在。
RNAi剂可能进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键修饰可能出现在正义链或反义链或两条链的链中任何位置的任何核苷酸。例如，核苷酸间键修饰可能出现在正义链和/或反义链上的每一个核苷酸；每个核苷酸间键修饰可能以交替模式出现在正义链和/或反义链；或正义链或反义链可能包含以交替模式的两种核苷酸间键的修饰。在正义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可能与反义链相同或不同，正义链上的核苷酸间键修饰的交替模式相对于反义链的核苷酸间键修饰的交替模式可能具有位移。在一个实施例中，双链RNAi剂包含6-8个硫代磷酸酯的核苷酸间键。在一个实施例中，反义链包含在5′-末端处的两个硫代磷酸酯的核苷酸间键和在3′-末端处的两个硫代磷酸酯的核苷酸间键，且正义链包含在5′-末端或3′-末端处的至少两个硫代磷酸酯的核苷酸间键。
在一个实施例中，RNAi包含在突出区域中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键修饰。例如，突出区域可能包含两个核苷酸，其在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键。也可能进行核苷酸间键修饰来连接突出核苷酸与双螺旋区域内末端配对的核苷酸。例如，至少2个、3 个、4个或所有突出核苷酸可能通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键连接，且任选地可能有另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯的核苷酸间键连接该突出核苷酸与在该突出核苷酸附近的配对核苷酸。例如，在末端三个核苷酸之间可能有至少两个硫代磷酸酯的核苷酸间键，其中三个核苷酸中有两个是突出核苷酸，且第三个是在该突出核苷酸附近的配对核苷酸。这些末端三个核苷酸可能是在反义链的3′-端、正义链的3′-端、反义链的5′-端、和/或反义链的5′-端。
在一个实施例中，该2个核苷酸突出是在反义链的3′-端，且在该末端三个核苷酸之间有两个硫代磷酸酯的核苷酸间键，其中该三个核苷酸中有两个是突出核苷酸，且该第三个核苷酸是在该突出核苷酸附近的配对核苷酸。任选地，该RNAi剂可能另外具有在正义链的5′-端和在反义链的5′-端两者处在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯的核苷酸间键。
在一个实施例中，RNAi剂包含与靶标的一个或多个错配、在双螺旋内的一个或多个错配、或其组合。错配可能出现在突出区域或双螺旋区域中。碱基对可能基于其促进解离或熔解的倾向排序(例如，基于特定配对的结合或解离的自由能，最简单的方法是以单个对为基础来检查多个对，但是也可以使用近邻(next neighbor)或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于 G:C；G:U优于G:C；且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如，非典型或除典型以外的配对(如本文中其他地方描述的)优于典型(A:T、A:U、G:C) 配对；且包括通用碱基的配对优于典型配对。
在一个实施例中，RNAi剂包含从反义链的5′-端起在双螺旋区域内的前 1个、2个、3个、4个、或5个碱基对中的至少一对，其独立地选自下组： A:U、G:U、I:C、和错配对(例如，非典型或除典型以外的配对或包括通用碱基的配对，以促进在双螺旋5′-端处的反义链解离。
在一个实施例中，从反义链的5′-端起在双螺旋区域内位置1处的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U、和dT。可替代地，从反义链5′-端起在双螺旋区域内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一对是AU 碱基对。例如，从反义链的5′-端起在双螺旋区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
在一个实施例中，正义链序列可以由式(I)表示：
5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’(I)
其中：
i和j各自独立地是0或1；
p和q各自独立地是0-6；
每个Na独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；以及
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。优选地，YYY全部都是经2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施例中，Na和/或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施例中，该YYY基序出现在正义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双螺旋区域时，YYY基序可以出现在正义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、 9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13处)，计数从5′-端起的第一个核苷酸开始；或任选地计数从5′-端起在双螺旋区域内第一个配对核苷酸开始。
在一个实施例中，i是1和j是0，或i是0和j是1，或i和j二者均是 1。因此正义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’(Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’(Ic)；或
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’(Id)。
当正义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0 个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2- 15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当正义链由式(Ic)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0- 4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含 2-20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当正义链由式(Id)表示时，每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0- 4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb是0、1、2、3、 4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个X、Y和Z彼此可以相同或不同。
在其他实施例中，i是0且j是0，并且正义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’ (Ia)。
当正义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15、或 2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施例中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5’nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3’ (II)
其中：
k和l各自独立地是0或1；
p’和q’各自独立地是0-6；
每个Na′独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包含0-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示突出核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；以及
X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，Na’和/或Nb’包含交替模式的修饰。
Y′Y′Y′基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有17-23个核苷酸长度的双螺旋区域时，该Y′Y′Y′基序可以出现在反义链的位置 9、10、11；10、11、12；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、 14、15，其中计数从5′--端起的第一个核苷酸开始；或任选地计数从5′-端起在双螺旋区域内第一个配对核苷酸开始。优选地，该Y′Y′Y′基序出现在位置 11、12、13。
在一个实施例中，Y′Y′Y′基序全部是经2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施例中，k是1且l是0，或k是0且l是1，或k和l二者都是 1。
因此反义链可以由下式表示:
5’nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3’ (IIb)；
5’nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3’ (IIc)；或
5’nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3’ (IId)。
当反义链由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0- 4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2- 20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IIc)表示时，Nb’表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0- 4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2- 20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IId)表示时，每个Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、 0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2-20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地， Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施例中，k是0且l是0，并且反义链可以由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’ (Ia)。
当反义链由式(IIa)表示时，每个Na’独立地表示包含2-20、2-15、或2- 10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个X′、Y′和Z′可能彼此相同或不同。
正义链和反义链的每个核苷酸可能独立地被LNA、CRN、UNA、cEt、 HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2′-氟修饰。例如，正义链和反义链的每个核苷酸独立地被2’-O-甲基或 2′-氟修饰。具体地，每个X、Y、Z、X′、Y′和Z′可以表示2’-O-甲基修饰或 2′-氟修饰。
在一个实施例中，当RNAi剂的双螺旋区域是21nt时，该RNAi剂的正义链可能包含出现在该链位置9、10和11的YYY基序，其中计数从5′-端起的第一个核苷酸开始，或任选地从5′-端起在双螺旋区域内的第一个配对核苷酸开始；并且Y表示2’-F修饰。
在一个实施例中，反义链可能包含出现在该链位置11、12、13的 Y′Y′Y′基序，其中计数从5′-端起的第一个核苷酸开始，或任选地从5′-端起在双螺旋区域内的第一个配对核苷酸开始；并且Y′表示2’-O-甲基修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)、和(Id)中任一式表示的正义链分别与式(IIa)、 (IIb)、(IIc)、和(IId)中任一式表示的反义链形成双螺旋。
因此，用于本发明的方法中的RNAi剂可以包含正义链和反义链，每一条链具有14至30个核苷酸，该RNAi双螺旋由式(III)表示：
有义链：5’np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3’
反义链：3’np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’5’
(III)
其中：
i、j、k、和l各自独立地是0或1；
p、p′、q和q′各自独立地是0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0-25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每个np’、np、nq’和nq，其每一个可能存在或可能不存在，独立地表示突出核苷酸；以及
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′、和Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施例中，i是0且j是0；或i是1且j是0；或i是0且j是1；或i和j二者都是0；或i和j二者都是1。在另一个实施例中，k是0且l是 0；或k是1且l是0；k是0且l是1；或k和l二者都是0；或k和l二者都是1。
形成RNAi双螺旋的正义链和反义链的示例性组合包括下式：
5’np-Na-YYY-Na-nq 3’
3’np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3’
3’np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3’
3’np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5’
(IIId)
5’-Na-YYY-Nb-3’
3’np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′5’
(IIIe)
当RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2-20、2-15、或 2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5 或1-4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2- 15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIc)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0- 7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个 Na独立地表示包含2-20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIId)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0- 7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个 Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15、或2-10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’、Nb和Nb’独立地包含交替模式的修饰。
当RNAi剂由式(IIIe)表示时，每个Na、Na′、Nb、和Nb’独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、和(IIIe)中的X、Y和Z可能彼此相同或不同。
当RNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、和(IIIe)表示时，Y 核苷酸中的至少一个可以与Y′核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，Y核苷酸中的至少两个与对应的Y′核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸与对应的Y′核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与Z′核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，Z核苷酸中的至少两个与对应的Z′核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸与对应的Z′核苷酸形成碱基对。
当RNAi剂由式(IIIc)或(IIId)表示时，X核苷酸中的至少一个可以与X′核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，X核苷酸中的至少两个与对应的X′核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸与对应的X′核苷酸形成碱基对。
在一个实施例中，在Y核苷酸上的修饰不同于在Y’核苷酸上的修饰，在 Z核苷酸上的修饰不同于在Z’核苷酸上的修饰，和/或在X核苷酸上的修饰不同于在X’核苷酸上的修饰。
在一个实施例中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或 2′-氟修饰。在另一个实施例中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2′- O-甲基或2′-氟修饰，且np′>0，且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接至相邻的核苷酸。在再另一个实施例中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是 2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′>0，且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接至相邻的核苷酸，并且正义链被轭合至通过二价或三价分支连接体(下文描述)附接的一个或多个GalNAc衍生物。在另一个实施例中，当RNAi剂由式(IIId) 表示时，Na修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰，np′>0，且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接至相邻的核苷酸，正义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且正义链被轭合至通过二价或三价分支连接体附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施例中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2′-O-甲基或 2′-氟修饰，np′>0，且至少一个np′经由硫代磷酸酯键连接至相邻的核苷酸，正义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且正义链被轭合至通过二价或三价分支连接体附接的一个或多个GalNAc衍生物。
在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)、和(IIIe)表示的两种RNAi剂在5′端处和在一个或两个3′端处彼此连接，并且任选地轭合至配体。每种药剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种药剂可以靶向在两个不同的靶标位点处的相同基因。
各种公开物描述了可以用于本发明的方法中的多聚体RNAi剂。此类公开物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO 2010/141511、WO 2007/117686、WO 2009/014887和WO 2011/031520，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
如下文中更详细描述的，包含一个或多个碳水化合物部分与RNAi剂的轭合物的RNAi剂可以使RNAi剂的一种或多种性质优化。在许多情况中，碳水化合物部分将附接至RNAi剂的经修饰的亚单位上。例如，dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚单位的核糖可以被另一个部分(例如，附接碳水化合物配体的非碳水化合物(优选地为环状)载体)置换。其中亚单位的核糖已被如此置换的核糖核苷酸亚单位在本文中被称为核糖置换修饰亚单位(RRMS)。环状载体可以是碳环环系统(即所有环原子均为碳原子)或杂环环系统(即一个或多个环原子可以是杂原子，例如，氮、氧、硫)。环状载体可以是单环环系统，或可以包含两个或更多个环，例如，稠合环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可以包含一个或多个双键。
配体可以经由载体附接至多核苷酸。载体包括(i)至少一个“主链附接点”，优选地两个“主链附接点”，和(ii)至少一个“系链(tethering)附接点”。如本文所使用的“主链附接点”是指官能基团(例如，羟基)、或通常一个键，其可用于且适合用于将载体掺入主链(例如，核糖核酸的磷酸酯或经修饰磷酸酯(例如，含硫)主链)中。在一些实施例中，“系链附接点”(TAP)是指环状载体的组成环原子，例如，碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)，其连接所选择的部分。该部分可以是例如，碳水化合物，例如，单糖、二糖、叁糖、肆糖、寡糖和多糖。该选择的部分任选地通过穿插的系链连接该环状载体。因此，该环状载体通常包括官能基团 (例如，氨基)或通常提供一个键，其适合用于将另一个化学实体(例如，配体)掺入或系链至组成环。
RNAi剂可能经由载体轭合至配体，其中该载体可以是环状基团或无环基团；优选地，该环状基团选自：吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑啶基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧杂环戊烷、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基、和十氢萘；优选地，无环基团选自：丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些具体实施例中，例如，用于本发明的方法中的RNAi剂是选自表 1、3、5、6和7中任一个表所列出的药剂的组的药剂。这些药剂可以进一步包含配体。
在某些实施例中，本发明的RNAi剂是选自下组，该组由以下各项组成：AD-66016、AD-65492、AD-66017、和AD-66018。
IV.与配体轭合的iRNA
本发明的iRNA中的RNA的另一种修饰涉及将该RNA化学连接至增强 iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个配体、部分或轭合物。此类部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分(Letsinger等人，Proc.Natl.Acid. Sci.USA[美国科学院院刊]，1989,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等人， Biorg.Med.Chem.Let.[生物有机与药物化学快报]，1994,4:1053-1060)、硫醚(例如铍(beryl)-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad. Sci.[纽约科学院年刊]，1992,660:306-309；Manoharan等人，Biorg.Med.Chem.Let.[生物有机与药物化学快报]，1993,3:2765-2770)、巯基胆固醇 (Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1992,20:533-538)、脂肪链 (例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison-Behmoaras等人，EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]，1991,10:1111-1118；Kabanov等人，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]，1990,259:327-330；Svinarchuk等人，Biochimie [生物化学]，1993,75:49-54)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2- 二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-膦酸三乙铵盐)(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体通讯]，1995,36:3651-3654；Shea等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1990,18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides[核苷和核苷酸]，1995,14:969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体通讯]，1995,36:3651- 3654)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]，1995,1264:229-237)、或硬脂胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分 (Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志]，1996, 277:923-937)。
在一个实施例中，配体改变其掺入的iRNA剂的分布、靶向或使用期。在优选的实施例中，与例如不存在这样的配体的物种相比，这些配体对所选择的靶标(例如，分子、细胞或细胞类型、隔室(例如，细胞或器官隔室)、组织、器官或身体区域)提供增强的的亲和力。优选的配体将不会参与双螺旋核酸中的双螺旋配对。
配体可以包括天然存在的物质，例如蛋白质(例如，人类血清白蛋白 (HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、支链淀粉(pullulan)、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精、N-乙酰基半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如，合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括聚氨基酸如聚赖氨酸 (PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯基酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯基酰胺聚合物、或聚磷嗪。多胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽类聚胺、树形分子聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺季盐、或α螺旋肽。
配体也可以包括靶向基团，例如，靶向细胞或组织的药剂，例如，凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如，结合特定细胞类型(例如肾脏细胞)的抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白质A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、单价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺、多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素、或RGD肽、RGD肽模拟物。在某些实施例中，配体包括单价或多价半乳糖。在某些实施例中，配体包括胆固醇。
配体的其他实例包括染料、嵌合剂(例如，吖啶类)、交联剂(例如，补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉(texaphyrin)、 Sapphyrin)、多环芳香烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人造内切核酸酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、茨醇、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)、以及肽轭合物 (例如，触角足肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如， PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、经取代的烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如，生物素)、运运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇集物、吖啶-咪唑轭合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、 HRP、或AP。
配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)、或肽(例如，对辅配体具有特异亲和力的分子)、或抗体(例如，结合特异性细胞类型(例如肝细胞)的抗体)。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽物质，例如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖、或多价岩藻糖。配体可以是例如，脂多糖、p38MAP激酶的活化剂、或NF-κB的活化剂。
配体可以是物质例如药物，其可以通过例如破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝、和/或中间丝来增加细胞中iRNA剂的摄取。该药物可以是例如，紫杉酚(taxon)、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、拉春库林A、毒伞素、红海海绵素 (swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)、或myoservin。
在一些实施例中，与本文所描述的iRNA附接的配体作为药物动力学调节剂(PK调节剂)起作用。PK调节剂包括亲脂物、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽类、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不限于，胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂类、鞘脂类、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。也已知包含许多硫代磷酸酯键的寡核苷酸可以结合血清蛋白，因此在主链中包含许多硫代磷酸酯键的短的寡核苷酸(例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适用于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。此外，在本文描述的实施例中，结合血清组分(例如，血清蛋白)的适配子也适合用作PK调节配体。
本发明的配体-轭合寡核苷酸可以通过带有侧接反应性功能(pendant reactivefunctionality)的寡核苷酸来合成，例如衍生自在寡核苷酸上附接连接分子的那种(如下文描述)。该反应性寡核苷酸可以直接与可商购的配体、合成的带有任何各种保护基团的配体、或具有与其附接的连接部分的配体反应。
本发明的轭合物中所使用的寡核苷酸可以通过熟知的固相合成技术来方便且常规地制备。用于此类合成的设备由数个供应商销售，包括例如应用生物系统公司(福斯特城，加利福尼亚州)(Applied Biosystems(Foster City, Calif.))。另外或可替代地，可以使用本领域已知的用于此类合成的任何其他方式。也已知，使用类似技术来制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本发明的配体-轭合寡核苷酸合带有配体分子的序列特异性连接的核苷中，可能在合适的DNA合成仪上利用标准的核苷酸或核苷前体、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷轭合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-轭合物前体、或带有非核苷配体的构成嵌段组装成寡核苷酸和寡核苷。
当使用已经带有连接部分的核苷酸-轭合物前体时，通常先完成序列特异性连接的核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体-轭合的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸或连接核苷是通过自动化合成仪，除了使用可商购的常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准的亚磷酰胺外使用衍生自配体-核苷轭合物的亚磷酰胺合成。
A.脂质轭合物
在一个实施例中，配体或轭合物是脂质或基于脂质的分子。这样的脂质或基于脂质的分子优选结合血清蛋白，例如，人类血清白蛋白(HSA)。 HSA结合性配体允许轭合物分布在靶组织，例如身体的非肾脏靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加轭合物对降解的抗性，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用于调整与血清蛋白(例如，HSA)的结合。
基于脂质的配体可以用于抑制(例如，控制)轭合物与靶组织的轭合。例如，脂质或基于脂质的配体与HSA的结合越强时，越不可能靶向肾脏，因此越不可能从身体清除。与HSA的结合较弱的脂质或基于脂质的配体可以用于将该轭合物靶向肾脏。
在优选的实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，其结合HSA 具有足够的亲和力，这样使得该轭合物将优选地分布至非肾脏组织。然而，优选的是，该亲和力不会太强以致于无法逆转HSA-配体结合。
在另一个优选的实施例中，该基于脂质的配体结合HSA的亲和力弱或完全没有亲和力，这样使得该轭合物将优选分布至肾脏。代替基于脂质的配体或除了基于脂质的配体外，也可以使用靶向肾脏细胞的其他部分。
在另一个方面中，该配体是例如维生素等部分，其被靶细胞(例如，增生细胞)摄取。这些特别适用于治疗如下障碍，该障碍特征在于不期望的例如恶性或非恶性类型(例如癌细胞)的细胞增生。示例性维生素包括维生素 A、E、和K。其他示例性维生素包括B族维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、维生素B6或被靶细胞例如肝细胞摄取的其他维生素或营养素。也包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
在另一个方面中，该配体是细胞渗透剂，优选地螺旋细胞渗透剂。优选地该药剂为两亲性的。示例性药剂是肽，例如tat肽或触角足肽。如果该药剂是肽，其可以是经修饰的，包括肽基模拟物、反转异构体、非肽或伪肽键、和D-氨基酸的使用。螺旋剂优选地是α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文也称为寡肽模拟物)是可以折叠成类似天然肽的限定三度空间结构的分子。与iRNA剂附接的肽和肽模拟物可以通过例如增强细胞识别和吸收来影响iRNA的药物动力学分布。该肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如，约5、10、15、20、 25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如，细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽、或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树形分子肽、约束性肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜转位序列 (MTS)。含疏水性MTS的肽的实例是具有氨基酸序列 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:11)的RFGF。含有疏水性MTS的 RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:12))也可以是靶向部分。该肽部分可以是“递送”肽，其可携带大型极性分子(包括肽、寡核苷酸与蛋白质)穿越细胞膜。例如，已发现来自HIV Tat蛋白质 (GRKKRRQRRRPPQ)(SEQ ID NO:13)和果蝇触角足(Drosophila antennapedia)蛋白质(RQIKIWFQNRRMKWKK)(SEQ ID NO:14)的序列能够作为递送肽发挥功能。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，例如从噬菌体展示文库或一珠粒一化合物(one-bead-one-compound(OBOC))组合文库(Lam等人，Nature[自然]，354:82-84,1991)鉴定的肽。出于细胞靶向目的经由并入的单体单位与dsRNA剂系链的肽或肽模拟物是精氨酸-甘氨酸 -天冬氨酸(RGD)-肽、或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以是从约5个氨基酸至约40个氨基酸。该肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或指导构型性质。可以采用下文描述的任何结构修饰。
本发明的组合物和方法中使用的RGD肽可以是线性或环状，并且可以是经修饰的(例如，糖基化或甲基化)以促进靶向一个或多个特定组织。包含RGD的肽和肽模拟物可以包括D-氨基酸和合成RGD模拟物。除了RGD 外，人们可以使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选轭合物靶向 PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够通透细胞，例如，微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人类细胞)。可以渗透微生物细胞的肽可以是例如，α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、包含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或抗菌肽(bactenecin))、或仅包含一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽也可以包括核定位信号 (NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，例如MPG，其是衍生自 HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大型T抗原的NLS(Simeoni等人Nucl. Acids Res.[核酸研究]31:2717-2724,2003)。
C.碳水化合物轭合物
在本发明的组合物和方法的一些实施例中，iRNA寡核苷酸进一步包含碳水化合物。碳水化合物轭合iRNA的优点在于核酸的体内递送、以及组合物适合于体内治疗用途，如本文所描述。本文所使用的“碳水化合物”是指其本身由一个或多个具有至少6个碳原子(其可以是线性、分支或环状)且在各个碳原子连接氧、氮或硫原子的单糖单位所构成碳水化合物的化合物；或具有由一个或多个具有至少6个碳原子(其可以是线性、分支或环状)且在各个碳原子上连接氧、氮或硫原子的单糖单位所构成的碳水化合物部分作为其中一部分的化合物。代表性碳水化合物包括糖类(单糖、二糖、叁糖和包含约4、5、6、7、8、或9个单糖单位的寡糖类)，以及多糖类，例如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶质。具体的单糖包括TTR和以上的(例如，TTR、C6、C7、或C8)糖类；二糖和叁糖包括具有两个或三个单糖单位的糖类(例如，TTR、C6、C7、或C8)。
在一个实施例中，本发明的组合物和方法中使用的碳水化合物轭合物是单糖。在另一个实施例中，本发明的组合物和方法中使用的碳水化合物轭合物选自下组，该组由以下各项组成：
在一个实施例中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺，例如
本文所描述的实施例中使用的另一个代表性碳水化合物轭合物包括但不限于，
(式XXIII)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的某些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由单价连接体附接至本发明的iRNA剂。在一些实施例中，GalNAc或GalNAc衍生物是经由二价连接体附接至本发明的iRNA剂。在本发明的又其他实施例中， GalNAc或GalNAc衍生物是经由三价连接体附接至本发明的iRNA剂。
在一个实施例中，本发明的双链RNAi剂包含附接至iRNA剂的一个 GalNAc或GalNAc衍生物。在另一个实施例中，本发明的双链RNAi剂包含复数个(例如，2、3、4、5、或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每一个独立地通过复数个单价连接体附接至该双链RNAi剂的复数个核苷酸上。
在一些实施例中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是一个更大分子的一部分，通过在一条链的3′-端和对应的另一条链的5′-端之间未被中断的核苷酸链连接形成发夹环时，该发夹环包含复数个未配对的核苷酸，该发夹环内每个未配对的核苷酸可以独立地包含经由单价连接体附接的GalNAc或 GalNAc衍生物。该发夹环也可以通过双螺旋的一条链中延伸的突出形成。
在一些实施例中，碳水化合物轭合物进一步包含一个或多个另外的如上所述的配体，例如但不限于，PK调节剂和/或细胞渗透肽。
适合用于本发明的另外的碳水化合物轭合物包括描述于PCT公开号WO 2014/179620和WO 2014/179627中的那些，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
D.连接体
在一些实施例中，本文描述的轭合物或配体可以用可以切割或不可切割的各种连接体附接至iRNA寡核苷酸。
术语“连接体”或“连接基团”意指连接化合物的两个部分的有机部分，例如，共价附接化合物的两个部分。连接体通常包含一个直接结合 (direct bond)或原子(例如氧或硫)、单位(例如NR8、C(O)、C(O)NH、 SO、SO2、SO2NH)或原子的链，例如但不限于，经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以穿插或末端为O、S、 S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经取代的脂肪族。在一个实施例中，连接体是在约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5- 24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子、7-17、8-17、6-16、7-16、或8-16个原子之间。
可切割的连接基团是在细胞外是足够稳定的，但当进入靶细胞内时其被切割而释放被连接体结合在一起的两个部分的基团。在优选的实施例中，可切割的连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择来模拟或代表细胞内条件)的切割比在受试者血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择来模拟或代表血液或血清中发现的条件)快至少约10倍、20倍、 30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍、或快至少约100 倍。
可切割的连接基团对切割剂(例如，pH、氧化还原电位或降解性分子的存在)敏感。通常，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更为普遍或以更高的水平存在。此类降解剂实例包括：针对特定底物选择的或没有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化性酶或还原性酶或还原剂例如硫醇，其可以通过还原作用降解可经氧化还原切割的连接基团；酯酶；核内体或可以产生酸性环境的试剂，例如，那些产生pH 5或更低的那些；可以水解或降解酸性可切割的连接基团的酶，其作用为普通酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶。
可切割的连接基团(例如二硫键)可能对pH敏感。人类血清的pH是 7.4，而细胞内平均pH稍低，在约7.1-7.3的范围内。核内体具有更加酸性的 pH，在5.5-6.0的范围内，并且溶酶体具有甚至更酸的pH(约5.0)。一些连接体将具有可切割的连接基团，其在优选的pH下被切割，从而在细胞内从配体释放阳离子脂质，或释放阳离子脂质进入所希望的细胞隔室内。
连接体可以包括可被特定酶切割的可切割的连接基团。掺入连接体中的可切割的连接基团类型可能取决于待靶向的细胞。例如，靶向肝的配体可以通过包含酯基团的连接体连接至阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，因此该连接体将在肝细胞中的切割比在没有富含酯酶的细胞类型中的切割更加有效率。其他富含酯酶的细胞类型包括肺、肾皮质和睪丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(例如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用包含肽键的连接体。
通常，通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估该候选的可切割的连接基团的适合性。还令人希望的是，也测试候选的可切割的连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，人们可以确定在第一条件和第二条件之间对切割作用的相对敏感性，其中选择第一条件来表示在靶细胞中的切割，并且选择第二条件来表示在其他组织或生物液体(例如，血液或血清)中的切割。这些评估可以在无细胞系统、细胞、细胞培养物、器官或组织培养物、或在完整动物体中进行。其可以用于在无细胞或培养条件下进行初始分析，并通过在完整动物体内进一步评估来确认。在优选的实施例中，可用的候选化合物在细胞中(或在选择来模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在选择来模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或约100倍。
i.氧化还原可切割的连接基团
在一个实施例中，可切割的连接基团是氧化还原可切割的连接基团，其在还原或氧化时切割。还原性可切割的连接基团的实例是二硫连接基团(-S- S-)。可以参见本文描述的方法来确定候选的可切割的连接基团是否为合适的“还原性可切割的连接基团”，或例如，是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用。例如，可以通过与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起培养，使用本领域已知的模拟细胞(例如，靶细胞)中将观察到的切割速率的试剂来评估候选物。这些候选物也可以在选择来模拟血液或血清的条件下进行评估。在一个中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞(或在选择来模拟细胞内条件的体外条件下)的降解与在血液中(或在选择来模拟细胞外条件的体外条件下)相比快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90、或约100倍。与选择来模拟细胞外基质的条件相比，在选择来模拟细胞内基质条件下使用标准酶动力学测定可以确定候选化合物的切割速度。
ii.基于磷酸酯的可切割的连接基团
在另一个实施例中，可切割的连接体包含基于磷酸酯的可切割的连接基团。基于磷酸酯的可切割的连接基团是被降解或水解磷酸酯的试剂切割。在细胞中切割磷酸酯的试剂的实例是细胞中的酶例如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S- P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S- P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S- P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选地的实施例是-O- P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O- P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O- P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、- O-P(S)(H)-S-。优选的实施例是-O-P(O)(OH)-O-。这些候选物可以使用与上述的那些类似的方法进行评估。
iii.酸可切割的连接基团
在另一个实施例中，可切割的连接体包含酸可切割的连接基团。酸可切割的连接基团是在酸性条件下切割的连接基团。在优选的实施例中，酸可切割的连接基团是在约6.5或更低的pH(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0 或更低)的酸性环境下切割，或被可以充当普通酸的试剂(例如酶)切割的基团。在细胞中，具体的低pH细胞器(例如核内体和溶酶体)可以为酸可切割的连接基团提供切割环境。酸可切割的连接基团的实例包括但不限于，腙类、酯类和氨基酸的酯类。酸可切割的基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O、或-OC(O)。优选的实施例是当附接酯的氧(烷氧基)的碳是芳基基团、经取代的烷基基团、或叔烷基基团(例如二甲基戊基或叔丁基)时。这些候选物可以使用与上述的那些类似的方法进行评估。
iv.基于酯的连接基团
在另一个实施例中，可切割的连接基团包含基于酯的可切割的连接基团。基于酯的可切割的连接基团被细胞中的酶(例如酯酶和酰胺酶)切割。基于酯的可切割的连接基团的实例包括但不限于，亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯类。可切割的酯连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选物可以使用与上述的那些类似的方法进行评估。
v.基于肽的切割基团
在再另一个实施例中，可切割的连接体包含基于肽的可切割的连接基团。基于肽的可切割的连接基团被细胞中的酶(例如肽酶和蛋白酶)切割。基于肽的可切割的连接基团是为了产生寡肽(例如，二肽、三肽等)而在氨基酸之间与多肽形成的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(- C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是为了产生肽和蛋白质而在氨基酸之间形成的一种特别类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)，且不包括整个酰胺官能基团。基于肽的可切割的连接基团具有通式- NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可以使用与上述的那些类似的方法进行评估。
在一个实施例中，本发明的iRNA通过连接体与碳水化合物轭合。使用本发明的组合物和方法的连接体的iRNA碳水化合物轭合物的非限制性实例包括但不限于，
当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价的分支连接体附接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。
在一个实施例中，将本发明的dsRNA轭合至二价或三价的分支连接体，该连接体选自在式(XXXII)-(XXXV)中任一式所示的结构的组：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C对于每次出现独立地表示0至20，并且其中重复单位可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、 T4A、T4B、T4A、T5B、T5C对于每次出现各自独立地是不存在、CO、NH、O、 S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C对于每次出现独立地是不存在、亚烷基、经取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以穿插或末端为O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C对于每次出现各自独立地是不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)- CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即对于每次出现各自独立地是单糖(例如GalNAc)、二糖、叁糖、肆糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价轭合的GalNAc衍生物特别适合与RNAi剂一起使用来抑制靶基因表达，例如式(XXXVI)的那些：
式XXXVI
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，例如GalNAc衍生物。
合适的二价和三价分支连接体基团轭合GalNAc衍生物的实例包括但不限于，上述的结构如式II、VII、XI、X和XIII。
教导制备RNA轭合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号 4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730； 5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802； 5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046； 4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941； 4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963； 5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469； 5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785； 5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726； 5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941；6,294,664；6,320,017； 6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，其每一个的完整内容特此通过引用结合在此。
不一定在给定化合物的所有位置均被一致修饰，且事实上可以在单个化合物中或甚至在iRNA中的单个核苷处掺入超过一个上述修饰。本发明也包括为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是包含两个或更多个化学上不同的区域的iRNA化合物(优选dsRNA)，在dsRNA化合物的情况下，每个该化学上不同的区域由至少一个单体单位(即核苷酸)组成。这些iRNA通常包含至少一个区域，其中该RNA被修饰以致于赋予增加iRNA对核酸酶降解的抗性、增加细胞摄取、和/或增加对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区域可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，核糖核酸酶H是细胞内切核酸酶，其切割RNA:DNA 双螺旋的RNA链。因此活化核糖核酸酶H导致RNA靶标的切割，从而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。结果，与硫代磷酸酯脱氧dsRNA杂交相同靶标区域相比，当使用嵌合dsRNA时，用较短的iRNA经常可以获得可比较的结果。RNA靶标的切割可以常规地通过凝胶电泳来检测，且如果必要时，可联合使用本领域已知的核酸杂交技术。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多种非配体分子已与iRNA轭合，以便增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类轭合的程序可从科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，例如胆固醇(Kubo,T.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]，2007,365(1):54-61；Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]，1989,86:6553)、胆酸(Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem. Lett.[生物有机与药物化学快报]，1994,4:1053)、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]，1992, 660:306；Manoharan等人，Bioorg.Med.Chem.Let.[生物有机与药物化学快报]，1993,3:2765)、巯基胆固醇(Oberhauser等人，Nucl.Acids Res.[核酸研究]，1992,20:533)、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)(Saison- Behmoaras等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]，1991,10:111； Kabanov等人，FEBS Lett.[欧洲生物化学学会联盟通讯]，1990,259:327； Svinarchuk等人，Biochimie[生物化学]，1993,75:49)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-膦酸三乙铵盐)(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体通讯]，1995,36:3651；Shea等人，Nucl.AcidsRes.[核酸研究]，1990,18:3777)、聚胺或聚乙二醇链 (Manoharan等人，Nucleosides&Nucleotides[核苷和核苷酸]，1995, 14:969)、或金刚烷乙酸(Manoharan等人，Tetrahedron Lett.[四面体通讯]， 1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]，1995,1264:229)、或硬脂胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分(Crooke等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志]，1996, 277:923)。上文已经列出教导制备此类RNA轭合物的代表性美国专利。典型的轭合方案涉及合成在序列的一个或多个位置带有氨基连接体的RNA。然后，氨基基团与被轭合的分子使用适当的轭合或活化试剂进行反应。轭合反应可以与仍结合在固体支持物上的RNA进行或可以在切割RNA后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA轭合物通常提供纯的轭合物。
V.本发明的iRNA的递送
可以用许多不同的方式实现将本发明的iRNA递送至细胞，例如，受试者内的细胞，该受试者例如是人类受试者(例如，对其有需要的受试者，例如罹患TTR相关疾病、障碍或病症的受试者)。例如，可以通过使细胞与本发明的iRNA在体外或体内接触进行递送。也可以直接通过向受试者给予包含iRNA(例如，dsRNA)的组合物进行体内递送。可替代地，可以间接通过给予编码并指导iRNA表达的一种或多种载体进行体内递送。这些替代方案在下文中进一步讨论。
一般而言，递送核酸分子的任何方法(体外或体内)可以适用于本发明的iRNA(参见例如，Akhtar S.和Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.[细胞生物学趋势]2(5):139-144和WO 94/02595，其以其全文通过引用结合在此)。对于体内递送，为了递送iRNA分子要考虑的因素包括例如，所递送的分子的生物稳定性、预防所递送的分子在靶组织中的非特异性作用和累积。可以通过局部给予，例如，通过直接注射或植入组织中或局部给予制剂来使iRNA 的非特异性作用最小化。局部给予至治疗位点使该试剂的局部浓度最大化，限制该试剂暴露于可能会受到该试剂伤害或使该试剂降解的全身组织，并且允许更低的待给予的iRNA分子的总剂量。数项研究已成功显示，当局部给予iRNA时基因产物被成功敲低。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射 (Tolentino,MJ.，等人(2004)Retina[视网膜]24:132-138)和在小鼠中通过视网膜下注射(Reich,SJ.，等人(2003)Mol.Vis.[分子视觉]9:210-216)VEGF dsRNA的眼内递送两者都显示在年龄相关的黄斑变性实验模型中预防新血管形成。另外，小鼠中dsRNA的直接瘤内注射减少了肿瘤体积(Pille,J., 等人(2005)Mol.Ther.11:267-274)，并且可以延长荷瘤小鼠的存活(Kim, WJ.，等人(2006)Mol.Ther.[分子疗法]14:343-350；Li,S.，等人(2007) Mol.Ther.[分子疗法]15:515-523)。RNA干扰也已显示成功地通过直接注射局部递送至CNS(Dorn,G.，等人(2004)Nucleic Acids[核酸]32:e49；Tan,PH.，等人(2005)Gene Ther.[基因疗法]12:59-66；Makimura,H.，等人 (2002)BMCNeurosci.[BMC神经科学]3:18；Shishkina,GT.，等人(2004) Neuroscience[神经科学]129:521-528；Thakker,ER.，等人(2004)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院刊]101:17270-17275；Akaneya,Y.，等人 (2005)J.Neurophysiol.[神经生理学杂志]93:594-602)，并且通过鼻内给予给予至肺部(Howard,KA.，等人(2006)Mol.Ther.[分子疗法]14:476-484； Zhang,X.，等人(2004)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]279:10677-10684； Bitko,V.，等人(2005)Nat.Med.[自然医学]11:50-55)。对于全身给予 iRNA用于治疗疾病，RNA可以被修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均可预防dsRNA在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。RNA 或药物载体的修饰还可以允许iRNA组合物靶向靶组织，并避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学缀合至亲脂性基团例如胆固醇来修饰以增强细胞摄取并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分轭合的、指导对抗ApoB 的iRNA全身注射至小鼠中，并且导致在肝与空肠中的apoB mRNA敲低 (Soutschek,J.，等人(2004)Nature[自然]432:173-178)。iRNA与适配子轭合已显示在小鼠前列腺癌模型中抑制肿瘤生长和介导肿瘤消退(McNamara, JO，等人(2006)Nat.Biotechnol.[自然生物技术]24:1005-1015)。在可替代的实施例中，可以使用药物递送系统(例如纳米粒子、树形分子、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进 iRNA分子(带负电荷)的结合，并且也增强在带负电荷的细胞膜上的相互作用以允许细胞对iRNA的有效摄取。阳离子脂质、树形分子、或聚合物可以与iRNA结合，或诱导形成包埋iRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim SH.，等人(2008)Journal of Controlled Release[控制释放杂志]129(2):107-116)。形成囊泡或胶束可在全身给予时进一步预防iRNA降解。制造和给予阳离子- iRNA复合物的方法是在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen, DR.，等人(2003)J.Mol.Biol[分子生物学杂志]327:761-766；Verma,UN.，等人(2003)Clin.Cancer Res.[临床癌症研究]9:1291-1300；Arnold,AS等人 (2007)J.Hypertens.[高血压杂志]25:197-205，其以其全文通过引用结合在此)。适用于全身性递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括 DOTAP(Sorensen,DR.，等人(2003)，见上文；Verma,UN.，等人 (2003)，见上文)、Oligofectamine(“固体核酸脂质粒子”) (Zimmermann,TS.，等人(2006)Nature[自然]441:111-114)、心磷脂 (Chien,PY.，等人(2005)Cancer Gene Ther.[癌症基因疗法]12:321-328； Pal,A.，等人(2005)Int J.Oncol.[国际肿瘤学杂志]26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME.，等人(2008)Pharm.Res[药学研究].印刷前的8月16日电子出版；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.[生物医学与生物技术杂志]71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.[分子药剂学]3:472-487)、和聚酰胺胺(Tomalia,DA.，等人(2007)Biochem.Soc. Trans.[生化学会会刊]35:61-67；Yoo,H.，等人(1999)Pharm.Res.[药学研究]16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成复合物用于全身性给予。iRNA与环糊精的给予方法和药物组合物可以发现于美国专利号 7,427,605，其以其全文通过引用结合在此。
A.编码本发明的iRNA的载体
靶向TTR基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达 (参见例如，Couture,A，等人，TIG.(1996)，12:5-10；Skillern,A.等人，国际PCT公开号WO 00/22113；Conrad，国际PCT公开号WO 00/22114；和 Conrad，美国专利号6,054,299)。表达可以是瞬时的(大约数小时至数周) 或持续的(数周至数个月或更久)，取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒、或病毒载体引入，该病毒载体可以是整合或非整合的载体。也可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊](1995)92:1292)。
iRNA的单个链或两条链可以从表达载体上的启动子转录。在两条单独的链表达以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入 (例如，通过转染或感染)至靶细胞中。可替代地，dsRNA的每一单个链可以通过启动子转录，其两者均位于相同的表达质粒上。在一个实施例中， dsRNA作为通过连接体多核苷酸序列连接的反向重复序列多核苷酸表达，这样使得dsRNA具有茎和环结构。
iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。可以使用可与真核生物细胞兼容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞兼容的那些表达载体来产生重组构建体，用于表达本文所描述的iRNA。真核生物细胞表达载体是本领域熟知的，且可从许多商业来源获得。通常，所提供的这些载体包含方便的限制位点用于插入所希望的核酸区段。iRNA表达载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内给予、通过给予至从患者移植的靶细胞接着重新引入患者体内、或通过允许引入所希望的靶细胞中的任何其他手段。
iRNA表达质粒可以作为与阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKOTM)的复合物转染至靶细胞中。本发明也考虑持续一周或更久的用于靶向靶标RNA的不同区域的iRNA 介导敲低的多重脂质转染法。可以使用各种已知的方法监测向宿主细胞成功引入载体。例如，瞬时转染可以用报告基因作为信号，例如荧光标记物，例如绿色荧光蛋白(GFP)。使用向转染细胞提供对特定环境因子(例如，抗生素和药物)的抗性(例如潮霉素B抗性)的标记物来确保离体细胞的稳定转染。
可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于，(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于，慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)等；(c)腺相关病毒载体； (d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头状瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，例如正痘病毒，例如，牛痘病毒载体或鸟痘(avipox)，例如，金丝雀痘或禽痘；以及(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同载体将不一定并入细胞基因组中。如果需要时，这些构建体可以包括用于转染的病毒序列。可替代地，该构建体可以并入能够进行附加体型复制的载体，例如，EPV和 EBV载体。用于iRNA的重组表达的构建体通常将需要调节元件(例如，启动子、增强子等)以确保iRNA在靶细胞中的表达。下文将进一步描述有关载体和构建体的其他方面。
可用于递送iRNA的载体包括足以在所希望的靶细胞或组织中表达iRNA 的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择这些调节元件来提供组成性或调节/诱导型表达。
可以例如通过使用对某些生理调节剂(例如，循环葡萄糖含量或激素) 敏感的诱导性调节序列准确调节iRNA的表达(Docherty等人，1994,FASEB J.[美国实验生物学学会联合会会刊]8:20-24)。适合用于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类诱导性表达系统包括例如，通过蜕皮激素、雌性激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导剂、以及异丙基-β-D1-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)的调节作用。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适当的调节/启动子序列。
可以使用包含编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见Miller等人，Meth.Enzymol.[酶学方法]，217:581-599 (1993))。这些逆转录载体含有正确包装病毒基因组并且将其整合进宿主细胞DNA中所必需的组分。将编码iRNA的核酸序列克隆进一种或多种载体中，其促进递送核酸至患者中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以发现于 Boesen等人，Biotherapy[生物治疗]，6:291-302(1994)中，其描述了使用逆转录病毒载体将mdr1基因递送至造血干细胞中以便使这些干细胞对化学疗法更有抗性。阐述逆转录病毒载体在基因疗法中的用途的其他参考文献是： Clowes等人，J.Clin.Invest.[临床研究杂志]，93:644-651(1994)；Kiem等人，Blood[血液]83:1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，Human Gene Therapy[人类基因疗法]4:129-141(1993)；以及Grossman和Wilson,Curr. Opin.in Genetics and Devel.[遗传学与发育新见]3:110-114(1993)。考虑使用的慢病毒载体包括例如基于HIV的载体，其描述于美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中，其通过引用结合在此。
也考虑使用腺病毒来递送本发明的iRNA。腺病毒是用于递送基因至呼吸上皮的特别有吸引力的媒介物。腺病毒天然地感染呼吸上皮，在呼吸上皮处它们引起轻度疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂的细胞的优点。Kozarsky 和Wilson，Current Opinion in Genetics andDevelopment[遗传学与发育新见]， 3:499-503，1993提供了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等人，Human Gene Therapy[人类基因疗法]，5:3-10(1994)证明了腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸上皮的用途。腺病毒在基因疗法中的用途的其他实例可以发现于Rosenfeld等人，Science[科学]252:431-434(1991)；Rosenfeld等人， Cell[细胞]68:143-155(1992)；Mastrangeli等人，J.Clin.Invest.[临床研究杂志]91:225-234(1993)；PCT公开WO 94/12649；以及Wang等人，Gene Therapy[基因疗法]2:775-783(1995)。用于表达在本发明中起重要作用的 iRNA的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送载体至靶细胞中的方法描述于Xia H等人(2002)，Nat.Biotech.[自然生物技术] 20:1006-1010。
也可以使用腺相关病毒(AAV)载体来递送本发明的iRNA(Walsh等人，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.[实验生物学与医学学会会报]204:289-300 (1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从重组 AAV载体表达为两个单独的、互补的单链RNA分子，该重组AAV载体具有例如U6或H1RNA启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子。用于表达在本发明中起重要作用的dsRNA的合适的AAV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送载体至靶细胞中的方法描述于Samulski R等人(1987)，J. Virol.[病毒学杂志]61:3096-3101；Fisher K J等人(1996)，J.Virol[病毒学杂志]，70:520-532；Samulski R等人(1989)，J.Virol.[病毒学杂志]，63: 3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号 WO 94/13788；以及国际专利申请号WO 93/24641，其完整披露内容已以引用的方式并入。
适合于递送本发明的iRNA的另一种病毒载体是痘病毒，例如牛痘病毒，例如减毒牛痘(例如经修饰的安卡拉(Ankara)病毒(MVA)或 NYVAC)、鸟痘(例如禽痘或金丝雀痘)。
适当的话，可以通过使用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原将载体假型化、或通过取代不同的病毒衣壳蛋白来对病毒载体的向性进行修饰。例如，慢病毒载体可以用来自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白质进行假型化处理。通过将载体工程化以表达不同衣壳蛋白血清型，可以使AAV载体靶向不同细胞；参见例如，Rabinowitz J E等人(2002)J Virol[病毒学杂志]76:791-801，其完整披露内容通过引用结合在此。
载体的药物制剂可以包括载体在可接受的稀释剂中，或可以包括其中已包埋基因递送媒介物的缓慢释放基质。可替代地，在可以从重组细胞完整产生完整基因递送载体(例如，逆转录病毒载体)的情况下，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。
VI.本发明的药物组合物
本发明也包括药物组合物和配制品，其包括本发明的iRNA。在一个实施例中，本文提供包含如本文描述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。包含iRNA的药物组合物可用于治疗与TTR基因的表达或活性有关的疾病或障碍。此类药物组合物是基于递送模式配制的。一个实例是被配制用于经由肠胃外递送(例如，通过皮下(SC)或静脉内(IV)递送)的全身性给予的组合物。另一个实例是被配制用于直接递送至脑实质(例如，如通过连续泵输注来输注至脑内)的组合物。本发明的药物组合物可以按足以抑制 TTR基因表达的剂量给予。在一个实施例中，本发明的iRNA剂(例如， dsRNA剂)在药学上可接受的载体中被配制用于皮下给予。
药物组合物可以经一段时间，例如经5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、和21、22、23、24、或约25分钟的时间通过静脉内输注给予。可以例如以规律方式重复给予，例如每周、双周(即每两周)持续一个月、两个月、三个月、四个月或更久。也可以例如以每月一次、或以每季度一次、例如约每12周重复给予。在初次治疗方案后，治疗可以按较少频率给予。例如，在每周一次或两周一次给予持续三个月后，给予可以每月一次进行重复，持续六个月或一年或更久。
药物组合物可以每天一次给予，或iRNA可以在一天内按适当间隔作为两个、三个或更多个亚剂量给予，或甚至使用连续输注，或通过控制释放的配制品递送。在那种情况下，在每个亚剂量中包含的iRNA必需相对较少，以便达到总日剂量。例如使用经几天的时间提供持续的iRNA释放的常规持续释放配制品，也可以将剂量单位复配用于在几天内递送。持续释放配制品是本领域中熟知的并且对于在特定位点递送药剂是特别有用的，由此可以与本发明的药剂一起使用。在本实施例中，该剂量单位包含对应的多个日剂量。
在其他实施例中，药物组合物的单次剂量可以是长效的，这样使得随后的剂量以不超过3、4或5天间隔、或以不超过1、2、3或4周间隔、或以不超过9、10、11、或12周间隔给予。在本发明的一些实施例中，本发明的药物组合物的单次剂量是一周给予一次。在本发明的其他实施例中，本发明的药物组合物的单次剂量是每两个月给予一次。在其他实施例中，本发明的药物组合物的单次剂量是每个月给予一次。在仍其他实施例中，本发明的药物组合物的单次剂量是每季度给予一次。
本领域技术人员将理解的是，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，这些因素包括但不限于疾病或障碍的严重性、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄、以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。如本文的其他地方所描述，使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，可以评估由本发明涵盖的TTR抑制组合物的有效剂量和体内半衰期。
取决于希望局部治疗还是全身性治疗以及取决于待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可能是局部(例如，通过透皮贴剂)、肺部(例如，通过吸入或吹入粉剂或气溶胶，包括通过喷雾器)；气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或肠胃外。肠胃外给予包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下(例如，经由植入装置)；或颅内(例如，通过脑实质内、鞘内或脑室内)给予。
iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，例如肝(例如肝的肝细胞)。
用于局部给予的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、油膏、洗液、乳霜、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体和粉剂。常用的药物载体、水性、粉状或油性基质、增稠剂等可能是需要或令人希望的。有涂层的避孕套、手套等也是有用的。合适的局部配制品包括如下那些，其中在本发明中起重要作用的iRNA是与局部递送剂(例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂)混合的。合适的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)、和阳离子(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明中起重要作用的iRNA可以包封在脂质体内或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可以与脂质(特别是与阳离子脂质) 复合。合适的脂肪酸和酯类包括但不限于，花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油一酸酯、甘油二酸酯或其药学上可接受的盐)。局部配制品详细描述于美国专利号6,747,014，其通过引用结合在此。
A.包含膜分子组合的iRNA配制品
本发明的组合物和方法中使用的iRNA可以配制用于在膜分子组合(例如，脂质体或胶束)中递送。本文所使用的术语“脂质体”是指由在至少一个双层(例如，一个双层或复数个双层)中排列的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层和多层囊泡，其具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部。该水性部分包含iRNA组合物。亲脂性材料使水性内部与水性外部(其通常不包括iRNA组合物，但在一些实例中其可能包括)分离。脂质体可用于转运和递送活性成分至作用位点。由于脂质体膜在结构上类似生物膜，因此当应用脂质体至组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体合并且细胞过程进行，包括iRNA的内部水性内容物被递送至细胞中，在该细胞中 iRNA可以特异性结合靶标RNA，并且可以介导iRNA。在一些情况下，脂质体还特异性靶向例如以引导iRNA至特定细胞类型。
包含iRNA剂的脂质体可以通过各种方法制备。在一个实例中，脂质体的脂质成分溶解于洗涤剂中以便与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质轭合物。洗涤剂可以具有高的临界胶束浓度，且可以为非离子的。示例性洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡萄糖苷、去氧胆酸盐、和月桂酰肌氨酸。然后添加iRNA剂制剂至包括脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与iRNA剂相互作用，并且在iRNA剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，除去洗涤剂(例如，通过透析)以产生iRNA剂的脂质体制剂。
如果必要，可以在缩合反应期间添加(例如，通过控制添加法)辅助缩合的载体化合物。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。也可以调节pH以利于缩合。
引入多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒介物的结构组分来生产稳定的多核苷酸递送媒介物的方法进一步描述于例如WO 96/37194中，其完整内容通过引用结合在此。脂质体配制品也可以包括以下文献中描述的示例性方法的一个或多个方面：Felgner,P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]8:7413-7417,1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678； Bangham等人，M.Mol.Biol.[分子生物学杂志]23:238,1965；Olson等人， Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]557:9,1979；Szoka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院刊]75:4194,1978；Mayhew等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]775:169,1984；Kim等人，Biochim. Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]728:339,1983；以及Fukunaga等人， Endocrinol.[内分泌学]115:757,1984。用于制备适当大小的脂质凝集物作为递送媒介物的常用技术包括超声波处理和冻融加挤压(参见例如，Mayer等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]858:161,1986)。当需要一致小的(50至200nm)且相当均一的凝集物时，可以使用微流体化(Mayhew等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报]775:169, 1984)。很容易改编这些方法来包装iRNA剂制剂到脂质体中。
脂质体落入两个大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子反应以形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合，并在核内体中内化。由于核内体中的酸性pH，脂质体会破裂，从而释放其内容物到细胞质中(Wang等人Biochem.Biophys.Res. Commun.[生物化学与生物物理研究通讯]，1987,147,980-985)。
对pH-敏感或带负电荷的脂质体截留核酸，而不是与其复合。由于核酸和脂质都带类似电荷，因此会发生排斥而不是形成复合物。尽管如此，一些核酸被截留在这些脂质体的水性内部。已经使用对pH敏感的脂质体来将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养物中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源性基因的表达(Zhou等人Journal of Controlled Release[控制释放杂志]，1992, 19,269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包括除了天然衍生的磷脂酰胆碱以外的磷脂。中性脂质体组合物可以例如，从二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常是从二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子基因融合性脂质体主要从二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物是从磷脂酰胆碱(PC)形成，如，例如，大豆PC和蛋PC。另一种类型是从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入细胞中的其他方法的实例包括美国专利号 5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner，J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269:2550,1994；Nabel； Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院刊]90:11307,1993；Nabel,Human Gene Ther.[人类基因疗法]3:649,1992；Gershon，Biochem.[生物化学]32:7143, 1993；以及Strauss EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]11:417,1992。
也曾检测非离子脂质体系统来确定其在递送药物至皮肤方面的用途，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体配制品来递送环孢菌素-A 至小鼠皮肤的真皮中。结果显示，此类非离子脂质体系统在促进环孢菌素-A 沉积在皮肤的不同层内方面有效(Hu等人，S.T.P.Pharma.Sci.[制药学科学、技术与实践]，1994,4(6)466)。
脂质体也包括本文所使用的名词“空间上稳定的”脂质体，其是指包含一种或多种特异性脂质的脂质体，当该特异性脂质掺入脂质体中时，导致相对于缺乏此类特异性脂质的脂质体增强的循环寿命。空间上稳定的脂质体的实例是如下那些，其中脂质体的囊泡形成脂质部分的部分(A)包含一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)衍生有一种或多种亲水性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但是本领域认为，至少针对包含神经节苷脂、鞘磷脂或PEG-衍生的脂质的空间上稳定的脂质体，这些空间上稳定的脂质体的增强的循环半衰期来源于网状内皮组织系统(RES)的细胞中的摄取减少(Allen等人，FEBS Letters[欧洲生物化学学会联盟通讯]，1987,223,42；Wu等人Cancer Research[癌症研究]， 1993,53,3765)。
本领域已知包含一种或多种糖脂的各种脂质体。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年刊]，1987,507,64)报告了单唾液酸神经节苷脂GM1、半乳糖脑苷脂硫酸酯和磷脂酰肌醇改善脂质体的血液半衰期的能力。Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国科学院院刊]，1988,85, 6949)已经阐述了这些发现。均授予Allen等人的美国专利号4,837,028和 WO 88/04924披露了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利号5,543,152(Webb等人)披露了包含鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等人)披露了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体的优点在于能够与细胞膜融合。非阳离子脂质体虽然不能如质膜一样有效融合，但可以在体内被巨噬细胞吸收，并且可以用于递送iRNA剂至巨噬细胞。
脂质体的进一步的优点包括：获得自天然磷脂的脂质体是生物可兼容和生物可降解的；脂质体可以并入许多种水可溶性与脂质可溶性药物中；脂质体可以保护包封在其内部隔室内的iRNA剂免于被代谢和降解(Rosoff，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，第1卷，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要考虑是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
带正电荷的合成阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，其与核酸自发地相互作用以形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷脂质融合，从而导致RNAi剂的递送(关于DOTMA及其与DNA的使用的描述，参见例如，Felgner,P.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA[美国科学院院刊] 8:7413-7417,1987以及美国专利号4,897,355)。
DOTMA类似物，1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用以形成DNA-复合的囊泡。LipofectinTM(贝塞斯达研究实验室，盖瑟斯堡，马里兰州(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg, Md.))是递送高阴离子核酸进入活组织培养细胞中的有效试剂，该活组织培养细胞包含带正电荷的DOTMA脂质体，该DOTMA脂质体与带负电荷的多核苷酸自发地相互作用以形成复合物。当使用带足够正电荷的脂质体时，在所得复合物上的净电荷也带正电荷。以此方式制备的带正电荷的复合物自发地附接至带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并且有效地递送功能性核酸至例如组织培养细胞中。另一种可商购的阳离子脂质，1,2-双(油酰氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(宝灵曼公司，印第安纳波利斯，印第安纳州 (Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana))不同于DOTMA，因为油酰部分是通过酯而非醚键连接。
其他报告了阳离子脂质化合物包括已轭合至包括例如羧基精胺的各种部分的那些，该羧基精胺已轭合至两种脂质类型中的一种并且包括化合物例如 5-羧基精氨基甘氨酸二辛酰油酰酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM，普洛麦格公司，麦迪逊，威斯康星州(Promega,Madison,Wisconsin))和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精氨基-酰胺(“DPPES”)(参见例如，美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质轭合物包括衍生有胆固醇的脂质(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合配制到脂质体中(参见Gao,X.和Huang,L.,Biochim. Biophys.Res.Commun.[生物化学和生物物理学研究通讯]，179:280,1991)。已报告通过将聚赖氨酸与DOPE轭合制成的脂聚赖氨酸可以在血清的存在下有效转染(Zhou,X.等人，Biochim.Biophys.Acta[生物化学生物物理学报] 1065:8,1991)。对于某些细胞系中，这些包含经轭合的阳离子脂质的脂质体据说比包含DOTMA的组合物展现更低的毒性并提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维卡公司，拉荷亚，加利福尼亚州(Vical,La Jolla,California))和Lipofectamine(DOSPA)(生命科技公司，盖瑟斯堡，马里兰州(LifeTechnology,Inc.,Gaithersburg, Maryland))。其他适合于递送寡核苷酸的阳离子脂质描述于WO 98/39359 和WO 96/37194中。
脂质体配制品特别适合于局部给予，脂质体比其他配制品具有数个优点。这些优点包括降低与所给予药物的全身性高度吸收有关的副作用、增加所给予药物在所希望的靶标处的累积、和给予iRNA剂至皮肤中的能力。在一些实施中，使用脂质体传递iRNA剂至表皮细胞，并且也增强iRNA剂渗透到皮肤组织中(例如，皮肤中)。例如，脂质体可以局部应用。将配制为脂质体的药物局部递送至皮肤已有文献描述(参见例如，Weiner等人，Journal ofDrug Targeting[药物靶向杂志]1992，第2卷，405-410；以及du Plessis等人，AntiviralResearch[抗病毒研究]，18,1992,259-265；Mannino,R.J.和 Fould-Fogerite,S.，Biotechniques[生物技术]6:682-690,1988；Itani,T.等人， Gene[基因]56:267-276.1987；Nicolau,C.等人，Meth.Enz.[酶学方法] 149:157-176,1987；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.Meth.Enz.[酶学方法]101:512-527,1983；Wang,C.Y.和Huang,L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]84:7851-7855,1987)。
也曾检测非离子脂质体系统来确定其在递送药物至皮肤方面的用途，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/ 胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子脂质体配制品来递送药物至小鼠皮肤的真皮。此类用iRNA剂的配制品可用于治疗皮肤障碍。
包括iRNA剂的脂质体可以被制成高度可变形的。这样的可变形性可以使得脂质体能够渗透穿过比脂质体平均半径更小的孔。例如，传递体 (transfersome)是可变形的脂质体的一种类型。可以通过添加表面边界活化剂(通常表面活性剂)至标准脂质体组合物中来制备传递体。包括iRNA剂的传递体可以例如，经皮下注射递送，以递送iRNA剂至皮肤中的角质细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必需在合适的透皮梯度下穿过一系列细孔，每个孔的直径均小于50nm。此外，基于脂质的性质，这些传递体可以自身最优化(适应例如皮肤中的孔形状)、自身修复，并且经常可以到达其靶标而不需要碎裂，且经常自身装载。
适用于本发明的其他配制品描述于PCT公开号WO 2008/042973，其完整内容特此通过引用结合在此。
传递体是另一种类型的脂质体，并且是可高度变形的脂质凝集体，其是药物递送媒介物的有吸引力的候选物。传递体可以被描述为脂质液滴，其可高度变形以致于能够容易渗透穿过小于液滴的孔。传递体可适应于使用它们的环境，例如，其可自身最优化(适应皮肤中的孔形状)、自身修复，经常到达其靶标而不需要碎裂，且经常自身装载。为了制备传递体，可以添加表面边界活化剂(通常表面活性剂)至标准脂质体组合物。传递体已经用于递送血清白蛋白至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已显示与皮下注射包含血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂可广泛应用于例如乳液(包括微乳液)和脂质体等配制品。对许多不同类型的表面活性剂(包括天然和合成的)的性质分类和分级的最常用的方式是通过使用亲水性/疏水性平衡(HLB)。亲水性基团(也称为“头部”)的性质为配制品中使用的不同表面活性剂的分类提供最有用的方式(Rieger，在“Pharmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，马塞尔-德克尔公司，纽约，纽约州(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.)，1988,p. 285)。
如果表面活性剂分子是非离子化，则其被归类于非离子表面活性剂。非离子表面活性剂广泛应用于药物和美容产品，且适用于大范围的pH值。通常，其HLB值范围为2至约18，取决于其结构。非离子表面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、山梨聚糖酯、蔗糖酯、和乙氧基化酯。此类表面活性剂也包括非离子链烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别的最常用的成员。
如果表面活性剂分子当溶解或分散于水中时携带负电荷，则该表面活性剂归类为阴离子。阴离子表面活性剂包括羧酸盐类，例如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸的酯(例如硫酸烷基酯和乙氧基化硫酸烷基酯)、磺酸酯(例如苯磺酸烷基酯、羟乙基磺酸酰基酯、牛磺酸酰基酯和磺基琥珀酸酯)、和磷酸酯。阴离子表面活性剂的最重要成员是硫酸烷基酯和皂类。
如果表面活性剂分子当溶解或分散于水中时携带正电荷，则该表面活性剂归类为阳离子。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类阳离子表面活性剂的最常用成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则该表面活性剂归类于两亲性。两亲性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、经取代的烷基酰胺、 N-烷基甜菜碱和磷脂。
表面活性剂在药物产品、配制品和在乳液中的用途已有综述(Rieger，在“Pharmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，马塞尔-德克尔公司，纽约，纽约州(MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.)，1988,p.285)。
本发明的方法中使用的iRNA剂也可以作为胶束配制品提供。本文中“胶束”被定义为一种特别的分子组装类型，其中两亲性分子被排列在球形结构中，这样使得分子的所有疏水性部分均向内，使亲水性部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则其排列相反。
适合于通过透皮膜递送的混合胶束配制品可以通过混合siRNA组合物的水性溶液、C8至C22烷基硫酸碱金属盐和胶束形成化合物来制备。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊萃取物、小黄瓜萃取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆烷基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成性化合物可能与添加烷基硫酸碱金属盐时同时或之后添加。基本上任何种类的成分混合法均可形成混合胶束，但需要充分混合以便提供较小的胶束。
在一种方法中，制备包含siRNA组合物和至少一种烷基硫酸碱金属盐的第一胶束组合物。该第一胶束组合物然后与至少三种胶束形成化合物形成混合的胶束组合物。在另一种方法中，胶束组合物是通过混合siRNA组合物、烷基硫酸碱金属盐和至少一种胶束形成性化合物，然后在充分混合下添加剩余的胶束形成化合物来制备。
可能添加苯酚和/或间甲酚至混合胶束组合物中，以便稳定配制品并保护防止细菌生长。可替代地，苯酚和/或间甲酚可以与胶束形成成分一起添加。也可以在混合胶束组合物形成后添加等渗剂，例如甘油。
对于作为喷雾剂递送胶束配制品，可以将配制品放入气溶胶分配器中，并且在该分配器中填充推进剂。分配器中的推进剂在加压下呈液态。调整成分比例，以致于水相和推进剂相合而为一，即只有一个相。如果出现两个相，必需先摇动分配器，然后再例如，通过计量阀分配一部分内容物。将从计量阀呈细雾推送出分配剂量的药物试剂。
推进剂可以包括含氢的氯氟化碳、含氢的氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
必要成分的具体浓度可以通过相当直接的实验确定。对于通过口腔吸收，经常需要增加(例如，至少两倍或三倍)通过注射或经过胃肠道给予的剂量。
B.脂质粒子
本发明的iRNA(例如，dsRNA)可以完全包封在脂质配制品(例如， LNP或其他核酸-脂质粒子)中。
本文所使用的术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质粒子。LNP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质、和防止粒子(例如，PEG-脂质轭合物)凝集的脂质。LNP极其适用于全身性应用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后展示延长的循环寿命，并在远端部位(例如，给予部位分离的身体部位)累积。LNP 包括“pSPLP”，其包括包封的缩合剂-核酸复合物，如在PCT公开号WO00/03683中所述。本发明的粒子典型地具有平均直径约50nm至约150nm、更典型地约60nm至约130nm、更典型地约70nm至约110nm、最典型地约 70nm至约90nm，且基本上无毒。此外，核酸当存在于本发明的核酸-脂质粒子中时，在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质粒子及其制备的方法披露于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410； 6,815,432；美国公开号2010/0324120和PCT公开号WO 96/40964中。
在一个实施例中，脂质与药物比率(质量/质量比)(例如，脂质与 dsRNA比率)将在从约1:1至约50:1、从约1:1至约25:1、从约3:1至约15:1、从约4:1至约10:1、从约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1的范围内。上述范围之间的范围也考虑为本发明的一部分。
阳离子脂质可以是例如，N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵 (DODAC)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯基氧基)丙基)- N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺 (DODMA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基 -3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、 1,2-二亚油酰-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亚油酰-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin- 2-DMAP)、1,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin- TMA.Cl)、1,2-二亚油酰-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2- 二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷(DLin-MPZ)、或3-(N,N-二亚油基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、 1,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、l,2- 二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N- 二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯- 5-胺(ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基氮烷二基)二十二烷-2-醇(Tech G1)、或其混合物。阳离子脂质可以包含粒子中存在的总脂质的约20mol％至约50 mol％或约40mol％。
在另一个实施例中，可以使用化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基- [1,3]-二氧杂环戊烷来制备脂质-siRNA纳米粒子。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷的合成描述于在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，其通过引用结合在此。
在一个实施例中，脂质-siRNA粒子包括40％2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷:10％DSPC:40％胆固醇:10％PEG-C-DOMG(摩尔百分比)，粒度为63.0±20nm，且siRNA/脂质比率为0.027。
可离子化/非阳离子脂质可以是阴离子脂质或中性脂质，包括但不限于，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油 (DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱 (POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N- 马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺 (DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇、或其混合物。如果包含胆固醇，非阳离子脂质可以是粒子中存在的总脂质的约5mol％至约90mol％、约10 mol％、或约58mol％。
抑制粒子凝集的轭合脂质可以是例如，聚乙二醇(PEG)-脂质，包括但不限于，PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷基氧基丙基(DAA)、PEG- 磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、或其混合物。PEG-DAA轭合物可以是例如， PEG-二月桂酰氧基丙基(Ci2)、PEG-二肉豆蔻基氧基丙基(Ci4)、PEG-二棕榈基氧基丙基(Ci6)、或PEG-二硬脂酰氧基丙基(Ci8)。防止粒子凝集的轭合脂质可以是粒子中存在的总脂质的0mol％至约20mol％或约2 mol％。
在一些实施例中，核酸-脂质粒子进一步包括例如，占粒子中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％的胆固醇。
在一个实施例中，可以使用类脂质ND98 4HCl(MW 1487)(参见2008 年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，其通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、和PEG-神经酰胺C16 (Avanti Polar Lipids公司)来制备脂质-dsRNA纳米粒子(即LNP01粒子)。每一种在乙醇中的储备溶液可以如下制备：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml；PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后，可以按例如42:48: 10的摩尔比组合ND98、胆固醇、和PEG-神经酰胺C16储备溶液。组合的脂质溶液可以与水性dsRNA(例如，在乙酸钠中，pH 5)混合，这样使得最终乙醇浓度为约35％-45％，且最终乙酸钠浓度为约100-300mM。通常在混合时自发地形成脂质-dsRNA纳米粒子。取决于所希望的粒度分布，所得的纳米粒子混合物可以使用例如热桶挤压器例如Lipex Extruder(北部的脂质公司 (NorthernLipids,Inc))通过聚碳酸酯膜(例如，截止值100nm)挤压。在一些情况下，可以省略挤压步骤。可以通过例如透析或正切流动过滤来实现去除乙醇并同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如在约pH 7、例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3、或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水 (PBS)交换。
式1
LNP01配制品描述于，例如，国际申请公开号WO 2008/042973中，其通过引用特此结合。
另外的示例性脂质-dsRNA配制品描述于表1中。
表A
DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG或PEG-C14)(PEG平均分子量为2000)
PEG-DSG：PEG-联苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(PEG平均分子量为2000)
PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰-1,2-二肉豆蔻基氧基丙胺(PEG平均分子量为2000)
包含SNALP(l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)) 的配制品描述于国际公开号WO 2009/127060(于2009年4月15日提交)，其通过引用特此结合。
包含XTC的配制品描述于PCT公开号WO 2010/088537中，其完整内容通过引用结合在此。
包含MC3的配制品描述于例如，于2010年6月10日提交的美国公开号 2010/0324120，其完整内容通过引用结合在此。
包含ALNY-100的配制品描述于PCT公开号WO 2010/054406，其完整内容特此通过引用结合在此。
包含C12-200的配制品描述于PCT公开号WO 2010/129709，其完整内容特此通过引用结合在此。
用于口服给予的组合物和配制品包括粉剂或颗粒剂、微粒、纳米粒、在水性或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、药囊、片剂或迷你片剂。可能需要增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂。在一些实施例中，口服配制品是其中在本发明起重要作用的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂组合给予的那些。合适的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、去氧胆酸、葡胆酸 (glucholic acid)、甘胆酸(glycholic acid)、甘去氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠和糖二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或甘油一酸酯、甘油二酸酯或其药学上可接受的盐(例如，钠盐)。在一些实施例中，可以使用渗透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。一种示例性组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。进一步的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。在本发明中起重要作用的dsRNA可以按包括喷雾干燥的粒子、或复合以形成微粒或纳米粒的颗粒形式口服递送。DsRNA复合剂包括聚-氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧杂环丁烷(polyoxethanes)、聚烷基氰基丙烯酸酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚烷基氰基丙烯酸酯；DEAE-衍生的聚亚胺、短梗霉多糖(pollulan)、纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸盐、和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备详细描述于美国专利 6,887,906、美国公开号20030027780和美国专利号6,747,014，其每一个通过引用结合在此。
用于肠胃外、(脑中)实质内、鞘内、心室内或肝内给予的组合物和配制品可以包括无菌水性溶液，其中也可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，例如但不限于，渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的药物组合物包括但不限于，溶液、乳液和包含脂质体的配制品。这些组合物可以从各种组分产生，包括但不限于，预成型的液体、自身乳化的固体和自身乳化的半固体。当治疗肝障碍(例如肝癌)时，特别优选的是靶向肝脏的配制品。
可以方便地按单位剂型提供的本发明的药物配制品可以根据制药工业中熟知的常规技术来制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药物载体或赋形剂组合的步骤。通常配制品通过以下步骤制备：均匀地并密切地将活性成分与液体载体或细粉碎的固体载体或与这两者混合，然后如果需要的话，使得到的产物成形。
本发明的组合物可以配制成许多可能剂型中的任一种，例如但不限于，片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶囊、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
C.另外的配制品
i.乳液
本发明的组合物可以制备并配制成乳液。乳液使一种液体分散在另一种液体中呈直径通常超过0.1μm的液滴的形式的典型不均匀系统(参见例如，“Ansel’s Dosage Formsand Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams& Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第199页；Rosoff，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]， Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York, N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第245页；Block，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第2卷，第335页；Higuchi等人，在“Remington’s ParmaceuticalSciences”[雷明顿氏药物科学]，Mack Publishing Co.,Easton,Pa. [麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州]，1985，第301页)。乳液通常是双相系统，其包含两个彼此密切混合和分散的不可混溶的液相。通常，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)种类。当水相被均匀地分成微小液滴并且作为微小液滴分散在大体积的油相中时，所得的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相被均匀地分成微小液滴并且作为微小液滴分散在大体积的水相中时，所得的组合物被称为水包油(o/w)乳液。乳液可以包含除了分散相以外的其他组分以及活性药物，该活性药物可以呈溶液存在于水相、油相中或其本身呈单独的相。需要时，在乳液中也可以存在药物赋形剂，例如乳化剂、稳定剂、染料、和抗氧化剂。药物乳液也可以是由超过两个相构成的多相乳液，如，例如，在油包水包油(o/w/o)和水包油包水 (w/o/w)乳液的情况下。此类复合配制品经常提供简单的二元乳液没有的某些优点。其中o/w乳液的个别油滴装入小水滴的多相乳液构成w/o/w乳液。同样地，油滴被装入在油连续相中稳定化的水球中的系统提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于很低或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散相或不连续相均匀分布在外部相或连续相中，并且通过乳化剂的方式或配制品的粘度维持在这种形式。乳液的任一相可以是半固体或固体，如乳液型油膏基质和乳霜的情况。稳定化的乳液的其他方式需要使用可以掺入乳液的任一相中的乳化剂。乳化剂在广义上可以分为四类；合成的表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质、和均匀分散的固体(参见例如，“Ansel’s DosageForms and Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、PopovichNG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]， Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York, N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第199页)。
合成的表面活性剂(也已知为表面活性剂)已发现广泛用于乳液的配制品中，且已综述于文献中(参见例如，“Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和 Ansel HC.，2004，LippincottWilliams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Rieger，在“Parmaceutical DosageForms”[药物剂型]，Lieberman、 Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第285页；Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，1988，第 1卷，第199页)。表面活性剂通常为两亲性，并且包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性性质的比率被称为亲水物/亲脂物平衡 (HLB)，并且是在制备配制品中用于分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水性基团的性质被分成不同类型：非离子、阴离子、阳离子、和两亲性(参见例如，“Ansel’s Dosage Forms and DrugDelivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和 AnselHC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Rieger，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、 Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第285页)。
用于乳液配制品的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性性质，这样使得它们可以吸收水以形成w/o 乳液，但仍保留其半固体稠度，例如无水羊毛脂和亲水性凡士林油。尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中，精细分裂的固体也已用作良好的乳化剂。这些包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物、非膨胀性粘土，例如膨润土、硅镁土、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱土、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝、色素、和非极性固体，例如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液配制品中也可包括各种各样的非乳化材料，并且它们促成乳液性质。这些物质包括脂肪、油类、蜡类、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保湿剂、亲水性胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，在“Parmaceutical Dosage Forms” [药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker, Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第335 页；Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第199页)。
亲水性胶体或水胶体包括天然存在的胶质和合成的聚合物例如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜尔豆胶、卡拉亚胶和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)、以及合成的聚合物(例如，卡波姆(carbomer)、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或膨胀以形成胶体溶液，这些胶体溶液通过在分散相的液滴周围形成强的介面膜并通过增加外部相的粘度来稳定乳液。
由于乳液经常包含许多可以容易地支持微生物生长的成分例如碳水化合物、蛋白质、固醇和磷脂，因此这些配制品经常掺入防腐剂。包括在乳液配制品中的常用防腐剂包括对羟基苯甲酸甲基酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、氯化苯甲烃铵、对羟基苯甲酸的酯类、和硼酸。也经常添加抗氧化剂至乳液配制品中，以防止配制品变质。所使用的抗氧化剂可以是游离基清除剂，例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、或还原剂(例如抗坏血酸和偏亚硫酸氢钠)、以及抗氧化增效剂(例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂)。
乳液配制品经由皮肤、口腔、和肠胃外途径的用途及其制造的方法已综述于文献中(参见例如，“Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems” [安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和Ansel HC.， 2004，Lippincott Williams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州； Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和 Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第199页)。用于口服递送的乳液配制品由于配制容易、以及吸收功效和生物利用度观点已被广泛使用(参见例如，“Ansel’s Dosage Formsand Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams& Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Rosoff，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第 1卷，第245页；Idson，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]， Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York, N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第199页)。以矿物油为基质的缓泻剂、油溶性维生素和高脂肪营养制剂是常用于按o/w乳液口服给予的材料。
ii.微乳液
在本发明的一个实施例中，iRNA和核酸的组合物被配制成微乳液。微乳液可以被定义为水、油与两亲物的系统，该系统是单一的光学各向同性和热力学上稳定的液体溶液(参见例如，“Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和 Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Rosoff，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第245页)。典型微乳液是首先通过使油分散在水性表面活性剂溶液中、然后添加足够量的第四组分(通常中链长度的醇)以形成透明系统所制备的系统。因此，微乳液也称为两种不混溶液体的动力学上稳定的各向同性透明分散液，其是通过表面活性分子的界面膜稳定化(Leung和Shah，在“Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate System”[药物的控制释放：聚合物和聚集系统]，Rosoff,M，编辑，1989，VCH出版社，纽约，第185-215页)。微乳液通常是经由3至5 种组分组合制备，该组分包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质。微乳液是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的性质和取决于表面活性剂分子的极性头部和碳水化合物尾部的结构和几何堆叠(Schott，在“Remington’s Parmaceutical Sciences”[雷明顿氏药物科学]，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.[麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州]，1985，第271页)。
利用相图的现象学方法已有广泛研究并且已为本领域技术人员产生如何配制微乳液的全面的知识(参见例如，“Ansel’s Dosage Forms and Drug Delivery Systems”[安塞尔继续和药物递送系统]，Allen,LV.、Popovich NG.和 Ansel HC.，2004，LippincottWilliams&Wilkins出版社(第8版)，纽约，纽约州；Rosoff，在“Parmaceutical DosageForms”[药物剂型]，Lieberman、 Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第1卷，第245页；Block，在“Parmaceutical Dosage Forms”[药物剂型]，Lieberman、Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.[马塞尔·德克尔公司，纽约，纽约州]，第 1卷，第335页)。与常规乳液相比，微乳液提供了在自发地形成的热力学上稳定的液滴的配制品中溶解水不溶性药物的优点。
在微乳液制备中使用的表面活性剂包括但不限于，单独的或与助表面活性剂组合的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯 (MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。助表面活性剂通常为短链醇，例如乙醇、1-丙醇、和1-丁醇，其通过渗透至表面活性剂膜中并且因为在表面活性剂分子之间产生的空隙而因此产生无序膜来增加界面流动性。然而不需要使用助表面活性剂也可以制备微乳液，并且本领域已知不含醇的自身乳化的微乳液系统。水相典型地可以是但不限于，水、药物的水性溶液、甘油、 PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于以下材料，例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)一酸甘油酯、二酸甘油酯、和三酸甘油酯、聚氧乙基化甘油基脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。
从药物溶解度和增强的药物吸收的观点来看，微乳液是特别感兴趣的。已提出基于脂质的微乳液(o/w和w/o两者)用于增强药物(包括肽)的口服生物利用度(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802； 7,157,099；Constantinides等人，Pharmaceutical Research[药物研究]，1994， 11，1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.[实验和临床药理学的方法和发现]，1993,13,205)。微乳液提供了以下优点：改善的药物溶解度、保护药物免于酶水解、可能基于表面活性剂诱导的膜流动性和通透性改变而增强的药物吸收、容易制备、比固体剂型容易口服给予、改善的临床效力、和降低的毒性(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860； 7,070,802；7,157,099；Constantinides等人，Pharmaceutical Research[药物研究]，1994,11,1385；Ho等人，J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]，1996,85,138- 143)。当在环境温度下将微乳液组分放在一起时，经常可自发第形成微乳液。当配制热不稳定的药物、肽、或iRNA时，这可能特别有利。微乳液也已经在化妆品和药物应用中透皮递送活性组分方面有效。预期本发明的微乳液组合物和配制品将促进增加从胃肠道系统吸收iRNA和核酸，并且改善 iRNA和核酸的局部细胞吸收。
本发明的微乳液也可以包含另外的组分和添加剂(例如山梨聚糖单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和渗透增强剂)以改善配制品性质和增强本发明的 iRNA和核酸的吸收。本发明的微乳液中使用的渗透增强剂可以被分类为属于 5大类之一：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂 (Lee等人“Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)。这些类别中的每一种已在上文中进行讨论。
iii.微粒子
本发明的iRNA剂可以掺入粒子(例如，微粒子)中。微粒子可以通过喷雾干燥产生，但是也可以通过其他方法产生，包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥、或这些技术的组合。
iv.渗透增强剂
在一个实施例中，本发明使用各种渗透增强剂来实现核酸(尤其是 iRNA)有效递送至动物皮肤。大多数药物以离子化和非离子化形式存在于溶液中。然而，通常只有脂质可溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已发现，如果将要穿过的膜用渗透增强剂处理，即使非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了协助非亲脂性药物扩散穿过细胞膜，渗透增强剂也增强亲脂性药物的渗透性。
渗透增强剂可以被分类为属于5大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、和非螯合的非表面活性剂(参见例如，Malmsten,M. “Surfactants and polymers indrug delivery”[药物递送中的表面活性剂和聚合物],Informa Health Care,New York,NY[Informa医疗公司，纽约，纽约州]， 2002；Lee等人，“Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)。上述各类渗透增强剂将在下文中更详细地进行描述。
表面活性剂(“surfactant”或“surface-active agent”)是当溶解于水性溶液中时降低溶液的表面张力或在水性溶液与另一种液体之间的界面张力，结果增强了iRNA通过黏膜的吸收的化学实体。除了胆汁盐和脂肪酸外，这些渗透增强剂包括例如，月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯- 20-鲸蜡基醚(参见例如，Malmsten,M.“Surfactants and polymers in drug delivery”[药物递送中的表面活性剂和聚合物]，Informa Health Care,New York,NY[Informa医疗公司，纽约，纽约州]，2002；Lee等人，“Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)；以及全氟化学乳液，例如FC-43。Takahashi等人，J.Pharm.Pharmacol.[药学与药理学杂志]，1988，40，252)。
充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)、和其单酸甘油酯和二酸甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，Touitou,E.等人， Enhancement in Drug Delivery[药物递送的增强]，CRC Press,Danvers,MA [CRC出版社，丹弗斯，马萨诸塞州]，2006；Lee等人，“Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第 92页；Muranishi,“Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1990，7，1-33；El Hariri等人，J.Pharm. Pharmacol.[药学与药理学杂志]，1992，44，651-654)。
胆汁的生理性角色包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如，Malmsten,M.，“Surfactants and polymers in drug delivery”[药物递送中的表面活性剂和聚合物]，Informa Health Care,New York,NY[Informa医疗公司，纽约，纽约州]，2002；Brunton，在“Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics”[Goodman和Gilman的治疗的药理学基础]，第9版，第38章，Hardman等人编辑，McGraw-Hill,New York[麦格劳希尔集团，纽约]，1996，第934-935页)。各种天然的胆汁盐及其合成衍生物充当渗透增强剂。因此术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分以及其任何合成衍生物。合适的胆汁盐包括例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐、胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、去氧胆酸(去氧胆酸钠)、葡胆酸(葡胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、糖去氧胆酸(糖去氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺去氧胆酸(牛磺去氧胆酸钠)、鹅去氧胆酸(鹅去氧胆酸钠)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠(STDHF)、糖二氢梭链孢酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如，Malmsten,M.，“Surfactants and polymers indrug delivery”[药物递送中的表面活性剂和聚合物]，Informa Health Care,New York,NY[Informa医疗公司，纽约，纽约州]，2002；Lee等人，“Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)； Swinyard，在：“Remington’s Parmaceutical Sciences”[雷明顿氏药物科学]，第18版，第39章，Gennaro编辑，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.[麦克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州]，1990，第782-783页；Muranishi,“Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1990，7，1-33；Yamamoto等人，J.Pharm.Exp.Ther.[药理学与实验治疗学杂志]，1992，263，25；Yamashita等人，J.Pharm.Sci.[药物科学杂志]， 1990,79,579-583)。
结合本发明使用的螯合剂可以被定义为通过与其形成复合物而从溶液中去除金属离子，结果增强了iRNA通过黏膜的吸收的化合物。关于螯合剂在本发明中作为渗透增强剂的用途，螯其附加优点在于也可充当脱氧核糖核酸酶抑制剂，因为大多数已表征的DNA核酸酶都需要二价金属离子用于催化作用，因此被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.[色谱法]，1993，618，315- 339)。合适的螯合剂包括但不限于，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香兰酸盐 (homovanilate))、胶原蛋白的N-酰基衍生物、聚乙二醇单十二醚-9和β- 二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如，Katdare,A.等人，“Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,anddrug delivery”[药物、生物技术和药物递送的赋形剂开发]，CRC出版社，丹弗斯，马萨诸塞州，2006； Lee等人，“Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)；Muranishi,“Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1990， 7，1-33；Buur等人，J.Control Rel.[控制释放杂志]，1990，14，43-51)。
本文所使用的非螯合的非表面活性剂渗透增强化合物可以被定义为已证实没有显著螯合剂或表面活性剂活性，但尽管如此仍增强iRNA通过消化道黏膜吸收的化合物(参见例如，Muranishi,“Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1990，7，1-33)。此类渗透增强剂包括例如，不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物 (Lee等人，“Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems”[治疗药物载体系统的关键评论]，1991，第92页)；和非甾体消炎药例如双氯芬酸钠、吲哚美辛(indomethacin)和苯基丁氮酮(Yamashita等人，J.Pharm.Pharmacol.[药学与药理学杂志]，1987，39，621-626)。
在细胞水平增强iRNA吸收的试剂也可以添加至本发明的药物及其他组合物中。也已知例如阳离子脂质(例如lipofectin(Junichi等人，美国专利号 5,705,188))、阳离子甘油衍生物、和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸(Lollo 等人，PCT申请WO 97/30731)用来增强dsRNA的细胞吸收。可商购的转染试剂的实例尤其包括，例如LipofectamineTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、Lipofectamine 2000TM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectinTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、CellfectinTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、DMRIE-CTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、FreeStyleTM MAX(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM 2000CD(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、LipofectamineTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、iRNAMAX(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OligofectamineTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、OptifectTM(英杰公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、X-tremeGENE Q2Transfection Reagent(罗氏公司 (Roche)；格兰扎克尔街(Grenzacherstrasse)，瑞士)、DOTAP Liposomal 转染试剂(格兰扎克尔街(Grenzacherstrasse)，瑞士)、DOSPER Liposomal 转染试剂(格兰扎克尔街(Grenzacherstrasse)，瑞士)、或Fugene(格兰扎克尔街(Grenzacherstrasse)，瑞士)、试剂(普洛麦格公司 (Promega)；麦迪逊，威斯康辛州)、TransFastTM转染试剂(普洛麦格公司 (Promega)；麦迪逊，威斯康辛州)、TfxTM-20试剂(普洛麦格公司(Promega)；麦迪逊，威斯康辛州)、TfxTM-50试剂(普洛麦格公司 (Promega)；麦迪逊，威斯康辛州)、DreamFectTM(OZ生物科学公司；马赛，法国)、EcoTransfect(OZ生物科学公司；马赛，法国)、TransPassa D1 转染试剂(新英格兰生物学实验室(New England Biolabs)；伊普斯维奇，马萨诸塞州，美国)、LyoVecTM/LipoGenTM(英杰公司(Invitrogen)；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、PerFectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、NeuroPORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、Cytofectin转染试剂(Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、BaculoPORTER转染试剂(Genlantis 公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、TroganPORTERTM转染试剂 (Genlantis公司；圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)、RiboFect(Bioline公司；汤顿，马萨诸塞州，美国)、PlasFect(Bioline公司；汤顿，马萨诸塞州，美国)、UniFECTOR(B桥国际有限公司(B-Bridge International)；山景城，加利福尼亚州，美国)、SureFECTOR(B桥国际有限公司(B-Bridge International)；山景城，加利福尼亚州，美国)、或HiFectTM(B桥国际有限公司(B-Bridge International)；山景城，加利福尼亚州，美国)。
可以使用其他试剂来增强所给予的核酸的渗透，这些试剂包括乙二醇 (例如乙二醇和丙二醇)、吡咯(例如2-吡咯)、氮酮和萜烯(例如柠檬烯和薄荷酮)。
v.载体
本发明的某些组合物也在配制品中掺入载体化合物。本文所使用的“载体化合物”或“载体”可以是指核酸或其类似物，其是惰性的(即本身不具有生物活性)但是通过体内过程被识别为通过例如降解生物活性核酸或促进其从循环中除去来降低该具有生物活性的核酸的生物利用度的核酸。共同给予核酸和载体化合物(后一物质通常为过量)可以导致大幅降低肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量，可能归因于载体化合物与核酸之间竞争共同受体所致。例如，当与聚肌苷酸、葡聚糖硫酸盐、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4′异硫氰基-芪-2,2′-二磺酸共同给予时，可以减少肝组织中部分硫代磷酸酯 dsRNA的回收(Miyao等人，DsRNA Res.Dev.[dsRNA研究与开发]，1995， 5，115-121；Takakura等人，DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.[dsRNA与核酸药物开发]，1996,6,177-183。
vi.赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是用于递送一种或多种核酸至动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药理学惰性媒介物。赋形剂可以是液体或固体，并且按计划的给予方式选择，以便在与核酸和指定的药物组合物中的其他组分组合时提供所希望的体积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于，结合剂(例如，预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟基丙基甲基纤维素等)；填料(例如，乳糖和其他糖类、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅土、胶体二氧化硅、硬脂酸、硬脂酸金属盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉乙醇酸钠等)；和湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
也可以使用适合用于非肠胃外给予且不会与核酸有不利反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂来配制本发明的组合物。合适的药学上可接受的载体包括但不限于，水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部给予核酸的配制品可以包括无菌和非无菌水性溶液、在共同溶剂(例如醇)中的非水性溶液、或核酸在液体或固体油基质中的溶液。溶液也可以包含缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用适合用于非肠胃外给予且不会与核酸有不利反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于，水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本发明的组合物可以另外包含在药物组合物中经常发现的按其在本领域已建立的使用水平的其他辅助组分。因此例如，组合物可以包含另外的可兼容的药物活性材料，如，例如，止痒剂、收敛剂、局部麻醉药或消炎药，或可以包含可用于物理性配制本发明的组合物的各种剂型的另外的材料，例如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然而，此类材料当添加时，不应不当干扰本发明的组合物中组分的生物活性。可以对这些配制品进行灭菌并且必要时与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与配制品的一种或多种核酸发生有害的相互作用。
水性悬浮液可以包含增加该悬浮液的粘度的物质，包括例如，羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液也可以包含稳定剂。
在一些实施例中，在本发明中起重要作用的药物组合物包括(a)一种或多种iRNA化合物和(b)一种或多种通过非iRNA机制发挥功能且可用于治疗溶血障碍的药剂。此类药剂的实例包括但不限于，消炎药、抗脂肪变性剂、抗病毒剂和/或抗纤维化剂。
此外，常用于保护肝脏的其他物质(例如水飞蓟素)也可以与本文描述的iRNA结合使用。可用于治疗肝脏疾病的其他药剂包括替比夫定、恩替卡韦和蛋白酶抑制剂(例如特拉匹韦)和其他披露于例如，Tung等人，美国申请公开号2005/0148548、2004/0167116、和2003/0144217；以及在Hale等人，美国申请公开号2004/0127488中的其他药剂。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过标准药剂程序在细胞培养物或实验性动物中来确定，例如，LD50(对50％的群体具杀伤性的剂量)和ED50 (在50％群体中的治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，且可以表达为LD50/ED50比率。展现高的治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于配制一系列的剂量供人类使用。在本发明中起重要作用的组合物的剂量通常落入包括极低或无毒性的ED50的循环浓度的范围内。可以取决于所采用的剂型、和给予途径，剂量可以在这个范围内变化。对于在本发明中起重要作用的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先从细胞培养测定进行评估。可以在动物模型中配制剂量以达到该化合物或如果适当时使靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度降低)，该范围包括在细胞培养物中确定的IC50 (即测试化合物实现症状的一半最大抑制的浓度)。这样的信息可以用于更精确地确定可用于人类的剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱法。
除了其如上所讨论的给予外，在本发明中起重要作用的iRNA可以与其他已知有效治疗受TTR表达介导的病理过程的药剂组合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或本文描述的标准功效测量所观察到的结果，给药医师可以调整iRNA给予的量和时间。
VII.抑制TTR表达的方法
本发明也提供抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法。这些方法包括使细胞与有效抑制细胞中TTR表达的量的RNAi剂(例如，双链 RNAi剂)接触，从而抑制细胞中TTR的表达。
使细胞与RNAi剂(例如，双链RNAi剂)接触可以在体外或体内进行。在体内使细胞与RNAi剂接触包括使受试者(例如，人类受试者)内的细胞或细胞群与RNAi剂(例如，双链RNAi剂)接触。将在体外和体内接触细胞或细胞群的方法组合也是可能的。如上文所讨论，可以直接或间接接触细胞或细胞群。此外，接触细胞或细胞群可以经由靶向配体(包括本文描述或本领域已知的任何配体)来完成。在优选的实施例中，靶向配体是碳水化合物部分，例如，GalNAc3配体、或可以指导RNAi剂到达感兴趣的位点(例如，受试者的肝脏)的任何其他配体。
本文所使用的术语“抑制”可与“降低”、“沉默”、“下调”、“抑制”和其他类似术语互换使用，且包括任何水平的抑制。优选地抑制包括统计学上显著或临床上显著的抑制。
短语“抑制TTR表达”旨在是指抑制任何TTR基因(如，例如，小鼠 TTR基因、大鼠TTR基因、猴TTR基因、或人类TTR基因)以及TTR基因的变体或突变体的表达。因此，在遗传操作细胞、细胞群或生物体的上下文中，TTR基因可以是野生型TTR基因、突变体TTR基因(例如引起淀粉样蛋白沉积的突变体TTR基因)、或转基因TTR基因。
“抑制TTR基因表达”包括TTR基因的任何水平的抑制，例如，至少部分抑制TTR基因表达。TTR基因表达可以基于与TTR基因表达有关的任何变量(例如，TTR mRNA水平、TTR蛋白质水平、或淀粉样蛋白沉积的量或程度)的水平或水平变化来评价。该水平可以在单个细胞中或在细胞群中 (包括例如，来源于受试者的样品)评价。
抑制可以通过与TTR表达相关的一种或多种变量与对照水平相比的绝对或相对减少水平来评价。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如，给药前的基线水平或从未处理或用对照(如，例如，仅缓冲液的对照或含无活性药剂的对照)处理的类似受试者、细胞或样品所确定的水平。
在本发明的方法的一些实施例中，TTR基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约 35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约 90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或低于测定检测的水平。在一些实施例中，抑制TTR基因表达导致TTR基因的水平的归一化，这样使得在治疗前水平与正常对照水平之间的差异被降低至少30％、35％、 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或 95％。在一些实施例中，该抑制是临床上相关的抑制。
对TTR基因表达的抑制可以表现为由其中TTR基因已转录且其已接受治疗(例如，通过使细胞或细胞群与本发明的RNAi剂接触，或通过向存在该细胞或细胞群的受试者给予本发明的RNAi剂)的第一细胞或细胞群(这些细胞可能存在于例如，来源于受试者的样品中)表达的mRNA的量的下降，这样使得当与基本上与该第一细胞或细胞群相同但未经如此治疗的第二细胞或细胞群(对照细胞(细胞群))相比时，TTR基因表达被抑制。在优选的实施例中，使用下列公式，通过经治疗的细胞中表达的mRNA水平相对于对照细胞中的mRNA水平的百分比来评价抑制：
可替代地，对TTR基因表达的抑制可以通过在功能上与TTR基因表达相关的参数的下降来评价，该参数例如是TTR蛋白质表达、视黄醇结合蛋白水平、维生素A水平、或包含TTR的淀粉样蛋白沉积的存在。可以在任何表达TTR的细胞(组成型或经过基因组工程)中，并且通过本领域已知的任何测定来确定TTR基因沉默。肝脏是TTR表达的主要部位。其他重要的表达部位包括脉络丛、视网膜和胰脏。
对TTR蛋白质表达的抑制可以表现为由细胞或细胞群表达的TTR蛋白质的水平的下降(例如，来源于受试者的样品中表达的蛋白质水平的下降)。如上文中对mRNA抑制的评价的解释，经治疗的细胞或细胞群的蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为相对于对照细胞或细胞群的蛋白质水平的百分比。
可以用于评价TTR基因表达的抑制的对照细胞或细胞群包括未与本发明的RNAi剂接触的细胞或细胞群。例如，对照细胞或细胞群可能来源于用 RNAi剂治疗受试者前的个体受试者(例如，人类或动物受试者)。
由细胞或细胞群表达的TTR mRNA水平或循环的TTR mRNA水平可以使用本领域已知的用于评价mRNA表达的任何方法确定。在一个实施例中，样品中TTR表达的水平是通过检测转录的多核苷酸或其一部分(例如，TTR 基因的mRNA)来确定。可以使用RNA提取技术(包括例如，使用酸苯酚/ 胍异硫氰酸酯提取法(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytix公司，瑞士)从细胞中提取RNA。使用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀分析 (nuclear run-on assay)、RT-PCR、核糖核酸酶保护测定(Melton等人，Nuc. Acids Res.[核酸研究]12:7035)、RNA印迹、原位杂交和微阵列分析。循环的TTR mRNA可以使用PCT/US 2012/043584中描述的方法检测，其完整内容特此通过引用结合在此。
在一个实施例中，使用核酸探针确定TTR表达的水平。本文所使用的术语“探针”是指能够选择性结合特异性TTR的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。探针可以特别设计带有标记。可以用作探针的分子的实例包括但不限于，RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，包括但不限于，DNA或RNA 印迹分析(Southern or Northern analyse)、聚合酶链反应(PCR)分析和探针阵列。用于确定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可以与TTR mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，mRNA被固定在固体表面，并与探针接触，例如，通过使分离的mRNA在琼脂凝胶上运行，使 mRNA从凝胶转移至膜(如硝基纤维素)上。在可替代的实施例中，一种或多种探针被固定在固体表面上，并且使mRNA与一种或多种探针接触，例如，在Affymetrix基因芯片阵列中。技术人员可以很容易地改编已知的 mRNA检测方法来用于确定TTR mRNA的水平。
用于确定样品中TTR表达水平的可替代方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增和/或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(在 Mullis,1987；美国专利号4,683,202中所示的实验实施例)、连接酶链反应 (Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88:189-193)、自我持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.USA[美国科学院院刊]86:1173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi等人 (1988)Bio/Technology[生物技术]6:1197)、滚环式复制(Lizardi等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数目存在时，这些检测程序特别适用于检测这些核酸分子。在本发明的具体方面中，通过定量产荧光RT-PCR(即TaqManTM系统)确定TTR的表达水平。
可使用膜印迹(例如用于杂交分析例如RNA印迹、DNA印迹等)、或显微分析孔、样品试管、凝胶、珠粒或纤维(或包含已结合核酸的任何固体支持物)来监测TTR mRNA的表达水平。参见美国专利号5,770,722、 5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其通过引用结合在此。确定 TTR表达水平也可以包括使用在溶液中的核酸探针。
在优选的实施例中，使用分支的DNA(bDNA)测定或实时PCR (qPCR)评价mRNA表达的水平。这些方法的使用描述和例示于本文所提供的实例中。
可以使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定TTR蛋白质表达的水平。此类方法包括例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法 (HPLC)、薄层层析法(TLC)、高扩散性色谱法、液体或凝胶沉淀反应、吸收光谱学、比色分析法、分光光度检测、流式细胞术、免疫扩散(单相或双向)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。
在一些实施例中，可以通过检测或监测淀粉样蛋白TTR沉积的减少来监测本发明的方法的功效。如本文所使用的，减少淀粉样蛋白TTR沉积包括受试者的器官或区域内TTR沉积的大小、数量或严重度的任何减少，或预防或降低TTR沉积形成，如可以在体外或体内使用本领域已知的任何方法进行评价的。例如，评价淀粉样蛋白沉积的一些方法描述于Gertz,M.A.和Rajukumar, S.V.(编辑)(2010)，Amyloidosis:Diagnosis and Treatment[淀粉样变性：诊断与治疗]，New York:Humana Press[纽约：胡玛纳出版社]。评价淀粉样蛋白沉积的方法可以包括生物化学分析，以及目视或计算机化评价淀粉样蛋白沉积，进行目视使用例如，免疫组织化学染色、荧光标记、光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜、或其他类型的显微镜。可以使用侵入性或非侵入性成像形式(包括例如，CT、PET或NMR/MRI成像)来评价淀粉样蛋白沉积。
本发明的方法可以在身体的任何数量的组织或区域中减少TTR沉积，包括但不限于，心脏、肝脏、脾脏、食道、胃、肠(回肠、十二指肠和结肠)、脑、坐骨神经、背根神经节、肾脏和视网膜。
本文所使用的术语“样品”是指从受试者分离的类似流体、细胞或组织、以及受试者内的流体、细胞或组织的集合。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊髓液、唾液、眼内液等。组织样品可以包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以来源于特定器官、器官的部分、或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可以来源于肝脏(例如，全肝脏或肝脏的某些区段或肝脏中某些细胞类型，如，例如，肝细胞)、视网膜或视网膜的部分(例如，视网膜色素上皮细胞)、中枢神经系统或中枢神经系统的部分(例如，脑室或脉络丛)、或胰脏或胰脏的某些细胞或部分。在优选的实施例中，“来源于受试者的样品”是指从该受试者抽取的血液或从其来源的血浆。在进一步的实施例中，“来源于受试者的样品”是指来源于该受试者的肝脏组织或视网膜组织。
在本发明的方法的一些实施例中，向该受试者给予RNAi剂这样使得 RNAi剂递送至该受试者内的特定部位。可以使用测量在来源于该受试者内特定部位的流体或组织的样品中TTR mRNA或TTR蛋白质的水平或水平变化来评价TTR表达的抑制。在优选的实施例中，该部位选自下组，该组由以下各项组成：肝脏、脉络丛、视网膜、和胰脏。该部位也可以是上述任何一个部位的细胞的小部分或小群(例如，肝细胞或视网膜色素上皮细胞)。该部位可能也包括表达特定类型受体的细胞(例如，表达脱唾液酸糖蛋白受体的肝细胞)。
VIII.治疗或预防TTR相关疾病的方法
本发明也提供治疗或预防受试者的TTR相关疾病的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的本发明的RNAi剂。
本文所使用的“受试者”是动物，例如哺乳动物，包括灵长类(例如人类、非人类灵长类(例如，猴、和黑猩猩))、非灵长类(例如牛、猪、骆驼、大羊驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、天竺鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马、和鲸鱼)、或禽(例如，鸭或鹅)。受试者可以包括转基因生物体。
在一个实施例中，该受试者是人类，例如正在接受针对可能因TTR基因表达降低而受益的疾病、障碍或病症的治疗或评估的人类；处于患有可能因 TTR基因表达降低而受益的疾病、障碍或病症的风险的人类；患有可能因 TTR基因表达降低而受益的疾病、障碍或病症的人类；和/或正在接受针对可能因TTR基因表达降低而受益的疾病、障碍或病症的治疗的人类，如本文所描述。
在一些实施例中，该受试者罹患TTR相关疾病。在其他实施例中，该受试者是处于发展出TTR相关疾病风险的受试者，例如，具有与发展出TTR相关疾病相关的TTR基因突变的受试者(例如，出现可能发展成TTR淀粉样变性的体征或症状之前)、具有TTR相关疾病家族病史的受试者(例如，出现可能发展成TTR淀粉样变性的体征或症状之前)、或出现可能发展成TTR淀粉样变性的体征或症状的受试者。
本文所使用的“TTR相关疾病”包括由淀粉样蛋白沉积的形成所引起或与其相关的任何疾病，其中小纤维前体是由变体或野生型TTR蛋白质组成。突变型和野生型TTR会产生各种形式的淀粉样蛋白沉积(淀粉样变性)。淀粉样变性涉及错误折叠蛋白质的形成和凝集，导致细胞外沉积而损害器官功能。与TTR凝集相关的临床症状包括例如，老年全身性淀粉样变性 (SSA)；全身性家族性淀粉样变性；家族性淀粉样变性多发性神经病 (FAP)；家族性淀粉样心肌病(FAC)；以及柔脑膜淀粉样变性，也被称为柔脑膜或脑膜脑血管淀粉样变性、中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、或淀粉样变性VII型。
在一个实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患家族性淀粉样心肌病 (FAC)的受试者。在另一个实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患具有混合表型的FAC的受试者，即患有心脏和神经损伤两者的受试者。在又另一个实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患具有混合表型的FAP的受试者，即患有神经和心脏损伤两者的受试者。在一个实施例中，本发明的RNAi 剂是给予至罹患FAP并已接受原位肝移植(OLT)治疗的受试者。在另一个实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患老年全身性淀粉样变性(SSA)的受试者。在本发明的方法的其他实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患家族性淀粉样心肌病(FAC)和老年全身性淀粉样变性(SSA)的受试者。正常序列TTR导致老年人的心脏淀粉样变性，并且被称为老年全身性淀粉样变性(SSA)(也被称为老年心脏淀粉样变性(SCA)或心脏淀粉样变性)。 SSA经常在许多其他器官中伴随出现显微沉积物。TTR突变加速TTR淀粉样形成的过程，并且TTR突变是临床上显著TTR淀粉样变性(也称为ATTR (淀粉样变性-甲状腺素运载蛋白型))发展的最重要的风险因素。已知有超过85种促淀粉样蛋白生成的TTR变体会引起全身性家族性淀粉样变性。
在本发明的方法的一些实施例中，本发明的RNAi剂是给予至罹患甲状腺素运载蛋白(TTR)-有关的家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)的受试者。此类受试者可能罹患眼部表现，例如玻璃体混浊和青光眼。本领域技术人员已知由视网膜色素上皮细胞(RPE)合成的促淀粉样蛋白生成的甲状腺素运载蛋白(ATTR)在眼睛淀粉样变性的进展上起着重要的作用。以前的研究已显示减少RPE细胞的全视网膜激光光凝术防止玻璃体中淀粉样蛋白沉积进展，表明有效抑制RPE中ATTR表达可能变成眼睛淀粉样变性的新颖疗法(参见例如，Kawaji,T.等人，Ophthalmology[眼科学]，(2010)117:552- 555)。本发明的方法可用于治疗TTR有关的FAP的眼睛表现，例如，眼睛淀粉样变性。该RNAi剂可以按适合于靶向特定组织(例如眼睛)的方式来递送。眼睛递送模式包括眼球后、皮下眼睑、结膜下、眼筋膜囊内、前房或玻璃体内注射(或内部注射或输注)。用于眼睛递送的特定配制品包括眼药水或眼药膏。
另一种TTR相关疾病是高甲状腺素血症，也称为“异常甲状腺素运载蛋白高甲状腺素血症”或“异常前白蛋白高甲状腺素血症”。这种类型的高甲状腺素血症可能继发于因突变TTR分子具有与甲状腺素的亲和力增加而引起的甲状腺素与TTR的结合增加。参见，例如，Moses等人(1982)J.Clin. Invest.[临床研究杂志]，86,2025-2033。
本发明的RNAi剂可以使用本领域已知的任何给予模式向受试者给予，包括但不限于，皮下、静脉内、肌内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、脑脊髓、及其任何组合。
在优选的实施例中，该药剂经皮下向受试者给予。在一些实施例中，向受试者经由皮下注射(例如，腹部、大腿或上臂注射)给予单次剂量的RNAi 剂。在其他实施例中，向受试者经由皮下注射给予分次剂量的RNAi剂。在一个实施例中，在受试者的两个不同解剖学位置，向该受试者经由皮下注射给予分次剂量的RNAi剂。例如，向受试者皮下注射在右上臂约250mg(例如，约500mg剂量的一半)和在左上臂约250mg的分次剂量。在本发明的一些实施例中，该皮下给予是自我给予，例如，经由预填充的针筒或自动注射器针筒。在一些实施例中，用于皮下给予的RNAi剂的剂量是包含在小于或等于1ml体积的例如药学上可接受的载体中。
在一些实施例中，给予是经由积存注射。积存注射可以按持续的方式在延长的时间段释放RNAi剂。因此积存注射可以减少为了获得所希望的效果 (例如，所希望的TTR抑制，或治疗性或预防性效果)所需的给药频率。积存注射也可以提供更持续的血清浓度。积存注射可以包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，积存注射是皮下注射。
在一些实施例中，给予是经由泵。泵可以是体外泵或手术植入的泵。在某些实施例中，泵是皮下植入的渗透压泵。在其他实施例中，泵是输注泵。输注泵可以被用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选的实施例中，输注泵是皮下输注泵。在其他实施例中，泵是可递送RNAi剂至肝脏的手术植入的泵。
在经由皮下输注泵给予RNAi剂的实施例中，单次剂量的RNAi剂可以经以下的时间段向受试者给予：约45分钟至约5分钟，例如，约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约 10分钟、或约5分钟。
其他给予模式包括硬膜外、脑内、脑室内、鼻内给予、动脉内、心内、骨内输注、鞘内、和玻璃体内、和肺部。可以基于是否需要局部或全身治疗和基于待治疗的区域选择给予模式。可以选择给予途径与部位来增强靶向。
在一些实施例中，向受试者给予有效抑制受试者内的细胞中的TTR表达的量的RNAi剂。有效抑制受试者内的细胞中的TTR表达的量可以使用上文所讨论的方法进行评价，这些方法包括涉及评价对TTR mRNA、TTR蛋白质、或相关变量(例如淀粉样蛋白沉积)的抑制。
在一些实施例中，向受试者给予治疗或预防有效量的RNAi剂。
本文所使用的“治疗有效量”旨在包括RNAi剂当给予至患者用于治疗 TTR相关疾病时足以实现治疗疾病(例如，通过减轻、缓解或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)的量。“治疗有效量”可能取决于RNAi剂、该 RNAi剂如何给予、疾病及其严重性、和病史、年龄、体重、家庭病史、基因构型、受TTR表达介导的病理过程阶段、任何先前或并行的治疗、和待治疗的患者的其他个别特征而变化。
本文所使用的“预防有效量”旨在包括RNAi剂当给予至尚未经历或出现TTR相关疾病症状但可能发展出该疾病的受试者时足以预防或缓解该疾病或该疾病的一种或多种症状的量。可能环节的症状包括感觉神经病变(例如，感觉异常、远端肢体感觉减退)、自主神经病变(例如，胃肠功能失调，例如胃溃疡、或体位性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍、和角膜格子状营养不良。缓解疾病包括减慢疾病过程或降低后续发展的疾病严重度。“预防有效量”可能取决于RNAi剂、该RNAi剂如何给予、发展疾病的风险的程度、和病史、年龄、体重、家庭病史、基因构型、任何先前或并行的治疗、和待治疗的患者的其他个别特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”也包括可以在适用于任何治疗的合理效益/风险比率下产生一些所希望的局部或全身性效果的RNAi剂的量。本发明的方法中使用的RNAi剂可能以足以产生适用于这样的治疗的合理效益/风险比率的量给予。
本文所使用的短语“治疗有效量”和“预防有效量”也包括在治疗、预防、或管理由TTR表达所介导的病理过程或病理过程的一个或多个症状方面提供益处的量。TTR淀粉样变性的症状包括感觉神经病变(例如，感觉异常、远端肢体感觉减退)、自主神经病变(例如，胃肠功能失调，例如胃溃疡、或体位性低血压)、运动神经病变、癫痫、痴呆、脊髓病、多发性神经病、腕管综合征、自主功能不全、心肌病、玻璃体混浊、肾功能不全、肾病变、实质降低的mBMI(修正的身体质量指数)、脑神经功能障碍、和角膜格子状营养不良。
在一个实施例中，例如，当该受试者患有FAP、具有混合表型的FAP、具有混合表型的FAC、或FAP，并且已经患有OLT，用本发明的dsRNA剂治疗受试者可减慢神经病变的进展。在另一个实施例中，例如，当该受试者患有FAP、具有混合表型的FAP、具有混合表型的FAC、或FAP，并且已经患有OLT，用本发明的dsRNA剂治疗受试者可减慢神经病变和心肌病的进展。
例如，在一个实施例中，本发明的方法可减慢、降低、或阻止神经损伤。可以使用任何合适的神经损伤测量来确定受试者是否已降低、减慢、或阻止神经损伤。
一种合适的测量是神经病变损害评分(NIS)。NIS是指测量虚弱、感觉和反射，尤其是关于周围神经病变的评分系统。NIS分数评价标准组的肌肉虚弱(1是25％虚弱、2是50％虚弱、3是75％虚弱、3.25是克服重力的运动、3.5是重力消除的运动、3.75是没有运动下肌肉颤动、并且4是瘫痪)，标准组的肌肉拉伸反射(0是正常、1是减少、2是不存在)，以及触摸压力、振动、关节位置和运动和针刺(全部在食指和拇趾上进行分级：0是正常、1是减少、2是不存在)。针对年龄、性别和身体健康校正评价。
在一个实施例中，本发明的方法使NIS降低至少10％。在其他实施例中，本发明的方法导致NIS降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、 40％或至少50％。在其他实施例中，这些方法阻止NIS分数增加，例如，该方法导致NIS分数增加0％。在再其他实施例中，本发明的方法减慢NIS分数增加的速度，例如，接受本发明的RNAi剂治疗的受试者的NIS分数增加的速度与未接受本发明的RNAi剂治疗的受试者的NIS分数增加速度进行比较。
确定人类受试者的NIS的方法是本领域技术人员所熟知的，并且可以发现y于例如，Dyck,PJ等人(1997)Neurology[神经学]1997.49(1)：pg.229- 239)；Dyck PJ.(1988)Muscle Nerve[肌肉神经].Jan；l l(l):21-32。
另一种合适的神经损伤测量是修正的神经病变损伤分数(mNIS+7)。如本领域普通技术人员所已知的，mNIS+7是指与小和大神经纤维功能的电生理测量(NCS和QST)以及自主功能测量(体位性血压)结合的基于临床检查的神经损伤评估(NIS)。该mNIS+7分数是NIS+7分数的改良(其代表NIS 加7个测试)。NIS+7分析虚弱和肌肉拉伸反射。七个测试中的五个包括神经传导的属性。这些属性是腓神经复合肌肉动作电位振幅、运动神经传导速度和运动神经远端潜伏期(MNDL)、胫骨MNDL和腓肠感觉神经动作电位振幅。这些值针对年龄、性别、身高和体重的变量进行校正。七个测试中的剩余两个包括振动检测阈值和伴随深呼吸的心率下降。
该mNIS+7分数改良了NIS+7，以考虑使用智能躯体特定区定量感觉测试(SmartSomatotopic Quantitative Sensation Testing)，新自主神经评估和使用尺骨、腓骨和胫神经振幅的复合肌肉动作电位，以及尺骨和腓肠神经的感觉神经动作电位(Suanprasert,N等人，(2014)J.Neurol.Sci.[神经科学杂志]，344(1-2):pg.121-128)。
在一个实施例中，本发明的方法使mNIS+7降低至少10％。在其他实施例中，本发明的方法导致mNIS+7分数降低至少5％、10％、15％、20％、 25％、30％、40％或至少50％。在其他实施例中，该方法阻止mNIS+7增加，例如，该方法导致mNIS+7增加0％。在再其他实施例中，本发明的方法减慢 NIS+7分数增加的速度，例如，接受本发明的RNAi剂治疗的受试者的NIS+7 分数增加的速度与未接受本发明的RNAi剂治疗的受试者的NIS+7分数增加速度进行比较。
本发明的治疗和预防方法也可以改善被治疗的受试者的其他临床参数如觉醒能力(awalking ability)。例如，在治疗期间或之后受试者可能具有增加的运动能力或活性。
任何合适运动能力测量均可以用于确定受试者是否具有增加的运动能力或活性。一种合适的测量是6分钟步行测试(6MWT)，其测量受试者在6 分钟内可以行走的多远，即6分钟步行距离(6MWD)。在一个实施例中，本发明的方法使该受试者从6MWD的基线增加至少约10分钟，例如，约 10、15、20、或约30分钟。
本发明的RNAi剂的治疗有效量和预防有效量也包括以下量，该量改善一种或多种生活质量参数(相对于基线)，例如，使在健康调查功能量表上的至少一项的分数增加；和/或增加的寿命；和/或减少的住院治疗。
可以使用任何合适的生活质量测量。例如，健康调查提供一种自我报告的和测量8项健康参数的多项量表：身体功能、由于身体健康问题引起的角色限制、身体疼痛、整体健康、生命力(能量和疲劳)、社交功能、由于情绪问题引起的角色限制、和心理健康(心理压力和心理幸福感)。该调查还提供一种身体构件总评和心理构件总评。在一个实施例中，本发明的方法为受试者提供以下相对于基线的改善：SF-36身体健康相关参数(身体健康、角色身体状况(role-physical)、身体疼痛和/或整体健康)中的至少一项，和/或SF-36心理健康相关参数中的至少一项(生命力、社交功能、角色情绪状况(role-emotional)、和/或心理健康)。这样的改善可以表现为使量表中的任何一个或多个参数增加至少1点(例如，至少2或至少3点)的形式。
本发明的方法也可以改善正在治疗的受试者的预后。例如，本发明的方法可以使受试者在治疗期间降低临床恶化事件的可能性。
向受试者给予的RNAi剂的剂量可以量身定制以平衡该特定剂量的风险和益处，例如，达到所希望的TTR基因抑制水平(例如基于如上所定义的 TTR mRNA抑制、TTR蛋白质表达或减少淀粉样蛋白沉积所评估的)或所希望的治疗性或预防性效果，然而同时避免不期望的副作用。
在一个实施例中，本发明的iRNA剂是按基于体重的剂量向受试者给予。“基于体重的剂量”(例如，以mg/kg计的剂量)使取决于受试者体重而变化的iRNA剂的剂量。在另一个实施例中，iRNA剂是按固定的剂量向受试者给予。“固定剂量”(例如，以mg计的剂量)意指不论任何特定受试者相关的因素(例如体重)，所有受试者均使用的iRNA剂的单次剂量。在一个具体实施例中，本发明的iRNA剂的固定剂量是基于预定的体重或年龄。
可以向受试者给予治疗量的iRNA，例如约0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、 0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.55 mg/kg、0.6mg/kg、0.65mg/kg、0.7mg/kg、0.75mg/kg、0.8mg/kg、0.85 mg/kg、0.9mg/kg、0.95mg/kg、1.0mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.25 mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8 mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4 mg/kg、2.5mg/kg dsRNA、2.6mg/kg dsRNA、2.7mg/kgdsRNA、2.8mg/kg dsRNA、2.9mg/kg dsRNA、3.0mg/kg dsRNA、3.1mg/kg dsRNA、3.2mg/kgdsRNA、3.3mg/kg dsRNA、3.4mg/kg dsRNA、3.5mg/kg dsRNA、3.6mg/kg dsRNA、3.7mg/kgdsRNA、3.8mg/kg dsRNA、3.9mg/kg dsRNA、4.0mg/kg dsRNA、4.1mg/kg dsRNA、4.2mg/kgdsRNA、4.3mg/kg dsRNA、4.4mg/kg dsRNA、4.5mg/kg dsRNA、4.6mg/kg dsRNA、4.7mg/kgdsRNA、4.8mg/kg dsRNA、4.9mg/kg dsRNA、5.0mg/kg dsRNA、5.1mg/kg dsRNA、5.2mg/kgdsRNA、5.3mg/kg dsRNA、5.4mg/kg dsRNA、5.5mg/kg dsRNA、5.6mg/kg dsRNA、5.7mg/kgdsRNA、5.8mg/kg dsRNA、5.9mg/kg dsRNA、6.0mg/kg dsRNA、6.1mg/kg dsRNA、6.2mg/kgdsRNA、6.3mg/kg dsRNA、6.4mg/kg dsRNA、6.5mg/kg dsRNA、6.6mg/kg dsRNA、6.7mg/kgdsRNA、6.8mg/kg dsRNA、6.9mg/kg dsRNA、7.0mg/kg dsRNA、7.1mg/kg dsRNA、7.2mg/kgdsRNA、7.3mg/kg dsRNA、7.4mg/kg dsRNA、7.5mg/kg dsRNA、7.6mg/kg dsRNA、7.7mg/kgdsRNA、7.8mg/kg dsRNA、7.9mg/kg dsRNA、8.0mg/kg dsRNA、8.1mg/kg dsRNA、8.2mg/kgdsRNA、8.3mg/kg dsRNA、8.4mg/kg dsRNA、8.5mg/kg dsRNA、8.6mg/kg dsRNA、8.7mg/kgdsRNA、8.8mg/kg dsRNA、8.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、9.1mg/kg dsRNA、9.2mg/kgdsRNA、9.3mg/kg dsRNA、9.4mg/kg dsRNA、9.5mg/kg dsRNA、9.6mg/kg dsRNA、9.7mg/kgdsRNA、9.8mg/kg dsRNA、9.9mg/kg dsRNA、9.0mg/kg dsRNA、10mg/kg dsRNA、15mg/kgdsRNA、20mg/kg dsRNA、25mg/kg dsRNA、30mg/kg dsRNA、35mg/kg dsRNA、40mg/kg dsRNA、45mg/kg dsRNA、或约50mg/kg dsRNA。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
在某些实施例中，例如，当本发明的组合物包含如本文描述的dsRNA和脂质时，可以向受试者给予治疗量的iRNA，例如约0.01mg/kg至约10 mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.05 mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10 mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.3mg/kg 至约5mg/kg、约0.3mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4 mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约10 mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5 mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10 mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg、或约9.5mg/kg至约10mg/kg。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
例如，dsRNA的给予剂量可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、 0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、 3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、 5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、 6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、 8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、 9.8、9.9、或约10mg/kg。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
在一些实施例中，例如，当本发明的组合物包含如本文描述的dsRNA和 N-乙酰基半乳糖胺时，可以向受试者给予治疗量的iRNA，例如约0.01mg/kg 至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约 0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.15mg/kg至约3mg/kg、约0.1mg/kg至约5 mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg 至约10mg/kg、约0.3mg/kg至约3mg/kg、约0.3mg/kg至约5mg/kg、约0.3 mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4mg/kg至约10 mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约0.6mg/kg 至约3mg/kg、约1mg/kg至约3mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg 至约10mg/kg、约1.25mg/kg至约3mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约 1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约10 mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg 至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约 5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10 mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg、或约 9.5mg/kg至约10mg/kg。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
例如，dsRNA的给予剂量可以是约0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、 0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、 3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、 5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、 8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、 9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
在其他实施例中，例如，当本发明的组合物包含如本文描述的dsRNA和 N-乙酰基半乳糖胺时，可以向受试者给予治疗量的iRNA，例如约0.1至约50 mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50 mg/kg、约1至约50mg/kg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约 2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50 mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约 10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50 mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约 35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45 mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45 mg/kg、约1至约45mg/kg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45 mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约 10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45 mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约 35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约 40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40 mg/kg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约 3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40 mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约 15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40 mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约 0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约 30mg/kg、约1至约30mg/kg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约 2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约 10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30 mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/kg、约1.5至约 20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约 3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20 mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg的剂量。在一个实施例中，当本发明的组合物包含如本文描述的dsRNA和N-乙酰基半乳糖胺时，可以向受试者给予治疗量的约10至约30mg/kg的 dsRNA。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
例如，可以向受试者给予治疗量的iRNA，例如约0.1、0.2、0.3、0.4、 0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.25、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、 1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、 3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、 4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、 6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、 7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、 9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、 14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、 21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、 28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46、47、48、49、或约50mg/kg。所陈述的数值之间的数值和范围也旨在是本发明的一部分。
在一些实施例中，按以下的固定剂量给予RNAi剂：在约25mg至约 900mg之间，例如，在约25mg至约850mg之间、在约25mg至约800mg 之间、在约25mg至约750mg之间、在约25mg至约700mg之间、在约25 mg至约650mg之间、在约25mg至约600mg之间、在约25mg至约550mg 之间、在约25mg至约500mg之间、在约100mg至约850mg之间、在约 100mg至约800mg之间、在约100mg至约750mg之间、在约100mg至约 700mg之间、在约100mg至约650mg之间、在约100mg至约600mg之间、在约100mg至约550mg之间、在约100mg至约500mg之间、在约200 mg至约850mg之间、在约200mg至约800mg之间、在约200mg至约750 mg之间、在约200mg至约700mg之间、在约200mg至约650mg之间、在约200mg至约600mg之间、在约200mg至约550mg之间、在约200mg至约500mg之间、在约300mg至约850mg之间、在约300mg至约800mg之间、在约300mg至约750mg之间、在约300mg至约700mg之间、在约300 mg至约650mg之间、在约300mg至约600mg之间、在约300mg至约550 mg之间、在约300mg至约500mg之间、在约400mg至约850mg之间、在约400mg至约800mg之间、在约400mg至约750mg之间、在约400mg至约700mg之间、在约400mg至约650mg之间、在约400mg至约600mg之间、在约400mg至约550mg、或在约400mg至约500mg之间。
在一些实施例中，按以下的固定剂量给予RNAi剂：约12.5mg、约15 mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50 mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85 mg、约90mg、约95mg、约100mg、约110mg、约120mg、约125mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约175mg、约 180mg、约190mg、200mg、约225mg、约250mg、约275mg、约300 mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425mg、约450 mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575mg、约600 mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750 mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、或约900 mg。
在某些实施例中，每3个月一次(即每季度一次)按约20、25、50、 75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、 400、425、450、475、500、525、550、575、或约600mg的固定剂量向受试者给予RNAi剂。在一个实施例中，该给予是皮下给予，例如，自我给予，例如经由预填充的针筒或自动注射器针筒。在一些实施例中，用于皮下给予的RNAi剂的剂量是包含在小于或等于1ml体积的例如药学上可接受的载体中。
在一些实施例中，该RNAi剂以二个或多个剂量给予。如果希望促进重复或频繁输注，植入递送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或关节囊内)、或储积器可能是可取的。在一些实施例中，后续剂量的数量或量取决于所希望的效果(例如，TTR基因的抑制)的实现，或治疗性或预防性效果(例如，降低淀粉样蛋白沉积或降低TTR相关疾病的症状)的实现。
在一些实施例中，RNAi剂根据时间表给予。例如，该RNAi剂可以每周 2次、每周3次、每周4次、或每周5次地给予。在一些实施例中，该时间表涉及规律间隔的给予，例如，每小时、每4小时、每6小时、每8小时、每 12小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周、每月或每季度。在一个实施例中，每月给予0.3mg/kg、0.6mg/kg、1mg/kg、1.25 mg/kg、1.5mg/kg、2、2.5mg/kg、或3mg/kg的剂量。在另一个实施例中，每季度给予0.3mg/kg、0.6mg/kg、1mg/kg、1.25mg/kg、1.5mg/kg、2、2.5 mg/kg、或3mg/kg的剂量。
在其他实施例中，该时间表涉及紧密间隔的给予，接着在一段较长时间期不再给予该药剂。例如，该时间表可能涉及在一段相对短的时间段内(例如，约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时、或约每72小时)给予一组初始剂量，接着在一段较长时间段内(例如，约1周、约2 周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10 周、约11周、或约12周)不再给予RNAi剂。在一个实施例中，最初每小时给予RNAi剂，后来以较长的间隔(例如，每天、每周、每两周、每月或每季度)给予。在另一个实施例中，最初每天给予RNAi剂，后来以较长的间隔(例如，每周、每两周、每月、或每季度)给予。在某些实施例中，较长的间隔随时间推移增加或基于所希望的效果的实现来确定。
在具体实施例中，RNAi剂是在第一周期间每天给予一次，随后从给予第8天开始每周一次、每月一次、或每季度一次给药。在另一个具体实施例中，该RNAi剂是在第一周期间每隔一天给予一次，接着从给予第8天开始每周一次、每月一次、或每季度一次给药。在另一个实施例中，RNAi剂是在第一周期间每天给予一次，持续5天，接着每周一次、每月一次、或每季度一次给药。
任何这些时间表均任选地重复一次或多次。重复次数可能取决于所希望的效果的实现，例如，TTR基因的抑制、视黄醇结合蛋白质水平、维生素A 水平、和/或治疗性或预防性效果的实现，例如，降低淀粉样蛋白沉积或降低 TTR相关疾病的症状。
在一些实施例中，RNAi剂与其他治疗剂或其他治疗方案一起给予。例如，适合于治疗TTR相关疾病的其他药剂或其他治疗方案可以包括：肝脏移植，其可以降低体内突变TTR水平；塔法米得(Tafamidis)(Vyndaqel)，其在动力学上稳定TTR四聚体，防止TTR淀粉样蛋白生成所需的四聚体解离作用；以及利尿剂，其可以用于例如，降低涉及心脏的TTR淀粉样变性中的水肿。
在一个实施例中，向受试者给予初始剂量以及一个或多个维持剂量的 RNAi剂。该或这些维持剂量可以与初始剂量相同或更低，例如，初始剂量的一半。维持方案可以包括使用以下的一个或多个剂量治疗受试者：在每天从 0.01μg至15mg/kg体重的范围内，例如，每天1mg/kg、1.25mg/kg、1.5 mg/kg、2mg/kg、2,5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.3mg/kg、0.6mg/kg、0.01mg/kg、0.001mg/kg、或 0.00001mg/kg体重，或每周约12.5mg至约900mg，例如，约25mg、约30 mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65 mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100 mg、约125mg、约150mg、约175mg、200mg、约225mg、约250mg、约 275mg、约300mg、约325mg、约350mg、约375mg、约400mg、约425 mg、约450mg、约475mg、约500mg、约525mg、约550mg、约575 mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725 mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875 mg、或约900mg的一个或多个剂量。维持剂量的给予是例如，不超过每2天一次、每5天一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每21天一次、每30天一次或每90天一次。而且，治疗方案可以持续一段时间，该时间将取决于特定疾病的性质、其严重度、和患者的整体状况而变化。在某些实施例中，该剂量的递送可以是每天不超过一次，例如，每24、36、48或更多小时不超过一次，例如，每5天或8天不超过一次。治疗后，可以监测患者的病症变化。如果患者对当前剂量水平没有显著反应，可以增加RNAi剂的剂量，或者如果已经观察到疾病状态的症状已缓和、如果疾病状态已消除、或如果观察到不期望的副作用，可以降低剂量。
VI.试剂盒
本发明还提供用于进行任何本发明的方法的试剂盒。此类试剂盒包括一种或多种RNAi剂和使用说明书，例如，通过使细胞与有效抑制TTR表达的量的一种或多种RNAi剂接触来抑制细胞中的TTR表达的说明书。这些试剂盒任选地可能进一步包含使细胞与RNAi剂接触的方式(例如，注射装置或输注泵)、或用于测量TTR的抑制的方式(例如，用于测量TTRmRNA或 TTR蛋白质抑制的方式)。此类用于测量TTR的抑制的方式可能包括用于从受试者获得样品，如，例如，血浆样品的方式。本发明的试剂盒任选地可能进一步包含向受试者给予一种或多种RNAi剂的方式或用于确定治疗有效量或预防有效量的方式。
包含在本发明的试剂盒中的合适的RNAi剂包括表1、3、5、6、或7中任一表中所列出的任一种RNAi剂。在一个实施例中，RNAi剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-66016、AD-65492、AD-66017、和AD-66018。
RNAi剂可以呈任何方便的形式(例如在无菌注射用水中的溶液)提供。例如，RNAi剂可以作为在无菌注射用水中的500mg/ml、450mg/ml、 400mg/ml、350mg/ml、300mg/ml、250mg/ml、200mg/ml、150mg/ml、100 mg/ml、或50mg/ml溶液提供。
本发明通过下列不应构成限制的实例进步阐述。本申请所引用的所有参考文献和公开的专利和专利申请的内容特此通过引用结合在此。
实例
实例1：靶向TTR的经化学修饰的RNAi剂的体外稳定性和沉默活性
下列实验证明了某些化学修饰(包括在正义链上的不超过8个2′-氟修饰、在反义链上的不超过6个2′-氟修饰、六个硫代磷酸酯核苷酸键、和配体 (例如，GalNAc3配体)对靶向TTR的RNAi剂的沉默活性的有益效果。所研究的药剂的序列在下表1中提供。
TTR siRNA序列是在Mermade 192合成仪(生物自动化公司 (BioAutomation))，使用固体支持物介导的亚磷酰胺化学按1μmol规模合成。固体支持物是装载有订制的GalNAc配体的控制孔玻璃(500A)或是通用的固体支持物(AM生物化学公司(AM biochemical))。辅助合成试剂 2’-F和2’-O-甲基RNA和脱氧亚磷酰胺获得自赛默飞世尔公司(Thermo-Fisher)(密尔沃基，威斯康星州)和兆维公司(Hongene)(中国)。使用相应的亚磷酰胺，引入2’F、2’-O-甲基、GNA(乙二醇核酸)、5′磷酸酯和无碱基修饰。3′GalNAc轭合的单链的合成是在GalNAc修饰的CPG支持物上进行。使用订制的CPG通用固体支持物来合成反义单链。所有亚磷酰胺(100 mM，在乙腈中)使用5-乙基硫代-1H-四唑(ETT)作为活化剂(0.6M，在乙腈中)的偶联时间是5分钟。硫代磷酸酯键是使用3-((二甲基氨基-亚甲基) 氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，获得自凯吉公司(Chemgenes)(威尔明顿，马萨诸塞州，美国(Wilmington,MA,USA))在无水乙腈/吡啶(1: 1v/v)中的中50mM溶液产生。氧化时间是3分钟。所有合成的序列最终都去除DMT基团(“去除DMT”)。
当固相合成完成时，从固体支持物切割寡核糖核苷酸，并在密封的96深孔板中使用200μL水性甲胺试剂在60℃去保护20分钟。在切割和去保护步骤结束时，允许合成板回到室温，并且通过添加1mL乙腈:乙醇混合物(9: 1)来进行沉淀。将板在-80℃冷却2小时，在多通道移液器的辅助下小心倾析上清液。寡核苷酸沉淀再悬浮于20mM NaOAc缓冲液中，并且在配备有 A905自动取样器和Frac 950部分收集器的AKTA净化器系统上使用5mL HiTrap尺寸排阻柱(GE医疗集团(GE Healthcare))进行脱盐。在96孔板中收集脱盐的样品。来自每个序列的样品通过LC-MS进行分析以确认同一性，通过UV(260nm)定量，并且选择一组样品通过IEX层析法进行分析以确定纯度。
TTR单链的退火是在Tecan液体自动操作仪上进行。合并正义和反义单链的等摩尔混合物，并且在96孔板中退火。在合并互补单链后，紧紧密封该 96孔板，并在100℃烘箱中加热10分钟，并在2-3小时的时间内缓慢恢复至室温。在1X PBS中将每种双螺旋的浓度归一化至10μM。
使用大鼠胞液稳定性测定来分析这些双螺旋的体外代谢稳定性。对于这样的测定，将雌性大鼠肝脏胞液(Xenotech公司，目录号R1500.C)解冻至室温，并且在50mM Tris缓冲液:HCl(pH 7.4)、5mM MgCl2中稀释至1 mg/mL。通过在微量离心管中混合100μL的1mg/mL胞液和25μL的0.4 mg/mL siRNA样品，并在设置为37℃和300rpm的埃彭道夫(Eppendorf)恒温混匀仪中孵育24小时来制备二十四小时样品。在孵育24小时后，向每个样品中添加300μL的Phenomenex裂解加载缓冲液(目录号ALO-8498)和 12.5μL的0.4mg/mL内部标准siRNA。通过混合100μL的1mg/mL胞液与 25μL的0.4mg/mL siRNA样品、300μL的Phenomenex裂解加载缓冲液、和 12.5μL的0.4mg/mL内部标准siRNA来制备零小时样品。使用PhenomenexClarity OTX Starter试剂盒(目录号KSO-8494)从24小时样品和0小时样品中提取siRNA。在提取样品后，将它们转移至微量离心管中，并且使用 Labconco CentriVap浓缩器(目录号7810010)干燥。然后，将样品重新悬浮于500μL无核酸酶的水中。将50μL的各个样品在安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1260无穷二级LC和安捷伦科技公司(AgilentTechnologies) 6130四极LC/MS上运行。使用双管柱设置以再生模式运行分析。四极泵方法是在0.400mL/min下用以下时间表运行12.20分钟：
四极泵方法是在0.700mL/min下用以下时间表运行12.20min：
时间函数 参数
左右两个柱均设置在75.00℃。在260nm波长下测量UV信号。使用下列公式计算每条链的剩余百分比：
％链剩余＝100*(峰面积链24h/峰面积链0h*(峰面积标准24h/峰面积标准0h))。
这些二十四小时胞液稳定性测定的结果证明了所有双螺旋都是高度稳定的。
还使用去污溶酶体稳定性测定评估了这些药剂的亚组的体外代谢稳定性。对于去污溶酶体稳定性测定，将大鼠肝脏去污溶酶体(Xenotech公司，定制产品PR14044)解冻至室温，并且在20mM柠檬酸钠(pH 5.0)缓冲液中稀释至0.5单位/mL酸性磷酸酶。通过在微量离心管中混合100μL的0.5单位/mL酸性磷酸酶和25μL的0.4mg/mL siRNA样品，并在设置为37℃和 300rpm的埃彭道夫(Eppendorf)恒温混匀仪中孵育24小时来制备二十四小时样品。在孵育24小时后，向每个样品中添加300μL的Phenomenex裂解加载缓冲液(目录号ALO-8498)和12.5μL的0.4mg/mL内部标准siRNA。通过混合100μL的0.5单位/mL酸性磷酸酶与25μL的0.4mg/mL siRNA样品、 300μL的Phenomenex裂解加载缓冲液、和12.5μL的0.4mg/mL内部标准 siRNA来制备时间0小时样品。使用Phenomenex Clarity OTX Starter试剂盒 (目录号KSO-8494)从24小时样品和0小时样品中提取siRNA。在提取样品后，将它们转移至微量离心管中，并且使用Labconco CentriVap浓缩器 (目录号7810010)干燥。然后，将样品重新悬浮于500μL无核酸酶的水中。将50μL的各个样品在安捷伦科技公司(Agilent Technologies)1260无穷二级LC和安捷伦科技公司(Agilent Technologies)6130四极LC/MS上运行。使用双管柱设置以再生模式运行分析。四极泵方法是在0.400mL/min下用以下时间表运行12.20分钟：
四极泵方法是在0.700mL/min下用以下时间表运行12.20min：
左右两个柱均设置在75.00℃。在260nm波长下测量UV信号。使用下列公式计算每条链的剩余百分比：
％链剩余＝100*(峰面积链24h/峰面积链0h*(峰面积标准24h/峰面积标准0h))。
在图1中提供的二十四小时去污溶酶体稳定性测定的结果证明了所有双螺旋在去污溶酶体中都是高度稳定的。
表2.在核酸序列代表中使用的核苷酸单体的缩写。应该理解，这些单体当存在于寡核苷酸中时通过5′-3′-磷酸二酯键相互连接。
设计和合成了靶向TTR的另外的药剂组。这些药剂的序列在下表3中提供。
这些另外的药剂在体外测定中评估。具体而言，使用Lipofectamine RNAiMAX通过标准反向转染，在Hep3B细胞(人类肝细胞瘤细胞系)或原代食蟹猴肝细胞(生命科技公司(Life Technologies))中确定各种iRNA剂的IC50。将Hep3b细胞在EMEM(具有10％FBS)中培养，而原代食蟹猴肝细胞在使用前立即解冻并在WMEM(具有10％FBS)中培养。在384孔板中，每孔添加5μL的RNA双螺旋和每孔添加4.9μL的Opti-MEM加0.1μL Lipofectamine RNAiMax(英杰公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，目录号13778-150)，在室温下培养15-20分钟来进行反向转染。培养后，向每个孔中添加40μL不具有抗生素但包含5,000Hep3B细胞或原代食蟹猴肝细胞的完全生长培养基。对于原代肝细胞，使用涂覆胶原蛋白的板。细胞在37℃和5％CO2大气下孵育24小时后，然后进行细胞溶解和通过RT- qPCR分析TTR和GAPDH mRNA。使用10nM至0.38fM范围内的8种不同siRNA浓度来评估IC50，并且将siRNA转染的细胞的TTR/GAPDH归一化至用10nM荧光素酶siRNA转染的细胞。
在与TTR siRNA孵育24小时后，评估原代食蟹猴肝细胞的自由摄取沉默。该方法与上述描述的方法类似，除了5μL完全生长培养基替代为包含 Lipofectamine RNAiMax和Optimem的5μL。如上所述进行TTR和GAPDH mRNA的下游分析。对于典型剂量反应曲线，从500nM至0.1.8pM通过8个点6-倍连续稀释滴定siRNA。
这些测定的结果(在表4中提供)证明了所有双螺旋都有效抑制TTR mRNA表达。
还使用上述胞液和去污溶酶体稳定性测定来评估这些另外的药剂的体外稳定性。
在图2A中提供了二十四小时胞液稳定性测定的结果并且在图2B中提供的二十四小时去污溶酶体稳定性测定的结果，证明了所有双螺旋在去污溶酶体和大鼠胞液中都是高度稳定的。
实例2.体内TTR沉默
在表达人类TTR的缬氨酸30甲硫氨酸变体(V30M hTTR)的转基因小鼠中评估上述另外的药剂的体内功效(参见例如，Nagata等人(1995)J Biochem.[生物化学杂志]117:169-175；Kohno等人(1997)Am J Pathol.[美国病理学杂志]150(4):1497-508)。已知TTR的V30M变体会导致人类家族性淀粉样蛋白多发性神经病I型。参见例如，Lobato,L.(2003)JNephrol[肾脏学杂志]，16(3):438-42。
向11至13个月龄TTR V30m小鼠皮下给予单次1mg/kg或2.5mg/kg剂量的药剂，并且在给药前和给药后第3、7、10、14、21、28、35、42、56、 70和84天确定动物血清中的TTR水平。简言之，使用已验证的TTR酶联免疫吸附测定(ELISA)来分析TTR水平(参见例如，Coelho等人(2013)N Engl J Med[新英格兰医学杂志]369:819)。在开始进行TTR血清蛋白ELISA 测定之前24小时，将96孔免疫微孔板在4℃下用兔抗人TTR pAb (Abcam)涂覆。在测定当天，在TBS-T中洗涤板，并在1x Powerblock (Biogenex公司)中，在室温下阻断2小时。血清样品在1X Powerblock中稀释15,000倍。使用人类TTR蛋白质标准物(西格玛-奥德里奇公司(Sigma- Aldrich)，P1742)的12点人类TTR标准曲线，使用1.6x连续稀释(从250 至0ng/mL的范围内)产生。阻断后，添加100μL体积的标准物和样品至板，并允许在室温下孵育2小时。将板在TBS-T中洗涤，在室温下与在1X Powerblock中稀释1:2500的绵羊抗-hTTR原代抗体(AbCam)孵育1小时。 TBS-T洗涤后，将板在室温下与在1X Powerblock中稀释3:10000的猴子抗绵羊碱性磷酸酶二级抗体(AbCam)孵育1小时。将板在TBS-T中洗涤，并且在每个孔添加100μL体积的制备的底物(SIGMAFASTTM对硝基苯基磷酸酯片剂)，允许在室温和黑暗中反应30分钟。每孔添加0.05ml的1M NaOH 淬灭反应。在SpectraMax板读数器中读取在405nm的吸光度，并将数据拟合成4-参数曲线以确定血清TTR蛋白质水平(以μg/mL计)。各个动物的蛋白质水平归一化至其相应的个体给药前血浆蛋白质值，以确定相对于给药前剩余的TTR部分。
在图3中提供1mg/kg单次剂量实验的结果并且在图4中提供2.5mg/kg 单次剂量实验的结果。结果证明了所有药剂都有效且持续地抑制TTR表达，在给予后约第7天达到最低点。结果也证明了在给予单次1mg/kg剂量的AD- 65492、AD-66017、或AD-66018后第42天保持了超过40％血清TTR抑制，在给予单次2.5mg/kg剂量的AD-65492或AD-66018后第42天保持了超过 60％血清TTR抑制。给予单次1mg/kg剂量后的给予后第56至84天之间和给予单次2.5mg/kg剂量后的给予后第70至84天之间出现基线血清TTR浓度的恢复。
动物中80％沉默的有效剂量(ED80)计算为1mg/kg。因此这些数据显示AD-65492、AD-66016、AD-66017、和AD-66018在低剂量和/或每月一次给药方案下治疗患有TTR相关障碍的受试者是有效的。
实例3.大鼠探索性毒性研究
还在大鼠中进行AD-66016、AD-65492、AD-66017、和AD-66018的临床前毒性研究。简言之，在第1、8、和15天时，向每组5只雄性大鼠皮下给予30mg/kg或100mg/kg剂量的AD-66016、AD-65492、AD-66017、或AD- 66018。对照组动物在第1、8、和15天时给予安慰剂。在第16天时，将所有动物处死。在处死之前，每天监测动物的任何临床症状，并每周测量体重。在处死之后，解剖动物，并样品通过全血血清化学、血液学和血液凝固操作盘、通过肝脏和肾脏的组织病理学、和针对肝转胺酶浓度进行分析。
这些分析的结果证明了AD-66016、AD-65492、AD-66017、和AD- 66018在临床上耐受良好，没有不良临床体征或体重变化。
实例4.AD-65492和AD-66017的多剂量给予的功效
评估了AD-65492和AD-66017的多剂量方案对hTTR V30M转基因 (Tg)小鼠中的TTR蛋白质表达的作用。
在一组实验中，向11至13个月龄的hTTR V30M小鼠皮下给予每周一次2mg/kg剂量的AD-65492，持续3周(QWx3)，并在给药前和给药后第 7、14、17、和21天，如上所述确定动物血清中的TTR蛋白质水平。
图5证明了向hTTR V30M Tg小鼠按QWx3给药方案给予AD-65492实现并维持了血清TTR蛋白质表达的大于90％抑制。
在另一组实验中，向11至13个月龄的hTTR V30M Tg小鼠皮下给予 AD-65492和AD-66017，每月一次0.3mg/kg剂量持续四个月(QMx4@0.3 mg/kg)、每月一次1mg/kg剂量持续四个月(QM4@1mg/kg)、或每月一次3mg/kg剂量持续四个月(QM4@3mg/kg)。在给药前和给药后第7、 14、21、28、35、42、49、56、63、70、84、91、98、与185天，如上所述确定血清TTR蛋白质水平。
如图6A-6C中所示，在给药后第7天的TTR敲低水平与第二剂量、第三剂量、和第四剂量后类似，并且在3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg剂量下达到的TTR表达最低点分别是大于80％、约70％-85％、和约25％-35％。这些图还证明了AD-65492比AD-66017提供更持续的TTR沉默水平，直到最后剂量后超过100天，在3mg/kg、1mg/kg、和0.3mg/kg下分别保持约60％、 40％、和约35％的TTR抑制。此外，对于AD-65492，在0.3mg/kg剂量下多次给药(QMx4)具有累加作用，导致与具有约25％-35％的敲低的第一剂量相比在第四次每月剂量后具有约40％TTR敲低。此外，尽管贯穿每种药剂的所有剂量水平在每个每月剂量之前均有一些TTR蛋白质水平恢复，如同单次皮下剂量，仍将多剂量方案下达到80％敲低(ED80)的有效剂量计算为约1 mg/kg。因此，这两种化合物在所有三种给药方案中的药效学活性和动力学与相同化合物在作为单次剂量给予时的药效学活性和动力学可比较。
实例5.在非人类灵长类中的TTR沉默
如上述实例所证明，AD-65492和AD-66017都具有良好耐受性，并在体内有效和持续地抑制TTR蛋白质水平。
因此，AD-65492和AD-66017的功效通过在食蟹猴中在这些iRNA剂的不同剂量和不同给药方案下给予进一步进行了研究。图7提供了该研究的概述。简言之，向四组(第1、2、4、和5组)皮下给予单次0.3mg/kg剂量 (第1和4组)或单次1mg/kg剂量的iRNA剂(第2和5组)。向其他四组 (第3组和第6-8组)给予每月一次1mg/kg剂量持续4个月(QMx4)(第7 和8组)或每月一次3mg/kg剂量持续4个月(QMx4)(第3和6组)。在给药前第-7和-1天以及给药后第3、7、10、14、21、28、35、42、49、56、 63、70、77、84、91、105、和119天收集血清；在给药前第1天以及给药后 0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血浆。如上所述确定血清TTR 蛋白质水平。
图8A提供0.3mg/kg单次剂量研究的结果，图8B提供1mg/kg单次剂量研究的结果，并且图8C提供3mg/kg单次剂量研究的结果。出于比较目的，图8B也描绘了在食蟹猴中皮下给予单次2.5mg/kg剂量的AD-51547对 TTR表达的作用，并且图8C也描绘了在食蟹猴中皮下给予单次5mg/kg剂量的AD-51547对TTR表达的作用。这些图证明了AD-65492和AD-66017两种 iRNA剂的ED50为约0.3mg/kg，对于这两种剂量和对于这两种iRNA剂在约第28天达到TTR表达最低点，并且在使用单次剂量的较高剂量水平下，AD- 65492比AD-66017在抑制TTR蛋白质表达方面更有效。这些图也证明了AD- 65942在给予单次1mg/kg剂量后第42天提供大于90％的对TTR表达的持续抑制，和在第63天提供大于80％的TTR抑制，在给药后第119天保持了约 40％TTR抑制，并且AD-66017在给予单次1mg/kg剂量后提供了最大73％的对TTR表达的抑制，其在第35天之前开始恢复TTR表达并在给药后第119 天恢复至基线的约20％以内。
针对AD-65492和AD-66017，图9A提供了1mg/kg多剂量研究的结果，且图9B提供了3mg/kg多剂量研究的结果。出于比较目的，图9A也描绘了在食蟹猴中给予每天5mg/kg剂量的AD-51547持续5天(在第0-4天的前5个箭头)，然后每周5mg/kg剂量持续四周(在第7、14、21、和28天的箭头)(QDx5，QWx4)对TTR表达的作用。这些图证明这两种iRNA剂都提供了稳键的TTR蛋白质抑制并且这两种iRNA剂在3mg/kg剂量下在第 21至28天之间完全抑制TTR蛋白质表达。这些图也证明在1mg/kg剂量下 AD-65492比AD-66017更有效。此外，这些图证明了这两种iRNA剂在1 mg/kg下在第35至42天之间达到TTR表达最低点，并且在第二次每月剂量的AD-65492之前具有大于85％抑制，且在第二次每月剂量AD-66017之前具有约70％抑制。对于AD-65492和AD-66017分别在第三和第四次每月剂量后达到维持约95％和85％抑制。
此外，如图10A所证明，每月一次给予(QMx4)AD-65492导致维持大于95％TTR抑制，并且如图10B所证明，多次给予(QMx4)AD-66017在1 mg/kg剂量下具有累加作用。图10B也证明了在AD-66017的第二次每月剂量后对TTR蛋白质表达有85％的抑制，并且在第三和第四次每月剂量维持了该抑制。
实例6.靶向TTR的经化学修饰的药剂的设计和合成
如上所述设计和合成另外的靶向TTR的双链RNAi剂，其中基本上所有正义链核苷酸和基本上所有反义链核苷酸均为经修饰的核苷酸，并且所包含的反义链含有与SEQ IDNO:2互补的区域。
这些药剂的正义链和反义链的核苷酸序列在表5中提供。
实例7.靶向TTR的经化学修饰的药剂的设计和合成
如上所述设计和合成另外的靶向TTR的双链RNAi剂。
这些药剂的未经修饰的正义链和反义链的核苷酸序列在表6中提供，并且这些药剂的经修饰的正义链和反义链的核苷酸序列在表7中提供。
实例8.向食蟹猴给予AD-65492
通过向食蟹猴给予来进一步评估AD-65492的功效。
在第一组实验中，向四组(第1、2、3和7组)皮下给予单次0.3mg/kg 剂量(第1组)；单次剂量1mg/kg(第2组)；每月一次剂量1mg/kg持续 4个月(QMx4)(第7组)；或
每月一次剂量3mg/kg持续4个月(QMx4)(第3组)。
对于第3和4组，在给药前和在第3、7、10、14、21、28、35、42、 49、56、63、70、77、84、91、98、112、126、154、175、203、230、260、 290、310、335、和364天收集血清、血浆、和稀疏肝脏样品。
对于第1和2组，在给药前第-7和-1天、以及给药后第3、7、10、14、 21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、105、和119天收集血清；在给药前第1天以及给药后0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血浆。
对于第3和7组，在给药前第-7和-1天、以及给药后第3、7、10、14、 21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98、112、127、155、 176、204、232、260、288、316、344和372天收集血清；在给药前第1天以及给药后0.5、1、2、4、8、12、24、48、96和168小时收集血浆；还在给药前第85天以及给药后0.5、1、2、4、8、12、24、48、96和168小时收集血浆。
对于第7组，稀疏肝脏样品收集自第1天给药前8小时(即，在向受试者给予AD-65492剂量之前8小时，从该受试者收集稀疏肝脏样品)；和给药后第7天；第22天；第29天，在给药前8小时；第57天，在给药前8小时；第85天，在给药前8小时；第91天；第106天；和第141天。
对于第3组，稀疏肝脏样品收集自给药后，第29天，给药前8小时；第57天，在给药前8小时；第85天，在给药前8小时；第91天、第106天、和第141天。
如上所述确定血清TTR蛋白质水平。
图11提供了这些研究的结果，并且显示通过给予AD-65492稳健抑制 TTR表达。数据证明了按每月一次给予1mg/kg的AD-65492(第7组)或3 mg/kg的AD-65492(第3组)持续四个月(QMx4)后，AD-65492分别在最后剂量后约6周和17周提供对TTR表达的大于90％的持续抑制。数据也证明了按每月一次给予1mg/kg的AD-65492(第7组)持续四个月 (QMx4)，在最后剂量后17周提供对TTR表达的约40％抑制。
假设食蟹猴与人类之间的剂量按1:1诠释，数据表明每季度一次向人类受试者给予AD-65492可以在1mg/kg至3mg/kg之间的剂量水平(例如，2 mg/kg)下有效抑制TTR表达。
在第2组实验中，向三组(第9、10、和11组；参见图12)皮下给予每月一次剂量0.3mg/kg持续6个月(QMx6)(第9组)；每月一次剂量0.6 mg/kg持续6个月(QMx6)(第10组)；或初始剂量1mg/kg，接着在初始剂量持续五个月(QMx5)后再每月一次维持剂量0.3mg/kg持续一个月 (QMx1)(第11组)。
在给药前第-7和-1天、和给药后第4、8、11、15、22、29、36、43、 50、57、64、71、78、85、92、99、113、127、155、176、和204、232、260 和288天收集血清样品。如上所述确定血清TTR蛋白质水平。
图13提供这些研究的结果，并且证明了AD-65492在每月一次剂量0.6 mg/kg持续2个月(QMx2)后达到了对TTR的稳健抑制，其比得上在1 mg/kg初始剂量后对TTR表达的抑制。数据还证明了AD-65492在每月一次剂量0.3mg/kg持续2个月后提供对TTR表达的约80％持续抑制；四只猴子中有三只在每月一次0.3mg/kg剂量的AD-65492持续2个月后达到60％-85％ TTR抑制。在单次1mg/kg剂量后展示了对TTR表达的高达90％抑制，其中第二次剂量0.3mg/kg在给予第二剂量后将最低点维持了3周。
等效物：
本领域普通技术人员应认识到，或使用不超出常规实验能够确定本文所述的特定实施例和方法的许多等效物。此类等效物旨在涵盖在以下权利要求书的范围内。

Claims (108)

1.一种用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中所述RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地包含在5′-末端的两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
2.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中所述双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Na′和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
3.如权利要求2所述的双链RNAi剂，其中该YYY基序出现在该正义链的切割位点处或附近。
4.如权利要求2所述的双链RNAi剂，其中该Y′Y′Y′基序出现在该反义链从5′-端起的位置11、12和13。
5.如权利要求2所述的双链RNAi剂，其中该Y核苷酸包含2′-氟修饰。
6.如权利要求2所述的双链RNAi剂，其中该Y′核苷酸包含2′-O-甲基修饰。
7.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是15-30个核苷酸对的长度。
8.如权利要求7所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是17-23个核苷酸对的长度。
9.如权利要求7所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是17-25个核苷酸对的长度。
10.如权利要求9所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是23-27个核苷酸对的长度。
11.如权利要求9所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是19-21个核苷酸对的长度。
12.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该双链区域是21-23个核苷酸对的长度。
13.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中每条链具有15-30个核苷酸。
14.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中每条链具有19-30个核苷酸。
15.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中在所述核苷酸上的所述修饰选自下组，该组由以下各项组成：脱氧核苷酸、3′-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2′-O-甲基修饰的核苷酸、2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、非锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2’-氨基-修饰的核苷酸、2’-O-烯丙基-修饰的核苷酸、2’-C-烷基-修饰的核苷酸、2’-羟基-修饰的核苷酸、2’-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2’-O-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰的核苷酸、1,5-无水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包含硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5′-磷酸酯的核苷酸、和包含5′-磷酸酯模拟物的核苷酸、及其组合。
16.如权利要求15所述的双链RNAi剂，其中在所述核苷酸上的所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
17.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该正义链包含不超过6个2′-氟修饰。
18.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该正义链包含不超过5个2′-氟修饰。
19.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该正义链包含不超过4个2′-氟修饰。
20.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该反义链包含不超过5个2′-氟修饰。
21.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该反义链包含不超过4个2′-氟修饰。
22.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该反义链包含不超过3个2′-氟修饰。
23.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该反义链包含不超过2个2′-氟修饰。
24.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其进一步包含在该反义链的5′核苷酸处的5′-磷酸酯或5′-磷酸酯模拟物。
25.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其进一步包含在该反义链的5′核苷酸处的5′-磷酸酯模拟物。
26.如权利要求25所述的双链RNAi剂，其中该5′-磷酸酯模拟物是5′-乙烯基磷酸酯(5′-VP)。
27.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体是通过二价或三价分支连接体附接的一个或多个GalNAc衍生物。
28.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体是
29.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该配体被附接至该正义链的3′端。
30.如权利要求29所述的双链RNAi剂，其中该RNAi剂与如以下图解所示的配体轭合
其中X是O或S。
31.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)，
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)，和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
32.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
33.如权利要求32所述的双链RNAi剂，其中该正义链和该反义链包含所述核苷酸序列
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。
34.如权利要求1所述的双链RNAi剂，其中所述RNAi剂选自在表1、3、5、6、或7中任一个表中所列出的RNAi剂的组。
35.一种用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中所述RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2完全互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合，其中该配体是通过二价或三价分支连接体附接的一个或多个GalNAc衍生物。
36.如权利要求35所述的双链RNAi剂，其中所述双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Na′和Nb′独立地表示包含8-10个核苷酸的寡核苷酸序列，所述8-10个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序，并且其中所述修饰是2′-O-甲基或2′-氟修饰。
37.一种用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中所述RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成：表5中的任何核苷酸序列。
38.一种用于抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的双链核糖核酸(RNAi)剂，其中所述RNAi剂包含与反义链互补的正义链，该反义链包含互补区域，该互补区域包含与表6中的任一个反义序列的差异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
39.如权利要求38所述的双链RNAi剂，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成：表6中的任何核苷酸序列。
40.如权利要求38所述的双链RNAi剂，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成：表7中的任何核苷酸序列。
41.一种细胞，其包含如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂。
42.一种载体，其包含如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂。
43.一种细胞，其包括如权利要求42所述的载体。
44.一种药物组合物，其包含如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂或如权利要求42所述的载体。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中该双链RNAi剂以未缓冲的溶液进行给予。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其中所述未缓冲的溶液是盐水或水。
47.如权利要求44所述的药物组合物，其中所述双链RNAi剂用缓冲溶液进行给予。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐、或其任何组合。
49.如权利要求47所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
50.一种抑制细胞中甲状腺素运载蛋白(TTR)表达的方法，该方法包括：
使该细胞与如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂、如权利要求42所述的载体、或如权利要求44-49中任一项所述的药物组合物接触，从而抑制该细胞中TTR基因的表达。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述细胞是在受试者内。
52.如权利要求51所述的方法，其中该受试者是人类。
53.如权利要求52所述的方法，其中该受试者罹患TTR相关疾病。
54.如权利要求50-53中任一项所述的方法，其中该TTR表达被抑制至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％。
55.一种治疗罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂、如权利要求42所述的载体、或如权利要求44-49中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
56.一种治疗罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的双链RNAi剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
57.一种降低、减慢或阻止罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS(mNIS+7)的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂、如权利要求42所述的载体、或如权利要求44-49中任一项所述的药物组合物，从而降低、减慢或阻止所述受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS(mNIS+7)。
58.一种降低、减慢或阻止罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS(mNIS+7)的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的双链RNAi剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
59.一种增加罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的如权利要求1、35、37和38中任一项所述的双链RNAi剂、如权利要求42所述的载体、或如权利要求44-49中任一项所述的药物组合物，从而增加所述受试者的6分钟步行测试(6MWT)。
60.一种增加罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量或预防有效量的双链RNAi剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
61.如权利要求56、58、和60中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Nb和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
62.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
63.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述受试者是罹患TTR相关疾病的受试者。
64.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述受试者是处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者。
65.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述受试者携带与发展出TTR相关疾病相关的TTR基因突变。
66.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、柔脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、和高甲状腺素血症。
67.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述受试者患有TTR相关的淀粉样变性，并且所述方法降低所述受试者中的淀粉样蛋白TTR沉积。
68.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是通过选自下组的给予方式向所述受试者给予，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、脑脊髓、及其任何组合。
69.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是经由皮下、肌内或静脉内向所述受试者给予。
70.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是经由皮下给予向所述受试者给予。
71.如权利要求70所述的方法，其中该皮下给予是自我给予。
72.如权利要求71所述的方法，其中该自我给予是经由预填充的针筒或自动注射器针筒。
73.如权利要求56-60中任一项所述的方法，其进一步包括评估在来源于该受试者的样品中的TTR mRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
74.如权利要求56、58、和60中任一项所述的方法，其中该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)，
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)，和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
75.如权利要求56、58、和60中任一项所述的方法，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
76.如权利要求75所述的方法，其中该正义链和该反义链包含所述核苷酸序列
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。
77.如权利要求70所述的方法，其中该双链RNAi剂是每4周、每5周、或每6周长期地向该受试者给予。
78.一种治疗罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予固定剂量约50mg至约250mg的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
79.一种降低、减慢或阻止罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的神经病变损害评分(NIS)或经修正的NIS(mNIS+7)的方法，该方法包括向该受试者给予固定剂量约50mg至约250mg的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
80.一种增加罹患TTR相关疾病或处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者的6分钟步行测试(6MWT)的方法，该方法包括向该受试者给予固定剂量约50mg至约250mg的双链核糖核酸(RNAi)剂，
其中该双链RNAi剂包含与反义链互补的正义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2互补的区域，
其中每条链是约14个至约30个核苷酸的长度，
其中该正义链的基本上所有核苷酸和该反义链的基本上所有核苷酸是经修饰的核苷酸，
其中该正义链包含不超过8个2′-氟修饰；
其中该反义链包含不超过6个2′-氟修饰；
其中该正义链和该反义链各自独立地在5′-末端包含两个硫代磷酸酯键；并且
其中该正义链与至少一个配体轭合。
81.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂由式(IIIe)表示：
正义：5′-Na-YYY-Nb-3′
反义：3′-np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-5′ (IIIe)
其中：
np′是2个核苷酸突出，并且np′内的每个核苷酸经由硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接；
每个Na、Nb、Nb和Nb′独立地表示包含0-25个核苷酸的寡核苷酸序列，所述0-25个核苷酸是经修饰的或未经修饰的或其组合，每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸；
YYY和Y′Y′Y′各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
82.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)，
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)，和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
83.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该正义链和该反义链包含选自下组的核苷酸序列，该组由以下各项组成
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugguuacaugAfaaucccasusc-3’(SEQ ID NO:6)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-UfsCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:8)；以及
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-VPusCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:9)，其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键；并且VP是5′-磷酸酯模拟物。
84.如权利要求83所述的方法，其中该正义链和该反义链包含所述核苷酸序列
5’-usgsggauUfuCfAfUfguaaccaaga-3’(SEQ ID NO:10)和
5’-usCfsuugGfuuAfcaugAfaAfucccasusc-3’(SEQ ID NO:7)，
其中a、c、g、和u是2′-O-甲基(2′-OMe)A、C、G、或U；Af、Cf、Gf、和Uf是2′-氟A、C、G、或U；并且s是硫代磷酸酯键。
85.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约50mg的固定剂量向该受试者给予。
86.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约75mg的固定剂量向该受试者给予。
87.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约100mg的固定剂量向该受试者给予。
88.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约125mg的固定剂量向该受试者给予。
89.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约150mg的固定剂量向该受试者给予。
90.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约175mg的固定剂量向该受试者给予。
91.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约200mg的固定剂量向该受试者给予。
92.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约225mg的固定剂量向该受试者给予。
93.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂以约250mg的固定剂量向该受试者给予。
94.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂的固定剂量是约每4周、每5周、每6周、每8周或每季度一次向该受试者给予。
95.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂的固定剂量是约每季度一次向该受试者给予。
96.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其中该双链RNAi剂是长期地向该受试者给予。
97.如权利要求78-96中任一项所述的方法，其中该受试者是人类。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述受试者是罹患TTR相关疾病的受试者。
99.如权利要求97所述的方法，其中所述受试者是处于发展出TTR相关疾病的风险的受试者。
100.如权利要求78-99中任一项所述的方法，其中所述受试者携带与发展出TTR相关疾病相关的TTR基因突变。
101.如权利要求78-100中任一项所述的方法，其中所述TTR相关疾病选自下组，该组由以下各项组成：老年全身性淀粉样变性(SSA)、全身性家族性淀粉样变性、家族性淀粉样变性多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)、柔脑膜/中枢神经系统(CNS)淀粉样变性、和高甲状腺素血症。
102.如权利要求78-100中任一项所述的方法，其中所述受试者患有TTR相关的淀粉样变性，并且所述方法降低所述受试者中的淀粉样蛋白TTR沉积。
103.如权利要求78-102中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是通过选自下组的给予方式向所述受试者给予，该组由以下各项组成：皮下、静脉内、肌内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、淋巴、脑脊髓、及其任何组合。
104.如权利要求78-102中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是经由皮下、肌内或静脉内向所述受试者给予。
105.如权利要求78-102中任一项所述的方法，其中所述双链RNAi剂是经由皮下给予向所述受试者给予。
106.如权利要求105所述的方法，其中该皮下给予是自我给予。
107.如权利要求106所述的方法，其中该自我给予是经由预填充的针筒或自动注射器针筒。
108.如权利要求78-102中任一项所述的方法，其进一步包括评估在来源于该受试者的样品中的TTR mRNA表达或TTR蛋白质表达的水平。
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