UA126276C2 - КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ - Google Patents

КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ Download PDF

Info

Publication number
UA126276C2
UA126276C2 UAA201802022A UAA201802022A UA126276C2 UA 126276 C2 UA126276 C2 UA 126276C2 UA A201802022 A UAA201802022 A UA A201802022A UA A201802022 A UAA201802022 A UA A201802022A UA 126276 C2 UA126276 C2 UA 126276C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
nucleotides
agent
double
stranded
subject
Prior art date
Application number
UAA201802022A
Other languages
English (en)
Inventor
Трейсі Циммерманн
Трэйси Циммерманн
Емі Чань
Эми Чань
Васант Джадгав
Мартін Майєр
Мартин Майер
Каллантготтатгіл Ґ. Раджив
Каллантготтатгил Г. Раджив
Original Assignee
Елнілем Фармасьютікалз, Інк.
Элнилэм Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Елнілем Фармасьютікалз, Інк., Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Елнілем Фармасьютікалз, Інк.
Publication of UA126276C2 publication Critical patent/UA126276C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344—Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки на патент США Мо 62/199563, поданої 31 липня 2015 р., і попередньої заявки на патент США Мо 62/287518, поданої 27 січня 2016 р. Повний зміст кожної з вищезгаданих заявок таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Дана заявка стосується попередньої заявки на патент США Мо 61/881257, поданої 23 вересня 2013 р., і міжнародної заявки Ме РСТ/ЛІ52014/056923, поданої 23 вересня 2014 р., повний зміст кожної з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Крім того, дана заявка стосується попередньої заявки на патент США Мо 61/561710, поданої 18 листопада 2011 р., міжнародної заявки Ме РСТ/О5З2012/065601, поданої 16 листопада 2012 р., попередньої заявки на патент США Мо 61/615618, поданої 26 березня 2012 р., попередньої заявки на патент США Мо 61/680098, поданої б серпня 2012 р., заявки на патент США
Мо 14/358972, поданої 16 травня 2014 р., і міжнародної заявки Мо РСТ/О52012/065691, поданої 16 листопада 2012 р., повний зміст кожної з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Перелік послідовностей
Дана заявка включає перелік послідовностей, який був поданий в електронному вигляді у форматі з кодуванням АЗСІЇ, і таким чином включений в даний документ в повному обсязі за допомогою посилання. Вказана копія файлу з кодуванням АЗСІЇ, створена 8 липня 2016 р., має назву 121301-03020 5І хі, та її розмір становить 68289 байт.
Рівень техніки
Транстиретин (ТТК) (також відомий як преальбумін) присутній у сироватці крові та спинномозковій рідині (С5Е). ТК транспортує ретинол-зв'язувальний білок (КВР) і тироксин (Т4), а також функціонує як переносник ретинолу (вітамін А) завдяки його асоціації з КВР у крові та С5Е. Транстиретин названий так, оскільки він транспортує тироксин і ретинол. ТТК також функціонує як протеаза і може розщеплювати білки, у тому числі ароА-Ї (основний аполіпопротеїн НОЇ), амілоїдний В-пептид і нейропептид У. Див. / ї7, М.А. еї аї. (2010) ІШВМВ
Іте, 62(6):429-435.
ТТК являє собою тетрамер із чотирьох ідентичних субодиниць (мономерів) із 127 амінокислот з високим вмістом структури в формі бета-листа. Кожний мономер містить два 4-
Зо ланцюгових бета-листа і має форму витягнутого еліпсоїда. Взаємодії між антипаралельними бета-листами зв'язують мономери у димери. Коротка петля кожного з мономерів утворює головну димер-димерну взаємодію. Ці дві пари петель розділяють протилежні випуклі бета- листи димерів з утворенням внутрішнього каналу.
Печінка є основним місцем експресії ТТЕК. Інші важливі місця експресії включають судинне сплетіння, сітківку (зокрема пігментний епітелій сітківки) та підшлункову залозу.
Транстиретин є одним із щонайменше 27 різних типів білків, який являє собою білок- попередник у формуванні амілоїдних фібрил. Див. Спюшап, У. еї а). (Мом. 4, 2011) Ситепі регзресіїме5 оп сагаіас ату!оідовів, Ат п) РНузіої Неап Сік Рпузіої, доі:10.1152/а)рпеап.00815.2011. Позаклітинне відкладання амілоїдних фібрил в органах і тканинах є ознакою амілоїдозу. Амілоїдні фібрили складаються з неправильно згорнутих білків у формі агрегатів, що може бути результатом або конкретних мутацій у білках-попередниках, або їх надлишкової продукції. Амілоїдогенний потенціал ТТЕ може бути пов'язаний із його великою структурою в формі бета-листа; дослідження з використанням рентгенівської кристалографії вказують на те, що певні амілоїдогенні мутації дестабілізують тетрамерну структуру білка. Див., наприклад, Загаїма М..М. (2002) Ехрегпі Кемієму5 іп МоіІесшаг Медісіпе, 4(12):1-11.
Амілоїдоз є загальним терміном для групи амілоїдних захворювань, які характеризуються амілоїдними відкладеннями. Амілоїдні захворювання класифікуються на основі їх білка- попередника; наприклад, назва починається з "А" для амілоїду, після чтого йде скорочення білка- попередника, наприклад, АТТЕ для амілоїдогенного транстиретину. ІБіа.
Існує безліч ТТК-асоційованих захворювань, більшість з яких є амілоїдними захворюваннями. ТТЕ із нормальною послідовністю асоційований із амілоїдозом серця у людей похилого віку і називається сенільним системним амілоїдозом (55А) (також має назву сенільний амілоїдоз серця (ЗСА) або амілоїдоз серця). З5А часто супроводжується мікроскопічними відкладеннями у багатьох інших органах. Пов'язаний із ТТК амілоїдоз проявляється у різних формах. Якщо периферична нервова система зазнала більш значного ураження, захворювання має назву сімейна амілоїдна полінейропатія (ЄАР). Якщо в першу чергу залучене серце, а не нервова система, захворювання називається сімейною амілоїдною кардіоміопатією (ЕАС).
Третім основним типом пов'язаного із ТТК амілоїдозу є лептоменінгеальний амілоїдоз, також відомий як лептоменінгеальний або менінгоцереброваскулярний амілоїдоз, амілоїдоз бо центральної нервової системи (СМ5) або амілоїдоз МІ форми. Мутації в ТТЕ можуть також бути причиною амілоїдного помутніння скловидного тіла, синдрому зап'ястного каналу і еутиреоїдної гіпертироксинемії, яка не є амілоїдним захворюванням, яка, як вважається, обумовлена підвищеним зв'язуванням тироксину з ТТК, причиною якого є мутантна молекула ТТК із підвищеною афінністю до тироксину. Див., наприклад, Моз5ез еї аї. (1982) 9. Сііп. Іпмеві., 86, 2025-2033.
Аномальні амілоїдогенні білки можуть бути або спадковими, або набутими внаслідок соматичних мутацій. пап, «). еї аї. (Мом. 4, 2011) Ситепі регересіїме5 оп сагаїас ату!іоідовів, Ат
У РВузіо! Неагі Сігс РпПузіої, дої:10.1152/аїрпеап.00815.2011. Асоційований із транстиретином
АТТЕК є найчастішою формою спадкового системного амілоїдозу. І орайо, І. (2003) У. Мерпгої., 16:438-442. Мутації ТА зумовлюють прискорення процесу утворення амілоїду з ТІК і є найважливішим фактором ризику розвитку АТТЕ. Відомо, що більше ніж 85 амілоїдогенних варіантів ТТА спричинюють системний сімейний амілоїдоз. Мутації ТТК зазвичай призводять до системного відкладання амілоїду, особливо із залученням периферичної нервової системи, хоча деякі мутації асоційовані з кардіоміопатією або помутнінням скловидного тіла. ІБіа.
Мутація МЗОМ є найпоширенішою мутацією ТТК. Див., наприклад, ІГобраїю, ГГ. (2003) У
Мернгої, 16:438-442. Мутація М1221І спостерігається у 3,995 афроамериканців і вона є найбільш розповсюдженою причиною ЕАС. Удасорзоп, О.К. еї аї. (1997) М. Епої. У. Мей. 336 (7): 466--73. За оцінками, на 55А страждає більше ніж 2595 населення віком більше 80 років. УУехієегтагк, Р. еї а!. (1990) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. О.5.А. 87 (7): 2843-5.
Відповідно, у даній галузі існує необхідність у ефективних засобах лікування ТТЕ- асоційованих захворювань.
Короткий опис винаходу
У даному винаході передбачені засоби для КМАЇ, наприклад, двониткові засоби для КМАЇ, та композиції, що забезпечують цілеспрямований вплив на ген транстиретину (ТТК). У даному винаході також передбачені способи інгібування експресії ТІК і способи лікування або попередження ТТК-асоційованого захворювання у суб'єкта за допомогою засобів для КМАЇ, наприклад, двониткових засобів для КЕМАі за даним винаходом. Даний винахід базується, щонайменше частково, на виявленні того факту, що засоби для ЕМАЇ, в яких практично всі нуклеотиди сенсової нитки та практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою
Зо модифіковані нуклеотиди, і які містять не більше 8 2'-фтор-модифікацій у сенсовій нитці, не більше 6 2'-фтор-модифікацій у антисенсовій нитці, два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці сенсової нитки, два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці антисенсової нитки та ліганд, наприклад, ліганд
Са!МАсз, як показано в даному документі, є ефективними у сайленсингу активності гена ТТЕ. Ці засоби демонструють несподівано підвищену активність сайленсингу гена ТТЕК. Не обмежуючись будь-якою теорією припускають, що комбінація або підкомбінація вищезгаданих модифікацій і конкретних цільових сайтів у цих засобах для ЕМАЇ надають засобам для ЕМАЇ за даним винаходом поліпшену ефективність, стабільність, активність і тривалість дії.
Відповідно, в одному аспекті у даному винаході передбачені засоби на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇ) для інгібування експресії транстиретину (ТТК) в клітині, де засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- ОСаСАОООСАОСОААССАДСА -3)), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше б 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотісатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному варіанті здійснення, і де двонитковий засіб для КМАЇї представлений формулою (Ше):
БО сенсова нитка: 5'- Ма -М М М - Мь - 3", антисенсова нитка: 3" - пр-Ма- У" Мь'- 5' (Ше), де
Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Ма і Мь" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їх комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із МУ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів. бо В одному варіанті здійснення мотив УУУ знаходиться в сайті розщеплення сенсової нитки або поруч з ним. В одному варіанті здійснення мотив У" знаходиться в положеннях 11, 12 і 13 від 5-кінця антисенсової нитки.
В одному варіанті здійснення нуклеотиди У містять 2'-фтор-модифікацію.
В одному варіанті здійснення нуклеотиди У" містять 2'-О-метил-модифікацію.
Довжина двониткової ділянки може становити 15-30 пар нуклеотидів, 17-23 пари нуклеотидів, 17-25 пар нуклеотидів, 23-27 пар нуклеотидів, 19-21 пару нуклеотидів або 21-23 пари нуклеотидів.
Кожна нитка двониткового засобу для КМАїЇ може містити 15-30 нуклеотидів або 19-30 нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення модифікації нуклеотидів вибрані з групи, що складається з дезоксинуклеотиду, 3'-кінцевого дезокситимінового (ат) нуклеотиду, 2'-О-метил-модифікованого нуклеотиду, 2'-фтор-модифікованого нуклеотиду, 2'-дезокси-модифікованого нуклеотиду, замкненого нуклеотиду, незамкненого нуклеотиду, конформаційно обмеженого нуклеотиду, конформаційно утрудненого етилом нуклеотиду, позбавленого азотистої основи нуклеотиду, 2'- аміно-модифікованого нуклеотиду, 2-О-аліл-модифікованого нуклеотиду, 2-С-алкіл- модифікованого нуклеотиду, 2'-гідроксил-модифікованого нуклеотиду, 2'-метоксиетил- модифікованого нуклеотиду, 2'-О-алкіл-модифікованого нуклеотиду, морфолінового нуклеотиду, фосфорамідату, нуклеотиду, який містить неприродну основу, тетрагідропіран-модифікованого нуклеотиду, 1,5-ангідрогекситол-модифікованого нуклеотиду, циклогексеніл-модифікованого нуклеотиду, нуклеотиду, що містить фосфотіоатну групу, нуклеотиду, який містить метилфосфонатну групу, нуклеотиду, що містить 5'-фосфат, і нуклеотиду, який містить міметик
Б-фосфату, та їх комбінацій.
В одному варіанті здійснення модифікації нуклеотидів являють собою 2'-О-метил- або 2'- фтор-модифікації.
Сенсова нитка може містити не більше 7 2'-фтор-модифікацій, не більше б 2'-фтор- модифікацій, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше 3 2'- фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій.
Антисенсова нитка може містити не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор- модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАї додатково містить 5'-фосфат або міметик 5'--фосфату на 5'-кінцевому нуклеотиді антисенсової нитки. В іншому варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї додатково містить міметик 5'-фосфату на 5'-кінцевому нуклеотиді антисенсової нитки.
В одному варіанті здійснення міметик 5'-фосфату являє собою 5'-вінілфосфат (5'-МР).
В одному варіанті здійснення ліганд являє собою одну або декілька похідних саїмМАс, приєднаних за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера. В іншому варіанті здійснення ліганд являє собою но ИН но ит ий о
АсНнМ о і но /Н 5 о Н Н ооо ло
АснМ о о о но нн іо в) бити титм о
АСНМ ДН Н
В одному варіанті здійснення ліганд приєднаний до 3'-кінця сенсової нитки.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї кон'югований із лігандом, як показано на наступній схемі:
- Х о он он ною о ном ту оьоя ів он
НО дю ма: жили ук о но ЯН І а,
Поденм пам В о де Х являє собою О або 5.
В одному варіанті здійснення антисенсові нитки містять нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5- изСтвииддицасайдАтаайсссазивс - З' (ЗЕО ІЮО МО: 6), 5- ивСівидсатииАїсацдАтайисссазивс - 3' (5ЕО ІЮ МО:7), 5- ОСІ детииАсацдАтайисссазивс - 3'(5ЕО ІО МО: 8), та 5- МРизСізидетипАїсацдАтаАйтисссазивс - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 9), де а, с, д і и являють собою 2'-
О-метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, б або Ш; А Сі, сї і Оїб являють собою 2'-фтор- модифіковані А, С, 5 або |; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик
Б-фосфату.
В одному варіанті здійснення сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- изСтвииддицасайдАтаайсссазивс - З' (ЗЕО ІО МО: 6); 5- издазадайлистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- ивСівидса ти иАїсацдАтайисссазивс - 3' (5ЕО ІО МО: 7); 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- ОСІ детииАсацдАтайисссазивс - 3'(5ЕО ІО МО: 8); та 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - З'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- МРизСізидетицАїсацдАтТаАтисссазивс - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 9), де а, с, д і и являють собою 2'-
О-метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, б або Ш; А Сі, сї і Оїб являють собою 2'-фтор- модифіковані А, С, б або М; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик
Б-фосфату. В іншому варіанті здійснення сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності: 5'- изазддашлистАтгдиаассаада - 3'(5ЕО ІЮ МО: 10) і 5- изСтвицастииАїсайдАтайАтисссазивс - 3' (5ЕО ІО МО: 7), де а, с, д ії и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, с або Ш; Аї, СІ, СТ ії Ої являють собою 2'"-фтор-модифіковані
А, С, б або Ш; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок. У ще одному варіанті здійснення засіб для КМАЇ вибраний із групи будь-яких засобів для ЕМАЇї, наведених у будь-якій із таблиць 1 і 3. У
Ко) ще одному варіанті здійснення засіб для ЕМАЇї являє собою АЮ-65492.
В одному аспекті у даному винаході передбачені засоби на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇ) для інгібування експресії транстиретину (ТТЕ) в клітині, де засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, повністю комплементарну до ЗЕО ІЮ МО:2 (5'- ОсСапАОООСАОСОААССААСА - 3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше б 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотісатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом, де ліганд являє собою одну або декілька похідних
СаІМАс, приєднаних за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАї представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'- Ма -М М М - Мь - 3", антисенсова нитка: 3" - пр-Ма- У" Мь'- 5' (Ше), де
Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку;
кожний із Ма, Мь, Ма і Мь" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 8-10 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їх комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із МУ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів, і де модифікації є 2'-О-метил- або 2'-фтор- модифікаціями;
У даному винаході також передбачені клітини, що містять двониткові засоби для КМАЇ за даним винаходом, клітини, що містять вектори за даним винаходом, і фармацевтичні композиції, що містять двониткові засоби для КМАЇї за даним винаходом або вектори за даним винаходом.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять у небуферному розчині, наприклад, сольовому розчині або воді.
В іншому варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАїЇі вводять з буферним розчином. В одному варіанті здійснення буферний розчин містить ацетат, цитрат, проламін, карбонат або фосфат або будь-яку їх комбінацію. В іншому варіанті здійснення буферний розчин являє собою фосфатно-сольовий буферний розчин (РВ5Б).
В іншому аспекті у даному винаході передбачені способи інгібування експресії транстиретину (ТТК) у клітині. Способи передбачають (а) приведення клітини в контакт з двонитковими засобами для ЕМАїі за даним винаходом, векторами за даним винаходом або фармацевтичними композиціями за даним винаходом; і (б) підтримання клітини, одержаної на стадії (а), протягом часу, достатнього для забезпечення руйнування мРНК-транскрипту гена
ТТЕ, завдяки чому здійснюється інгібування експресії гена ТТ в клітині.
В одному варіанті здійснення клітина знаходиться в організмі суб'єкта.
В одному варіанті здійснення суб'єктом є людина.
В одному варіанті здійснення суб'єкт страждає на ТТК-асоційоване захворювання.
В одному варіанті здійснення експресія ТТЕ інгібується щонайменше на приблизно 1095, на приблизно 1595, на приблизно 2095, на приблизно 2595, на приблизно 3095, на приблизно 4095, на приблизно 5095, на приблизно 6095, на приблизно 7095, на приблизно 8095, на приблизно 9095, на приблизно 9595, на приблизно 9895 або на приблизно 10095.
Зо У ще одному аспекті в даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК), шляхом введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткових засобів для ЕМАЇ за даним винаходом, або векторів за даним винаходом, або фармацевтичних композицій за даним винаходом, завдяки чому здійснюється лікування суб'єкта.
У ще одному аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку порушення, асоційованого з транстиретином (ТТК), шляхом введення суб'єкту профілактично ефективної кількості двониткових засобів для КМАЇ за даним винаходом, або векторів за даним винаходом, або фармацевтичних композицій за даним винаходом, завдяки чому здійснюється профілактичне лікування суб'єкта.
У додатковому аспекті в даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткового засобу для ЕМАЇ, де двонитковий засіб для
КЕМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО:2 (5- ОСДИаСАОООСАОСОААССАДСА -3)), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше б 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотісатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
У додатковому аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку порушення, асоційованого з транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту профілактично ефективної кількості двониткового засобу для
ЕМАЇ, де двонитковий засіб для КМАїЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕБО ІЮ МО:2 (5- рапаАОООСАОсОААСсСААСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- 60 модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті у даному винаході передбачені способи зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІ5 (тМІ5-7) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК).
Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткових засобів для ЕМАЇ за даним винаходом, або векторів за даним винаходом, або фармацевтичних композицій за даним винаходом, завдяки чому забезпечується зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІ5 (піМІ5--7) у суб'єкта.
У додатковому аспекті у даному винаході передбачені способи зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала симптомів за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІБ5) або модифікованою МІЗ (тМіІб-7) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткового засобу для КМАі, де двонитковий засіб для ЕМАї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЗЕО ІЮ МО:2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи підвищення показника тесту з 6- хвилинною ходьбою (6ММУТ) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК).
Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткових засобів для ЕМАЇ за даним винаходом, або векторів за даним винаходом, або фармацевтичних композицій за даним винаходом, завдяки чому забезпечується підвищення показника тесту з 6- хвилинною ходьбою (6МУМТ) у суб'єкта.
У додатковому аспекті в даному винаході передбачені способи підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6МУМТ) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином
Зо (ТК). Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості двониткового засобу для КМАі, де двонитковий засіб для ЕМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЗЕО ІЮ МО:2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАї представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'- Ма -М М М - Мь - 3", антисенсова нитка: 3" - пр-Ма- У" Мь'- 5' (Ше), де
Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Мь ії Му" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їх комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із МУ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення суб'єктом є людина.
В одному варіанті здійснення суб'єктом є суб'єкт, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання. В іншому варіанті здійснення суб'єктом є суб'єкт із ризиком розвитку ТТК- асоційованого захворювання. В одному варіанті здійснення суб'єкт із ризиком розвитку ТТК- асоційованого захворювання має мутацію в гені ТТК, асоційовану з розвитком ТТК- асоційованого захворювання, або є суб'єктом із сімейним анамнезом ТТЕ-асоційованого захворювання, або суб'єктом, у якого спостерігаються ознаки або симптоми, які свідчать про розвиток пов'язаного з ТТЕК амілоїдозу.
В одному варіанті здійснення ТТН-асоційоване захворювання вибране з групи, що складається з сенільного системного амілоїдозу (55А), системного сімейного амілоїдозу, бо сімейної амілоїдної полінейропатії (БАР), сімейної амілоїдної кардіоміопатії (ЕАС),
лептоменінгеального амілоїдозу/"амілоїдозу центральної нервової системи (СМ5) і гіпертироксинемії.
В одному варіанті здійснення у суб'єкта спостерігається ТТК-асоційований амілоїдоз, і при цьому спосіб забезпечує зниження відкладання ТТЕ-амілоїду у суб'єкта.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять суб'єкту за допомогою шляху введення, вибраного з групи, що складається з підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньобронхіального, внутрішньоплеврального, внутрішньочеревного, внутрішньоартеріального, лімфатичного, спинномозкового і будь-яких їх комбінацій. В іншому варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАЇї вводять суб'єкту шляхом підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення. У ще одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇ вводять суб'єкту шляхом підшкірного введення.
В одному варіанті здійснення способи додатково включають оцінку рівня експресії мРНК
ТТЕ або експресії білка ТТК у зразку, одержаному від суб'єкта.
В одному варіанті здійснення введення двониткового засобу для КМАїі не призводить до запальної реакції у суб'єкта, що оцінюють за рівнем цитокіну або хемокіну, вибраних із групи, що складається з 5-21, ТЕМ-у, 1-10, 1-12 (р70), 1-18, 1 -Тга, 1-6, 20 11-86, ІР-10, МОСР-1, МІР-1а,
МІР-1ВД, ТМЕа і будь-якої їх комбінації, у зразку від суб'єкта.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 12,5 мг до приблизно 200 мг (наприклад, приблизно 12,5 мг, приблизно 25 мг, приблизно 50 мг, приблизно 75 мг, приблизно 100 мг, приблизно 125 мг, приблизно 150 мг, приблизно 175 мг або приблизно 200 мг) двониткового засобу для ЕМАЇ, де двонитковий засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕБЕО ОО МО:2 (5- раваАОООСАОсОААСсСААСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В іншому аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку порушення, асоційованого з транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 12,5 мг до приблизно 200 мг (наприклад, приблизно 12,5 мг, приблизно 25 мг, приблизно 50 мг, приблизно 75 мг, приблизно 100 мг, приблизно 125 мг, приблизно 150 мг, приблизно 175 мг або приблизно 200 мг) двониткового засобу для КМАЇї, де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- О0СИаСаАОООСАОСОДАССАДСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'"-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 0,15 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг (наприклад, приблизно 0,15 мг/кг, приблизно 0,3 мг/кг, приблизно 0,6 мг/кг, приблизно 1 мг/кг, приблизно 1,25 мг/кг, приблизно 2 мг/кг, приблизно 2,5 мг/кг або приблизно З мг/кг) двониткового засобу для КМАЇ, де двонитковий засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- ОДОаСАОООСАОСОААССАдДаА -3)), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше б 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотісатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку порушення, асоційованого з транстиретином (ТТК). Способи 60 передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 0,15 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг
(наприклад, приблизно 0,15 мг/кг, приблизно 0,3 мг/кг, приблизно 0,6 мг/кг, приблизно 1 мг/кг, приблизно 1,25 мг/кг, приблизно 2 мг/кг, приблизно 2,5 мг/кг або приблизно З мг/кг) двониткового засобу для КМАЇї, де двонитковий засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- рапаАОООСАОсОААСсСААСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В іншому аспекті у даному винаході передбачені способи зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІ5 (тМІ5-7) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК).
Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 0,15 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг (наприклад, приблизно 0,15 мг/кг, приблизно 0,3 мг/кг, приблизно 0,6 мг/кг, приблизно 1 мг/кг, приблизно 1,25 мг/кг, приблизно 2 мг/кг, приблизно 2,5 мг/кг або приблизно З мг/кг) двониткового засобу для КМАЇї, де двонитковий засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- рапаАОООСАОсОААСсСААСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
У ще одному аспекті в даному винаході передбачені способи підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6ЄММУТ) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТЮК).
Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 0,15 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг (наприклад, приблизно 0,15 мг/кг, приблизно 0,3 мг/кг, приблизно 0,6 мг/кг, приблизно 1 мг/кг, приблизно 1,25 мг/кг, приблизно 2 мг/кг, приблизно 2,5 мг/кг або приблизно З мг/кг) двониткового засобу для КМАЇї, де двонитковий засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- рапаАОООСАОсОААССААСсА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 10 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 500 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 300 мг (наприклад, приблизно 10, приблизно 20, приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 60, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 110, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 175, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 225, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250 мг, приблизно 260, приблизно 270, приблизно 275, приблизно 280, приблизно 290, приблизно 300, приблизно 310, приблизно 320, приблизно 325, приблизно
БО 330, приблизно 340, приблизно 350, приблизно 360, приблизно 370, приблизно 375, приблизно 380, приблизно 390, приблизно 400, приблизно 410, приблизно 420, приблизно 425, приблизно 430, приблизно 440, приблизно 450 мг, приблизно 460, приблизно 470, приблизно 475, приблизно 480, приблизно 490, приблизно 500, приблизно 510, приблизно 520, приблизно 525, приблизно 530, приблизно 540, приблизно 550, приблизно 560, приблизно 570, приблизно 575, приблизно 580, приблизно 590 або приблизно 600 мг) двониткового засобу для ЕМАЇ, де двонитковий засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕБЕО ОО МО:2 (5- раваАОООСАОсОААСсСААСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі бо нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор- модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку порушення, асоційованого з транстиретином (ТТК). Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 10 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 500 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 300 мг (наприклад, приблизно 10, приблизно 20, приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 60, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 110, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 175, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 225, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250 мг, приблизно 260, приблизно 270, приблизно 275, приблизно 280, приблизно 290, приблизно 300, приблизно 310, приблизно 320, приблизно 325, приблизно 330, приблизно 340, приблизно 350, приблизно 360, приблизно 370, приблизно 375, приблизно 380, приблизно 390, приблизно 400, приблизно 410, приблизно 420, приблизно 425, приблизно 430, приблизно 440, приблизно 450 мг, приблизно 460, приблизно 470, приблизно 475, приблизно 480, приблизно 490, приблизно 500, приблизно 510, приблизно 520, приблизно 525, приблизно 530, приблизно 540, приблизно 550, приблизно 560, приблизно 570, приблизно 575, приблизно 580, приблизно 590 або приблизно 600 мг) двониткового засобу для ЕМАЇї, де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО:2 (5- О0СИаСаАОООСАОСОДАССАДСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
Зо В іншому аспекті у даному винаході передбачені способи зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІ5 (тМІ5-7) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК).
Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 10 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 500 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 300 мг (наприклад, приблизно 10, приблизно 20, приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 60, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 110, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 175, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 225, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250, приблизно 260, приблизно 270, приблизно 275, приблизно 280, приблизно 290, приблизно 300, приблизно 310, приблизно 320, приблизно 325, приблизно 330, приблизно 340, приблизно 350, приблизно 360, приблизно 370, приблизно 375, приблизно 380, приблизно 390, приблизно 400, приблизно 410, приблизно 420, приблизно 425, приблизно 430, приблизно 440, приблизно 450, приблизно 460, приблизно 470, приблизно 475, приблизно 480, приблизно 490, приблизно 500, приблизно 510, приблизно 520, приблизно 525, приблизно 530, приблизно 540, приблизно 550, приблизно 560, приблизно 570, приблизно 575, приблизно 580, приблизно 590 або приблизно 600 мг) двониткового засобу для КМАЇ, де двонитковий засіб для КМАЇ містить
БО сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО:2 (5- ОФЮССОАОООСАОСОДАССАДСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше б 2'"-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінції і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
У ще одному аспекті в даному винаході передбачені способи підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6ЄММУТ) у суб'єкта з порушенням, асоційованим із транстиретином (ТТК). 60 Способи передбачають введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 10 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 500 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг, або від приблизно 80 мг до приблизно 300 мг (наприклад, приблизно 10, приблизно 20, приблизно 30, приблизно 40, приблизно 50, приблизно 60, приблизно 70, приблизно 75, приблизно 80, приблизно 90, приблизно 100, приблизно 110, приблизно 120, приблизно 125, приблизно 130, приблизно 140, приблизно 150, приблизно 160, приблизно 170, приблизно 175, приблизно 180, приблизно 190, приблизно 200, приблизно 210, приблизно 220, приблизно 225, приблизно 230, приблизно 240, приблизно 250, приблизно 260, приблизно 270, приблизно 275, приблизно 280, приблизно 290, приблизно 300, приблизно 310, приблизно 320, приблизно 325, приблизно 330, приблизно 340, приблизно 350, приблизно 360, приблизно 370, приблизно 375, приблизно 380, приблизно 390, приблизно 400, приблизно 410, приблизно 420, приблизно 425, приблизно 430, приблизно 440, приблизно 450, приблизно 460, приблизно 470, приблизно 475, приблизно 480, приблизно 490, приблизно 500, приблизно 510, приблизно 520, приблизно 525, приблизно 530, приблизно 540, приблизно 550, приблизно 560, приблизно 570, приблизно 575, приблизно 580, приблизно 590 або приблизно 600 мг) двониткового засобу для КМАЇ, де двонитковий засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО:2 (5- ОФЮССОАОООСАОСОДАССАДСА -3), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'"-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінції і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'- Ма -М М М - Мь - 3", антисенсова нитка: 3" - пр-Ма- У" Мь'- 5' (Ше), де
Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр зв'язаний із
Зо сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку; кожний із Ма, МБ, МБ і МБ' незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їх комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із МУ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5- изСтвииддицасайдАтаайсссазивс - З' (ЗЕО ІЮО МО: 6), 5- ивСівидсатииАїсацдАтТалисссазивс - З'ЇЗЕО ІО МО: 7), 5- ОСІ детииАсацдАтайисссазивс - 3'(5ЕО ІО МО: 8), та 5- МРизСізидетицАїсацдАтТаАтисссазивс - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 9), де а, с, д і и являють собою 2'-
О-метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, б або Ш; А Сі, сї і Оїб являють собою 2'-фтор- модифіковані А, С, б або І; 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'- фосфату.
В одному варіанті здійснення сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з 5- издазадашлистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- изСтвииддицасайдАтаайсссазивс - З' (ЗЕО ІО МО: 6); 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- ивСівидса ти иАїсацдАтайисссазивс - 3' (5ЕО ІО МО: 7); 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - З'(5ЕО ІЮ МО: 10) та 5- ОС цдетииАсацдАтайтисссазивс - З'ЇЗЕО ІЮО МО: 8); та 5- издазадайштистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- МРизСізидетицАїсацдАтТаАтисссазивс - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 9), де а, с, д і и являють собою 2'-
О-метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, б або Ш; А Ст ОЇ і 07 являють собою 2'-фтор- модифіковані А, С, 5 або |; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик
Б-фосфату.
В одному варіанті здійснення сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні 60 послідовності:
5- изазадашлистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5- ивСівидса ти иАїсацдАтайисссазивс - 3' (5ЕО ІО МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2"-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, С або ЦО; АГ, СТ, сі г являють собою 2'"-фтор-модифіковані А, С, с або Ш; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
Фіксовану дозу двониткового засобу для КМАії можна вводити суб'єкту один раз на приблизно кожні 4 тижні, кожні 5 тижнів, кожні шість тижнів, кожні вісім тижнів або один раз на три місяці.
Дозу двониткового засобу для КМАЇї можна вводити суб'єкту один раз на приблизно кожні 4 тижні, кожні 5 тижнів, кожні шість тижнів, кожні вісім тижнів або один раз на три місяці.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАЇї вводять суб'єкту приблизно один раз на три місяці.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАЇї вводять суб'єкту протягом тривалого часу.
В одному варіанті здійснення суб'єктом є людина.
В одному варіанті здійснення суб'єктом є суб'єкт, який страждає на ТТЕК-асоційоване захворювання. В іншому варіанті здійснення суб'єктом є суб'єкт із ризиком розвитку ТТК- асоційованого захворювання. В одному варіанті здійснення суб'єкт із ризиком розвитку ТТК- асоційованого захворювання має мутацію в гені ТТК, асоційовану з розвитком ТТК- асоційованого захворювання, або є суб'єктом із сімейним анамнезом ТТЕ-асоційованого захворювання, або суб'єктом, у якого спостерігаються ознаки або симптоми, які свідчать про розвиток пов'язаного з ТТЕК амілоїдозу.
В одному варіанті здійснення ТТН-асоційоване захворювання вибране з групи, що складається з сенільного системного амілоїдозу (55А), системного сімейного амілоїдозу, сімейної амілоїдної полінейропатії (БАР), сімейної амілоїдної кардіоміопатії (РАС), лептоменінгеального амілоїдозу/амілоїдозу центральної нервової системи (СМ5) і гіпертироксинемії.
В одному варіанті здійснення у суб'єкта спостерігається ТТК-асоційований амілоїдоз, і при цьому спосіб забезпечує зниження відкладання ТТЕ-амілоїду у суб'єкта.
В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять суб'єкту за допомогою
Зо шляху введення, вибраного з групи, що складається з підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньобронхіального, внутрішньоплеврального, внутрішньочеревного, внутрішньоартеріального, лімфатичного, спинномозкового і будь-яких їх комбінацій. В іншому варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇ вводять суб'єкту шляхом підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення. У ще одному варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАї вводять суб'єкту шляхом підшкірного введення, наприклад, введення здійснюється самостійно, наприклад, за допомогою попередньо заповненого шприца або автоматичного медичного шприца.
В одному варіанті здійснення способи додатково включають оцінку рівня експресії мРНК
ТТЕ або експресії білка ТТК у зразку, одержаному від суб'єкта.
В одному варіанті здійснення введення двониткового засобу для КМАЇї не призводить до запальної реакції у суб'єкта, що оцінюють за рівнем цитокіну або хемокіну, вибраних із групи, що складається з 5-С51Е, ТЕМ-у, 1-10, 1-12 (р70), 1-18, П-Тга, 1-6, 20 11-86, ІР-10, МОСР-1, МІР-1а,
МІР-1В, ТМЕа і будь-якої їх комбінації, у зразку від суб'єкта.В одному варіанті здійснення засіб, придатний для застосування в способах за даним винаходом, являє собою АЮ-65492. АЮ-65492 можна вводити суб'єкту протягом тривалого часу кожні 4 тижні, кожні 5 тижнів або кожні шість тижнів або кожні три місяці.
В одному аспекті в даному винаході передбачені засоби на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ЕМАЇ) для застосування в інгібуванні експресії транстиретину (ТТЕ) в клітині. Засоби включають сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з будь- яких із нуклеотидних послідовностей в таблиці 5.
В іншому аспекті в даному винаході передбачені засоби на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ЕМАЇ) для застосування в інгібуванні експресії транстиретину (ТТЕ) в клітині. Засоби включають сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, при цьому антисенсова нитка містить ділянку комплементарності, яка містить щонайменше 15 суміжних нуклеотидів, що відрізняються не більше ніж З нуклеотидами від будь-якої з антисенсових послідовностей, наведених у таблиці 6, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом. бо Сенсова та антисенсова нитки можуть містити нуклеотидні послідовності, вибрані з групи,
що складається з будь-яких із нуклеотидних послідовностей в таблиці 6 або таблиці 7.
В одному аспекті у даному винаході передбачені засоби на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ЕМАЇ) для застосування в інгібуванні експресії транстиретину (ТТЕ) в клітині, де засоби для ЕМАЇ містять сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- издзадайшистАтдиаассаада - З (5ЕО І
МО: 19) і антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5- изСівидетиАїсайдАтТаАйтисссазивс - 3'(ЗЕО ІО МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил- модифіковані (2'-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СІ, С ії Ої являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, б або М; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
В іншому аспекті у даному винаході передбачені способи лікування суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання. Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг двониткового засобу для КМАЇ, де засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- издазддайлЛистАттдиаассаада - 3'(ЗЕО ІО МО: 10) і антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- изСї5иидстиАгсацдАгтайисссазивс - 3' (ЗЕО ІО МО: 7), деа, с, ді и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, б або М; Аг, СТ, сї ії Ж являють собою 2"-фтор-модифіковані А, С, б або Ш; ії 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок, завдяки чому здійснюється лікування суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання.
У ще одному аспекті в даному винаході передбачені способи профілактичного лікування суб'єкта з ризиком розвитку ТТК-асоційованого захворювання. Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг двониткового засобу для ЕМАЇ, де засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- изаздачаштистАтОгдиаассаада - 3'(ЗЕО ІО МО: 10) і антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- изСївиидстииАсаидАталйтисссавзивс -
З (ЗБОЮ МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, б або и;
Аї, Сі, сг і Об являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, б або ШО; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок, завдяки чому здійснюється профілактичне лікування суб'єкта з ризиком розвитку ТТК-асоційованого захворювання.
В одному аспекті у даному винаході передбачені способи зменшення, уповільнення або
Зо припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІ5 (птіМІ5--7) у суб'єкта, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання. Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг двониткового засобу для ЕМАЇ, де засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- издзадашлистАтгднаассаада - 3 (ЗЕО ІЮ МО: 10) і антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- изСївиидстииАсаидАталйтисссавзивс -
З'ЇЗЕО ІЮ МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, б або и;
Аї, Сі, сг і Об являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, б або ШО; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок, завдяки чому забезпечується зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІЗ) або модифікованою МІЗ (тпМІ5 7) у суб'єкта.
В іншому аспекті у даному винаході передбачені способи підвищення показника тесту з 6- хвилинною ходьбою (6МУМТ) у суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання. Способи передбачають введення суб'єкту дози від приблизно 50 мг до приблизно 300 мг двониткового засобу для ЕМАЇ, де засіб для КМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- издзадашлистАтгднаассаада - 3 (ЗЕО ІЮ МО: 10) і антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність 5'- изСївиидстииАсаидАталйтисссавзивс -
З (ЗБОЮ МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, б або и;
БО Аї, Сі, сг і Об являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, б або ШО; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок, завдяки чому забезпечується підвищення показника тесту з 6- хвилинною ходьбою (6МУМТ) у суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання.
Даний винахід додатково проілюстровано за допомогою наступного детального опису та графічних матеріалів.
Короткий опис графічних матеріалів
Фігура 1 являє собою графік, що зображує стабільність вказаних засобів для КМАЇ у двадцятичотирьохгодинному аналізі стабільності у тритосомах.
Фігура 2А являє собою графік, що зображує стабільність вказаних засобів для ЕМАЇ у бо двадцятичотирьохгодинному аналізі стабільності в цитозолі пацюків, і фігура 28 являє собою графік, що зображує стабільність вказаних засобів для КМАії у двадцятичотирьохгодинному аналізі стабільності у тритосомах.
Фігура З являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТЕК в трансгенних мишей, які експресують варіант МЗОМ ТТК людини (ПТК УЗОМ), після введення одноразової підшкірної дози 1 мг/кг вказаних засобів для КМАЇ.
Фігура 4 являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТЕК в трансгенних мишей, які експресують ПТТК МЗОМ, після введення одноразової підшкірної дози 2,5 мг/кг вказаних засобів для ЕМАЇ.
Фігура 5 являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТЕК в трансгенних мишей, які експресують пЯТТК УЗОМ, після введення дози 2 мг/кг АЮ-65492 один раз на тиждень протягом трьох тижнів (ОМУХЗ).
Фігура 6А являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в трансгенних мишей, які експресують пЯТТК МУЗОМ, після підшкірного введення дози 0,3 мг/кг вказаних засобів для ЕМАЇ один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМх4 у кількості 0,3 мг/кг). Фігура 6В являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в трансгенних мишей, які експресують ПТТЕ МУЗОМ, після підшкірного введення дози 1 мг/кг вказаних засобів для КМАЇ один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМХА4 у кількості 1 мг/кг). Фігура 6С являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білюа ТТК в трансгенних мишей, які експресують
ТТ МУЗОМ, після підшкірного введення дози З мг/кг вказаних засобів для КМАЇї один раз на місяць протягом чотирьох місяців (0МхаА у кількості З мг/кг).
На фігурі 7 зображено план дослідження підшкірного введення АЮ-65492 і А0-66017 яванським макакам.
Фігура ВА являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в яванських макак після введення одноразової підшкірної дози 0,3 мг/кг вказаних засобів для КМАЇї. Фігура 8В являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТЕ в яванських макак після введення одноразової підшкірної дози 1 мг/кг АЮО-65492, одноразової підшкірної дози 1 мг/кг АО- 66017 або одноразової підшкірної дози 2,5 мг/кг АО-51547. Фігура 8С являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в яванських макак після введення одноразової підшкірної дози З мг/кг АЮ-65492, одноразової підшкірної дози З мг/кг АЮ-66017 або одноразової підшкірної дози 5 мг/кг АЮ-51547.
Фігура 9А являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в яванських макак після введення підшкірної дози 1 мг/кг АЮ-65492 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (С0Мха4), підшкірної дози 1 мг/кг АЮО-66017 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМха4) або дози 5 мг/кг АЮ-51547 один раз на день протягом п'яти днів з наступним введенням
З5 дози 5 мг/кг один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів (2О0х5, ОМУх4). Фігура 9В являє собою графік, що зображує пригнічення експресії білка ТТК в яванських макак після введення підшкірної дози З мг/кг вказаних засобів для ЕМАЇ один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМха).
Фігура 10А являє собою графік, що зображує підтримання пригнічення експресії ТА шляхом підшкірного введення дози 1 мг/кг АЮ-65492 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (0Мх4; суцільна лінія) порівняно з пригніченням експресії ТТК після введення одноразової підшкірної дози 1 мг/кг АЮ-65492 (пунктирна лінія) в яванських макак.
Фігура 108 являє собою графік, що зображує адитивний ефект підшкірного введення дози 1 мг/кг АО-66017 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (0Мх4; суцільна лінія) стосовно пригнічення експресії білка ТТК порівняно з одноразовою підшкірною дозою 1 мг/кг АЮ-66017 (пунктирна лінія) в яванських макак.
Фігура 11 являє собою графік, що зображує стійке пригнічення експресії ТТК у сироватці крові яванських макак після підшкірного введення дози 1 мг/кг АЮО-65492 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМх4) або підшкірного введення дози З мг/кг АЮ-65492 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (СМх4) порівняно з одноразовою підшкірно введеною дозою 1 мг/кг АЮ-65492 або одноразовою підшкірно введеною дозою 0,3 мг/кг АЮ-65492.
На фігурі 12 зображено план дослідження підшкірного введення АЮ-65492 яванським макакам.
Фігура 13 являє собою графік, що зображує стійке пригнічення експресії ТТК у сироватці крові яванських макак після підшкірного введення дози 0,3 мг/кг АО-65492 один раз на місяць протягом шести місяців (ОМхб), або підшкірного введення дози 0,6 мг/кг АО-65492 один раз на місяць протягом шести місяців (0Мхб), або введення одноразової початкової дози 1 мг/кг АЮО- 65492 (ОМХ1) з наступним введенням дози 0,3 мг/кг АЮ-65492 один раз на місяць, починаючи від дня 28 після введення початкової дози, протягом п'яти місяців (ОМХх5). 60 Детальний опис винаходу
У даному винаході передбачені засоби для КМАЇ, наприклад, двониткові засоби для КМАЇ, та композиції, що забезпечують цілеспрямований вплив на ген транстиретину (ТТК). У даному винаході також передбачені способи інгібування експресії ТТК і способи лікування або попередження ТТК-асоційованого захворювання у суб'єкта за допомогою засобів для КМАЇ, наприклад, двониткових засобів для КЕМАі за даним винаходом. Даний винахід базується, щонайменше частково, на виявленні того факту, що засоби для ЕМАЇ, в яких практично всі нуклеотиди сенсової нитки та практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, і які містять не більше 8 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 7 2"-фтор-модифікацій, не більше 6 2'"-фтор-модифікацій, не більше 5 2'"-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор- модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) у сенсовій нитці, не більше 6 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій, або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) у антисенсовій нитці, два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці сенсової нитки, два фосфотісатні зв'язки на 5'-кінці антисенсової нитки і ліганд, наприклад, ліганд сзаїіМАсз, як показано в даному документі, є ефективними у вибірковому сайленсингу активності гена ТТК. Ці засоби демонструють несподівано підвищену активність сайленсингу гена ТТ. Не обмежуючись будь- якою теорією припускають, що комбінація або підкомбінація вищезгаданих модифікацій і конкретних цільових сайтів у цих засобах для КМАії надають засобам для ЕМАїі за даним винаходом поліпшену ефективність, стабільність, активність і тривалість дії.
У наступному детальному описі розкрито, як одержувати та застосовувати композиції, які містять ІЕМА, для вибіркового інгібування експресії гена ТТК, а також композиції, шляхи застосування та способи лікування суб'єктів із захворюваннями та порушеннями, на які будуть сприятливо впливати інгібування та/або зниження експресії гена ТК.
І. Визначення
Для того, щоб даний винахід можна було легше зрозуміти, спочатку наведені визначення деяким термінам. Крім того, слід зазначити, що у всіх випадках в переліках значення або діапазону значень параметра мається на увазі, що значення та діапазони, проміжні щодо перелічених значень, маються на увазі також як частина даного винаходу.
Зо Форму однини використовують у даному документі для позначення одного або декількох (тобто щонайменше одного) граматичних об'єктів даної заявки. Як приклад, "елемент" означає один елемент або декілька елементів, наприклад багато елементів.
Термін "що включає" використовують у даному документі для позначення фрази "що включає без обмеження", і використовують взаємозамінно з нею.
Термін "або" використовують у даному документі для позначення терміна "та/або" і використовують взаємозамінно з ним, якщо контекст явно не вказує інше.
Термін "приблизно" використовується в даному документі для позначення типових діапазонів допустимих відхилень у даній галузі. Наприклад, "приблизно" можна розуміти як приблизно 2 стандартних відхилення від середнього. У певних варіантах здійснення приблизно означає яї1095. У певних варіантах здійснення приблизно означає жї595. Якщо "приблизно" знаходиться перед групою числових значень або діапазоном, слід розуміти, що "приблизно" може модифікувати кожне з числових значень в групі або діапазоні.
Як використовується в даному документі, "транстиретин" ("ТТ") стосується добре відомого гена та білка. ТТЕ також відомий як преальбумін, НеТ2651, РАВ і ТВРА. ТТК функціонує як транспортер ретинол-зв'язувального білка (КВР), тироксину (14) і ретинолу, і він також діє як протеаза. Печінка секретує ТТК у кров, а судинне сплетіння секретує ТТК в спинномозкову рідину. ТТК також експресується в підшлунковій залозі та пігментному епітелії сітківки.
Найбільша клінічна значимість ТТК полягає в тому, що як нормальний, так і мутантний білок
ТТЕ може утворювати амілоїдні фібрили, які агрегують з утворенням позаклітинних відкладень, спричиняючи амілоїдоз. Для огляду див., наприклад, Загаіїма М.9У.М. (2002) Ехреп Кемієму5 іп
МоїІесшіаг Меадісіпе, 4(12):11-141. Молекулярне клонування і нуклеотидну послідовність транстиретину пацюка, а також розповсюдження експресії мРНК, описали ОісКзоп, Р.МУ. еї аї. (1985) 9. Віої. Спет. 260(13)8214-8219. Рентгенівська кристалічна структура ТТК людини описана в ВіаКе, С.С. еї аї. (1974) У Мої! Вісо! 88, 1-12. Послідовність мРНК-транскрипту ТТК людини можна знайти в Кеїзед від Національного центру біотехнологічної інформації (МОВІ) під номером доступу ММ 000371 (наприклад, 5Е2 ІЮ МО:1 ї 5). Послідовність МРНК ТТК миші можна знайти в Кеїзед під номером доступу ММ 013697.2, а послідовність МРНК ТТК пацюка можна знайти в КеїзЗед під номером доступу ММ 012681.1. Додаткові приклади послідовностей
МРНК ТТК легко доступні в загальнодоступних базах даних, наприклад, СепВапкК, ОпіРгої і (510) ОМІМ.
Як використовується в даному документі, "цільова послідовність" стосується неперервної частини нуклеотидної послідовності молекули РНК, що утворюється в процесі транскрипції гена
ТТЕ, у тому числі мРНК, яка є продуктом процесингу РНК первинного продукту транскрипції. В одному варіанті здійснення цільова частина послідовності буде щонайменше достатньо довгою, щоб служити як субстрат для керованого ІКМА розщеплення в цій частині або поряд із цією частиною нуклеотидної послідовності молекули РНК, що утворюється в процесі транскрипції гена ТТК. В одному варіанті здійснення цільова послідовність знаходиться в межах ділянки гена
ТТЕ, що кодує білок. В іншому варіанті здійснення цільова послідовність знаходиться в межах 3-ТК гена ТТ.
Довжина цільової послідовності може становити приблизно 9-36 нуклеотидів, наприклад, приблизно 15-30 нуклеотидів. Наприклад, довжина цільової послідовності може становити приблизно 15-30 нуклеотидів, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19- 30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 або 21-22 нуклеотиди. У деяких варіантах здійснення довжина цільової послідовності становить від приблизно 19 до приблизно 30 нуклеотидів. В інших варіантах здійснення довжина цільової послідовності становить від приблизно 19 до приблизно 25 нуклеотидів. У ще одних варіантах здійснення довжина цільової послідовності становить від приблизно 19 до приблизно 23 нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення довжина цільової послідовності становить від приблизно 21 до приблизно 23 нуклеотидів. Значення діапазону та довжини, проміжні щодо наведених вище значень діапазону та довжини, також розглядаються як частина даного винаходу.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу цільова послідовність гена ТТК містить нуклеотиди 615-637 5БЕО ІЮ МО:1 або нуклеотиди 505-527 5БЕО ІЮ МО:5 (тобто 5- вАТаСОаАТТТСАТИатТААССААСА - 3"; 5БЕО ІЮ МО 4).
Використовуваний у даному документі термін "нитка, яка містить послідовність" стосується олігонуклеотиду, що містить ланцюг нуклеотидів, який описують послідовністю, що позначається з використанням стандартної номенклатури нуклеотидів.
Як правило, кожний із "с", "С" "А", "т" її "У" означає нуклеотид, який містить відповідно гуанін, цитозин, аденін, тимідин і урацил як основу. Однак, буде зрозуміло, що термін "рибонуклеотид" або "нуклеотид" також може означати модифікований нуклеотид, який більш детально описаний нижче, або імітувальний замінний фрагмент (див., наприклад, таблицю 2).
Фахівцю в даній галузі добре відомо, що гуанін, цитозин, аденін і урацил можуть бути замінені іншими фрагментами без значної зміни властивостей щодо спарювання основ олігонуклеотиду, який містить нуклеотид, що несе такий замінний фрагмент. Наприклад, без обмеження, нуклеотид, що містить інозин як основу, може утворювати пару основ з нуклеотидами, які містять аденін, цитозин або урацил. Отже, нуклеотиди, що містять урацил, гуанін або аденін, можуть бути замінені в нуклеотидних послідовностях а45ЕМА, описаних в даному винаході, нуклеотидами, які містять, наприклад, інозин. В іншому прикладі аденін і цитозин в будь-якому місці в олігонуклеотиді можуть бути замінені гуаніном й урацилом, відповідно, з утворенням неоднозначного спарювання основ -) з цільовою мРНК. Послідовності, що містять такі замінні фрагменти, є придатними для композицій і способів, описаних в даному винаході.
Терміни "ІКМА", "засіб для ЕМАЇ", "засіб на основі ІЕМА", "засіб для РНК-інтерференції", що використовують в даному документі взаємозамінно, стосуються засобу, що містить РНК у тому значенні, в якому даний термін визначено в даному документі, і який опосередковує цілеспрямоване розщеплення РНК-транскрипту за допомогою шляху за участю РНК-індуковного комплексу сайленсингу (КІЗС). ІКМА керує специфічним щодо послідовності руйнуванням мРНК за допомогою такого процесу, як РНК-інтерференція (ЕМАЇї). ІКМА модулює, наприклад інгібує, експресію гена ТТК в клітині, наприклад в клітині в організмі суб'єкта, як, наприклад, суб'єкта- ссавця.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАїЇ за даним винаходом включає однониткову
РНК, яка взаємодіє з цільовою послідовністю РНК, наприклад цільовою послідовністю мРНК
ТТЕК, для керування розщепленням цільової РНК. Не обмежуючись будь-якою теорією припускають, що довга двониткова РНК, введена в клітини, руйнується під дією ендонуклеази ЇЇ типу, відомої як Оісег, з утворенням двониткових коротких інтерферуючих РНК (5ікМА), які містять сенсову нитку і антисенсову нитку (Зпагр еї аіІ. (2001) Сепе5 ЮОем. 15:485). бБісег, фермент, подібний до рибонуклеази І типу, забезпечує процесинг цих 45ЕМА до коротких інтерферуючих РНК довжиною 19-23 пар основ із характерними 3'-виступаючими кінцями з двох бо основ (Вегпзвіевїп, еї аї!., (2001) Майшге 409:363). Ці вікМА потім вбудовуються в РНК-індуковний комплекс сайленсингу (КІЗС), в якому одна або декілька хеліказ розкручують дуплекс 5ікМмА, що дозволяє комплементарній антисенсовій нитці управляти розпізнаванням мішені (Мукапеп, еї а!., (2001) СеїІ 107:309). Після зв'язування з відповідною цільовою мРНК одна або декілька ендонуклеаз в КІЗС розщеплюють мішень для індукції сайленсингу (ЕІбазпіг, еї а!., (2001) Сепев5
Оем. 15:188). Таким чином, в одному аспекті даний винахід стосується однониткової 5вікМА (55КМА) (антисенсова нитка дуплекса 5ікфМА), утвореної всередині клітини, і яка сприяє утворенню КІЗС-комплексу для здійснення сайленсингу цільового гена, тобто гена ТТК.
Відповідно термін "зіКМА" використовують у даному документі також для позначення КМАЇ, описаної вище.
В іншому варіанті здійснення засіб для ЕМАїЇ може являти собою однониткову РНК, яку вводять в клітину або організм для інгібування цільової мРНК. Однониткові засоби для КЕМАЇї зв'язуються з Агдопаше 2 комплексу КІЗС, що має ендонуклеазну активність, який потім розщеплює цільову мРНК. Як правило, однониткові 5БікМА містять 15-30 нуклеотидів і є хімічно модифікованими. Конструювання та тестування однониткових 5ікМА описані в патенті США Мо 8101348 ї в Гіта еї аї., (2012) Сеїї 150:883-894, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання. Будь-які антисенсові нуклеотидні послідовності, описані в даному документі, можна застосовувати як однониткову РНК, описану в даному документі або яка хімічно модифікована способами, описаними в І та еї аї., (2012) СеїЇ 150:883-894.
В іншому варіанті здійснення "ІКМА" для застосування в композиціях, шляхах застосування та способах за даним винаходом є двонитковою РНК, і в даному документі її називають "двонитковим засобом для КМАЇ", "молекулою двониткової РНК (а5ЕМА)", "засобом на основі а5зКМА "або"азЕМА". Термін "а5еМА" стосується комплексу молекул рибонуклеїнової кислоти з дуплексною структурою, що містить дві антипаралельні та практично комплементарні нитки нуклеїнової кислоти, які розглядаються як такі, що мають "сенсову" і "антисенсову" орієнтації щодо цільової РНК, тобто гена ТТК. У деяких варіантах здійснення даного винаходу двониткова
РНК (а5КМА) запускає руйнування цільової РНК, наприклад мРНК, через пост-транскрипційний механізм сайленсингу генів, що називається у даному документі РНК-інтерференцією або ЕМАЇ.
Як правило, більшість нуклеотидів кожної нитки молекули а5КМА є рибонуклеотидами, але,
Зо як докладно описано в даному документі, кожна нитка або обидві нитки можуть містити також один або декілька нуклеотидів, які не є рибонуклеотидами, наприклад дезоксирибонуклеотид іабо модифікований нуклеотид. Крім того, використовуваний у даному описі "засіб для ЕМАЇ" може включати рибонуклеотиди з хімічними модифікаціями; засіб для ЕМАЇ може включати значні модифікації багатьох нуклеотидів.
Як використовується в даному документі, термін "модифікований нуклеотид" стосується нуклеотиду, який незалежно має модифікований цукровий фрагмент, міжнуклеотидний зв'язок іМабо модифіковану нуклеотидну основу. Таким чином, термін модифікований нуклеотид охоплює заміни, додавання або видалення, наприклад, функціональної групи або атома, в міжнуклеозидних зв'язках, цукрових фрагментах або нуклеотидних основах. Модифікації, придатні для застосування у засобах за даним винаходом, включають усі типи модифікацій, розкритих у даному документі або відомих із рівня техніки. Будь-які такі модифікації, які використовуються в молекулі типу 5ікМА, охоплені терміном "засіб для КМАЇ" в контексті даного опису та формули винаходу.
Дуплексна ділянка може мати будь-яку довжину, яка дозволяє здійснювати специфічне руйнування необхідної цільової РНК за допомогою шляху за участю КІЗС, і може варіювати за довжиною в діапазоні від приблизно 9 до 36 пар основ, наприклад, її довжина становить приблизно 15-30 пар основ, наприклад, довжина становить приблизно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 або 36 пар основ, як, наприклад, приблизно 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19- 30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 або 21-22 пари основ. Значення діапазону та довжини, проміжні щодо наведених вище значень діапазону та довжини, також розглядаються як частина даного винаходу.
Дві нитки, що утворюють дуплексну структуру, можуть бути різними частинами однієї більшої молекули РНК, або вони можуть бути окремими молекулами РНК. Якщо дві нитки є частиною однієї більшої молекули і, отже, з'єднані неперервним ланцюгом нуклеотидів від 3'- кінця однієї нитки до 5'-кінця відповідної іншої нитки, що утворюють дуплексну структуру, то сполучний ланцюг РНК називають петлею "шпилька". Петля "шпилька" може містити 60 щонайменше один неспарений нуклеотид. У деяких варіантах здійснення петля "шпилька" може містити щонайменше 2, щонайменше 3, щонайменше 4, щонайменше 5, щонайменше 6, щонайменше 7, щонайменше 8, щонайменше 9, щонайменше 10, щонайменше 20, щонайменше 23 або більше неспарених нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення розмір петлі "шпилька" може становити 10 або менше нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення розмір петлі "шпилька" може становити 8 або менше неспарених нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення розмір петлі "шпилька" може становити 4-10 неспарених нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення розмір петлі "шпилька" може становити 4-8 нуклеотидів.
Якщо дві практично комплементарні нитки 45КМА утворені з окремих молекул РНК, то ці молекули не обов'язково повинні, але можуть бути з'єднані ковалентним зв'язком. Якщо дві нитки з'єднані ковалентно іншим чином, ніж неперервним ланцюгом нуклеотидів від 3'-кінця однієї нитки до 5'-кінця відповідної іншої нитки, що утворюють дуплексну структуру, то сполучну структуру називають "лінкером". Нитки РНК можуть мати однакове або різне число нуклеотидів.
Максимальна кількість пар основ є кількістю нуклеотидів у найкоротшій нитці а5КМА за винятком будь-яких виступаючих кінців, які присутні в дуплексі. Крім дуплексної структури засіб для КМАЇї може передбачати один або декілька нуклеотидних виступаючих кінців.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАїЇ за даним винаходом являє собою азкКМА, кожна нитка якої має довжину 24-30 нуклеотидів, яка взаємодіє з цільовою послідовністю РНК, наприклад, цільовою послідовністю мРНК гена ТТК, для керування розщепленням цільової
РНК. Не обмежуючись будь-якою теорією припускають, що довга двониткова РНК, введена в клітини, руйнується під дією ендонуклеази І типу, відомої як Оісег, з утворенням 5ікМА (ЗПпагр еї аї. (2001) Сепез Оем. 15:485). ОСісег, фермент, подібний до рибонуклеази І типу, забезпечує процесинг 85КМА до коротких інтерферуючих РНК довжиною 19-23 пари основ з характерними
З'-виступаючими кінцями з двох основ (Вегпзівїп, еї аї., (2001) Маїиге 409:363). вікМА потім включаються в РНК-індуковний комплекс сайленсингу (КІ5С), в якому одна або декілька хеліказ розкручують дуплекс 5зікМА, що дозволяє комплементарній антисенсовій нитці управляти розпізнаванням мішені (МуКапеп, еї аї., (2001) СеїІ 107:309). Після зв'язування з відповідною цільовою мРНК одна або декілька ендонуклеаз в КІС розщеплюють мішень для індукції сайленсингу (ЕїЇбабзпіїг, еї аї., (2001) Сепезв Оем. 15:188). В одному варіанті здійснення засобу для
ЕМАЇ щонайменше одна нитка містить 3'євиступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду. В
Зо іншому варіанті здійснення щонайменше одна нитка містить 3'-виступаючий кінець щонайменше з 2 нуклеотидів, наприклад, із 2, 3, 4, 5,6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів. В інших варіантах здійснення щонайменше одна нитка засобу для КМАЇ містить 5'-виступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду. У певних варіантах здійснення щонайменше одна нитка містить 5'- виступаючий кінець щонайменше з 2 нуклеотидів, наприклад, із 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів. У ще одних варіантах здійснення як 3'-, так і 5''виступаючий кінець однієї нитки засобу для КМАЇ містять виступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇї за даним винаходом являє собою засіб на основі а5КМА, кожна нитка якого містить 19-23 нуклеотидів, який взаємодіє з послідовністю РНК
ТТК для керування розщепленням цільової РНК. Не обмежуючись будь-якою теорією припускають, що довга двониткова РНК, введена в клітини, руйнується під дією ендонуклеази ЇЇ типу, відомої як Оісег, з утворенням 5ікМА (ЗПпагр еї аіІ. (2001) Сепе5 ЮОем. 15:485). Рісег, фермент, подібний до рибонуклеази І типу, забезпечує процесинг й5ЕМА до коротких інтерферуючих РНК довжиною 19-23 пари основ з характерними 3'-виступаючими кінцями з двох основ (Вегпвівїп, еї аї., (2001) Майшиге 409:363). БікМА потім вбудовуються в РНК-індуковний комплекс сайленсингу (КІЗС), в якому одна або декілька хеліказ розкручують дуплекс 5ікМА, що дозволяє комплементарній антисенсовій нитці управляти розпізнаванням мішені (Мукапеп, еї а!., (2001) СеїІ 107:309). Після зв'язування з відповідною цільовою мРНК одна або декілька ендонуклеаз в КІЗС розщеплюють мішень для індукції сайленсингу (ЕІбавнпіг, еї а!., (2001) Сепев5
Рем. 15:188). В одному варіанті здійснення засіб для ЕМАїі за даним винаходом являє собою а5КМА з 24-30 нуклеотидів, яка взаємодіє з послідовністю РНК ТТК для керування розщепленням цільової РНК.
Як використовується в даному документі, термін "нуклеотидний виступаючий кінець" стосується щонайменше одного неспареного нуклеотиду, який виступає з дуплексної структури
ІНМА, наприклад, 45КМА. Наприклад, якщо 3'-виступаючий кінець однієї нитки О5КМА виходить за межі 5-кінця іншої нитки або навпаки, то утворюється нуклеотидний виступаючий кінець. а5КМА може містити виступаючий кінець щонайменше з одного нуклеотиду; як альтернатива, виступаючий кінець може містити щонайменше два нуклеотиди, щонайменше три нуклеотиди, щонайменше чотири нуклеотиди, щонайменше п'ять нуклеотидів або більше. Нуклеотидний виступаючий кінець може містити нуклеотидний/нуклеозидний аналог, в тому числі бо дезоксинуклеотид/нуклеозид, або складатися з нього. Виступаючий кінецьккінці) може(можуть)
знаходитися в межах сенсової нитки, антисенсової нитки або будь-якої їх комбінації. Крім того, нуклеотид(нуклеотиди) виступаючого кінця може(можуть) бути присутнім(присутніми) на 5'-кінці,
З'-кінці або обох кінцях або антисенсової, або сенсової нитки а5КМА. В одному варіанті здійснення 0Ї5КЕМА щонайменше одна нитка містить 3'євиступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду. В іншому варіанті здійснення щонайменше одна нитка містить 3'-виступаючий кінець щонайменше з 2 нуклеотидів, наприклад, із 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів. В інших варіантах здійснення щонайменше одна нитка засобу для КМАЇ містить 5'- виступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду. У певних варіантах здійснення щонайменше одна нитка містить 5'-виступаючий кінець щонайменше з 2 нуклеотидів, наприклад, із 2, 3, 4, 5, б, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15 нуклеотидів. У ще одних варіантах здійснення як 3'-, так і 5'- виступаючий кінець однієї нитки засобу для КМАЇї містять виступаючий кінець щонайменше з 1 нуклеотиду.
В одному варіанті здійснення антисенсова нитка а5хКМА містить 1-10 нуклеотидів, наприклад, 0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів, які виступають на 3'-кінці та/або 5'-кінці. В одному варіанті здійснення сенсова нитка а5ЕКМА містить 1-10 нуклеотидів, наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 нуклеотидів, які виступають на 3'-кінці та/або 5'-кінці. В іншому варіанті здійснення один або декілька нуклеотидів виступаючого кінця замінюють нуклеозидтіофосфатом.
У певних варіантах здійснення виступаючий кінець в межах сенсової нитка або антисенсової нитка, або обох, може містити подовжені відрізки довжиною більше 10 нуклеотидів, наприклад, 1-30 нуклеотидів, 2-30 нуклеотидів, 10-30 нуклеотидів або 10-15 нуклеотидів. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться в межах сенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться на 3'- кінці сенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться на 5'-кінці сенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться в межах антисенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться на 3'-кінці антисенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення подовжений виступаючий кінець знаходиться на 5'- кінці антисенсової нитки дуплекса. У певних варіантах здійснення один або декілька нуклеотидів
Зо виступаючого кінця замінені нуклеозидтіофосфатом. У певних варіантах здійснення виступаючий кінець містить самокомплементарну частину, так що виступаючий кінець здатний утворювати шпилькову структуру, яка є стабільною за фізіологічних умов. "Затуплений кінець" або "тупий кінець" означає, що на кінці двониткового засобу для КМАЇ немає неспарених нуклеотидів, тобто немає нуклеотидного виступаючого кінця. Засіб для ЕМАЇ "з тупими кінцями" являє собою а5ЕМА, яка є двонитковою по всій довжині, тобто не має нуклеотидного виступаючого кінця на будь-якому кінці молекули. Засоби для ЕМАЇї за даним винаходом включають в себе засоби для КМАЇ з нуклеотидним виступаючим кінцем на одному кінці (тобто засоби з одним виступаючим кінцем і одним тупим кінцем) або з нуклеотидними виступаючими кінцями на обох кінцях.
Термін "антисенсова нитка" або "направляюча нитка" стосується нитки ІЕМА, наприклад, а5КМА, яка містить ділянку, практично комплементарну до цільової послідовності, наприклад,
МРНК ТТК. Як використовується в даному документі, термін "ділянка комплементарності" стосується ділянки антисенсової нитки, яка є практично комплементарною до послідовності, наприклад, цільової послідовності, наприклад, нуклеотидної послідовності ТТК, визначеної в даному документі. Якщо ділянка комплементарності не повністю комплементарна до цільової послідовності, то помилкові спарювання можуть знаходитися у внутрішніх або кінцевих ділянках молекули. Як правило, найбільш допустимі помилкові спарювання знаходяться в кінцевих ділянках, наприклад, в межах 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотиду 5'- та/або 3'-кінця ІКМА. В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАі за даним винаходом передбачає помилкове спарювання нуклеотидів в антисенсовій нитці. В іншому варіанті здійснення двонитковий засіб для ЕМАЇ за даним винаходом передбачає помилкове спарювання нуклеотидів в сенсовій нитці.
В одному варіанті здійснення помилкове спарювання нуклеотидів відбувається, наприклад, в межах 5, 4, 3, 2 або 1 нуклеотиду від 3'-кінця ІКМА. В іншому варіанті здійснення помилкове спарювання нуклеотидів відбувається, наприклад, за 3'-кінцевим нуклеотидом іІЕМА.
Термін "сенсова нитка" або "супроводжувальна нитка", використовуваний в даному документі, стосується нитки ІКМА, що містить ділянку, яка є практично комплементарною до ділянки антисенсової нитки, як цей термін визначений в даному документі.
Використовуваний у даному документі термін "ділянка розщеплення" стосується ділянки, яка безпосередньо прилягає до сайту розщеплення. Сайт розщеплення є сайтом мішені, за яким бо відбувається розщеплення. У деяких варіантах здійснення ділянка розщеплення містить три основи на будь-якому з кінців сайту розщеплення, яка безпосередньо прилягає до нього. У деяких варіантах здійснення ділянка розщеплення містить дві основи на будь-якому з кінців сайту розщеплення, яка безпосередньо прилягає до нього. У деяких варіантах здійснення сайт розщеплення знаходиться зокрема в сайті, що межує з нуклеотидами 10 і 11 антисенсової нитки, і ділянка розщеплення містить нуклеотиди 11, 12 і 13.
Якщо не зазначено інше, то використовуваний у даному документі термін "комплементарний", під час використання для опису першої нуклеотидної послідовності відносно другої нуклеотидної послідовності, стосується здатності олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що містить першу нуклеотидну послідовність, гібридизуватися і, за певних умов, утворювати дуплексну структуру з олігонуклеотидом або полінуклеотидом, який містить другу нуклеотидну послідовність, як буде зрозуміло фахівцю в даній галузі. Наприклад, такі умови можуть являти собою жорсткі умови, де жорсткі умови можуть включати 400 мм масі, 40
ММ РІРЕЗ5, рН 6,4, 1 мм ЕОТА, 50 "С або 70 "С протягом 12-16 годин з наступним відмиванням (див., наприклад, "МоїІесцшіаг Сіопіпд: А І арогаїгу Мапиаї, затьгоок, еї аї. (1989) Соїй Бргіпд
Нагбог І арогайогу Ргев55). Можна застосовувати інші умови, такі як фізіологічно відповідні умови, характерні для організму. Фахівець в даній галузі зможе визначити набір умов, найбільш придатних для тестування комплементарності двох послідовностей відповідно до кінцевого застосування гібридизованих нуклеотидів.
Комплементарні послідовності в ІКМА, наприклад, в а5хКМА, описаних в даному документі, включають утворення пар основ олігонуклеотиду або полінуклеотиду, що містить першу нуклеотидну послідовність, з олігонуклеотидом або полінуклеотидом, що містить другу нуклеотидну послідовність, по всій довжині однієї або обох нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності можуть бути вказані в даному документі як "повністю комплементарні" відносно одна одної. Однак, якщо в даному документі перша послідовність зазначена як "практично комплементарна" стосовно другої послідовності, дві послідовності можуть бути повністю комплементарними, або вони можуть утворювати одну або декілька, але, як правило, не більше 5, 4, З або 2 помилково спарених пар основ під час гібридизації з утворенням дуплексу аж до 30 пар основ, із збереженням при цьому здатності гібридизуватися за умов, найбільш відповідних їх кінцевому застосуванню, наприклад, інгібуванню експресії гена за допомогою шляху за участю КІ5С. Однак коли два олігонуклеотиди призначені утворювати, під час гібридизації, один або декілька однониткових виступаючих кінців, тоді такі виступаючі кінці не будуть вважатися помилковими спарюваннями стосовно визначення комплементарності. Наприклад, а5КМА, що містить один олігонуклеотид довжиною 21 нуклеотид та інший олігонуклеотид довжиною 23 нуклеотиди, де довший олігонуклеотид містить послідовність 3 21 нуклеотиду, яка повністю комплементарна коротшому олігонуклеотиду, може бути вказана як "повністю комплементарна" для цілей, описаних у даному документі. "Комплементарні" послідовності, використовувані у даному документі, можуть також включати або можуть бути утворені повністю з пар основ, утворених не за моделлю Уотсона-
Кріка, та/або пар основ, утворених з модифікованих нуклеотидів, що не зустрічаються в природі, і модифікованих нуклеотидів, у такій мірі, за якої виконуються вищевказані вимоги щодо їх здатності гібридизуватися. Такі пари основ, утворені не за моделлю Уотсона-Кріка, включають без обмеження неоднозначні 5:Ш або Хугстинівські пари основ.
Терміни "комплементарний," "повністю комплементарний" і "практично комплементарний" в даному документі можна використовувати стосовно збігу основ між сенсовою ниткою і антисенсовою ниткою а5ЕМА, або між антисенсовою ниткою засобу на основі ІКМА і цільовою послідовністю, як буде зрозуміло з контексту їх використання.
Використовуваний у даному документі полінуклеотид, що є "практично комплементарним до щонайменше частини" матричної РНК (мРНК), стосується полінуклеотиду, який є практично комплементарним до неперервної частини мРНК, що становить інтерес, (наприклад, мРНК, яка кодує ген ТТК). Наприклад, полінуклеотид є комплементарним до щонайменше частини мРНК
ТТА, якщо послідовність є практично комплементарною до непереривної частина мРНК, що кодує ген ТВ.
Відповідно, в деяких варіантах здійснення антисенсові полінуклеотиди, розкриті в даному документі, є повністю комплементарними до цільової послідовності ТК. В інших варіантах здійснення антисенсові полінуклеотиди, розкриті в даному документі, є повністю комплементарними до ЗЕО ІЮ МО:2 (5- ОСССАОООСАОСОААССААСА -3). В одному варіанті здійснення антисенсова полінуклеотидна послідовність являє собою 5- псаавООАСАОпАААООСССАиЄ -3' (5ЕО ІЮ МОЗ).
В інших варіантах здійснення антисенсові полінуклеотиди, розкриті в даному документі, є бо практично комплементарними до цільової послідовності ТТЕК і містять неперервну нуклеотидну послідовність яка щонайменше на приблизно 8095 комплементарна по всій своїй довжині еквівалентній ділянці нуклеотидної послідовності будь-якої з ЗЕО 10 МО2 (5- ваапАООСАОпОАДАССААСІА -3) або фрагмента будь-якої з 5ЕО ІЮО МО, 2 ії 5, як, наприклад, комплементарна на приблизно 8595, на приблизно 8695, на приблизно 8795, на приблизно 8895, на приблизно 8995, на приблизно 9095, на приблизно 9195, на приблизно 9295, на приблизно 9395, на приблизно 9495, на приблизно 9595, на приблизно 9695, на приблизно 9795, на приблизно 9895 або на приблизно 9995.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇї за даним винаходом містить сенсову нитку, яка є практично комплементарною до антисенсового полінуклеотиду, який, в свою чергу, є комплементарним до цільової послідовності ТТК, і при цьому полінуклеотид сенсової нитки містить неперервну нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на приблизно 8095 комплементарна по всій своїй довжині еквівалентній ділянці нуклеотидної послідовності будь- якої з послідовностей, наведених у таблицях 1, 3, 5, 6 і 7, як, наприклад, комплементарна на приблизно 8595, на приблизно 8695, на приблизно 8795, на приблизно 8895, на приблизно 8995, на приблизно 9095, на приблизно 9195, на приблизно 9295, на приблизно 9395, на приблизно 9495, на приблизно 9595, на приблизно 9695, на приблизно 9795, на приблизно 9895 або на приблизно 99965.
В іншому варіанті здійснення засіб для ЕМАЇ за даним винаходом містить антисенсову нитку, яка є практично комплементарною до цільової послідовності ТТК і містять неперервну нуклеотидну послідовність, яка щонайменше на приблизно 8095 комплементарна по всій своїй довжині еквівалентній ділянці нуклеотидної послідовності будь-якої з послідовностей, наведених у таблицях 1 і 3, як, наприклад, комплементарна на приблизно 8595, на приблизно 8695, на приблизно 8795, на приблизно 8895, на приблизно 8995, на приблизно 9095, на приблизно 9195, на приблизно 9295, на приблизно 9395, на приблизно 9495, на приблизно 9595, на приблизно 9695, на приблизно 9795, на приблизно 9895 або на приблизно 9995.
У деяких варіантах здійснення більшість нуклеотидів кожної нитки є рибонуклеотидами, але, як детально описано в даному документі, кожна нитка або обидві нитки можуть також містити один або декілька нуклеотидів, які не є рибонуклеотидами, наприклад, дезоксирибонуклеотид іабо модифікований нуклеотид. Крім того, "ІЕМА" може містити рибонуклеотиди з хімічними
Зо модифікаціями. Такі модифікації можуть включати всі типи модифікацій, розкритих у даному документі або відомих з рівня техніки. Будь-які такі модифікації, які використовують в молекулі
ІЕМА, охоплюються "ІКМА" для цілей даного опису та формули винаходу.
В одному аспекті даного винаходу засіб для застосування в способах і композиціях за даним винаходом являє собою молекулу однониткової антисенсової нуклеїнової кислоти, яка інгібує цільову мРНК за допомогою механізму антисенсового інгібування. Молекула однониткової антисенсової РНК комплементарна послідовності в цільовій МРНК. Однониткові антисенсові олігонуклеотиди можуть інгібувати трансляцію стехіометричним способом шляхом спарювання основ з МРНК і фізичного порушення механізму трансляції, див. Юіа5, М. еї аї., (2002) Мої Сапсег
Тег 1:347-355. Молекула однониткової антисенсової РНК може мати довжину від приблизно 15 до приблизно 30 нуклеотидів і мати послідовність, яка комплементарна цільовій послідовності.
Наприклад, молекула однониткової антисенсової РНК може містити послідовність, яка містить щонайменше приблизно 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше суміжних нуклеотидів із будь-якої з антисенсових послідовностей, описаних в даному документі.
Передбачається, що "ТТК-асоційоване захворювання", як використовується в даному документі, включає будь-яке захворювання, асоційоване з геном або білком ТТК. Таке захворювання може бути спричинене, наприклад, надлишковим продукуванням білка ТТ, мутацією гена ТТЕ, аномальним розщепленням білка ТТК, аномальними взаємодіями між ТТтК та іншими білками або іншими ендогенними або екзогенними речовинами. "ТТК-асоційоване захворювання" включає будь-який тип пов'язаного з ТТК амілоїдозу (АТТК), де ТТЕ відіграє роль в утворенні аномальних позаклітинних агрегатів або відкладень амілоїду. ТТК-асоційовані захворювання включають сенільний системний амілоїдоз (554А), системний сімейний амілоїдоз, сімейну амілоїдну полінейропатію (БАР), сімейну амілоїдну кардіоміопатію (ЕАС), лептоменінгеальний амілоїдоз/(амілоїдоз центральної нервової системи (СМ5), амілоїдне помутніння скловидного тіла, синдром зап'ястного каналу та гіпертироксинемію. Симптоми пов'язаного з ТТК амілоїдозу включають сенсорну нейропатію (наприклад, парестезію, гіпестезію дистальних відділів кінцівок), вегетативну нейропатію (наприклад, дисфункцію шлунково-кишкового тракту, як, наприклад, виразку шлунку, або ортостатичну гіпотензію), моторну нейропатію, судомні напади, деменцію, мієлопатію, полінейропатію, синдром зап'ястного каналу, вегетативну недостатність, кардіоміопатію, помутніння скловидного тіла, бо ниркову недостатність, нефропатію, суттєво знижений тВМІ (модифікований індекс маси тіла),
дисфункцію черепних нервів і решітчасту дистрофію рогівки.
П.ЛЕМКА за даним винаходом
У даному винаході передбачені ікМА, які вибірково інгібують експресію одного або декількох генів ТТ. В одному варіанті здійснення засіб на основі ІКМА включає молекули двониткової рибонуклеїнової кислоти (05ЕКМА) для інгібування експресії гена ТТЕ у клітині, такій як клітина в організмі суб'єкта, наприклад, ссавця, такого як людина, з ТТК-асоційованим захворюванням. а5КМА містить антисенсову нитку, яка має ділянку комплементарності, що є комплементарною до щонайменше частини мРНК, утворюваної під час експресії гена ТТК. Довжина ділянки комплементарності становить приблизно 30 нуклеотидів або менше (наприклад, довжина становить приблизно З0, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19 або 18 нуклеотидів або менше).
У випадку контакту з клітиною, яка експресує ген ТТК, іеЕМА вибірково інгібує експресію гена
ТТК (наприклад, гена ТТ людини, примата, відмінної від примата тварини або птаха) щонайменше на приблизно 1095, що встановлено шляхом аналізу, наприклад, за допомогою
ПЛР або способу з використанням розгалуженої ДНК (БОМА), або способу на основі аналізу білків, як, наприклад, за допомогою імунофлуоресцентного аналізу із застосуванням, наприклад, методик вестерн-блотингу або проточної цитометрії. а5зКМА містить дві нитки РНК, які є комплементарними і гібридизуються з утворенням дуплексної структури за умов, за яких буде застосовуватися йа5КМА. Одна нитка а5ЕМА (антисенсова нитка) містить ділянку комплементарності, яка є практично комплементарною, і, як правило, повністю комплементарною до цільової послідовності. Цільову послідовність можна одержати із послідовності МРНК, що утворюється в процесі експресії гена ТТК. Інша нитка (сенсова нитка) містить ділянку, яка є комплементарною до антисенсової нитки, так що дві нитки гібридизуються й утворюють дуплексну структуру при об'єднанні за придатних умов. Описані в іншій частині в даному документі та відомі з рівня техніки комплементарні послідовності а5КЕМА також можуть міститися у вигляді самокомплементарних ділянок однієї молекули нуклеїнової кислоти, на відміну від перебування в складі окремих олігонуклеотидів.
Як правило, довжина дуплексної структури становить від 15 до 30 пар основ, наприклад, довжина становить 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15- 18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29,
Зо 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20- 25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 або 21-22 пари основ. Значення діапазону та довжини, проміжні щодо наведених вище значень діапазону та довжини, також розглядаються як частина даного винаходу.
Аналогічним чином, довжина ділянки комплементарності для цільової послідовності становить від 15 до 30 нуклеотидів, наприклад, довжина становить 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18- 25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21- 28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 або 21-22 нуклеотиди. Значення діапазону та довжини, проміжні щодо наведених вище значень діапазону та довжини, також розглядаються як частина даного винаходу.
У деяких варіантах здійснення довжина а5ЕМА становить від приблизно 15 до приблизно 20 нуклеотидів або довжина становить від приблизно 25 до приблизно 30 нуклеотидів. Як правило, а5зКМА є достатньо довгою, щоб служити як субстрат для ферменту Оісег. Наприклад, як добре відомо з рівня техніки, 45ЕМА, довжина яких становить більше приблизно 21-23 нуклеотиди, можуть служити як субстрати для Оісег. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ділянка РНК, що є цільовою для розщеплення, найчастіше буде являти собою частину більшої молекули
РНК, часто молекули мРНК. У відповідних випадках "частина" цільової МРНК являє собою неперервну послідовність цільової мРНК, яка має довжину, достатню для того, щоб дозволити їй бути субстратом для ЕМАі-спрямованого розщеплення (тобто розщеплення за допомогою шляху за участю КІЗС).
Фахівцю у даній галузі буде зрозуміло, що дуплексна ділянка являє собою основну функціональну частину Д5КМА, наприклад, дуплексну ділянку із приблизно 9-36 пар основ, наприклад, із приблизно 10-36, 11-36, 12-36, 13-36, 14-36, 15-36, 9-35, 10-35, 11-35, 12-35, 13-35, 14-35, 15-35, 9-34, 10-34, 11-34, 12-34, 13-34, 14-34, 15-34, 9-33, 10-33, 11-33, 12-33, 13-33, 14- 33, 15-33, 9-32, 10-32, 11-32, 12-32, 13-32, 14-32, 15-32, 9-31, 10-31, 11-31, 12-31, 13-32, 14-31, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15- 17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20- 60 2420-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 або 21-22 пар основ.
Таким чином, в одному варіанті здійснення в тій мірі, в якій вони стають процесованими до функціонального дуплекса розміром, наприклад, 15-30 пар основ, який цілеспрямовано впливає на необхідну РНК для розщеплення, молекула РНК або комплекс молекул РНК, які мають дуплексну ділянку розміром більше 30 пар основ, являє собою а5КМА. Таким чином, фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що в одному варіанті здійснення тікМА являє собою а5ЕМА. В іншому варіанті здійснення д5КМА являє собою тікМА, що не зустрічається в природі. В іншому варіанті здійснення засіб на основі ІКМА, застосовний для цілеспрямованого впливу на експресію гена ТТЕ, не утворюється в цільовій клітини у випадку розщеплення більшої а5КМА. а5КМА, описана в даному документі, може додатково містити один або декілька однониткових нуклеотидних виступаючих кінців, наприклад, з 1, 2, З або 4 нуклеотидів. а5КМА, які мають щонайменше один нуклеотидний виступаючий кінець, можуть характеризуватися несподівано кращими інгібіторними властивостями порівняно з їх аналогами із тупими кінцями.
Нуклеотидний виступаючий кінець може містити нуклеотидний/нуклеозидний аналог, в тому числі дезоксинуклеотид/нуклеозид, або складатися з нього. Виступаючий кінець(кінці) може(можуть) знаходитися в межах сенсової нитки, антисенсової нитки або будь-якої їх комбінації. Крім того, нуклеотид(нуклеотиди) виступаючого кінця може(можуть) бути присутнім(присутніми) на 5'-кінці, 3'-кінці або обох кінцях або антисенсової, або сенсової нитки а5КМА. У певних варіантах здійснення можливі довші, подовжені виступаючі кінці. азКМА можна синтезувати за допомогою стандартних способів, відомих з рівня техніки, додатково описаних нижче, наприклад, із застосуванням автоматичного синтезатора ДНК, такого як комерційно доступний, наприклад, від Віозеагсі, Арріїєа Віозує(етв, Іпс.
Сполуки на основі ІКМА за даним винаходом можна одержувати за допомогою двостадійної процедури. По-перше, окремі нитки молекули двониткової РНК одержують окремо. Потім складові нитки відпалюють. Окремі нитки сполуки на основі віКМА можна одержувати із застосуванням рідкофазного або твердофазного органічного синтезу, або їх обох. Органічний синтез дає перевагу в тому, що можна легко одержувати олігонуклеотидні нитки, що містять неприродні або модифіковані нуклеотиди. Однониткові олігонуклеотиди за даним винаходом можна одержувати із застосуванням рідкофазного або твердофазного органічного синтезу, або їх обох.
В одному аспекті 45КМА за даним винаходом містить щонайменше дві нуклеотидні послідовності, сенсову послідовність і антисенсову послідовність. Сенсова нитка вибрана із групи послідовностей, наведених в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, а антисенсова нитка, що відповідає сенсової нитці, вибрана із групи послідовностей в будь-якій із таблиць 1, 3, 5,61 7. В даному аспекті одна з двох послідовностей є комплементарною до іншої із двох послідовностей, при цьому одна з послідовностей практично комплементарна до послідовності мРНК, утворюваної в процесі експресії гена ТТЕК. Відповідно до цього, в даному аспекті а5ЕМА буде містити два олігонуклеотиди, де один олігонуклеотид описується як сенсова нитка в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, а другий олігонуклеотид описується як антисенсова нитка, що відповідає сенсовій нитці, в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7. В одному варіанті здійснення практично комплементарні послідовності азЗКМА містяться в окремих олігонуклеотидах. В іншому варіанті здійснення практично комплементарні послідовності а5КМА містяться в одному олігонуклеотиді.
Буде зрозуміло, що хоча деякі послідовності, наведені в таблицях 1, 3, 5, 6 і 7, описуються як модифіковані та/або кон'юговані послідовності, РНК із числа ІКМА за даним винаходом, наприклад, а5КМА за даним винаходом, може містити будь-які з послідовностей, викладених в таблицях 1, 3, 5, 6 і 7, яка є немодифікованою, некон'югованою та/або модифікованою та/або кон'югованою іншим чином, ніж описано в них.
Фахівцю в даній галузі добре відомо, що а5КМА з дуплексною структурою із приблизно 20-23 пар основ, наприклад, із 21 пари основ, були визнані як особливо ефективні в індукції РНК- інтерференції (ЕІбазпіг еї аІ., ЕМВО 2001, 20:6877-6888). Проте інші автори виявили, що коротші або довші дуплексні структури РНК також можуть бути ефективними (Спи і Капа (2007) РНК 14:1714-1719; Кіт еї аї. (2005) Маї Віоїесп 23:222-226). В описаних вище варіантах здійснення відповідно до природи олігонуклеотидних послідовностей, наведених в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, азЕМА, описані в даному документі, можуть містити щонайменше одну нитку, довжина якої становить мінімум 21 нуклеотид. З достатньою вірогідністю можна припустити, що коротші дуплекси з однією із послідовностей із будь-якої з таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, за винятком лише декількох нуклеотидів на одному або обох кінцях, можуть бути так само ефективними порівняно з азКМА, описаними вище. Відповідно, а5ЕеЕМА із послідовністю щонайменше з 15, 16, 17, 18, 19, 20 або більше суміжних нуклеотидів, одержаних із однієї з послідовностей із будь-якої з таблиць 1,3, 5,6 і 7, і які відрізняються за їх здатністю інгібувати експресію гена ТТЕ не більше ніж на 60 приблизно 5, 10, 15, 20, 25 або 3095 інгібування від 45ЕМА, яка містить повну послідовність,
розглядаються як такі, що знаходяться в межах обсягу даного винаходу.
Крім того, РНК, наведені в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, ідентифікують сайт(сайти) в транскрипті ТТК, які є чутливими до КІЗС-опосередкованого розщеплення. Відповідно, даний винахід додатково описує іКкМА, які цілеспрямовано впливають на один із цих сайтів. У контексті даного документа мають на увазі, що ІКМА цілеспрямовано впливає на конкретний сайт РНК- транскрипту, якщо іЕЖМА сприяє розщепленню транскрипту в будь-якому місці в цьому конкретному сайті. Така ІКМА буде, як правило, містити щонайменше приблизно 15 суміжних нуклеотидів з однієї із послідовностей, наведених в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, з'єднаних із додатковими нуклеотидними послідовностями, взятими з ділянки, суміжної з вибраною послідовністю в гені ТТЕК.
Хоча довжина цільової послідовності, як правило, становить приблизно 15-30 нуклеотидів, існує широкий спектр придатності конкретних послідовностей в цьому діапазоні для керування розщепленням будь-якої визначеної цільової РНК. Ряд пакетів програмного забезпечення і принципи, викладені в даному документі, надають керівництво для ідентифікації оптимальних цільових послідовностей для будь-якого даного цільового гена, але також можна використати емпіричний підхід, в якому "вікно" або "маску" даного розміру (як необмежувальний приклад 21 нуклеотид) буквально або фігурально (в тому числі, наприклад, іп 5іїсо) накладають на цільову послідовність РНК для ідентифікації послідовностей в розмірному діапазоні, які можуть виконувати роль цільових послідовностей. Поступово переміщаючи "вікно" послідовності на один нуклеотид вище або нижче щодо початкового положення цільової послідовності, можна ідентифікувати наступну потенційну цільову послідовність, поки не буде ідентифіковано повний набір можливих послідовностей для будь-якого заданого вибраного цільового розміру. За допомогою цього способу разом з системним синтезом і тестуванням ідентифікованих послідовностей (за допомогою аналізів, описаних в даному документі або відомих з рівня техніки) для ідентифікації таких послідовностей з оптимальними характеристиками, можна ідентифікувати ті послідовності РНК, які при націлюванні засобом на основі ІКМА опосередковують найкраще інгібування експресії цільових генів. Таким чином, при тому, що ідентифіковані послідовності, наприклад, в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, являють собою ефективні цільові послідовності, передбачається, що додаткова оптимізація ефективності
Зо інгібування може бути досягнута шляхом поступового "переміщення вікна" на один нуклеотид вище або нижче щодо заданих послідовностей для ідентифікації послідовностей з такими самими або кращими характеристиками інгібування.
Крім цього, також передбачається, що для будь-якої ідентифікованої послідовності, наприклад, в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 і 7, додаткова оптимізація може бути досягнута шляхом систематичного додавання або видалення нуклеотидів з одержанням довших або коротших послідовностей і тестування цих послідовностей, одержаних шляхом переміщення вікна, довшого або коротшого за розміром, вище або нижче щодо цільової РНК в даній точці.
Також об'єднання цього підходу для одержання нових кандидатних мішеней разом з тестуванням ефективності ІКМА на основі цих цільових послідовностей в аналізі інгібування, відомого з рівня техніки або описаного в даному документі, може мати результатом додаткові поліпшення в ефективності інгібування. Більш того, такі оптимізовані послідовності можна коректувати, наприклад, шляхом введення модифікованих нуклеотидів, описаних у даному документі або відомих з рівня техніки, додавання або змін виступаючого кінця, або інших модифікацій, відомих з рівня техніки та/л'або описаних в даному документі для додаткової оптимізації молекули (наприклад, підвищення стабільності в сироватці крові або періоду напівжиття в крові, підвищення термостабільності, покращення трансмембранної доставки, націлювання на конкретне місце розташування або тип клітин, підвищення ступеня взаємодії з ферментами шляху сайленсингу, підвищення вивільнення з ендосом) як інгібітора експресії.
ІЕМА, описана в даному документі, може містити одну або декілька помилок спарювання з цільовою послідовністю. В одному варіанті здійснення ІКМА, описана в даному документі, містить не більше З помилок спарювання. Якщо антисенсова нитка ІЕМА містить помилки спарювання з цільовою послідовністю, переважно, щоб зона помилкового спарювання знаходилась не в центрі ділянки комплементарності. Якщо антисенсова нитка ІКМА містить помилки спарювання з цільовою послідовністю, переважно, щоб помилка спарювання була обмежена розташуванням в межах останніх 5 нуклеотидів або від 5'-, або від 3'-кінця ділянки комплементарності. Наприклад, у випадку засобу на основі ІЕМА із 23 нуклеотидів нитка, яка є комплементарною до ділянки гена ТТК, як правило, не містить жодного помилкового спарювання в межах центральних 13 нуклеотидів. Способи, описані в даному документі, або способи, відомі з рівня техніки, можна застосовувати для визначення того, чи є іІКМА, яка бо містить помилки спарювання з цільовою послідовністю, ефективною в інгібуванні експресії гена
ТТВ. Розгляд ефективності ІЕМА із помилками спарювання під час інгібування експресії гена
ТТЕ є важливим, в особливості, якщо відомо, що конкретна ділянка комплементарності в гені
ТТК характеризується поліморфною мінливістю послідовності в популяції.
ПІ. Модифіковані іІКМА за даним винаходом
В одному варіанті здійснення РНК із числа ІКМА за даним винаходом, наприклад, а5зКМА, є немодифікованою і не містять, наприклад, хімічних модифікацій та/або кон'югацій, відомих з рівня техніки і описаних в даному документі. В іншому варіанті здійснення РНК із числа іІКМА за даним винаходом, наприклад, аб5КМА, є хімічно модифікованою з метою підвищення стабільності або інших корисних характеристик. У певних варіантах здійснення даного винаходу практично всі нуклеотиди ІКМА за даним винаходом є модифікованими. В інших варіантах здійснення даного винаходу всі нуклеотиди ІКМА за даним винаходом є модифікованими. У деяких варіантах здійснення практично всі нуклеотиди іКЖМА за даним винаходом є модифікованими, і при цьому ІЕМА містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 7 2'-фтор-модифікацій, не більше б 2'-фтор-модифікацій, не більше 5 2'-фтор- модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в сенсовій нитці і не більше 6 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор- модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в антисенсовій нитці. В інших варіантах здійснення всі нуклеотиди ІКМА за даним винаходом є модифікованими, і при цьому ІКМА містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 7 2'-фтор-модифікацій, не більше 6 2'-фтор-модифікацій, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор- модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в сенсовій нитці і не більше 6 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в антисенсовій нитці їКМА за даним винаходом, в яких "практично всі нуклеотиди є модифікованими", головним чином, але не цілком є модифікованими і вони можуть містити не більш ніж 5, 4, 3, 2 або 1 немодифікований нуклеотид.
Нуклеїнові кислоти, описані в даному винаході, можуть бути синтезовані та/або модифіковані способами, добре відомими з рівня техніки, такими як описані в "Сигепі ргоїосої5 іп писієїс асій спетівігу, Веаийисаде, 5.Г. еї аї. (Едг5.), дхопп УМієеу 5 Боп5, Іпс., Мем/ МОїК, МУ,
США, який таким чином включений в даний документ за допомогою посилання. Наприклад, модифікації включають в себе кінцеві модифікації, наприклад модифікації / 5'-кінця (фосфорилювання, кон'югування, інвертовані зв'язки) або модифікації 3'-кінця (кон'югування, нуклеотиди ДНК, інвертовані зв'язки тощо); модифікації основ, наприклад, заміну на стабілізуючі основи, дестабілізуючі основи або основи, які утворюють пару основ з розширеним репертуаром партнерів, видалення основ (позбавлені азотистої основи нуклеотиди) або кон'югування основ; модифікації цукрів (наприклад, в 2'-положенні або 4"-положенні) або заміну цукру, та/або модифікації остова, в тому числі модифікацію або заміну фосфодіестерних зв'язків. Конкретні приклади сполук на основі ІКМА, які можна застосовувати в описаних у даному документі варіантах здійснення, включають без обмеження РНК, що містять модифіковані остови або неприродні міжнуклеозидні зв'язки. Серед іншого, РНК з модифікованими остовами включають такі, які не містять атом фосфору в остові. У контексті даного опису, а також як іноді згадується в рівні техніки, модифіковані РНК, що не містять атома фосфору в їхньому міжнуклеозидному остові, також можуть вважатися олігонуклеозидами. У деяких варіантах здійснення модифікована іїБМА буде містити атом фосфору в своєму міжнуклеозидному остові.
Модифіковані остови РНК включають, наприклад, фосфотіоати, хіральні фосфотісати, фосфодитіоати, фосфотриестери, аміноалкілфосфотриестери, метил та інші алкілфосфонати, в тому числі 3'-алкіленфосфонати, а також хіральні фосфонати, фосфінати, фосфорамідати, в тому числі 3'-амінофосфорамідат і аміноалкілфосфорамідати, тіонофосфорамідати, тіоноалкілфосфонати, тіоноалкілфосфотриестери та боранофосфати з нормальними 3'-5- зв'язками, їх аналоги з 2'-5'-зв'язками, а також аналоги з інвертованою полярністю, де сусідні пари нуклеозидних ланок з'єднані 3-5 до 5-3 або 2-5 до 5-2". Також включені різні солі, змішані солі та форми вільних кислот.
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання згаданих вище зв'язків, які включають фосфор, включають без обмеження патенти США МоМо 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799; 5587361; 5625050; 6028188; 6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6239265; 6277603; 6326199; 60 6346614; 6444423; 6531590; 6534639; 6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315;
7041816; 7273933; 7321029 і патентний документ США КЕЗ39464, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Модифіковані остови РНК, які не містять атома фосфору у своєму складі, включають остови, утворені коротколанцюговими алкільними або циклоалкільними міжнуклеозидними зв'язками, змішаними гетероатомними і алкільними або циклоалкільними міжнуклеозидними зв'язками або одним чи декількома коротколанцюговими гетероатомними або гетероциклічними міжнуклеозидними зв'язками. Вони включають остови з морфоліновими зв'язками (частково утвореними з цукрової частини нуклеозиду); силоксанові остови; сульфідні, сульфоксидні та сульфонові остови; формацетильні та тіоформацетильні остови; метиленформацетильні та тіоформацетильні остови; остови, що містять алкени; сульфаматні остови; метиленімінові та метиленгідразинові остови; сульфонатні та сульфонамідні остови; амідні остови та інші, що містять суміш складових частин М, 0, 5 і СН».
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання згаданих вище олігонуклеозидів, включають без обмеження патенти США МоМо 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 і 5677439, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
В інших варіантах здійснення розглядаються відповідні міметики РНК для застосування в
ІЕМА, в яких як цукор, так і міжнуклеозидний зв'язок, тобто остов, нуклеотидних ланок замінені на нові групи. Структурні одиниці у вигляді основ зберігаються для гібридизації з відповідною цільовою сполукою нуклеїнової кислоти. Одна така олігомерна сполука, міметик РНК, який, як було показано, має відмінні властивості гібридизації, називається пептидо-нуклеїновою кислотою (РМА). У сполуках РМА остов РНК, що містить цукор, замінений на остов, який містить амід, зокрема на аміноетилгліциновий остов. Нуклеотидні основи зберігаються і з'єднуються безпосередньо або опосередковано з атомами азоту азагрупи в амідній частині остова.
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання сполук РМА, включають без обмеження патенти США МоМе 5539082; 5714331 і 5719262, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання. Додаткові сполуки РМА, придатні для застосування в ІКМА за даним винаходом, описані, наприклад, в Міеївеп еї аї., Зсіепсе, 1991, 254, 1497-1500.
Деякі варіанти здійснення, представлені в даному винаході, передбачають РНК з фосфотіоатними остовами та олігонуклеозиди з остовами із гетероатомами і, зокрема --СНе--
МНн--Сне-, --Н2--МЖ(СНз)--0--СНе--Івідомий як метилен(метиліміновий) або ММІ-остові, --СН2--0--
М(СНз)--Сне--, -Сно--М(СНз)--М(СНз)--СНе-- і -М«(СНз)--Сно--СНе--Іде нативний фосфодіестерний остов представлений як --0--Р--0--СНео--| згідно з вищезгаданим патентом
США Мо 5489677 і амідні остови згідно з вищезгаданим патентом США Мо 5602240. У деяких варіантах здійснення РНК, представлені в даному документі, мають морфолінові структури остова згідно з вищезгаданим патентом США Мо 5034506.
Модифіковані РНК також можуть містити один або декілька заміщених цукрових фрагментів.
Представлені в даному документі ІкМА, наприклад а5КмМА, у 2'-положенні можуть містити одне з наступних: ОН; Е; 0-, 5- або М-алкіл; О-, 5- або М-алкеніл; О-, 5- або М-алкініл або О-алкіл-О- алкіл, де алкіл, алкеніл і алкініл можуть бути заміщеним або незаміщеним С1-Стіосалкілом або Сг-
Суісалкенілом і алкінілом. Ілюстративні придатні модифікації включають ОКСНг)Ої| тСНз,
О(СНг) Осн», О(СНозМНг, О(СНг) «СНз, О(СНаОМН: ії (СНОМ (СНег)СНз)|г, де п і т становлять від 1 до приблизно 10. В інших варіантах здійснення а5КМА в 2'-положенні містять одне з наступних: нижчий С1-Сіоалкіл, заміщений нижчий алкіл, алкарил, аралкіл, О-алкарил або О-аралкіл, ЗН, 5СНз, ОСМ, СІ, Ві, СМ, СЕз, ОСЕз, БОСН:з, 5О2СНз, ОМО», МО», Мз, МНе, гетероциклоалкіл, гетероциклоалкарил, аміноалкіламіно, поліалкіламіно, заміщений силіл, групу, що розщеплює РНК, репортерну групу, інтеркалятор, групу для поліпшення фармакокінетичних властивостей іЇКМА або групу для поліпшення фармакодинамічних властивостей ІКМА та інші замісники з аналогічними властивостями. У деяких варіантах здійснення модифікація включає 2'-метоксиетокси (2'-0--СН»СНгОСснН», також відомий як 2'-0-(2- метоксиетил) або 2'-МОЕ) (Мапіп еї аї., Нем. Спіт. Асіа, 1995, 78:486-504), тобто алкокси- алкоксигрупу. Іншою ілюстративною модифікацією є 2'-диметиламінооксиетокси, тобто група
О(СНггОоМ(СнНЗ)», також відома як 2-ОМАСЕ, описана в прикладах у даному документі нижче, і 2г"-диметиламіноетоксиетокси (також відома з рівня техніки як 2'-О-диметиламіноетоксиетил або 2'-»ВМАЕОЕ), тобто 2'-0О--СН2г--0--СН2--М(СН?г)».
Інші модифікації включають 2'-метокси (2'-ОСН»з), 2'-амінопропокси (2-ОСН».СН.СНМН») і 2'- бо фтор (2-Е). Подібні модифікації можуть бути здійснені також в інших положеннях в РНК із числа
ІЕМА, зокрема в 3'-положенні цукру в 3'-кінцевому нуклеотиді або в д5ЕМА з 2'-5'-зв'язками і в 5'- положенні 5'-кінцевого нуклеотиду. Замість пентофуранозильного цукру ІКМА можуть містити також міметики цукрів, такі як циклобутилові фрагменти. Ілюстративні патенти США, в яких описане одержання таких структур з модифікованими цукрами, включають без обмеження патенти США МоМо 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 і 5700920, деякі з яких належать авторам даної заявки. Повний зміст кожного з вищезгаданих джерел таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
РНК із числа ІКМА за даним винаходом може містити також модифікації або заміщення нуклеотидної основи (що часто називається у даній галузі просто як "основа"). Використовувані в даному документі "немодифіковані" або "природні" нуклеотидні основи включають пуринові основи аденін (А) і гуанін (С), а також піримідинові основи тимін (Т), цитозин (С) і урацил ()).
Модифіковані нуклеотидні основи включають в себе інші синтетичні та природні нуклеїнові основи, такі як дезокситимін (ат), 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гідроксиметилцитозин, ксантин, гіпоксантин, 2-аміноаденін, б-метил та інші алкіл-похідні аденіну та гуаніну, 2-пропіл та інші алкіл-похідні аденіну та гуаніну, 2-тіоурацил, 2-тіотимін ії 2-тіоцитозин, 5-галогенурацил і - цитозин, 5-пропінілурацил і -цитозин, 6б-азоурацил, -цитозин і -тимін, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тіоурацил, 8-галоген-, 8-аміно-, 8-тіол-, 8-тіоалкіл-, 8-гідроксил- та інші 8-заміщені аденіни та гуаніни, 5-галоген, зокрема 5-бром, 5-трифторметил та інші 5-заміщені урацили та цитозини, 7- метилгуанін і 7-метиладенін, 8-азагуанін і 8-азааденін, 7-деазагуанін і 7-деазааденін, а також 3- деазагуанін і З-деазааденін. Додаткові нуклеотидні основи включають розкриті в патенті США Мо 3687808, розкриті в Моадійей Мисіеозіде5 іп Віоспетівзігу, ВіоїесппоЇоду апа Меаісіпе, Негаем/і|п,
Р. єд. М/Пеу-МСН, 2008; розкриті в Те Сопсізе Епсусіоредіа ОЇ Роїутег 5сіепсе Апа Епдіпеегіпод, раде5 858-859, КгозсПм/ї7, 9. Її, ей. допп МУМпеу й Боп5, 1990, розкриті в Епадії5си еї аї.,
Апдежапае Спептіеє, Іп(егпайопаї! Едйоп, 1991, 30, 613, а також розкриті в Ззапопмі, М 5., Спаріег 15, азВМА Резвєагсіп апа Арріїсайопе5, раде5 289-302, СтооКе, 5. Т. апа І ерієм, В., Еа., САС
Рге55, 1993. Деякі з цих нуклеотидних основ особливо придатні для підвищення афінності зв'язування олігомерних сполук, описаних у даному винаході. Вони включають 5-заміщені піримідини, б-азапіримідини та М-2, М-6 і 0-6-заміщені пурини, в тому числі 2-амінопропіладенін,
Зо Б-пропінілурацил і 5-пропінілцитозин. Було показано, що 5-метилцитозинові заміщення підвищують стабільність дуплекса нуклеїнових кислот на 0,6-1,2 7 (Запопмі, У. 5., Сгооке, 5. Т. апа І ерієим, В., Едз., а5АМА Везеагсі апа Арріїсайоп5, САС Ргезв, Воса ВНаїйоп, 1993, рр. 276- 218) і являють собою ілюстративні заміщення основ, ще більш конкретно в комбінації з 2'-0- метоксиетильними модифікаціями цукрів.
Ілюстративні патенти США, в яких викладена ідея одержання певних згаданих вище модифікованих нуклеотидних основ, а також інших модифікованих нуклеотидних основ, включають без обмеження згадані вище патенти США МоМо 3687808, 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121, 5596091; 5614617; 5681941; 5750692; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 і 7495088, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
РНК із числа ІКМА також може бути модифікована таким чином, щоб вона містила один або декілька біциклічних цукрових фрагментів. "Біциклічний цукор" являє собою фуранозильне кільце, модифіковане шляхом утворення містка між двома атомами. "Біциклічний нуклеозид" ("ВМА") являє собою нуклеозид, який має цукровий фрагмент, який містить місток, що з'єднує два атоми вуглецю цукрового кільця, завдяки чому утворюється біциклічна кільцева система. У певних варіантах здійснення місток з'єднує 4"-вуглець і 2'--вуглець в цукровому кільці. Таким чином, в деяких варіантах здійснення засіб за даним винаходом може містити одну або декілька замкнених нуклеїнових кислот (І МА). Замкнена нуклеїнова кислота являє собою нуклеотид, що містить модифікований рибозний фрагмент, де рибозний фрагмент містить додатковий місток, що з'єднує 2'- і 4--атоми вуглецю. Іншими словами, ЇМА являє собою нуклеотид, який містить біциклічний цукровий фрагмент, що містить місток 4-СН2-0-2. Така структура ефективно "замикає" рибозу в структурній конформації 3'-ендо. Було показано, що додавання замкнених нуклеїнових кислот в 5БікМА підвищує стабільність 5ікМА в сироватці крові та знижує нецільові ефекти (ЕїЇІптеп, «5. еї а!., (2005) Мисівіс Асіаз Незеєагсіп 33(1):439-447; Моок, ОВ. еї аї., (2007) Мої
Сапс Тег 6(3):833-843; СптипмеїПетг, А. єї а!., (2003) Мисівіс Асідх ВРезеагсі 31(12):3185-3193).
Приклади біциклічних нуклеозидів для застосування в полінуклеотидах за даним винаходом включають без обмеження нуклеозиди, які містять місток між 4- і 2-атомами рибозильного кільця. У певних варіантах здійснення засоби на основі антисенсових полінуклеотидів за даним 60 винаходом містять один або декілька біциклічних нуклеозидів, які містять місток 4-2". Приклади таких біциклічних нуклеозидів з містком 4-2" включають без обмеження 4-(СН2г)-О0-2 (І МА); 4- (СбНнг)-5-277. 4-(СН2г)2-0-2" (ЕММА); 4-СН(СНЗ)-О0-2' (що також називається "конформаційно утрудненим етилом" або "СЕР і 4-СН(СН2гОСНЗ)-О0-2' (і його аналоги; див., наприклад, патент
США Мо 7399845); 4-С(СНЗУСНЗ)-0-2 (і його аналоги; див., наприклад, патент США Мо 8278283); 4-СН2-- М (ОСНЗ)-2' (і його аналоги; див., наприклад, патент США Мо 8278425); 4-
Сбнг-О0--М(СНЗ)-2' (див., наприклад, публікацію патенту США Мо 2004/0171570); 4-СН2--
М(2)-0-2", де ЕК являє собою Н, С1-С12алкіл або захисну групу (див., наприклад, патент США
Мо 7427672); 4-СН2-- О(«НуУСНЗ)-2' (див., наприклад, Спайораднуауа еї аї., У. Огуд. Спет., 2009, 74, 118-134); і 4-СН2-с2с («-0Н2)-27 (і його аналоги; див., наприклад, патент США Мо 8278426).
Повний зміст кожного з вищезгаданих джерел таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Додаткові ілюстративні патенти США і публікації патентів США, в яких викладена ідея одержання нуклеотидів замкнених нуклеїнових кислот, включають без обмеження наступні: патенти США МоМо 6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 6998484; 7053207; 7034133:7084125; 7399845; 7427672; 7569686; 7741457; 8022193; 8030467; 8278425; 8278426; 8278283; 005 2008/0039618 ії 005 2009/0012281, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Будь-який із вищезгаданих біциклічних нуклеозидів можна одержувати з однією або декількома стереохімічними конфігураціями цукрів, в тому числі, наприклад, «(ас-1- рибофуранозою та В-ЮО-рибофуранозою (див. УМО 99/14226).
РНК із числа ІКМА також може бути модифікована таким чином, щоб вона містила один або декілька конформаційно утруднених етилом нуклеотидів. Як використовується в даному документі, "конформаційно утруднений етилом нуклеотид" або "СЕ" являє собою замкнену нуклеїнову кислоту, яка містить біциклічний цукровий фрагмент, що містить місток 4'-СН(СНЗ)- 0-2". В одному варіанті здійснення конформаційно утруднений етилом нуклеотид знаходиться в
З-конформації, яка називається в даному документі "5-СЕЇ".
ІЕМА за даним винаходом також може містити один або декілька "конформаційно обмежених нуклеотидів" ("СЕМ"). СЕМ являють собою аналоги нуклеотидів із лінкером, який з'єднує С2"- і б4атоми вуглецю рибози або С3- і С5-атоми вуглецю рибози. СЕМ замикає
Зо рибозне кільце в стабільну конформацію і підвищує афінність гібридизації з мРНК. Лінкер має достатню довжину для того, щоб розмістився кисень в оптимальному положенні для забезпечення стабільності та афінності, що приводить в результаті до меншого "зморщування" рибозного кільця.
Ілюстративні публікації, в яких викладена ідея одержання певних згаданих вище СЕМ, включають без обмеження публікацію патенту США Мо 2013/0190383; і публікацію згідно з РСТ
УМО 2013/036868, повний зміст кожної з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Один або декілька нуклеотидів ІЇКМА за даним винаходом також можуть включати гідроксиметилзаміщений нуклеотид. "Гідроксиметилзаміщений нуклеотид" являє собою ациклічний 2'-3'--секонуклеотид, який також називається модифікацією "незамкнена нуклеїнова кислота" ("ОМА").
Ілюстративні публікації США, в яких викладена ідея одержання ОМА, включають без обмеження патент США Мо 8314227; і публікації патентів США МоМо 2013/0096289; 2013/0011922; і 2011/0313020, повний зміст кожної з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Потенційно стабілізуючі модифікації на кінцях молекул РНК можуть включати в себе М- (ацетиламінокапроїл)-4-гідроксипролінол.: (Нур-С6-МНАс), М-(капроїл-4-гідроксипролінол (Нур-
Сб), М-(ацетил-4-гідроксипролінол о (Нур-МНАс), тимідин-2-О-дезокситимідин (етер), М- (амінокапроїл)-4-гідроксипролінол. (Нур-Сб-аміно), 2-докозаноїлуридин-3'-фосфат, інвертована основа ат(ат) та інші. Розкриття такої модифікації можна знайти в публікації згідно з РСТ МеУуО 2011/005861.
Інші модифікації нуклеотидів ІЕМА за даним винаходом включають 5'-фосфат або міметик
Б-фосфату, наприклад, 5'-кінцевий фосфат або міметик фосфату в антисенсовій нитці засобу для ЕМАЇїі. Придатні міметики фосфату розкриті, наприклад, в публікації патенту США Мо 2012/0157511, повний зміст якого включено в даний документ за допомогою посилання.
А. Модифіковані ікМА, що містять мотиви за даним винаходом
У певних аспектах даного винаходу двониткові засоби для КМАїЇ за даним винаходом передбачають хімічні модифікації, розкриті, наприклад, в попередній заявці на патент США Мо 61/561710, поданій 18 листопада 2011 р., або в РСТ/О52012/065691, поданій 16 листопада 2012 60 р., повний зміст кожної з яких включено в даний документ за допомогою посилання.
Більш конкретно, несподівано було виявлено, що якщо сенсова нитка і антисенсова нитка двониткового засобу для КМАЇ модифіковані так, що містять один або декілька мотивів з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів у сайті розщеплення щонайменше однієї нитки засобу для КМАЇ або поруч з ним, то активність засобу для ЕМАїЇ щодо сайленсингу генів була підвищена кращим чином.
Відповідно, в даному винаході передбачені двониткові засоби для ЕМАЇ, здатні інгібувати експресію цільового гена (тобто гена ТТК) іп мімо. Засіб для ЕМАЇї містить сенсову нитку і антисенсову нитку. Довжина кожної нитки засобу для ЕМАії може варіюватися від 12 до 30 нуклеотидів. Наприклад, довжина кожної нитки може становити 14-30 нуклеотидів, 17-30 нуклеотидів, 25-30 нуклеотидів, 27-30 нуклеотидів, 17-23 нуклеотиди, 17-21 нуклеотид, 17-19 нуклеотидів, 19-25 нуклеотидів, 19-23 нуклеотиди, 19-21 нуклеотид, 21-25 нуклеотидів або 21-23 нуклеотиди.
Як правило, сенсова нитка й антисенсова нитка утворюють двонитковий РНК-дуплекс (азкМА"), що також називається в даному документі як "засіб для ЕМАЇ". Довжина дуплексної ділянки засобу для КМАЇї може становити 12-30 пар нуклеотидів. Наприклад, довжина дуплексної ділянки може становити 14-30 пар нуклеотидів, 17-30 пар нуклеотидів, 27-30 пар нуклеотидів, 17-23 пари нуклеотидів, 17-21 пару нуклеотидів, 17-19 пар нуклеотидів, 19-25 пар нуклеотидів, 19-23 пари нуклеотидів, 19-21 пару нуклеотидів, 21-25 пар нуклеотидів або 21-23 пари нуклеотидів. В іншому прикладі довжина дуплексної ділянки вибрана з 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 і 27 нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇї може містити одну або декілька ділянок, що виступають, і/або блокувальних груп на 3'-кінці, 5'-кінці або обох кінцях однієї або обох ниток.
Довжина виступаючого кінця може становити 1-6 нуклеотидів, наприклад, 2-6 нуклеотидів, 1-5 нуклеотидів, 2-5 нуклеотидів, 1-4 нуклеотиди, 2-4 нуклеотиди, 1-3 нуклеотиди, 2-3 нуклеотиди або 1-2 нуклеотиди. Виступаючі кінці можуть бути обумовлені тим, що одна нитка довша за іншу, або можуть бути обумовлені тим, що дві нитки однакової довжини розташовані зі зсувом.
Виступаючий кінець може утворювати помилкове спарювання з цільовою мРНК, або він може бути комплементарним до цільових послідовностей генів або може мати іншу послідовність.
Перша і друга нитки також можуть бути з'єднані, наприклад, додатковими основами з
Зо утворенням "шпильки" або за допомогою інших лінкерів, що не містять основ.
В одному варіанті здійснення кожний з нуклеотидів у ділянці, що виступає, засобу для ЕМАЇ незалежно може являти собою модифікований або немодифікований нуклеотид, у тому числі без обмеження цукор з 2'-модифікацією, такою як 2-Е, 2-О-метил, тимідин (Т), 2-0- метоксиетил-5-метилуридин (Тео), 2'-О-метоксиетиладенозин (Аео), 2'-О-метоксиетил-5- метилцитидин (т5сСео) і будь-які їх комбінації. Наприклад, послідовність виступаючого кінця на кожному кінці кожної нитки може являти собою ТТ. Виступаючий кінець може утворювати помилкове спарювання з цільовою мРНК, або він може бути комплементарним до цільових послідовностей генів або може мати іншу послідовність. 5- або 3'-виступаючі кінці сенсової нитки, антисенсової нитки або обох ниток засобу для
ЕМАїЇ можуть бути фосфорильовані. У деяких варіантах здійснення ділянка(ділянки), що виступає(виступають) містить(містять) два нуклеотиди з фосфотіоатом між двома нуклеотидами, при цьому два нуклеотиди можуть бути однаковими або різними. В одному варіанті здійснення виступаючий кінець присутній на 3'-кінці сенсової нитки, антисенсової нитки або обох ниток. В одному варіанті здійснення даний 3'-виступаючий кінець присутній в антисенсовій нитці. В одному варіанті здійснення даний 3'-виступаючий кінець присутній у сенсовій нитці.
Засіб для КМАї може передбачати лише один виступаючий кінець, який може підвищувати інтерферуючу активність ЕМАії без впливу на його загальну стабільність. Наприклад, однонитковий виступаючий кінець може бути розташований на 3'-кінці сенсової нитки або, як альтернатива, на 3'-кінці антисенсової нитки. КМАЇї також може мати тупий кінець, розташований на 5'-кінці антисенсової нитки (або 3'-кінці сенсової нитки), або місе мегза. Як правило, антисенсова нитка КМАї має нуклеотидний виступаючий кінець на 3'-кінці, а 5'-кінець є тупим.
Не бажаючи бути обмеженими будь-якою теорією вважають, що асиметричний тупий кінець на
Б'-кінці антисенсової нитки і 3'-кінцевий виступаючий кінець антисенсової нитки сприяють включенню направляючої нитки в процес з участю КІЗО.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇї містить сенсову нитку з 21 нуклеотиду і антисенсову нитку з 23 нуклеотидів, де сенсова нитка містить щонайменше один мотив з трьох 2-Е-модифікацій трьох послідовних нуклеотидів у положеннях 9, 10, 11 від 5'-кінця; антисенсова нитка містить щонайменше один мотив з трьох 2'-О-метил-модифікацій трьох послідовних 60 нуклеотидів у положеннях 11, 12, 13 від 5'-кінця, де один кінець засобу для КМАЇ тупий, у той час як інший кінець передбачає виступаючий кінець з 2 нуклеотидів. Переважно, виступаючий кінець з 2 нуклеотидів знаходиться на 3'-кінці антисенсової нитки.
Якщо виступаючий кінець з 2 нуклеотидів знаходиться на 3'-кінці антисенсової нитки, то між трьома кінцевими нуклеотидами можуть бути два фосфотіоатні міжнуклеотидні зв'язки, при цьому два з трьох нуклеотидів є нуклеотидами, що виступають, а третій нуклеотид є спареним нуклеотидом, наступним за нуклеотидом, що виступає. В одному варіанті здійснення засіб для
КМАЇ додатково містить два фосфотіоатні міжнуклеотидні зв'язки між трьома кінцевими нуклеотидами як на 5'-кінці сенсової нитки, так і на 5"-кінці антисенсової нитки. В одному варіанті здійснення кожний нуклеотид у сенсовій нитці й антисенсовій нитці засобу для ЕМАЇ, в тому числі нуклеотиди, які є частиною мотивів, є модифікованим нуклеотидом. В одному варіанті здійснення кожний залишок незалежно модифікований 2'-О-метилом або 3"-фтором, наприклад в мотиві, що чергується. В одному варіанті здійснення всі нуклеотиди ІКМА за даним винаходом є модифікованими, і при цьому ІЕМА містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 7 2'-фтор-модифікацій, не більше б 2'-фтор-модифікацій, не більше 5 2'-фтор- модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор-модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в сенсовій нитці і не більше б 2'-фтор-модифікацій (наприклад, не більше 5 2'-фтор-модифікацій, не більше 4 2'-фтор-модифікацій, не більше З 2'-фтор- модифікацій або не більше 2 2'-фтор-модифікацій) в антисенсовій нитці. Необов'язково засіб для ЕМАЇ додатково містить ліганд (переважно, саіІМАсз).
В одному варіанті здійснення сенсова нитка засобу для КМАЇ містить щонайменше один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів, де один з мотивів знаходиться в сайті розщеплення у сенсовій нитці.
В одному варіанті здійснення антисенсова нитка засобу для КМАїЇ може також містити щонайменше один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів, де один з мотивів знаходиться в сайті розщеплення у сенсовій нитці або поруч з ним.
Для засобу для ЕМАЇї з дуплексною ділянкою, довжина якої становить 17-23 нуклеотиди, сайт розщеплення антисенсової нитки знаходиться зазвичай біля 10, 11 і 12 положень від 5'- кінця. Таким чином, мотиви з трьома ідентичними модифікаціями можуть знаходитися в положеннях 9, 10, 11; положеннях 10, 11, 12; положеннях 11, 12, 13; положеннях 12, 13, 14 або положеннях 13, 14, 15 антисенсової нитки, при цьому відлік починається з 12 нуклеотиду від 5'- кінця антисенсової нитки, або відлік починається з 19 спареного нуклеотиду в дуплексній ділянці від 5'-кінця антисенсової нитки. Сайт розщеплення в антисенсовій нитці може змінюватися також відповідно до довжини дуплексної ділянки КМАЇ від 5'-кінця.
Сенсова нитка засобу для КМАЇ може містити щонайменше один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів у сайті розщеплення нитки; і антисенсова нитка може мати щонайменше один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів у сайті розщеплення нитки або поруч з ним. Якщо сенсова нитка й антисенсова нитка утворюють дуплекс а5КМА, то сенсова нитка й антисенсова нитка можуть бути вирівняні так, що один мотив з трьох нуклеотидів у сенсовій нитці й один мотив з трьох нуклеотидів у антисенсовій нитці мають перекриття щонайменше в один нуклеотид, тобто щонайменше один з трьох нуклеотидів мотиву у сенсовій нитці утворює пару основ щонайменше з одним із трьох нуклеотидів мотиву в антисенсовій нитці. Як альтернатива, можуть перекриватися щонайменше два нуклеотиди, або можуть перекриватися всі три нуклеотиди.
В одному варіанті здійснення кожний нуклеотид у сенсовій нитці й антисенсовій нитці засобу для ЕМАЇ, в тому числі нуклеотиди, які є частиною мотивів, може бути модифікований. Кожний нуклеотид може бути модифікованим однаковою або різними модифікаціями, які можуть включати одну або декілька змін одного або обох незв'язаних з фосфатом атомів кисню та/або одного або декількох зв'язаних з фосфатом атомів кисню; зміну компонента рибозного цукру, наприклад 2'-гідроксилу у рибозному цукрі; повну заміну фосфатного фрагмента "дефосфоризованими" лінкерами; модифікацію або заміну основи, що зустрічається в природі, та заміну або модифікацію рибозофосфатного остова.
Оскільки нуклеїнові кислоти являють собою полімери із субодиниць, то багато модифікацій зустрічаються у положенні, яке повторюється в межах нуклеїнової кислоти, наприклад модифікація основи, або фосфатного фрагмента, або атома О, що не утворює зв'язку, фосфатного фрагмента. У деяких випадках модифікація буде зустрічатися в усіх розглянутих положеннях в нуклеїновій кислоті, але в багатьох випадках не буде. Як приклад, модифікація може зустрічатися лише в 3- або 5'-кінцевому положенні, може зустрічатися лише у кінцевій ділянці, наприклад у положенні кінцевого нуклеотиду або в останніх 2, 3, 4, 5 або 10 бо нуклеотидах нитки. Модифікація може зустрічатися у двонитковій ділянці, в однонитковій ділянці або в обох. Модифікація може зустрічатися лише у двонитковій ділянці РНК, або може зустрічатися лише в однонитковій ділянці РНК. Наприклад, фосфотіоатна модифікація у положенні атома 0, що не утворює зв'язку, може зустрічатися лише на одному або обох кінцях, може зустрічатися лише у кінцевій ділянці, наприклад у положенні кінцевого нуклеотиду або в останніх 2, 3, 4, 5 або 10 нуклеотидах нитки, або може зустрічатися в двонитковій і однонитковій ділянках, зокрема на кінцях. 5'-кінець або кінці можуть бути фосфорильованими.
Це створює можливість, наприклад, для підвищення стабільності, для включення конкретних основ у виступаючі кінці, або для включення модифікованих нуклеотидів чи |імітаторів нуклеотидів в однониткові виступаючі кінці, наприклад в 5'- або 3'-виступаючий кінець, або в обидва. Наприклад, може бути бажаним включити у виступаючі кінці пуринові нуклеотиди. У деяких варіантах здійснення всі або деякі основи в 3'- або 5'-виступаючих кінцях можуть бути модифіковані, наприклад за допомогою модифікації, описаної в даному документі. Модифікації можуть передбачати, наприклад, застосування модифікацій у 2'-положенні рибозного цукру за допомогою модифікацій, відомих Кк! рівня техніки, наприклад, застосування дезоксирибонуклеотидів, 2'-дезокси-2'-фтор-(2-Е)- або 2'-О-метил-модифікацій замість рибозного цукру нуклеотидної основи, а також модифікацій фосфатної групи, наприклад фосфотіоатних модифікацій. Виступаючі кінці не обов'язково повинні бути гомологічними цільовій послідовності.
В одному варіанті здійснення кожний залишок сенсової нитки і антисенсової нитки незалежно модифікований МА, СЕМ, СЕТ, ОМА, НМА, СемА, 2'-метоксиетилом, 2'--О-метилом, 2-О-алілом, 2"-С-алілом, 2'-дезокси, 2"-гідроксилом або 2'"-фтором. Нитки можуть містити більше однієї модифікації. В одному варіанті здійснення кожний залишок сенсової нитки й антисенсової нитки незалежно модифікований 2'-О-метилом або 2'-фтором.
Як правило, у сенсовій нитці й антисенсовій нитці присутні щонайменше дві різні модифікації. Ці дві модифікації можуть являти собою 2'-О-метил- або 2'--фтор-модифікації або інші.
В одному варіанті здійснення Ма та/або Мь містять модифікації патерну, що чергується.
Термін "мотив, що чергується", використовуваний в даному документі, стосується мотиву з однією або декількома модифікаціями, при цьому кожна модифікація зустрічається у
Зо нуклеотидів, що чергуються, однієї нитки. Нуклеотид, що чергується, може стосуватися кожного другого нуклеотиду або кожного третього нуклеотиду або аналогічного патерну. Наприклад, якщо кожний з А, В і С являє собою один тип модифікації нуклеотиду, то мотив, що чергується, може являти собою "АВАВАВАВАВАВ..." "ААВВААВВААВВ...", "ААВААВААВААВ...", "ХААВАААВАААВ...", "АААВВВАААВВВ..." або " АВСАВСАВСАВС..." тощо.
Тип модифікацій, які містяться у мотиві, що чергується, може бути однаковим або різним.
Наприклад, якщо кожний з А, В, С, О являє собою один тип модифікації нуклеотиду, то патерн, що чергується, тобто модифікації кожного другого нуклеотиду, може бути однаковим, але кожна зі сенсової нитки або антисенсової нитки може бути вибрана з декількох можливих модифікацій у мотиві, що чергується, такому як "АВАВАВ...", "АСАСАС...", "ВОВОВО..." або "СОСОСО.. С" тощо.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАї за даним винаходом містить патерн модифікацій для мотиву, що чергується, сенсової нитки, зсунутий відносно патерну модифікації для мотиву, що чергується, антисенсової нитки. Зсув може бути таким, що модифікована група нуклеотидів сенсової нитки відповідає іншим чином модифікованій групі нуклеотидів антисенсової нитки і місе мегза. Наприклад, у разі спарювання сенсової нитки з антисенсовою ниткою в дуплекс а5КМА мотив, що чергується, у сенсовій нитці може починатися з "АВАВАВ" від 5і- до 3-кінця нитки, а мотив, що чергується, в антисенсовій нитці може починатися з "ВАВАВА" від 5'- до 3"-кінця нитки в дуплексній ділянці. Як інший приклад, мотив, що чергується, у сенсовій нитці може починатися з "ААВВААВВ" у напрямку від 5'- до 3-кінця нитки, а мотив, що чергується, в антисенсовій нитці може починатися з "ВВААВВАА" у напрямку від 5'- до 3'- кінця нитки в межах дуплексної ділянки, так що між сенсовою ниткою і антисенсовою ниткою є повний або частковий зсув патернів модифікацій.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇ, який містить патерн мотиву, що чергується, 2'-
О-метил-модифікації та 2'-Е-модифікації у сенсовій нитці, початково має зсув відносно патерну мотиву, що чергується, 2'-О-метил-модифікації та 2'-Е-модифікації в антисенсовій нитці, тобто 2"-Ю-метил-модифікований нуклеотид у парах основ у сенсовій нитці з 2'-Е-модифікованим нуклеотидом в антисенсовій нитці і місе мегза. Положення 1 у сенсовій нитці може починатися з 2'-Е-модифікації, а положення 1 в антисенсовій нитці може починатися з 2'-О-метил-модифікації.
Введення одного або декількох мотивів з трьома ідентичними модифікаціями трьох бо послідовних нуклеотидів у сенсову нитку та/або антисенсову нитку порушує початковий патерн
Зо модифікацій, присутній у сенсовій нитці та/або антисенсовій нитці. Таке порушення патерну модифікацій сенсової та/або антисенсової ниток шляхом введення одного або декількох мотивів з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів у сенсову та/або антисенсову нитки несподівано підвищує активність сайленсингу генів щодо цільового гена.
В одному варіанті здійснення, якщо мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів вводять у будь-яку з ниток, то модифікація нуклеотиду, наступного за мотивом, є модифікацією, відмінною від модифікації мотиву. Наприклад, частина послідовності, що містить мотив, являє собою "...МаУММУМь..., де "У" являє собою модифікацію мотиву з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів, а "Ма" і "Ме" являють собою модифікацію нуклеотиду, наступного за мотивом "УУ У", яка відрізняється від модифікації в У, і де Ма і Мь можуть бути однаковими або різними модифікаціями. Як альтернатива, Ма та/або Мь можуть бути присутніми або відсутніми в разі, якщо присутня фланкуюча модифікація.
Засіб для РМАїЇ може додатково містити щонайменше один фосфотіоатний або метилфосфонатний міжнуклеотидний зв'язок. Модифікація фосфотіоатного або метилфосфонатного міжнуклеотидного зв'язку може зустрічатися у будь-якого нуклеотиду сенсової нитки або антисенсової нитки або обох ниток у будь-якому положенні нитки.
Наприклад, модифікація міжнуклеотидного зв'язку може зустрічатися у кожного нуклеотиду сенсової нитки та/або антисенсової нитки; при цьому кожна модифікація міжнуклеотидного зв'язку може зустрічатися у патерні, що чергується, у сенсовій нитці та/або антисенсовій нитці; або сенсова нитка або антисенсова нитка можуть містити обидві модифікації міжнуклеотидного зв'язку у патерні, що чергується. Патерн, що чергується, модифікації міжнуклеотидного зв'язку у сенсовій нитці може бути таким самим, як в антисенсовій нитці, або відмінним від нього, і патерн, що чергується, модифікації міжнуклеотидного зв'язку у сенсовій нитці може характеризуватися зсувом відносно патерну, що чергується, модифікації міжнуклеотидного зв'язку в антисенсовій нитці. В одному варіанті здійснення двонитковий засіб для КМАЇ містить 6-8 фосфотіоатних міжнуклеотидних зв'язків. В одному варіанті здійснення антисенсова нитка містить два фосфотіоатні міжнуклеотидні зв'язки на 5'-кінці і два фосфотісатні міжнуклеотидні зв'язки на 3'-кінці, а сенсова нитка містить щонайменше два фосфотіоатні міжнуклеотидні зв'язки або на 5'-кінці, або на 3'-кінці.
Зо В одному варіанті здійснення ЕМАї містить модифікацію фосфотіоатного або метилфосфонатного міжнуклеотидного зв'язку у ділянці, що виступає. Наприклад, ділянка, що виступає, може містити два нуклеотиди з фосфотідлсатним або метилфосфонатним міжнуклеотидним зв'язком між двома нуклеотидами. Модифікації міжнуклеотидного зв'язку можуть бути виконані також для з'єднання нуклеотидів, що виступають, з кінцевими спареними нуклеотидами в дуплексній ділянці. Наприклад, щонайменше 2, 3, 4 або всі нуклеотиди, що виступають, можуть бути зв'язані за допомогою фосфотіоатного або метилфосфонатного міжнуклеотидного зв'язку, і необов'язково можуть бути присутніми додаткові фосфотіоатні або метилфосфонатні міжнуклеотидні зв'язки, які з'єднують нуклеотид, що виступає, зі спареним нуклеотидом, котрий іде за нуклеотидом, що виступає. Наприклад, між трьома кінцевими нуклеотидами можуть бути присутніми щонайменше два фосфотіоатні міжнуклеотидні зв'язки, при цьому два з трьох нуклеотидів є нуклеотидами, що виступають, а третій є спареним нуклеотидом, наступним за нуклеотидом, що виступає. Ці три кінцеві нуклеотиди можуть бути на 3'-кінці антисенсової нитки, 3'-кінці сенсової нитки, 5'-кінці антисенсової нитки та/або 5'-кінці антисенсової нитки.
В одному варіанті здійснення виступаючий кінець з 2 нуклеотидів знаходиться на 3'-кінці антисенсової нитки, і між трьома кінцевими нуклеотидами присутні два фосфотісатні міжнуклеотидні зв'язки, при цьому два з трьох нуклеотидів є нуклеотидами, що виступають, а третій нуклеотид є спареним нуклеотидом, наступним за нуклеотидом, що виступає.
Необов'язково засіб для КМАЇї додатково може містити два фосфотісатні міжнуклеотидні зв'язки між кінцевими трьома нуклеотидами як на 5'-кінці сенсової нитки, так і на 5'-кінці антисенсової нитки.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇї містить помилкове(помилкові) спарювання з мішенню, в дуплексі або їх комбінації. Помилкове спарювання може зустрічатися в ділянці, що виступає, або в дуплексній ділянці. Пари основ можна ранжувати на основі їхньої здатності сприяти дисоціації або плавленню (наприклад, за вільною енергією асоціації або дисоціації певного спарювання, при цьому найбільш простим підходом є вивчення пар окремо для кожної пари основ, проте можна застосовувати також аналіз найближчого сусіда або подібний йому). З точки зору сприяння дисоціації: А: є більш переважною, ніж :С; (5:00 є більш переважною, ніж с:С, і Сб є більш переважною, ніж (5:С (І - інозин). Помилкові спарювання, наприклад бо неканонічні або відмінні від канонічних типи спарювання (описані в інших місцях в даному документі), є більш переважними ніж канонічні типи спарювання (А:Т, А, (3:С); і типи спарювання, які включають універсальну основу, є більш переважними ніж канонічні типи спарювання.
В одному варіанті здійснення засіб для КМАЇ містить щонайменше одну з перших 1, 2, 3, 4 або 5 пар основ в дуплексних ділянках від 5'-кінця антисенсової нитки, незалежно вибрану з групи, що складається з А, :И, ІС ї помилково спарених пар, наприклад неканонічних або відмінних від канонічних типів спарювання або типів спарювання, які включають універсальну основу, для сприяння дисоціації антисенсової нитки на 5'-кінці дуплексу.
В одному варіанті здійснення нуклеотид у положенні 1 в межах дуплексної ділянки, в напрямку від 5'-кінця антисенсової нитки, вибраний з групи, що складається з А, ЗА, ДО, Ш і ат.
Як альтернатива, щонайменше одна з перших 1, 2 або З пар основ у межах дуплексної ділянки, в напрямку від 5'-кінця антисенсової нитки, являє собою пару основ А). Наприклад, перша пара основ у межах дуплексної ділянки, в напрямку від 5'-кінця антисенсової нитки, являє собою пару основ А.
В одному варіанті здійснення послідовність сенсової нитки може бути представлена формулою (1):
Б пр-ма-(Х Х Х )І-МБ-м М У -МБ-(2 2 2 )|-Ма-па З' (І) де кожний з і та | незалежно дорівнює 0 або 1; кожний з р і д незалежно дорівнює 0-6; кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 модифікованих нуклеотидів, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний Мь незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10 модифікованих нуклеотидів;
КОЖНИЙ Пр і пд незалежно являє собою нуклеотид, що виступає; де МБ і У мають неоднакову модифікацію, і кожний 3 ХХХ, МУ і 227 незалежно являє собою один мотив з трьох ідентичних модифікацій трьох послідовних нуклеотидів. Переважно, в УМ всі нуклеотиди є 2-БЕ- модифікованими.
В одному варіанті здійснення Ма та/або Мь містять модифікації патерну, що чергується.
В одному варіанті здійснення мотив УУУ знаходиться в сайті розщеплення сенсової нитки або поруч з ним. Наприклад, якщо засіб для ЕМАЇї містить дуплексну ділянку довжиною 17-23 нуклеотидів, то мотив УУУ може знаходиться в сайті розщеплення або біля нього (наприклад, може знаходиться в положеннях 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12 або 11, 12, 13) сенсової нитки, при цьому відлік починається з 12 нуклеотиду від 5'-кінця; або необов'язково відлік починається з 12 спареного нуклеотиду в дуплексній ділянці від 5'-кінця.
В одному варіанті здійснення і дорівнює 1, і | дорівнює 0, або і дорівнює 0, та | дорівнює 1, або як і, так і | дорівнює 1. Таким чином, сенсова нитка може бути представлена наступними формулами: 5 пр-Ма-УУм-Мр-222-Ма-па З' (ІБ); 5 пр-Ма-ХХХ-МЬ-УУУ-Ма-па 3' (Іс); або 5 пр-Мма-ХХХ-Мр-УУмУ-Мр-2272-Ма-па з' (19).
Якщо сенсова нитка представлена формулою (ІБ), то Мь являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів. Кожний Ма незалежно може являти собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо сенсова нитка представлена формулою (Іс), то Мь являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів.
Кожний Ма незалежно може являти собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо сенсова нитка представлена формулою (Ід), то кожний Мь незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів. Переважно Ма дорівнює 0, 1, 2, 3, 4, 5 або б, кожний Ма незалежно може являти собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Кожний із Х, У і 7 може бути однаковим або відрізнятися від інших.
В інших варіантах здійснення і дорівнює 0, і | дорівнює 0, і сенсова нитка може бути представлена формулою: бо Б пр-Ма- УМ У- Ма-Па З" (Іа).
Якщо сенсова нитка представлена формулою (Іа), то кожний Ма незалежно може являти собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення послідовність антисенсової нитки ЕМАїЇ може бути представлена формулою (ІІ):
Б па-Ма-(2273К-МБАУ УАМБ ХЗІ-М'а-пр" 3" (ІІ) де кожний з К і | незалежно дорівнює 0 або 1; кожний з р' і д' незалежно дорівнює 0-6; кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 модифікованих нуклеотидів, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний Мь незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10 модифікованих нуклеотидів;
КОЖНИЙ З Пр і пу незалежно являє собою нуклеотид, що виступає; де Мь і У мають неоднакову модифікацію; і кожний з ХХХ, У У Її 27 незалежно являє собою один мотив з трьох ідентичних модифікацій трьох послідовних нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення Ма та/або Мь' містять модифікації патерну, що чергується.
Мотив МУ" знаходиться в сайті розщеплення антисенсової нитки або поруч з ним.
Наприклад, якщо засіб для ЕМАїі містить дуплексну ділянку довжиною 17-23 нуклеотиди, то мотив У" може знаходитися в положеннях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 або 13, 14, 15 антисенсової нитки, при цьому відлік починається з 19 нуклеотиду від 5'-кінця або необов'язково відлік починається з 12 спареного нуклеотиду в дуплексній ділянці від 5'-кінця.
Переважно мотив У""У" знаходиться в положеннях 11, 12, 13.
В одному варіанті здійснення в мотиві У" усі нуклеотиди є 2''ОМе-модифікованими.
В одному варіанті здійснення К дорівнює 1, а І дорівнює 0, або К дорівнює 0, а І дорівнює 1, або як К, так і І дорівнює 1.
Таким чином, антисенсова нитка може бути представлена наступними формулами:
Зо 5 па-Ма-222-МБАУ М -Ма"-пр" 3" (ПІБ);
Б па-Ма-У У -МЬ-Х ХХ пр" 3" (Пс); або
Б па-Ма- 7 И-МрАУ У У-МЬ- ХХХ -Ма"-пр" 3" (ПО).
Якщо антисенсова нитка представлена формулою (ПІБ), то Мь" являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів.
Кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2- 10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо антисенсова нитка представлена формулою (Іс), то Мь являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів.
Кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2- 10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо антисенсова нитка представлена формулою (ІПЯ), то кожний Мь незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів. Кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів. Переважно Мь дорівнює 0, 1, 2, 3, 4, 5 або 6.
В інших варіантах здійснення К дорівнює 0, і | дорівнює 0, і антисенсова нитка може бути представлена формулою:
Б пр-Ма-У "м - Мапа" З' (Іа).
Якщо сенсова нитка представлена формулою (Па), то кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Кожний з Х", У і 2" може бути однаковим або відрізнятися від інших.
Кожний нуклеотид сенсової нитки і антисенсової нитки може бути незалежно модифікований
І МА, СВМ, ОМА, сЕї, НМА, СемМА, 2'-метоксиетилом, 2'-О-метилом, 2-О-алілом, 2"-С-алілом, 2'- гідроксилом або 2'-фтором. Наприклад, кожний нуклеотид сенсової нитки і антисенсової нитки незалежно модифікований 2'-О-метилом або 2"-фтором. Зокрема, кожний Х, У, 2, ХХ, У і 27 може являти собою 2'-О-метил-модифікацію або 2'-фтор-модифікацію.
В одному варіанті здійснення сенсова нитка засобу для ЕМАїі може містити мотив УУУ, що знаходиться в положеннях 9, 10 і 11 нитки, якщо дуплексна ділянка становить 21 нуклеотид, то при цьому відлік починається з 12 нуклеотиду від 5'-кінця, або необов'язково відлік починається бо з 192 спареного нуклеотиду в дуплексній ділянці від 5'-кінця; і МУ являє собою 2'-Е-модифікацію.
В одному варіанті здійснення антисенсова нитка може містити мотив У", що знаходиться в положеннях 11, 12, 13 нитки, при цьому відлік починається з 172 нуклеотиду від 5'-кінця, або необов'язково відлік починається з 12 спареного нуклеотиду в дуплексній ділянці від 5'-кінця; і являє собою 2"-О-метил-модифікацію.
Сенсова нитка, представлена будь-якою з вищенаведених формул (Іа), (ІБ), (Іс) ї (Ід), утворює дуплекс з антисенсовою ниткою, представленою будь-якою з формул (Па), (ПІБ), (Пс) і (Па) відповідно.
Відповідно, засоби для КМАїЇ для застосування в способах за даним винаходом можуть містити сенсову нитку і антисенсову нитку, при цьому кожна нитка містить 14-30 нуклеотидів, дуплекс для КМАЇї, представлений формулою (І): сенсова нитка: 5" пр -Ма-(Х Х Х);-Мь- М М М -Мь -(2 2 2))-Ма-па З! антисенсова нитка: 3' пр-Ма-ОСХ "ХК Мь- м им -Мь-(22'23-Ма-па 5, (І) де кожний зі, |, К і Ї незалежно дорівнює 0 або 1; кожний з р, р", 4 і 4 незалежно дорівнює 0-6; кожний із Ма і Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 модифікованих нуклеотидів, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із Мь і Ме незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10 модифікованих нуклеотидів; де кожний із Пр, Пр, Па і По, КОЖНИЙ з яких може бути присутнім або відсутнім, незалежно являє собою нуклеотид, що виступає; і кожний з ХХХ, УМХ, 229, ХХ, У і 22 незалежно являє собою один мотив з трьох ідентичних модифікацій трьох послідовних нуклеотидів.
В одному варіанті здійснення і дорівнює 0, і | дорівнює 0; або і дорівнює 1, а | дорівнює 0; або і дорівнює 0, а | дорівнює 1; або як і, так і | дорівнює 0; або як і, так і | дорівнює 1. В іншому варіанті здійснення К дорівнює 0, і І дорівнює 0; або К дорівнює 1, а І дорівнює 0; К дорівнює 0, а
І дорівнює 1; або як К, так і І дорівнює 0; або як К, так і І дорівнює 1.
Зо Ілюстративні комбінації сенсової нитки та антисенсової нитки, що утворюють дуплекс для
ЕМАЇ, включають нижченаведені формули: 5 пр - Ма -У М М -Ма-па З'
З'пр-Ма-ЄУ У -Мата 5' (Ша)
Б пр-Ма -М М М -МБ -2 2 7 -Ма-па 3"
З пр-Ма-У У -МЬ-27и-Мата 5 (ШІ) 5 пр-Ма- Х Х Х -МЬ -М М м - Ма-пад 3'
З' пр-Ма-Х хх -МЬ-У У У -Ма-па 5 (Шс)
Б пр -Ма -Х Х Х -МБ-М М м -МЬ- 2 72 7 -Ма-па 3"
З пр-Ма-Х хх -МЬ- У У У-МЬ- 22 2-Ма-па 5 (па) 5 - Ма -м мМ м -Мр- З"
З пр-Ма-У У -МБ 5" (Ше)
Якщо засіб для КМАї представлений формулою (Ша), то кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо засіб для КМАї представлений формулою (ІБ), то кожний Мь незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 1-10, 1-7, 1-5 або 1-4 модифікованих нуклеотиди.
Кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2- 10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо засіб для КМАі представлений формулою (Пс), то кожний Мь, Ме незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів. Кожний Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів.
Якщо засіб для КМАЇї представлений формулою (Па), то кожний Мь, Ме незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 або 0 модифікованих нуклеотидів. Кожний із Ма, Ма незалежно являє собою олігонуклеотидну 60 послідовність, що містить 2-20, 2-15 або 2-10 модифікованих нуклеотидів. Кожний з Ма, Ма, Мь і
Мь незалежно містить модифікації патерну, що чергується.
Якщо засіб для ЕМАЇї представлений формулою (Ше), то кожний Ма, Ма, Мь і Ме" незалежно являє собою оолігонуклеотидну послідовність, що містить 0-25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їх комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди;
Кожний із Х, М ії 2 у формулах (ІІІ), (Ша), (ПШБ), (Шс), (Ша) ї (Пе) може бути однаковим або відрізнятися від інших.
Якщо засіб для КЕМАї представлений формулою (ІІ), (Ша), (ПІБ), (Пс), (Ша) ї (Ше), то щонайменше один із нуклеотидів У може утворювати пару основ з одним із нуклеотидів У". Як альтернатива, щонайменше два з нуклеотидів У утворюють пари основ з відповідними нуклеотидами У; або всі три з нуклеотидів М утворюють пари основ з відповідними нуклеотидами У".
Якщо засіб для КМАЇї представлений формулою (ПІБ) або (ПП), то щонайменше один з нуклеотидів 2 може утворювати пару основ з одним з нуклеотидів 2". Як альтернатива, щонайменше два з нуклеотидів 7 утворюють пари основ з відповідними нуклеотидами 72"; або всі три з нуклеотидів 2 утворюють пари основ з відповідними нуклеотидами 2"
Якщо засіб для КМАї представлений формулою (Пс) або (ПП), то щонайменше один з нуклеотидів Х може утворювати пару основ з одним із нуклеотидів Х". Як альтернатива, щонайменше два з нуклеотидів Х утворюють пари основ з відповідними нуклеотидами Х"; або всі три з нуклеотидів Х утворюють пари основ із відповідними нуклеотидами хХ".
В одному варіанті здійснення модифікація нуклеотиду У відрізняється від модифікації нуклеотиду У", модифікація нуклеотиду 7 відрізняється від модифікації нуклеотиду 7, та/або модифікація нуклеотиду Х відрізняється від модифікації нуклеотиду Х".
В одному варіанті здійснення, якщо засіб для ЕМАї представлений формулою (Ша), то модифікаціями Ма є 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікації. В іншому варіанті здійснення, якщо засіб для ЕМАЇї представлений формулою (Па), то модифікаціями Ма є 2'-О-метил- або 2'-фтор- модифікації, і про20, а також щонайменше один пр з'єднаний з сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку. У ще одному варіанті здійснення, якщо засіб для ЕМАЇ представлений формулою (Па), то модифікаціями Ма є 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікації, Пр'
Зо 20 і щонайменше один пр з'єднаний з сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку, а сенсова нитка кон'югована з однією або декількома похідними саїІМАс, приєднаними за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера (описаного нижче). В іншому варіанті здійснення, якщо засіб для КМАїЇ представлений формулою (Па), то модифікаціями Ма є 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікації, пр ' »0 і щонайменше один пр з'єднаний з сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку, сенсова нитка містить щонайменше один фосфотіоатний зв'язок, і сенсова нитка кон'югована з однією або декількома похідними саМАс, приєднаними за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера.
В одному варіанті здійснення, якщо засіб для ЕМАї представлений формулою (Па), то модифікаціями Ма є 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікації, пр ' »0 і щонайменше один пр з'єднаний з сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку, сенсова нитка містить щонайменше один фосфотіоатний зв'язок, і сенсова нитка кон'югована з однією або декількома похідними саМАс, приєднаними за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера.
В одному варіанті здійснення два засоби для КМАЇї, представлені формулою (1), (Ша), (ПІБ), (Шс), (Ша) ії (Ше), з'єднані один з одним на 5' кінці, і один або обидва 3'-кінці необов'язково кон'юговані з лігандом. Кожний із засобів може цілеспрямовано впливати на один і той самий ген або на два різні гени; або кожний із засобів може цілеспрямовано впливати на один і той самий ген у двох різних цільових сайтах.
У різних публікаціях описані мультимерні засоби для КМАЇ, які можна застосовувати у способах за даним винаходом. Такі публікації включають М/О 2007/091269, патент США Мо 7858769, УМО 2010/141511, УМО 2007/117686, УМО 2009/014887 і УМО 2011/031520, повний зміст яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Як описано більш детально нижче, засіб для ЕКМАЇ, що містить один або декілька вуглеводних фрагментів, кон'югованих із засобом для КМАї, може покращувати одну або декілька властивостей засобу для КМАі. У багатьох випадках вуглеводний фрагмент буде приєднаний до модифікованої субодиниці засобу для КМАЇї. Наприклад, рибозний цукор однієї або декількох рибонуклеотидних субодиниць засобу на основі О5КМА можна замінювати іншим фрагментом, наприклад відмінним від вуглеводу (переважно циклічним) носієм, до якого бо приєднаний вуглеводний ліганд. Рибонуклеотидну субодиницю, в якій рибозний цукор субодиниці був замінений таким чином, у даному документі називають субодиницею з модифікацією шляхом заміни рибози (КЕМ5). Циклічний носій може являти собою карбоциклічну кільцеву систему, тобто всі атоми в кільці є атомами вуглецю, або гетероциклічну кільцеву систему, тобто один або декілька атомів у кільці можуть бути гетероатомами, наприклад, атомом азоту, кисню, сірки. Циклічний носій може являти собою моноциклічну кільцеву систему, або може містити два або більше кілець, наприклад конденсованих кілець.
Циклічний носій може являти собою повністю насичену кільцеву систему, або він може містити один або декілька подвійних зв'язків.
Ліганд може бути приєднано до полінуклеотиду за допомогою носія. Носії включають (Її) щонайменше одну "точку приєднання до остова", переважно дві "точки приєднання до остова", і (ї) щонайменше одну "зв'язувальну точку приєднання". "Точка приєднання до остова", використовувана в даному документі, стосується функціональної групи рибонуклеїнової кислоти, наприклад гідроксильної групи, або зазвичай її зв'язку, доступного для введення носія в остов, наприклад фосфатний або модифікований фосфатний, наприклад остов, що містить сірку, і який підходить для цього. "Зв'язувальна точка приєднання" (ТАР) в деяких варіантах здійснення стосується атома циклічного носія, що входить у кільце, наприклад атома вуглецю або гетероатома (відмінного від атома, який забезпечує точку приєднання до остова), з яким зв'язується вибраний фрагмент. Фрагмент може являти собою, наприклад, вуглевод, наприклад, моносахарид, дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олігосахарид і полісахарид.
Необов'язково вибраний фрагмент приєднаний за допомогою проміжного зв'язувального фрагмента до циклічного носія. Таким чином, циклічний носій буде часто включати функціональну групу, наприклад аміногрупу, або зазвичай забезпечувати зв'язок, що підходить для введення або зв'язування іншого хімічного структурного елемента, наприклад ліганду, у склад кільця.
Засоби для ЕМАїі можна кон'югувати з лігандом через носій, де носій може являти собою циклічну групу або ациклічну групу; переважно циклічну групу, вибрану з піролідинілу, піразолінілу, піразолідинілу, імідазолінілу, імідазолідинілу, піперидинілу, піперазинілу, (1,3|- діоксолану, оксазолідинілу, ізоксазолідинілу, морфоліну, тіазолідинілу, ізотіазолідинілу, хіноксалінілу, піридазинонілу, тетрагідрофурилу та декаліну;х переважно ациклічна група
Ко) вибрана з остова, який являє собою серинол, або остова, що являє собою діетаноламін.
У певних конкретних варіантах здійснення засіб для ЕМАЇї, наприклад, для застосування у способах за даним винаходом, являє собою засіб, вибраний із групи засобів, наведених у будь- якій з таблиць 1, 3, 5, 6 і 7. Такі засоби можуть додатково містити ліганд.
У певних варіантах здійснення засіб для КЕМАіЇ за даним винаходом являє собою засіб, вибраний із групи, що складається з АЮ-66016, АО-65492, АЮ-66017 і АО-66018.
ІМ. ІЕМА, кон'юговані з лігандами
Інша модифікація РНК із числа іІЕМА за даним винаходом передбачає хімічне зв'язування
РНК з одним або декількома лігандами, фрагментами або кон'югатами, які підвищують активність, розподіл в клітинах або поглинання іеЕМА клітинами. Такі фрагменти включають без обмеження ліпідні фрагменти, такі як холестериновий фрагмент (І еізіпдег еї аї., Ргос. Май. Асіа. осі. ОБА, 1989, 86: 6553-6556), холева кислота (Мапопйагап еї аї!., Віогд. Мед. Спет. І еї., 1994, 4:1053-1060), тіоетер, наприклад, берил-5-тритилтіол (Мапойагап еї аїЇ., Апп. М.У. Асай. 5обі., 1992, 660:306-309; Мапопагап еї аї!., Віога. Мед. Спет. І еї., 1993, 3:2765-2770), тіохолестерин (Орегнайзег єї аї., Мисі. Асідбє Вев., 1992, 20:533-538), аліфатичний ланцюг, наприклад, додекандіолові або ундецилові залишки (Заіхоп-Вептоагаз єї а!І., ЕМВО ., 1991, 10:1111-1118;
Карапом єї аІ., РЕВ5 Іей., 1990, 259:327-330; бміпагспикК еї аї., Віоспітіє, 1993, 75:49-54), фосфоліпід, наприклад, дигексадецил-рац-гліцерин або 1,2-ди-О-гексадецил-рац-гліцеро-3- фосфонат триетиламонію (Мапойагап еї аї., Техгапедгоп Гей., 1995, 36:3651-3654; 5Нпвєа 6вї аї.,
Мисі. Асіав Нез., 1990, 18:3777-3783), поліамінний або поліетиленгліколевий ланцюг (Мапопагап еї аі., Мисіеозідез 8. Мисієоіїідев5, 1995, 14:969-973), або адамантаноцтова кислота (Мапопйагап еї а!., Темапедгоп І ей., 1995, 36:3651-3654), пальмітиловий фрагмент (Мізпга еї аї., Віоспіт.
Віорпув. Асіа, 1995, 1264:229-237), або октадециламінний або гексиламінокарбонілоксихолестериновий фрагмент (Стооке еї аї., У. Рнаптасої. Ехр. ТНег., 1996, 277:923-937).
В одному варіанті здійснення ліганд змінює розподіл, націлювання або час існування засобу на основі ІЕМА, в який він введений. У переважних варіантах здійснення ліганд забезпечує підвищену афінність щодо вибраної мішені, наприклад, молекули, клітини або типу клітин, компартмента, наприклад, компартмента клітини або органа, тканини, органа або ділянки тіла, наприклад, порівняно з молекулою, у якої такий ліганд відсутній. Переважні ліганди не будуть бо брати участь в спарюванні дуплексу в дуплексній нуклеїновій кислоті.
Ліганди можуть включати речовину, що зустрічається в природі, таку як білок (наприклад, сироватковий альбумін людини (Н5БА), ліпопротеїн низької щільності (101) або глобулін); вуглевод (наприклад, декстран, опулулан, хітин, хітозан, інулін, циклодекстрин, М- ацетилгалактозамін або гіалуронову кислоту) або ліпід. Ліганд також може бути рекомбінантною або синтетичною молекулою, такою як синтетичний полімер, наприклад, синтетична поліамінокислота. Приклади поліамінокислот включають поліамінокислоту, що являє собою полілізин (РІ), полі-І -аспарагінову кислоту, полі-І -глутамінову кислоту, співполімер стиролу й ангідриду малеїнової кислоти, співполімер І -лактиду й гліколіду, співполімер дивінілового етеру та малеїнового ангідриду, М-(2-гідроксипропілуметакриламідний співполімер (НМРА), поліеєтиленгліколь (РЕС), полівініловий спирт (РМА), поліуретан, полі(2-етилакрилову кислоту),
М-ізопропілакриламідні полімери або поліфосфазин. Приклади поліамінів включають поліетиленімін, полілізин (РІГ), спермін, спермідин, поліамін, поліамін-псевдопептид, поліамін- пептидоміметик, поліамін-дендример, аргінін, амідин, протамін, катіонний ліпід, катіонний порфірин, сіль четвертинного поліаміну або а-спіральний пептид.
Ліганди також можуть включати групи, що націлюють, наприклад засіб, який націлює на клітину або тканину, наприклад лектин, глікопротеїн, ліпід або білок, наприклад антитіло, яке зв'язується з певним типом клітин, таким як клітина нирки. Група, що націлює, може являти собою тиреотропін, меланотропін, лектин, глікопротеїн, поверхневий білок А, вуглевод муцин, полівалентну лактозу, моновалентну галактозу, М-ацетилгалактозамін, М-ацетилглюкозамін, полівалентну манозу, полівалентну фукозу, глікозильовані поліамінокислоти, полівалентну галактозу, трансферин, бісфосфонат, поліглутамат, поліаспартат, ліпід, холестерин, стероїд, жовчну кислоту, фолат, вітамін В12, біотин або КОЮ-пептид або міметик КОО-пептиду. У певних варіантах здійснення ліганди включають моновалентну або полівалентну галактозу. У певних варіантах здійснення ліганди включають холестерин.
Інші приклади лігандів включають барвники, інтеркаляторні засоби (наприклад, акридини), зшивальні засоби (наприклад, псорален, мітоміцин С), порфірини (ТРРС4, тексафірин, сапфірин), поліциклічні ароматичні вуглеводні (наприклад, феназин, дигідрофеназин), штучні ендонуклеази (наприклад, ЕОТА), ліпофільні молекули, наприклад, холестерин, холеву кислоту, адамантаноцтову кислоту, 1-піренмасляну кислоту, дигідротестостерон, 1,3-біс-
Зо О(гексадецил)гліцерин, геранілоксигексильну групу, гексадецил-гліцерин, борнеол, ментол, 1,3- пропандіол, гептадецильну групу, пальмітинову кислоту, міристинову кислоту, О3- (олеоїл)літохолеву кислоту, ОЗ3-(олеоїл)ухоленову кислоту, диметокситритил або феноксазин і пептидні кон'югати (наприклад, пептид апіеппаредіа, Таї-пептид), алкілуючі засоби, фосфат, аміно, меркапто, РЕС (наприклад, РЕС-40К), МРЕС, |МРЕСІ», поліаміно, алкіл, заміщений алкіл, мічені радіоїзотопом маркери, ферменти, гаптени (наприклад, біотин), речовини, які сприяють транспорту/абсорбції (наприклад, аспірин, вітамін Е, фолієву кислоту), синтетичні рибонуклеази (наприклад, імідазол, бісімідазол, гістамін, імідазольні кластери, кон'югати акридин-імідазол, комплекс ЕиЗ3-- тетраазамакроцикли), динітрофеніл, НЕР або АР.
Ліганди можуть являти собою білки, наприклад глікопротеїни, або пептиди, наприклад молекули зі специфічною афінністю щодо ко-ліганду, або антитіла, наприклад антитіло, яке зв'язується з певним типом клітин, таким як клітина печінки. Ліганди також можуть включати гормони та рецептори гормонів. Вони також можуть включати відмінні від пептидів види, такі як ліпіди, лектини, вуглеводи, вітаміни, кофактори, полівалентну лактозу, полівалентну галактозу,
М-ацетилгалактозамін, М-ацетилглюкозамін, полівалентну манозу або полівалентну фукозу.
Наприклад, ліганд може являти собою ліпополісахарид, активатор МАР-кінази р38 або активатор МЕ-КкВ.
Ліганд може являти собою речовину, наприклад лікарський засіб, що може збільшувати поглинання засобу на основі ІКМА клітиною, наприклад, шляхом руйнування цитоскелета клітини, наприклад шляхом руйнування мікротрубочок, мікрофіламентів і/або проміжних філаментів клітини. Лікарський засіб може являти собою, наприклад, таксон, вінкристин, вінбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакінолід, латрункулін А, фалоїдин, свінголід А, інданоцин або міосервін.
У деяких варіантах здійснення ліганд, приєднаний до іІКкМА, описаної в даному документі, виконує роль фармакокінетичного модулятора (РК-модулятора). РК-модулятори включають ліпофільні сполуки, жовчні кислоти, стероїди, фосфоліпідні аналоги, пептиди, засоби, що зв'язують білки, РЕС, вітаміни тощо. ілюстративні РК-модулятори включають без обмеження холестерин, жирні кислоти, холеву кислоту, літохолеву кислоту, діалкілгліцериди, діацилгліцериди, фосфоліпіди, сфінголіпіди, напроксен, ібупрофен, вітамін Е, біотин тощо.
Також відомо, що олігонуклеотиди, які містять декілька фосфотіоатних зв'язків, зв'язуються з 60 білком сироватки крові, таким чином, короткі олігонуклеотиди, наприклад, олігонуклеотиди з приблизно 5 основ, 10 основ, 15 основ або 20 основ, що містять декілька з фосфотіоатних зв'язків в остові, також є придатними згідно з даним винаходом як ліганди (наприклад, РК- модулюючі ліганди). Крім того, аптамери, які зв'язують компоненти сироватки крові (наприклад, білки сироватки крові) також є придатними для застосування як РК-модулюючі ліганди в варіантах здійснення, описаних в даному документі.
Кон'юговані з лігандами олігонуклеотиди за даним винаходом можуть бути синтезовані із застосуванням олігонуклеотиду, який має реакційно-здатну функціональність, обумовлену бічним ланцюгом, як наприклад, одержаним в результаті приєднання зв'язувальної молекули до олігонуклеотиду (описаного нижче). Цей реакційноздатний олігонуклеотид може вступати в реакцію безпосередньо з комерційно доступними лігандами, лігандами, які синтезуються з будь- якою з низки захисних груп, або лігандами із зв'язувальним фрагментом, приєднаним до нього.
Олігонуклеотиди, застосовувані в кон'югатах за даним винаходом, можна одержувати зручним і стандартним способом за допомогою добре відомої методики твердофазного синтезу.
Обладнання для такого синтезу реалізується декількома постачальниками, в тому числі, наприклад, Арріїєа Віозузіетв (Фостер-Сіті, Каліфорнія). Додатково або як альтернатива можна використовувати будь-які інші засоби для такого синтезу, відомі з рівня техніки. Також відомим є застосування подібних методик для одержання інших олігонуклеотидів, таких як фосфотіоати й алкільовані похідні.
В кон'югованих з лігандами олігонуклеотидах і нуклеозидах, зв'язаних з конкретними послідовностями, що несуть молекули лігандів, за даним винаходом, олігонуклеотиди та олігонуклеозиди можуть бути зібрані на придатному синтезаторі ДНК, з використанням попередників стандартних нуклеотидів і нуклеозидів, або попередників кон'югатів нуклеотидів або нуклеозидів, які вже несуть зв'язувальний фрагмент, попередників кон'югатів нуклеотидів або нуклеозидів з лігандами, які вже несуть молекулу ліганду, або ненуклеозидних структурних елементів, що несуть ліганд.
Під час застосування попередників кон'югатів нуклеотидів, які вже несуть зв'язувальний фрагмент, синтез нуклеозидів, зв'язаних з конкретними послідовностями, як правило, є завершеним, а молекула ліганду потім вступає в реакцію зі зв'язувальним фрагментом з утворенням кон'югованого з лігандом оолігонуклеотиду. У деяких варіантах здійснення олігонуклеотиди або зв'язані нуклеозиди за даним винаходом синтезовані автоматичним синтезатором із застосуванням фосфорамідитів, одержаних з кон'югатів нуклеозидів з лігандами, на додаток до стандартних фосфорамідитів і нестандартних фосфорамідитів, які є комерційно доступними і, як правило, застосовуються в синтезі олігонуклеотидів.
А. Кон'югати з ліпідами
В одному варіанті здійснення ліганд або кон'югат являє собою ліпід або молекулу на основі ліпіду. Така ліпідна молекула або молекула на основі ліпіду переважно зв'язується з сироватковим білком, наприклад сироватковим альбуміном людини (НБА). Ліганд, що зв'язується з Н5БА, забезпечує розподіл кон'югату в цільовій тканині, наприклад цільовій тканині організму, відмінній від тканини нирок. Наприклад, цільовою тканиною може бути печінка, в тому числі паренхіматозні клітини печінки. Також як ліганди можна використовувати інші молекули, які можуть зв'язувати НЗА. Наприклад, можна використовувати напроксен або аспірин. Ліпідний ліганд або ліганд на основі ліпіду може (а) підвищувати стійкість до руйнування кон'югату, (Б) підвищувати здатність цілеспрямованої дії або транспорту у цільову клітину або клітинну мембрану та/або (с) може бути використаний для коригування зв'язування із сироватковим білком, наприклад НА.
Ліганд на основі ліпіду можна застосовувати для інгібування, наприклад регулювання зв'язування кон'югату з цільовою тканиною. Наприклад, ліпідний ліганд або ліганд на основі ліпіду, який сильніше зв'язується з НЗА, з меншою імовірністю буде націлюватися на нирки, а отже з меншою імовірністю буде виводитися з організму. Ліпідний ліганд або ліганд на основі ліпіду, який слабше зв'язується з НБА, можна застосовувати для націлювання кон'югату на нирки.
В переважному варіанті здійснення ліганд на основі ліпіду зв'язує Н5А. Переважно він зв'язує НЗА з достатньою афінністю, щоб кон'югат переважно розподілявся у тканину, відмінну від тканини нирок. Однак, переважно, щоб афінність не була настільки сильною, що зв'язування
НЗА-ліганду не могло бути зворотним.
В іншому переважному варіанті здійснення ліганд на основі ліпіду слабо зв'язує НЗА або не зв'язує взагалі, так що кон'югат буде розподілятися переважно в нирку. Інші фрагменти, які цілеспрямовано діють на клітини нирки, також можна використовувати замість або додатково до ліганду на основі ліпіду. бо В іншому аспекті лігандом є фрагмент, наприклад вітамін, який поглинається цільовою клітиною, наприклад проліферуючою клітиною. Такі варіанти є особливо придатними для лікування порушень, що характеризуються небажаною проліферацією клітин, наприклад злоякісного або доброякісного типу, наприклад ракових клітин. Ілюстративні вітаміни включають вітамін А, Е ії К. Інші ілюстративні вітаміни включають вітамін В, наприклад, фолієву кислоту,
В12, рибофлавін, біотин, піридоксаль або інші вітаміни або поживні речовини, що поглинаються цільовими клітинами, такими як клітини печінки. Також включені Н5БА і ліпопротеїн низької щільності (0).
В. Засоби, що забезпечують проникнення в клітину
В іншому аспекті лігандом є засіб, що забезпечує проникнення в клітину, переважно спіральний засіб, що забезпечує проникнення в клітину. Переважно, засіб є амфіпатичним.
Ілюстративним засобом є пептид, такий як їаї або апіеппоредіа. Якщо засіб являє собою пептид, то він може бути модифікованим, при цьому засіб може включати пептидилміметик, інвертомери, відмінні від пептидних або псевдопептидні зв'язки та застосування ЮО-амінокислот.
Спіральний засіб переважно являє собою альфа-спіральний засіб, який переважно характеризується ліпофільною та ліпофобною фазами.
Ліганд може являти собою пептид або пептидоміметик. Пептидоміметик (також названий у даному документі олігопептидоміметиком) є молекулою, здатною згортатися у певну тривимірну структуру, аналогічну природному пептиду. Приєднання пептиду або пептидоміметика до засобів на основі ІКЕМА може впливати на фармакокінетичний розподіл ІЕМА, наприклад, шляхом посилення розпізнавання клітин і абсорбції клітинами. Пептидний фрагмент або фрагмент-пептидоміметик може становити приблизно 5-50 амінокислот в довжину, наприклад, приблизно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 амінокислот в довжину.
Пептидом або пептидоміметиком, може бути, наприклад, пептид, що забезпечує проникнення в клітину, катіонний пептид, амфіпатичний пептид або гідрофобний пептид (наприклад, що складається головним чином з Туг, Ттр або Ріє). Фрагмент, що являє собою пептид, може являти собою пептид-дендример, пептид з обмеженою конформаційною свободою або перехресно зшитий пептид. В іншому альтернативному варіанті фрагмент, що являє собою пептид, може включати гідрофобну послідовність, яка контролює перенесення через мембрану (МТ5). Ілюстративним пептидом, що містить гідрофобну МТ5, є КЕСЕ з
Зо амінокислотною послідовністю ААМАГГРАМІ ГА АР (ЗЕО ІЮО МО: 11). Аналог КЕСЕ (наприклад, амінокислотна послідовність ААГ І РМІ ГААР (5ЕО І МО: 12), що містить гідрофобну МТ5, також може являти собою націлювальний фрагмент. Пептидний фрагмент може являти собою пептид для доставки, який може переносити великі полярні молекули, в тому числі пептиди, олігонуклеотиди та білки, через клітинні мембрани. Наприклад, як було виявлено, послідовності
Таї-більа НІМ (СЕККККОКККРРО) (ЗЕО ІЮО МО: 13) і білка Апіеппаредіа Огозорпіїа (КОЇКІММЕОМАКМКУУКК) (ЗЕБО ІО МО: 14) здатні функціонувати як пептиди для доставки.
Пептид або пептидоміметик може кодуватися випадковими послідовностями ДНК, як, наприклад, пептид, ідентифікований з бібліотеки фагового дисплея або комбінаторної бібліотеки "одна гранула-одна сполука" (ОВОС) (І ат еї аї., Маштє, 354:82-84, 1991). Приклади пептиду або пептидоміметика, зв'язаних із засобом на основі аОБКМА за допомогою введеної мономерної одиниці, з метою націлювання на клітину, являє собою пептид, що складається з аргініну-гліцину (КОЮ), або КОЮ-міметик. Пептидний фрагмент може варіюватися за довжиною від приблизно 5 амінокислот до приблизно 40 амінокислот. Пептидні фрагменти можуть мати структурну модифікацію, як, наприклад, для підвищення стабільності або керування конформаційними властивостями. Можна використовувати будь-яку з нижчеописаних структурних модифікацій.
ВОаО-пептид для застосування в композиціях і способах за даним винаходом може бути лінійним або циклічним і може бути модифікованим, наприклад, глікозильованим або метильованим, для полегшення націлювання на конкретну(конкретні) тканину(тканини).
Пептиди, що містять КОЮ, і пептидоміметики можуть включати Ю-амінокислоти, а також синтетичні КОЮО-міметики. Додатково до КОЮ можна використовувати інші фрагменти, які націлюють ліганд інтегрин. Переважні кон'югати цього ліганду націлюються на РЕСАМ-1 або
МЕРЕ. "Пептид, що забезпечує проникнення в клітину" здатний проникати в клітину, наприклад мікробну клітину, таку як клітина бактерії або гриба, або клітину ссавця, таку як клітина людини.
Пептидом, що забезпечує проникнення в мікробну клітину, наприклад, може бути а-спіральний лінійний пептид (наприклад, ІІ -37 або Сегоріп Р1), пептид, що містить дисульфідний зв'язок (наприклад, а-дефензин, В-дефензин або бактенецин), або пептид, що містить тільки одну або дві домінуючі амінокислоти (наприклад, РК-39 або індоліцидин). Пептид, що забезпечує бо проникнення в клітину, може включати також клітинний сигнал внутрішньоядерної локалізації
(МІ5). Наприклад, пептидом, що забезпечує проникнення в клітину, може бути двокомпонентний амфіпатичний пептид, такий як МРО, одержаний з домену злитого пептиду дра НІМ-1 ії МІ5 з великого Т-антигену 5М40 (5ітеопі еї аїЇ., Мисі. Асід5 Кев. 31:2717-2724, 2003).
С. Кон'югати з вуглеводами
У деяких варіантах здійснення композицій і способів за даним винаходом олігонуклеотид
ІКМА додатково містить вуглевод. Кон'югована з вуглеводом ІКМА є переважною для іп мімо доставки нуклеїнових кислот, а також композицій, придатних для іп мімо терапевтичного застосування, описаного в даному документі. Використовуваний в даному документі вираз "вуглевод" стосується сполуки, яка являє собою вуглевод рег 5е, утворений з однієї або декількох моносахаридних ланок, що мають щонайменше б атомів вуглецю (які можуть бути лінійними, розгалуженими або циклічними) з атомом кисню, азоту або сірки, зв'язаним з кожним атомом вуглецю; або сполуки, що має як її частину вуглеводний фрагмент, утворений з однієї або декількох моносахаридних ланок, кожна з яких має щонайменше шість атомів вуглецю (які можуть бути лінійними, розгалуженими або циклічними) з атомом кисню, азоту або сірки, зв'язаним з кожним атомом вуглецю. Типові вуглеводи включають цукри (моно-, ди-, три- та олігосахариди, що містять від приблизно 4, 5, 6, 7, 8 або 9 моносахаридних ланок) і полісахариди, такі як крохмалі, глікоген, целюлоза та полісахаридні смоли. Конкретні моносахариди включають цукри ТТЕ і вище (наприклад, ТТК, Сб, С7 або С8); ди- і трисахариди включають цукри з двома або трьома моносахаридними ланками (наприклад, ТТЕ, Сб, С7 або
СВ).
В одному варіанті здійснення кон'югат із вуглеводом для застосування в композиціях і способах за даним винаходом являє собою моносахарид. В іншому варіанті здійснення кон'югат із вуглеводом для застосування в композиціях і способах за даним винаходом вибраний із групи, що складається з но ЙН о Н Н ев, о
АсСнНМ о ів он но о о Н Н но па па а
АСНМ о о о но юн (в) но пав на: (в) лені о формула ЇЇ, но но но -9 но о (в) кита Оті но- но Н но -9 но о (в) о. ауто АТ З. но- НО но о но -0 но о. ит о
Н формула ПІ, но он (о) но о. иа
МНАс Я но он Маля
Ф) ГТ но ота
МНАс формула ІМ,
но он о) «КВ в.о
МНА с «й о но Ян р о 9) но в.о
МНАс формула М, но ОН
Н на, но он "МНАс о |: водо
МНАс (в) формула МІ, но он ол осо
НО ОН 0 МНАСс о осо
МНАсно ОН о юка ви
МНАс формула МІ, во ОВ2 вВ2гО -0 вВ2о во ОВ2 о ОАс
Вго "9 део -9 820 о О,,кформула МІЇ, но ИН о о Н о а а а о, но М В
АсСнНМ Н о но ЙН о о
Н но М З
АСНМ її її но (он ів) (в) о Н
Хя в АЛ ААА Д но М о
АСНМ Н формула ІХ, м
ІФ) п) тет
АснМ н но ОН о
Хо зи ит (в) но о М
АснМ и о но Ин
ІФ) но о. ит т о
АСНМ н формула Х,
РОЗ.
Ге он но -о
СА шк о
Оз о иа тк
Ге) он Н но Ге що Ге
ОР ит студе о он (в) (в) но -о а и а ко) н формула ХІ,
РОЗ
ІФ) он но -9 но
Н Н
РО» м ана о (в) он Ге) но -9 но о о М М о (в) Он 6) (в) (в) но -9 но (в) формула ХІЇ, но ЯН о у. ці
Оси АК дин М о, но М М
АСНМ Н о но ЯН кова М
М
НО Аснм М жо (в) но Н (в; о нН (в)
АСНМ Н формула ХІП,
но ОН о но юн «о о но Го) о! МН
АсНМ х с утри
О формула ХІМ, но нН о но он о о є) о АсНМ АЖ но (в) о МН
АСНМ
О формула ХУ, но нН о но он о о (в) о АсНМ АЖ но (в) о МН
АСНМ
О формула ХМІ, он г) он се но А
О формула ХМІ, он ) он се се ун но
О формула ХМІІ, он о)
Ф зе но
О формула ХІХ,
НОо- ОН о водо, он о в) но «рок, о Кн ана аннн и
О формула ХХ,
ін/Ф) он
Ко) норок, он о о) по о) АЖ щі) Й
Те) а й
Н
О формула ХХІ, ін/Ф) он
Ко) водо он о о) но ГФ) АЖ щі) Й но А АЙ МН о аа
Н
О формула ХХІЇ.
В одному варіанті здійснення моносахаридом є М-ацетилгалактозамін, такий як о Н Н ев, і)
АсНМ о ів но ИН о о Н Н но нема па а
АсСНМ о о о но ИН (6) ін) ема на: (6) лені о формула ІІ.
Інший типовий кон'югат із вуглеводом для застосування в варіантах здійснення, описаних в даному документі, включає без обмеження но й о
Но мине
АснмМ Нн но он Го)
Оу ит, У им о. лит, но АСНМ о Ох о її о о но ,ЙН г хо, ку ове Щі Мона -и Н по снм о й ? Мн ит о в) в) в) сос нН (Формула ХХІЇ), де один з Х або У являє собою олігонуклеотид, інший являє собою водень.
У певних варіантах здійснення даного винаходу СаіМАс або похідна саіМАс приєднані до засобу на основі ІЕМА за даним винаходом через моновалентний лінкер. У деяких варіантах здійснення саїЇМАс або похідна саЇМАс приєднані до засобу на основі ІКМА за даним винаходом через бівалентний лінкер. У ще декількох інших варіантах здійснення даного винаходу саіМАс або похідна саМАс приєднані до засобу на основі ІЇБКМА за даним винаходом через тривалентний лінкер.
В одному варіанті здійснення двониткові засоби для ЕМАЇ за даним винаходом містять один сСаіМмАс або похідну саїіМАс, приєднані до засобу на основі ІКМА. В іншому варіанті здійснення двониткові засоби для КМАЇ за даним винаходом містять деяке число (наприклад, 2, 3, 4, 5 або б) саіМАс або похідних бЗаіМмАс, при цьому кожний незалежно приєднаний до деякого числа нуклеотидів двониткового засобу для ЕМАЇї через деяке число моновалентних лінкерів.
У деяких варіантах здійснення, наприклад, якщо дві нитки засобу на основі ІЕМА за даним винаходом є частиною однієї більшої молекули та з'єднані неперервним ланцюгом нуклеотидів від 3'-кінця однієї нитки до 5'-кінця відповідної іншої нитка, що утворює петлю "шпильку", яка містить деяке число неспарених нуклеотидів, то кожний неспарений нуклеотид у петлі "шпильці" може незалежно містити сзаіМмАс або похідну сСаіІМАс, приєднані через моновалентний лінкер.
Петля "шпилька" також може бути утворена подовженим виступаючим кінцем в одній нитці дуплекса.
У деяких варіантах здійснення кон'югат із вуглеводом додатково містить один або декілька додаткових лігандів, описаних вище, таких як без обмеження РК-модулятор і/або пептид, що забезпечує проникнення в клітину.
Додаткові кон'югати з вуглеводом, придатні для застосування в даному винаході, включають такі, що описані в публікаціях згідно з РСТ МоМо УМО 2014/179620 і УМО 2014/179627, повний зміст кожної з яких включено в даний документ за допомогою посилання. р. Лінкери
У деяких варіантах здійснення кон'югат або ліганд, описані в даному документі, можуть бути приєднані до олігонуклеотиду іКЖМА за допомогою різних лінкерів, які можуть бути розщеплюваними або нерозщеплюваними.
Термін "лінкер" або "лінкерна група" означає органічний фрагмент, який з'єднує дві частини сполуки, наприклад, зв'язує ковалентними зв'язками дві частини сполуки. Лінкери, як правило, містять прямий зв'язок або атом, такий як кисень або сірка, одиницю, таку як МК8, С(О),
С(О)МН, 50, 505, 502МН або ланцюг з атомів, такий як без обмеження заміщений або незаміщений алкіл, заміщений або незаміщений алкеніл, заміщений або незаміщений алкініл, арилалкіл, арилалкеніл, арилалкініл, гетероарилалкіл, гетероарилалкеніл, гетероарилалкініл, гетероциклілалкіл, гетероциклілалкеніл, гетероциклілалкініл, арил, гетероарил, гетероцикліл, циклоалкіл, циклоалкеніл, алкіларилалкіл, алкіларилалкеніл, алкіларилалкініл, алкеніларилалкіл, алкеніларилалкеніл, алкеніларилалкініл, алкініларилалкіл, алкініларилалкеніл, алкініларилалкініл, алкілгетероарилалкіл, алкілгетероарилалкеніл, алкілгетероарилалкініл, алкенілгетероарилалкіл, алкенілгетероарилалкеніл, алкенілгетероарилалкініл, алкінілгетероарилалкіл, алкінілгетероарилалкеніл, алкінілгетероарилалкініл, алкілгетероциклілалкіл, алкілгетероциклілалкеніл, алкілгетероциклілалкініл, алкенілгетероциклілалкіл, алкенілгетероциклілалкеніл, алкенілгетероциклілалкініл, алкінілгетероциклілалкіл, алкінілгетероциклілалкеніл, алкінілгетероциклілалкініл, алкіларил, алкеніларил, алкініларил, алкілгетероарил, алкенілгетероарил, алкініллетероарил, в яких один або декілька метиленів можуть перериватися або закінчуватися О, 5, 5(0), 50», М(К8), С(О), заміщеним або незаміщеним арилом, заміщеним або незаміщеним гетероарилом, заміщеним або незаміщеним гетероциклілом; де К8 являє собою водень, ацил, аліфатичний або заміщений аліфатичний компонент. В одному варіанті здійснення лінкер становить приблизно 1-24 атоми, 2-24, 3-24, 4- 24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомів, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 або 8-16 атомів.
Розщеплювана лінкерна група являє собою групу, яка є достатньо стабільною поза клітиною, але яка у разі входження в цільову клітину розщеплюється з вивільненням двох частин, які разом утримують лінкер. В переважному варіанті здійснення розщеплювана лінкерна група розщеплюється приблизно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз або більше, або щонайменше приблизно в 100 раз швидше в цільовій клітині або за першої згаданої умови (яку можна, наприклад, вибрати для імітації або моделювання внутрішньоклітинних умов), ніж в крові суб'єкта або за другої згаданої умови (яку можна, наприклад, вибрати для імітації або моделювання умов, наявних в крові або сироватці крові).
Розщеплювані лінкерні групи є сприйнятливими до засобів розщеплення, наприклад, рн, редокс-потенціалу або присутності руйнівних молекул. Як правило, фактори розщеплення більш поширені або зустрічаються на вищих рівнях або мають вищу активність всередині клітин, ніж в сироватці крові або крові. Приклади таких руйнівних засобів включають: окиснювально-відновні засоби, які вибирають для конкретних субстратів або які не мають специфічність до субстратів, в тому числі, наприклад, окиснювальні або відновні ферменти або відновні засоби, такі як меркаптани, присутні в клітинах, що можуть руйнувати редоксо-розщеплювану лінкерну групу шляхом відновлення; естерази; ендосоми або засоби, які можуть створювати кисле 60 середовище, наприклад, такі, що приводять до рН, рівному п'ять або нижче; ферменти, які можуть гідролізувати або руйнувати розщеплювану кислотою лінкерну групу, діючи як універсальна кислота, пептидази (що можуть бути субстрат-специфічними) і фосфатази.
Розщеплювана лінкерна група, така як дисульфідний зв'язок, може бути сприйнятливою до рН. рН сироватки крові людини становить 7,4, в той час як середній внутрішньоклітинний рн трохи нижче, і знаходиться в діапазоні приблизно 7,1-7,3. Ендосоми характеризуються більш кислим рН в діапазоні 5,5-6,0, а лізосоми характеризуються ще більш кислим рН, приблизно 5,0.
Деякі лінкери будуть містити розщеплювану лінкерну групу, яка розщеплюється за переважного рН з вивільненням таким чином катіонного ліпіду з ліганду всередину клітини або в переважний компартмент клітини.
Лінкер може включати розщеплювану лінкерну групу, яка розщеплюється конкретним ферментом. Тип розщеплюваної лінкерної групи, включеної в лінкер, може залежати від клітини, що підлягає націлюванню. Наприклад, ліганд, що націлюється на печінку, може бути зв'язаний з катіонним ліпідом за допомогою лінкера, який включає естерну групу. Клітини печінки містять багато естераз, і, таким чином, лінкер може бути розщеплений більш ефективно в клітинах печінки, ніж у клітинах, які не містять багато естераз. Інші типи клітин з високим вмістом естераз включають клітини легені, кори нирок і сім'яника.
Лінкери, які містять пептидні зв'язки, можна застосовувати у разі націлення на інші типи клітин з високим вмістом пептидаз, такі як клітини печінки та синовіоцити.
Як правило, придатність кандидатної розщеплюваної лінкерної групи може бути оцінена за допомогою тестування здатності руйнівного засобу (або умови) розщеплювати кандидатну лінкерну групу. Крім того, бажаним також є тестування кандидатної розщеплюваної лінкерної групи щодо здатності витримувати розщеплення в крові або у разі контакту з іншої нецільовою тканиною. Таким чином, можна визначити відносну сприйнятливість до розщеплення між першою та другою умовою, де першу вибирають як показник розщеплення в цільовій клітині та другу вибирають як показник розщеплення в інших тканинах або біологічних рідинах, наприклад, крові або сироватці крові. Оцінки можна проводити в безклітинних системах, в клітинах, в культурі клітин, в культурі органів або тканин або для тварин в цілому. Може бути корисним виконувати початкові вимірювання в умовах безклітинної системи або в умовах культури, а підтверджувати за допомогою додаткових вимірювань на тваринах в цілому. У
Зо переважних варіантах здійснення придатні кандидатні сполуки розщеплюються щонайменше приблизно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або приблизно в 100 разів швидше в клітині (або в іп міго умовах, вибраних для імітації внутрішньоклітинних умов) порівняно з кров'ю або сироваткою крові (або в іп міго умовах, вибраних для імітації позаклітинних умов). і. Розщеплювані за допомогою окисно-відновних реакцій лінкерні групи
В одному варіанті здійснення розщеплювана лінкерна група являє собою розщеплювану за допомогою окисно-відновних реакцій лінкерну групу, яка розщеплюється під час відновлення або окислення. Прикладом розщеплюваної під час відновлення лінкерної групи є дисульфідна лінкерна група (-5-5-). Для визначення того, чи є кандидатна розщеплювана лінкерна група придатною "розщеплюваною під час відновлення лінкерною групою" або, наприклад, придатною для застосування з певним фрагментом ІЕМА і певним засобом, що здійснює націлювання, можна звернутися до способів, описаних в даному документі. Наприклад, кандидат може бути оцінений шляхом інкубування з дитіотретолом (О01ТТ) або іншим відновлювальним засобом із застосуванням реактивів, відомих з рівня техніки, які імітують швидкість розщеплення, яка спостерігалася б у клітині, наприклад, цільовій клітині. Кандидати також можуть бути оцінені в умовах, які вибирають для імітації умов в крові або сироватці крові В одному варіанті кандидатні сполуки розщеплюються в найбільшій мірі на приблизно 1095 в крові. В інших варіантах здійснення придатні кандидатні сполуки руйнуються щонайменше приблизно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 або приблизно в 100 разів швидше в клітині (або в іп міго умовах, вибраних для імітації внутрішньоклітинних умов) порівняно з кров'ю (або в іп міго умовах, вибраних для імітації позаклітинних умов). Швидкість розщеплення кандидатних сполук може бути визначена за допомогою стандартних аналізів ферментативної кінетики в умовах, вибраних для імітації внутрішньоклітинних середовищ, і порівняно з умовами, вибраними для імітації позаклітинних середовищ. і. Фосфатні розщеплювані лінкерні групи
В іншому варіанті здійснення розщеплюваний лінкер містить фосфатну розщеплювану лінкерну групу. Фосфатна розщеплювана лінкерна група розщеплюється засобами, які руйнують або гідролізують фосфатну групу. Прикладом засобу, який розщеплює фосфатні групи в клітинах, є ферменти, такі як клітинні фосфатази. Прикладами фосфатних лінкерних груп є -О-
Р(ІФОХОРАК)-О-, -О-Р(ІБХДОВК)-О-, -О-Р(Б3УЗАК)-О-, -5-Р(ХОВКЮ)-О-, -О-Р(ОХОВЮ)-5-, Ш-5- (510) Р(ІФОХОНВК)-5-, -О-Р(ЗХО ВК)-5-, -5-Р(5ХОВК)-О-, -О-Р(ОХ(АК)-О-, -О-Р(Б)(АК)-О-, -5-Р(ОХ(АК)-О-, -
З-Р(З)ХАК)-О-, -5-Р(О(АК)-5-, -О-Р(Б) ВК)-5-. Переважними варіантами здійснення є -О-
Р(ІФХОН)-О-, -0О-Р(БХОН)-О-, -О-Р(З)(ЗН)-О-, -5-Р(ОХОН)-О-, -О-Р(ФОХХОН)-5-, -5-Р(ФОХОН)-5-, -
О-Р(ІБХОН)-5-,. -5-Р(5ХОН)-О-,. -О-Р(ОХН)-О-,. -О-Р(ЗХН)-О-,. -5-Р(ФОХ(Н)-О, -5-Р(З)(Н)-О-, -5-
Р(ІФОХН)-5-,. -О-Р(ЗХН)-5-. Переважним варіантом здійснення є -О-Р(Ф)(ОН)-О-. Ці кандидати можуть бути оцінені за допомогою способів, аналогічних описаним вище. ії. Розщеплювані кислотами лінкерні групи
В іншому варіанті здійснення розщеплюваний лінкер містить розщеплювану кислотою лінкерну групу. Розщеплювана кислотою лінкерна група являє собою лінкерну групу, яка розщеплюється в кислих умовах. У переважних варіантах здійснення розщеплювані кислотою лінкерні групи розщеплюються в кислому середовищі з рН приблизно 6,5 або нижче (наприклад, приблизно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 або нижче) або за допомогою засобів, таких як ферменти, які можуть виступати в ролі універсальної кислоти. В клітині конкретні органели з низьким рн, такі як ендосоми та лізосоми, забезпечують середовище розщеплення для розщеплюваних кислотами лінкерних груп. Приклади розщеплюваних кислотами лінкерних груп включають без обмеження гідразони, естери й естери амінокислот. Розщеплювані кислотами групи можуть характеризуватися загальною формулою: -С-ММ-, С(О)О або -ОС(О). Переважним варіантом здійснення є випадок, коли вуглець, приєднаний до кисню естеру (алкоксигрупи), являє собою арильну групу, заміщену алкільну групу або третинну алкільну групу, таку як диметилпентил або трет-бутил. Ці кандидати можуть бути оцінені за допомогою способів, аналогічних описаним вище. ім. Естерні лінкерні групи
В іншому варіанті здійснення розщеплюваний лінкер містить естерну розщеплювану лінкерну групу. Естерна розщеплювана лінкерна група розщеплюється ферментами, такими як клітинні естерази й амідази. Приклади естерних розщеплюваних лінкерних груп включають без обмеження естери з алкіленовими, алкеніленовими й алкініленовими групами. Естерні розщеплювані лінкерні групи характеризуються загальною формулою: -2(0)0- або -0ОС(О)-. Ці кандидати можуть бути оцінені за допомогою способів, аналогічних описаним вище. м. Пептидні розщеплювані групи
У ще іншому варіанті здійснення розщеплюваний лінкер містить пепгидну розщеплювану
Зо лінкерну групу. Пептидна розщеплювана лінкерна група розщеплюється ферментами, такими як клітинні пептидази та протеази. Пептидні розщеплювані лінкерні групи являють собою пептидні зв'язки, утворені між амінокислотами з одержанням олігопептидів (наприклад, дипептидів, трипептидів тощо) і поліпептидів. Пептидні розщеплювані групи не включають амідну групу (-
С(О)МН-М Амідна група може бути утворена між будь-яким алкіленом, алкеніленом або алкінеленом. Пептидний зв'язок являє собою особливий тип амідного зв'язку, утвореного між амінокислотами з одержанням пептидів і білків. Пептидна розщеплювана група, як правило, обмежена пептидним зв'язком (тобто амідним зв'язком), утвореним між амінокислотами з утворенням пептидів і білків, і не включає всю амідну функціональну групу. Пептидні розщеплювані лінкерні групи характеризуються загальною формулою -
МНОНААС(О)МНОНАВС(О)-, де КА і КВ являють собою Е-групи двох суміжних амінокислот. Ці кандидати можуть бути оцінені за допомогою способів, аналогічних описаним вище.
В одному варіанті здійснення ІКМА за даним винаходом кон'югована з вуглеводом за допомогою лінкера. Необмежувальні приклади кон'югатів ІКМА-вуглевод з лінкерами в композиціях і способах за даним винаходом включають без обмеження: он ООН во М. и о
АСНМ у ів но, он он й Бл ною ту ьо ва ую о о (9) Го! он ООН ною ту -ити Го) ів) (Формула ХХІМ),
но (ОН житт но тр іч Бо но юн чи мо ов о дон Й рол
АснмМ о в! о Ге! но (Н хо лих
М І. Ше) пи в; (Формула ХХМ), он
М оо АЛ. М о но м'я Ж хо
АСНМ Н о до юн о Гу о о Н Н ю о, кун я МО о
АСНМ І 5 Н хо у но Фн о о х- 1-30
Хо АЛІНИ Х у 175
НО дснм Що (Формула ХХМ), но ЯН о у! Н
АСНМ Н о хо
Н Н о М но У ул Ме ми от У
АсНМ Н 9 5 Н х 5 у но Н
Ге) (в) Н (в) х - 1-30 но о и Мито у - 1-15
АСНМ Н
(Формула ХХМІЇ), но НН о о Н о дити МО хо но
АСНМ Н 0 х ще іш) ОН о Ка ри о Н Н Мол о -8 о о, У уко Ме 5 у
АснМ Н 5 о їй но ЯН х - 0-80 9 ух й у-1-15 о и Мито но
АСНМ НІ
(Формула ХХМІЇ), но НН о о Н о уки МО хо но
АСНМ Н 0 ХУ ще іш) ОН о Ка ти о Н Н М о - 8 о о, У ул ЦО Ме Ту у
АснМ Н 5 о їй но ОН х - 0-30 9 ЯН у. у- 1-5 но о и Мито 7-1-20
АСНМ ї (Формула ХХІХ),
но ОН
Хо АЛ. М і) но ма хо
АСНМ Н о 3 в, Н ми
Ге) (6) ода М Н Му
М.,0 М о --З-5 (6) нО-еди ана т Ки -Зо те у но юн х - 1-30 но Мити о 7-1-20
АСНМ Н
(Формула ХХХ) і но Н
Хедо АЛ. М 16) но шамавї хо
АСНМ Н о ід
Ге) (6) «А хлоеі ву
М.О М о я -З-5 (6)
НО дснм Щи ї я о 70 у но ЯН х - 1-30 до А Х у 118 но Мито 7-1-20
АСНМ Н
(Формула ХХХІ), де один із Х або У являє собою олігонуклеотид, при цьому інший являє собою водень.
У певних варіантах здійснення композицій і способів за даним винаходом ліганд являє собою одне або декілька похідних "СаіМАс" (М-ацетилгалактозамін), приєднаних через бівалентний або тривалентний розгалужений лінкер.
В одному варіанті здійснення а5ЕМА за даним винаходом кон'югована з двовалентним або тривалентним розгалуженим лінкером, вибраним з групи структур, показаних в будь-якій із формул (ХХХІЇ) - (ХХХУ):
Формула ХХХ Формупа ХХХ
Диховя А | тТРАд я димом | тА ЗА с і І А х ут вн и сй : «ло М р ви | - тгва ов воза, т ті
З М у. т А й дач. кача диму т тА ОА
І й гЯ ше ле
ААМКО | що днк пит р ИВ вв | завд в Мч р х да ЧИ З роди е ев що
Формула ХХХІУ вух Формупа ХХХУ де 92А, д28, азА, азв, а«4А, д48, д5А, 958 і 485С дорівнюють незалежно для кожного випадку 0- 20, і де повторювана одиниця може бути однаковою або відрізнятися; кожний ІЗ РА, рев, РА, Рв, РА, рев, РА, Рв, рос, ТА, ТВ, ТА, тв. ТА, тв, ТА, Т5В, те незалежно для кожного випадку відсутній, являє собою СО, МН, О, 5, "С(0), МНС(О), СН»,
СНоМН або СНО;
ОСА, ОВ ОЗА, (В, Су, СВ, (3А, СрВ, ро незалежно для кожного випадку відсутні, являють собою алкілен, заміщений алкілен, де одна або декілька метиленових груп можуть перериватися або закінчуватися одним або декількома з О, 5, 5(0), 502, М(ВМ), С(А)-С(В8"),
СЕС або С(О); кожна з 2А, В2В, ВЗА, ДЗВ, ДА, ДВ, Д5А, БВ, дос незалежно для кожного випадку відсутня, являє, собою МН, 0, 5, СНе, (ОО, С(О)МН, МНеН(НУС(О), -С(0)-СН(Вг)-МН-, СО, СнН-М-О, о 8-8 но 5-58 водно вав
Бо , Н , , и МУ або гетероцикліл;
ІА |28 |ЗА |В |ЧА |В |5А 58 115 являють собою ліганд; тобто незалежно для кожного випадку моносахарид (такий як саіІМАс), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олігосахарид або полісахарид; і К? являє собою Н або бічний ланцюг амінокислоти. Тривалентні кон'югуючі похідні сзайМмАс є особливо придатними для застосування із засобами на основі КМАЇї для інгібування експресії цільового гена, як, наприклад, такі, що характеризуються формулою (ХХХМІ): се Р ЗА. г ЗА В А - ТВА ЕВ т ше ши спол Є ш шо ва М їх тевдуя
Її ря Се" НІ
Формула УНІ де 5А,158115С являють собою моносахарид, такий як похідна саЇМАс.
Приклади придатних двовалентних і тривалентних розгалужених лінкерних груп, що кон'югують похідні сзаМмАс, включають без обмеження структури, наведені вище у вигляді формул ІЇ, МІЇ, ХІ, Х ії ХІПІ.
Ілюстративні патенти США, в яких описане одержання кон'югатів РНК, включають без обмеження патенти США МоМо 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 і 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931; 6900297; 7037646; 8106022, повний зміст кожного з яких таким чином включений в даний документ за допомогою посилання.
Немає необхідності, щоб всі положення в даній сполуці були однаково модифіковані, і, фактично, більш ніж одна з вищезазначених модифікацій може бути включена в одну сполуку або навіть в один нуклеозид в ІЕМА. Даний винахід також передбачає сполуки іІКМА, які є химерними сполуками. "Химерні" сполуки ІЕМА, або "химери", в контексті даного винаходу являють собою сполуки
ІЕМА, переважно а5КМА, які містять дві або більше хімічно різних ділянок, при цьому кожна складається щонайменше з однієї мономерної ланки, тобто нуклеотиду, у випадку сполуки а5зКМА. Такі ІКМА, як правило, містять щонайменше одну ділянку, де РНК модифікують так, щоб надати ІКМА підвищену стійкість до руйнування нуклеазою, покращене захоплення клітиною та/або підвищену афінність зв'язування з цільовою нуклеїновою кислотою. Додаткова ділянка
ІЕМА може служити як субстрат для ферментів, здатних розщеплювати гібриди РНК:ДНК або
РНЕ"РНК. Як приклад, РНКаза Н є клітинною ендонуклеазою, яка розщеплює нитку РНК дуплексу РНК:ДНК. Отже, активація РНКази Н призводить до розщеплення цільової РНК зі значним підвищенням, таким чином, ефективності інгібування експресії гена за допомогою
ІЕМА. Отже, під час застосування химерних а5КМА порівнювані результати часто можуть бути одержані для більш коротких ІКМА порівняно з фосфотіоатдезокси-й5КМА, що гібридизуються з тією самою цільовою ділянкою. Розщеплення цільової РНК, як правило, можна виявити шляхом гель-електрофорезу і за необхідності за допомогою методик, асоційованих з гібридизацією нуклеїнових кислот, відомих із рівня техніки.
В певних випадках РНК з ІКМА може бути модифікована групою, що не є лігандом. Ряд молекул, що не є лігандами, кон'югували з ІКМА для посилення активності, розподілу в клітині або клітинного захоплення ікМА, і процедури для виконання таких типів кон'югування доступні в науковій літературі. Такі фрагменти, що не є лігандами, мають включені ліпідні фрагменти, такі 5О0 як холестерин (Кибо, Т. еї аі.,, Віоспет. Віорпуз. Ве5. ботт., 2007, 365(1):54-61; І еівіподег евї аї.,
Ргос. Май. Асад. зсі. ОБА, 1989, 86:6553), холева кислота (Мапопйагап еї а!., Вісогу. Мед. Спет.
ІГей., 1994, 4:1053), тіоестер, наприклад, гексил-5-тритилтіол (Мапопйагап еї аї!., Апп. М.У. Асад. збсі., 1992, 660:306; Мапопагап еї аї., Віоогд. Мей. Спет. Геї., 1993, 3:2765), тіохолестерин (Орегпаизег ей аїі,, Мисі. Асій5 Ке5., 1992, 20:533), аліфатичний ланцюг, наприклад, додекандіолові або ундецилові залишки (Заізоп-Вептоагав еї аі., ЕМВО .4., 1991, 10:111;
Кабрапом еї аїЇ., РЕВЗ Гей., 1990, 259:327; Зміпагопик еї аї., Віоспітіє, 1993, 75:49), фосфоліпід, наприклад, дигексадецил-рац-гліцерин або 1,2-ди-О-гексадецил-рац-гліцеро-3-Н-фосфонат триетиламонію (Мапопагап еї аї., Техгапеагоп Гек., 1995, 36:3651; ЗНєа еї аї., Мисі. Асіав Вев., 1990, 18:3777), поліамінний або поліеєтиленгліколевий ланцюг (Мапойагап еї аї., Мисіеовзіде5 5
Мисіеоїіде5, 1995, 14:969), або адамантаноцтова кислота (Мапопйагап еї аї., Теїгапедгоп ГІ ей., 1995, 36:3651), пальмітиловий фрагмент (Мігхпга еї аї!., Віоспіт. Віорпу5. Асіа, 1995, 1264:2259), або октадециламінний або гексиламінокарбонілоксихолестериновий фрагмент (Стгооке еї аї.,..
РПпаптасої. Ехр. ТПег., 1996, 277:923). Ілюстративні патенти Сполучених Штатів, які описують одержання таких кон'югатів РНК, були наведені вище. Типові протоколи кон'югування передбачають синтез РНК, що несуть амінолінкер в одному або декількох положеннях послідовності. Потім проводять реакцію аміногрупи з молекулою, що підлягає кон'югуванню, за допомогою відповідних реагентів конденсації або активації. Реакція кон'югування може бути виконана або з РНК, все ще зв'язаною з твердою підкладкою, або після розщеплення РНК в фазі розчину. Очищення кон'югата РНК за допомогою НРІ С, як правило, дає чистий кон'югат.
М. Доставка ІКМА за даним винаходом
Доставку ІКМА за даним винаходом до клітини, наприклад, клітини в організмі суб'єкта, такого як суб'єкт-людина (наприклад, суб'єкт, який потребує цього, такий як суб'єкт із захворюванням, порушенням або станом, асоційованим із ТТК), можна здійснювати рядом різних шляхів. Наприклад, доставку можна здійснювати шляхом приведення клітини в контакт з
ІЕМА за даним винаходом або іп міїго, або іп мімо. Доставку іп мімо можна також здійснювати безпосередньо шляхом введення суб'єкту композиції, що містить ІКМА, наприклад а5КМА. Як альтернатива, доставку іп мімо можна здійснювати опосередковано шляхом введення одного або декількох векторів, які кодують ІКМА і керують її експресією. Такі альтернативні випадки додатково описані нижче.
Як правило, будь-який спосіб доставки молекули нуклеїнової кислоти (іп міго або іп мімо) може бути адаптований для застосування з ікКМА за даним винаходом (див., наприклад, Акпіаг
З. апа Ушіап ВІ. (1992) Ттепаз СеїІ. Віої. 2(5):139-144 і М/О94/02595, які включені в даний документ за допомогою посилання в своїй повноті). Що стосується доставки іп мімо, то чинники, які враховують в контексті доставки молекули іІКМА, включають, наприклад, біологічну стабільність молекули, що доставляється, запобігання неспецифічним ефектам і накопичення молекули, що доставляється, в цільовій тканині. Неспецифічні ефекти ІКМА можуть бути зведені до мінімуму шляхом локального введення, наприклад шляхом прямої ін'єкції або імплантації в тканину, або місцевого введення препарату. Локальне введення в місце обробки максимально збільшує локальну концентрацію засобу, обмежує вплив засобу на системні тканини, що в іншому випадку можуть бути пошкоджені засобом або які можуть зруйнувати засіб, і дає можливість вводити нижчу загальну дозу молекули ІКМА. У декількох дослідженнях було показано ефективний нокдаун генних продуктів у разі введення іЇКМА локально.
Наприклад, було показано, що внутрішньоочна доставка Д452ЕМА до МЕСЕ як шляхом ін'єкції в скловидне тіло яванських макак (Тоїепійо, М.., еї а! (2004) ВНейпа 24:132-138), так і субретинальних ін'єкцій мишам (Кеїсп, 59., еї а! (2003) Мої. Міб5. 9:210-216) попереджують неоваскуляризацію в експериментальній моделі вікової дегенерації макули. Крім того, пряма внутрішньопухлинна ін'єкція 456ЕМА мишам знижує об'єм пухлин (Ре, 9., еї а! (2005) Мої.
ТНнег.11:267-274) і може збільшувати виживаність мишей з пухлинами (Кіт, УМУ., еї а! (2006) Мої.
БО ТНнег. 14:343-350; 1, 5., еї ан! (2007) Мої. ТНег. 15:515-523). Також було показано, що РНК- інтерференція була успішною у випадку локальної доставки в СМ5 шляхом прямої ін'єкції (богп,
СЄ., еї а. (2004) Мисівїс Асіаз 32:е49; Тап, РН., ві а! (2005) Сепе ТНег. 12:59-66; МаКітига, Н., єї аї (2002) ВМС Мешгозсі. 3:18; ЗпівнКіпа, СТ., еї а! (2004) Мешйгозсієпсе 129:521-528; Тнаккег, ЕВ., єї а! (2004) Ргос. Маї). Асай. сі. 0.5.А. 101:17270-17275; АКапеуа,У., еї а! (2005) У. Мешигорпузвіо). 93:594-602) і в легені шляхом інтраназального введення (Ноугага, КА., еї а! (2006) Мої. Тпег. 14:476-484; 7Напа, Х., єї а! (2004) У). Віої. Снет. 279:10677-10684; Віїко, У., єї а! (2005) Маї. Меа. 11:50-55). Що стосується системного введення ікМА для лікування захворювання, то РНК може бути модифікована або, як альтернатива, доставлена за допомогою системи доставки лікарського засобу; обидва способи служать для запобігання швидкому руйнуванню а5еЕМА бо ендо- та екзонуклеазами іп мімо. Модифікація РНК або фармацевтичний носій також можуть робити можливим націлювання композиції з ІЕМА на цільову тканину, і з їх допомогою можна уникнути небажаних нецільових ефектів. Молекули ІКЕМА можна модифікувати за допомогою хімічного кон'югування з ліпофільними групами, такими як холестерин, для підвищення поглинання клітиною та запобігання руйнуванню. Наприклад, спрямовану проти АроВ ікМА, кон'юговану з фрагментом, що являє собою ліпофільний холестерин, вводили шляхом ін'єкції системно мишам, що приводило до нокдауну мРНК ароВ як в печінці, так і в тонкій кишці (бБоцівзспек, у., еї а! (2004) Маїште 432:173-178). Як було показано, кон'югування ІКМА з аптамером сприяє інгібуванню росту пухлини й опосередковує регрес пухлини на мишачих моделях раку передміхурової залози (МеМатага, 90., еї а! (2006) Маї. Віотесппо!. 24:1005-1015).
В альтернативному варіанті здійснення ІЕМА можна доставляти за допомогою систем доставки лікарських засобів, таких як наночастинка, дендример, полімер, ліпосоми або катіонна система доставки. Позитивно заряджені катіонні системи доставки сприяють зв'язуванню молекули ІЕМА (негативно зарядженої) і також збільшують взаємодії на негативно зарядженій клітинній мембрані із забезпеченням ефективного захоплення іеЕМА клітиною. Катіонні ліпіди, дендримери або полімери можуть або бути пов'язаними з іКМА, або їх індукують з метою утворення везикули або міцели (див., наприклад, Кіт 5Н., еї а! (2008) ЧдЧоцтпа! ої СопігоїІєд Веївазе 129(2):107-116), які заключають в себе іКМА. Утворення везикул або міцел також запобігає руйнуванню іЇЕМА у разі введення системно. Способи одержання та введення катіонних комплексів з ІКМА знаходяться в межах кваліфікації фахівця в даній галузі (див., наприклад,
Зогепзеп, ОВ., єї а! (2003) 9. Мої. Віої 327:761-766; Мепта, ОМ., еї а! (2003) Сііп. Сапсег Нев. 9:1291-1300; Аттоїд, АБЗ еї а! (2007) У. Нурепепв. 25:197-205, які включені в даний документ за допомогою посилання у всій своїй повноті). Деякі необмежувальні приклади систем доставки лікарських засобів, придатних для системної доставки ІЕМА, включають ОСОТАР (Зогепзеп, ОК., еї а! (2003), вище; Мегта, ОМ., еї а! (2003), вище), олігофектамін, "тверді частинки з нуклеїновою кислотою-ліпідом" (Хіттептапп, Т5., еї а! (2006) Майшге 441:111-114), кардіоліпін (Спіеп, РУ., еї а! (2005) Сапсег Сепе Тпег. 12:321-328; Раї, А., еї а! (2005) Іпї У. Опсої. 26:1087-1091), полієтиленімін (Воппеї МЕ., еї а! (2008) Рпагт. Кев. Ачцу 16 Ериб апеаай ої ргіпі; Аідпег, А. (2006)
У. Віотеа. Віоїтесппої. 71659), що містять Агд-Сіу-Азр (КОБЮ) пептиди (Гічм, 5. (2006) Мої. Рпагт. 3:472-487), і поліамідоаміни (Тотаїіа, БА., еї а! (2007) Віоспет. 50с. Тгап5. 35:61-67; Моо, Н., єї
Зо а! (1999) Рпагт. Невз. 16:1799-1804). У деяких варіантах здійснення ІКМА утворює комплекс з циклодекстрином для системного введення. Способи введення та фармацевтичні композиції з
ІНМА та циклодекстринами можна знайти у патенті США Ме 7427605, який включений у даний документ за допомогою посилання в повному його обсязі.
А. ІКМА, що кодуються вектором, за даним винаходом
ІКМА, що цілеспрямовано впливає на ген ТТК, може експресуватися з транскрипційних одиниць, вставлених в ДНК- або РНК-вектори (див., наприклад, Сошіиге, А, еї аї., ТІ. (1996), 12:5-10; 5КШегп, А., еї аїЇ., міжнародну публікацію згідно з РСТ Мо М/О 00/22113, Сопгай, міжнародну публікацію згідно РСТ Мо УМО 00/22114 і Сопгад, патент США Мо 6054299). Експресія може бути тимчасовою (приблизно від годин до тижнів) або стійкою (від тижнів до місяців або довше), залежно від конкретної застосовуваної конструкції та цільової тканини або типу клітин.
Такі трансгени можна вводити у вигляді лінійної конструкції, кільцевої плазміди або вірусного вектора, який може бути інтегруючим або неінтегруючим вектором. Трансген також може бути сконструйований з можливістю успадкування його у вигляді екстрахромосомної плазміди (Сазвзтапп, єї а!., Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА (1995) 92:1292).
Окрема нитка або нитки ІЕМА можуть транскрибуватися з промотору вектора експресії. У цільову клітину можна спільно вводити два окремі вектори експресії (наприклад, шляхом трансфекції або інфікування) для експресії двох окремих ниток з одержанням, наприклад, а5зКМА. Як альтернатива, кожна окрема нитка а5ЕМА може транскрибуватися за участю промоторів, обидва з яких розташовані в одній і тій самій плазміді експресії. В одному варіанті здійснення а5КМА експресується у вигляді полінуклеотидів з інвертованим повтором, з'єднаних лінкерною полінуклеотидною послідовністю так, що а5КМА має структуру типу "стебло-петля".
Як правило, вектори експресії ІКМА є ДНК-плазмідами або вірусними векторами. Вектори експресії, сумісні з еукаріотичними клітинами, переважно сумісні з клітинами хребетних, можна використовувати для одержання рекомбінантних конструкцій для експресії ІКМА, яка описана в даному документі. Вектори експресії для еукаріотичних клітин добре відомі з рівня техніки і доступні з низки комерційних джерел. Зазвичай передбачаються такі вектори, які містять зручні сайти рестрикції для вставки потрібного сегмента нуклеїнової кислоти. Доставка векторів, що експресують ІКМА, може бути системною, як наприклад шляхом внутрішньовенного або внутрішньом'язового введення, шляхом введення в цільові клітини, експлантовані від пацієнта, 60 з наступним зворотним введенням пацієнту, або шляхом будь-якого іншого способу, який забезпечує можливість введення в потрібну цільову клітину.
Цільові клітини можна трансфікувати плазмідами експресії ІКМА у вигляді комплексу з носіями-катіонними ліпідами (наприклад, олігофектаміном) або носіями на основі некатіонних ліпідів (наприклад, Тгап5й-ТКО"М) У даному винаході розглядаються також множинні трансфекції за допомогою ліпідів для типів ІКЕМА-опосередкованого нокдауну, націлених на різні ділянки цільової РНК, протягом тижня або більше. Успішне введення векторів у клітини-хазяїни можна контролювати за допомогою різних відомих способів. Наприклад, про тимчасову трансфекцію можна виявити за допомогою репортера, такого як флуоресцентний маркер, такий як зелений флуоресцентний білок (СЕР). Стабільна трансфекція клітин ех мімо може бути підтверджена із застосуванням маркерів, які забезпечують стійкість трансфікованої клітини до конкретних чинників навколишнього середовища (наприклад, антибіотиків і лікарських засобів), як, наприклад, стійкість до гігроміцину В.
Системи вірусних векторів, які можна використовувати зі способами та композиціями, описаними в даному документі, включають без обмеження (а) аденовірусні вектори; (б) ретровірусні вектори, в тому числі без обмеження лентивірусні вектори, вірус мишачого лейкозу
Молоні тощо; (с) вектори на основі аденоасоційованого вірусу; (4) вектори на основі вірусу простого герпесу; (є) вектори на основі 5М40; (І) вектори на основі вірусу поліоми; (9) вектори на основі вірусу папіломи; (п) вектори на основі пікорнавірусу; (і) вектори на основі поксвірусу, такого як ортопокс, наприклад вектори на основі вірусу осповакцини, або авіпокс, наприклад канарипокс або віспи курей, і (Ї) хелпер-залежний або "слабкий" аденовірус. Також переважними можуть бути віруси з порушеною реплікацією. Різні вектори будуть або не будуть вбудовуватися в геном клітин. За необхідності, конструкції можуть включати вірусні послідовності для трансфекції. Як альтернатива, конструкція може бути вбудована у вектори, здатні до епісомальної реплікації, наприклад вектори на основі ЕРМ і ЕВУ. Як правило, в конструкціях для рекомбінантної експресії ІЕМА будуть необхідні регуляторні елементи, наприклад промотори, енхансери тощо, для забезпечення експресії ІКМА в цільових клітинах. Інші аспекти, які розглядаються щодо векторів і конструкцій, додатково описані нижче.
Вектори, придатні для доставки ІКМА, будуть включати регуляторні елементи (промотор, енхансер тощо), достатні для експресії ІЕМА в потрібній цільовій клітині або тканині. Регуляторні
Зо елементи можна вибирати для одержання або конститутивної, або регульованої/ндуковної експресії.
Експресія ІЕМА може бути точно регульованою, наприклад, шляхом застосування індуковної регуляторної послідовності, яка є сприйнятливою до певних фізіологічних регуляторів, наприклад, рівнів циркулюючої глюкози або гормонів (Юоспегіу еї а!., 1994, ЕАЗЕВ .). 8:20-24).
Такі індуковні системи експресії, придатні для керування експресією а5ЕМА в клітинах або у ссавців, включають, наприклад, регулювання за допомогою екдизону, за допомогою естрогену, прогестерону, тетрацикліну, хімічних індукторів димеризації та ізопропіл-бета-01- тіогалактопіранозиду (ІРТО). Фахівець у даній галузі зможе вибрати відповідну регуляторну/промоторну послідовність, виходячи з передбачуваного використання трансгену
ІАМА.
Можна застосовувати вірусні вектори, які містять послідовності нуклеїнових кислот, що кодують ІКМА. Наприклад, можна застосовувати ретровірусний вектор (див. Міег еї аї., Ме.
Епгутої. 217:581-599 (1993)). Такі ретровірусні вектори містять компоненти, необхідні для правильного упакування вірусного генома та інтеграції в ДНК клітини-хазяїна. Послідовності нуклеїнових кислот, що кодують іІЕМА, клонують в один або декілька векторів, які полегшують доставку нуклеїнової кислоти в організм пацієнта. Більш детальний опис ретровірусних векторів можна знайти, наприклад, в Воезеп еї аї., Віоїпегару 6:291-302 (1994), в якому описано застосування ретровірусного вектора для доставки гена таг1 в гемопоетичні стовбурові клітини для надання стовбуровим клітинам кращої стійкості до хіміотерапії. Іншими джерелами, що ілюструють застосування ретровірусних векторів у генній терапії, є: Сіомез еї аї., У. Сііп. Іпмеві. 93:644-651 (1994); Кієт еї аї!., Віоса 83:1467-1473 (1994); Заітоп5 апа Сип2регу, Нитап Сепе
Тпегару 4:129-141 (1993); і Сгоз5тап апа Умізоп, Си. Оріп. іп Сепейс5 апа Оеємеї. 3:110-114 (1993). Лентивірусні вектори, що передбачаються для застосування, включають, наприклад, вектори на основі НІМ, описані у патентах США МоМо 6143520; 5665557 і 5981276, які включені в даний документ за допомогою посилання.
Також для застосування у доставці ІКМА за даним винаходом передбачаються аденовіруси.
Аденовіруси є особливо перспективними "провідниками", наприклад для доставки генів у респіраторний епітелій. Аденовіруси природним шляхом інфікують респіраторний епітелій, де вони спричинюють легке захворювання. Іншими мішенями для систем доставки на основі бо аденовірусів є печінка, центральна нервова система, ендотеліальні клітини та м'язи.
Аденовіруси мають перевагу в тому, що вони здатні інфікувати клітини, що не діляться. У
КолагїзКу апа Уміїзоп, Сцтепі Оріпіоп іп Сепеїйс5 апа ОємеІортепі 3:499-503 (1993) представлена оглядова стаття про генну терапію на основі аденовірусів. У Воці еї аІ., Нитап Сепе Паегару 5:3-10 (1994) показано застосування аденовірусних векторів для перенесення генів к респіраторний епітелій макак-резусів. Інші приклади застосування аденовірусів в генній терапії можна знайти в Козепгеїа еї аї., Зсіепсе 252:431-434 (1991); Розеп'івїй еї аї!., Се!! 68:143-155 (1992); Мазігапавії єї аї., у. Сііп. Іпмеві. 91:225-234 (1993); публікації згідно з РСТ МУО94/126459; і
Мапа, єї аі., Сепе ТНегару 2:775-783 (1995). Придатний АМ вектор для експресії ІЕМА, описаної в даному винаході, спосіб конструювання рекомбінантного АМ вектора та спосіб доставки вектора в цільові клітини описані в Хіа Н еї а!. (2002), Маї. Віоїесп. 20: 1006-1010.
Вектори на основі аденоасоційованого вірусу (ААМ) також можна застосовувати для доставки ІКМА за даним винаходом (Умаї5п еї аї!., Ргос. ос. Ехр. ВіоІЇ. Мед. 204:289-300 (1993); патент США Мо 5436146). В одному варіанті здійснення ІКМА може експресуватися у вигляді двох окремих комплементарних однониткових молекул РНК за допомогою рекомбінантного
ААМУ-вектора, наприклад, або з РНК-промоторами Иб або НІ, або з промотором цитомегаловірусу (СММ). Придатні ААМ-вектори для експресії а5зКМА, описаної в даному винаході, способи конструювання рекомбінантного АМ вектора та способи доставки векторів у цільові клітини описані в затиі5кКі К еї а. (1987), 9. МігоїЇ. 61: 3096-3101; Різне" К У єї аії. (1996), 9.
Мігої, 70: 520-532; ЗатиївКі А еї аї. (1989), 9). Міо. 63: 3822-3826; патенті США Мо 5252479; патенті США Ме 5139941; міжнародній заявці на патент Мо УМО 94/13788 і міжнародній заявці на патент Мо УМО 93/24641, повне розкриття яких включене в даний документ за допомогою посилання.
Інший вірусний вектор, придатний для доставки ІЕМА за даним винаходом, являє собою поксвірус, такий як вірус вісповакцини, наприклад атенуйований вірус вісповакцини, такий як модифікований вірус Анкара (ММА) або МУМАС, авіпокс, такий як віспа курей або віспа канарок.
За необхідності тропізм вірусних векторів може бути модифікований шляхом псевдотипування векторів білками оболонки або іншими поверхневими антигенами з інших вірусів або шляхом заміщення різних вірусних капсидних білків. Наприклад, лентивірусні вектори можна піддавати псевдотипуванню поверхневими білками з вірусу везикулярного
Зо стоматиту (ММ), вірусу сказу, вірусу Ебола, вірусу Мокола тощо. ААМ-вектори можна одержувати для націлювання на різні клітини шляхом конструювання векторів так, щоб вони експресували різні серотипи капсидних білків; див., наприклад, Кабріпом/й» У Е еї аї. (2002), 9
Мігої! 76:791-801, повне розкриття якого включене в даний документ за допомогою посилання.
Фармацевтичний препарат на основі вектора може включати вектор у прийнятному розчиннику або може включати матрицю сповільненого вивільнення, в яку включено засіб для доставки генів. Як альтернатива, якщо вектор доставки цілого гена може продукуватися нативно рекомбінантними клітинами, наприклад ретровірусними векторами, то фармацевтичний препарат може включати одну або декілька клітин, які продукують систему доставки генів.
МІ. Фармацевтичні композиції за даним винаходом
Даний винахід включає також фармацевтичні композиції та склади, які включають ІКМА за даним винаходом. В одному варіанті здійснення в даному документі передбачені фармацевтичні композиції, що містять ІЕМА, описану в даному документі, та фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтичні композиції, які містять ІКМА, застосовні для лікування захворювання або порушення, асоційованого з експресією або активністю гена ТТЕ. Такі фармацевтичні композиції складають залежно від способу доставки. Одним прикладом є композицій, які складені для системного введення за допомогою доставки парентеральним шляхом, наприклад, шляхом підшкірної (50) або внутрішньовенної (ІМ) доставки. Іншим прикладом є композиції, які складені для прямої доставки в паренхіму головного мозку, наприклад, шляхом інфузії в головний мозок, як, наприклад, неперервної інфузії за допомогою насоса. Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити в дозах, достатніх для інгібування експресії гена ТТК. В одному варіанті здійснення засоби на основі ІЕМА за даним винаходом, наприклад, засіб на основі а5ЕМА, складають для підшкірного введення в фармацевтично прийнятному носії.
Фармацевтичну композицію можна вводити шляхом внутрішньовенної інфузії протягом певного періоду часу, як, наприклад, протягом 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ії 21, 22, 23, 24 або приблизно 25 хвилин. Введення можна повторювати, наприклад, регулярно, як, наприклад: один раз на тиждень, один раз на два тижні (тобто кожні два тижні) протягом одного місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців або довше. Введення можна повторювати, наприклад, кожного місяця, або кожні три місяці, наприклад, приблизно бо кожні 12 тижнів. Після здійснення схеми первинного лікування лікарські препарати можна вводити з меншою частотою. Наприклад, після введення один раз на тиждень або один раз на два тижні протягом трьох місяців введення можна повторювати один раз на місяць протягом шести місяців або року або довше.
Фармацевтичну композицію можна вводити один раз на день або ІКМА можна вводити у вигляді двох, трьох або більше частин дози через певні інтервали протягом дня або навіть через безперервну інфузію або доставку за допомогою складу з контрольованим вивільненням.
У такому випадку, кількість ІКМА, що міститься в кожній частині дози, повинна бути відповідно меншою, щоб забезпечити загальну добову дозу. Одиниця дозування також може бути складена для доставки протягом декількох днів, наприклад за допомогою традиційного складу з уповільненим вивільненням, який передбачає уповільнене вивільнення ІКМА протягом періоду в декілька днів. Склади з уповільненим вивільненням добре відомі з рівня техніки й особливо придатні для доставки засобів у певну ділянку, як, наприклад, їх можна застосовувати із засобами за даним винаходом. У цьому варіанті здійснення одиниця дозування містить відповідну кількість добової дози.
В інших варіантах здійснення одноразова доза фармацевтичних композицій може бути тривалої дії, так що наступні дози вводять з інтервалами не більше 3, 4 або 5 днів, з інтервалами не більше 1, 2, З або 4 тижнів, або з інтервалами не більше 9, 10, 11 або 12 тижнів.
У деяких варіантах здійснення даного винаходу одноразову дозу фармацевтичних композицій за даним винаходом вводять один раз на тиждень. В інших варіантах здійснення даного винаходу одноразову дозу фармацевтичних композицій за даним винаходом вводять один раз на два місяці. В інших варіантах здійснення одноразову дозу фармацевтичних композицій за даним винаходом вводять один раз на місяць. У ще декількох інших варіантах здійснення одноразову дозу фармацевтичних композицій за даним винаходом вводять один раз на три місяці.
Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що певні чинники можуть впливати на дозу і часові рамки, необхідні для ефективного лікування суб'єкта, у тому числі без обмеження тяжкість захворювання або порушення, типи попереднього лікування, загальний стан здоров'я та/або вік суб'єкта й інші наявні захворювання. Крім того, лікування суб'єкта терапевтично ефективною кількістю композиції може включати один період лікування або серію періодів лікування.
Зо Розрахунки ефективних доз і часу напівжиття іп мімо для окремих ІКМА, охоплені даним винаходом, можна проводити із застосуванням традиційних методик, або на підставі тестування іп мімо із застосуванням відповідної тваринної моделі, як описано в іншій частині в даному документі.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом можна вводити різними шляхами залежно від того, чи потрібне локальне або системне лікування, та від області, що підлягає обробці.
Введення може бути місцевим (наприклад, за допомогою трансдермального пластиру), легеневим, наприклад шляхом інгаляції або інсуфляції порошків або аерозолів, у тому числі за допомогою інгалятора; інтратрахеальним, інтраназальним, епідермальним і трансдермальним, пероральним або парентеральним. Парентеральне введення включає внутрішньовенну, внутрішньоартеріальну, підшкірну, внутрішньочеревну або внутрішньом'язову ін'єкцію або інфузію; субдермальне, наприклад, за допомогою вживленого пристрою; або інтракраніальне, наприклад, інтрапаренхіматозне, інтратекальне або інтравентрикулярне введення.
ІЕМА можна доставляти таким чином, щоб відбувалося націлювання на конкретну тканину, таку як печінка (наприклад, гепатоцити печінки).
Фармацевтичні композиції та склади для місцевого введення можуть включати трансдермальні пластирі, мазі, лосьйони, креми, гелі, краплі, супозиторії, розпилювані розчини, рідини та порошки. Можуть бути потрібними або бажаними традиційні фармацевтичні носії, водні, порошкоподібні або олійні основи, загусники тощо. Також можуть бути придатними презервативи, рукавички з покриттям тощо. Придатні склади для місцевого застосування включають склади, в яких ІКМА, описані в даному винаході, знаходяться в суміші із засобом для місцевої доставки, таким як ліпіди, ліпосоми, жирні кислоти, естери жирних кислот, стероїди, хелатувальні засоби та поверхнево-активні речовини. Придатні ліпіди та ліпосоми включають нейтральні (наприклад, діолеотїлфосфатидилетаноламін (ОРЕ), диміристоїлфосфатидилхолін (ОМРО), дистеароїлфосфатидилхолін), негативно заряджені (наприклад, диміристоїлфосфатидилгліцерин (ОМРС)) і катіонні (наприклад, діолеїлтетраметиламінопропіл (СОТАР) і діолеоїлфосфатидилетаноламін (ОТМА)). ІКМА, описані в даному винаході, можуть бути інкапсульовані в ліпосомах або можуть утворювати комплекси з ними, зокрема з катіонними ліпосомами. Як альтернатива, ІКМА можуть утворювати комплекси з ліпідами, зокрема з катіонними ліпідами. Придатні жирні кислоти й естери включають без обмеження 60 арахідонову кислоту, олеїнову кислоту, ейкозанову кислоту, лауринову кислоту, каприлову кислоту, капринову кислоту, міристинову кислоту, пальмітинову кислоту, стеаринову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеїн, дилаурин, гліцерил-1- монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнітин, ацилхолін або С.-гоалкілові естери (наприклад, ізопропілміристат (ІРМ)), моногліцерид, дигліцерид або їх фармацевтично прийнятну сіль. Склади для місцевого застосування докладно описані в патенті США Мо 6747014, який включений у даний документ за допомогою посилання. (а) А. Склади на основі ІКМА, які містять мембранні молекулярні ансамблі
ІЕМА для застосування в композиціях і способах за даним винаходом можуть бути складені для доставки в мембранному молекулярному ансамблі, наприклад, в ліпосомі або міцелі.
Термін "ліпосоми", використовуваний у даному документі, відноситься до везикули, що складається з амфіфільних ліпідів, розташованих у вигляді щонайменше одного бішару, наприклад одного бішару або багатьох бішарів. Ліпосоми включають одношарові та багатошарові везикули, які мають мембрану, утворену з ліпофільного матеріалу, і водне внутрішнє середовище. Водна частина містить композицію з ІКМА. Ліпофільний матеріал відокремлює водне внутрішнє середовище від водного зовнішнього середовища, яке зазвичай не включає композицію з ЇКМА, хоча в деяких прикладах може включати. Ліпосоми є придатними для перенесення та доставки активних інгредієнтів до місця дії. Завдяки тому, що мембрана ліпосоми структурно подібна до біологічних мембран, у разі введення ліпосом у тканину бішар ліпосоми зливається з бішаром клітинних мембран. У міру того, як відбувається злиття ліпосоми та клітини, внутрішній водний вміст, який містить ІКМА, доставляється в клітину, де ІКМА може специфічно зв'язуватися з цільовою РНК і може опосередковувати КМАЇ.
У деяких випадках ліпосоми також є специфічно націленими, наприклад для спрямування ІКМА в конкретні типи клітин.
Ліпосоми, які містять засіб на основі ІКМА, можна одержувати за допомогою низки способів.
В одному прикладі ліпідний компонент ліпосоми розчиняють у детергенті для утворення міцел із ліпідного компонента. Наприклад, ліпідний компонент може являти собою амфіпатичний катіонний ліпід або ліпідний кон'югат. Детергент може характеризуватися високою критичною концентрацією утворення міцел і може бути неіонним. Ілюстративні детергенти включають холат, СНАР5, октилглюкозид, дезоксихолат і лауроїлсаркозин. Потім препарат засобу на основі ІЕМА додають до міцел, які містять ліпідний компонент. Катіонні групи ліпіду взаємодіють із засобом на основі ІЕМА та конденсуються навколо засобу на основі ІЕМА з утворенням ліпосоми. Після конденсації детергент видаляють, наприклад, шляхом діалізу з одержанням ліпосомного препарату засобу на основі ІКМА.
За необхідності сполуку-носій, яка сприяє конденсації, можна додавати під час реакції конденсації, наприклад, шляхом контрольованого додавання. Наприклад, сполука-носій може являти собою полімер, відмінний від нуклеїнової кислоти (наприклад, спермін або спермідин).
Також для сприяння конденсації можна коригувати значення рн.
Способи одержання стабільних засобів доставки полінуклеотидів, які як структурні компоненти засобів доставки включають комплекс полінуклеотиду/катіонного ліпіду, додатково описані, наприклад, у УМО 96/37194, повний зміст якої включено в даний документ за допомогою посилання. Утворення ліпосом може також включати один або декілька аспектів ілюстративних способів, описаних у Редпег, Р. Ї. еї аї., Ргос. Май). Асад. 5сі., ОБА 8:7413-7417, 1987; патенті
США Мо 4897355; патенті США Мо 5171678; Вапопат, еї аї. М. Мої. Віої. 23:238, 1965; Оі5оп, еї аї.
Віоспіт. Віорпув. Асіа 557:9, 1979; 520Ка, вї а). Ргос. Маї). Асад. осі. 75: 4194, 1978; Маупем, еї а! Віоспіт. Віорпу5. Асіа 775:169, 1984; Кіт, еї аї. Віоспіт. Віорпу5. Асіа 728:339, 1983; і
ЕиКипада, еї аї. Епдосгіпої. 115:757, 1984. Широко застосовувані методики одержання ліпідних агрегатів відповідного розміру для застосування як засобів для доставки включають обробку ультразвуком і заморожування-розморожування з екструзією (див., наприклад, Мауег, еї аї.
Віоспіт. Віорпу5. Асіа 858:161, 1986). Мікрофлюїдизацію можна застосовувати в тих випадках, коли потрібні стабільно малі (від 50 до 200 нм) та порівняно однорідні агрегати (Маупему, еї аї.
Віоспіт. Віорпуз. Асіа 775:169, 1984). Ці способи легко адаптувати для упаковування препаратів засобу на основі ІеЕМА в ліпосоми.
Ліпосоми діляться на два великі класи. Катіонні ліпосоми є позитивно зарядженими ліпосомами, які взаємодіють із негативно зарядженими молекулами нуклеїнових кислот з утворенням стабільних комплексів. Позитивно заряджений комплекс нуклеїнової кислоти/ліпосоми зв'язується з негативно зарядженою клітинною поверхнею й інтерналізується в ендосому. Внаслідок кислого рН всередині ендосоми ліпосоми руйнуються, вивільнюючи свій вміст в цитоплазму клітини (Умапо еї аї., Віоспет. Віорпу5. Кез. Соттип., 1987, 147, 980-985).
Ліпосоми, які є рН-чутливими або негативно-зарядженими, захоплюють нуклеїнові кислоти, бо замість утворення комплексу з ними. Оскільки як нуклеїнова кислота, так і ліпід мають однаковий заряд, то замість утворення комплексу відбувається відштовхування. Проте деяка частина нуклеїнових кислот захоплюється водним внутрішнім середовищем цих ліпосом. рн- чутливі ліпосоми використовувались для доставки нуклеїнових кислот, які кодують ген тимідинкінази, в моношари клітин у культурі. Експресію екзогенного гена виявляли в цільових клітинах (2пои еї аї., доигпаї ої СопігоПей Ке!Іеазе, 1992, 19, 269-274).
Один основний тип о ліпосомних композицій включає фосфоліпіди, відмінні від фосфатидилхоліну природного походження. Наприклад, композиції нейтральних ліпосом можуть бути утворені З диміристоїлфосфатидилхоліну (ОМРС) або дипальмітоїлфосфатидилхоліну (ОРРС). Композиції аніонних ліпосом, як правило, утворені з диміристоїлфосфатидилгліцерину, тоді як аніонні фузогенні ліпосоми утворені головним чином із діолеоїлфосфатидилетаноламіну (ОРЕ). Інший тип ліпосомних композицій утворений із фосфатидилхоліну (РОС), такого як, наприклад, РС соєвих бобів і РС яєць. Інший тип утворений із сумішей фосфоліпіду, талабо фосфатидилхоліну, та/або холестерину.
Приклади інших способів для введення ліпосом у клітини іп міїго і іп мімо включають патент
США Мо 5283185; патент США Мо 5171678; УМО 94/00569; УМО 93/24640; УМО 91/16024; РеіІдпег, 9.
ВіоІ. Спнет. 269:2550, 1994; Мабеї, Ргос. Маї!. Асад. 5сі. 90:11307, 1993; Мабеї, Нитап Сепе ТНег. 3:649, 1992; Сегепоп, Віоспет. 32:7143, 1993; і ігайз5 ЕМВО .). 11:417, 1992.
Також досліджували неіїонні ліпосомні системи з метою визначення їх придатності для доставки лікарських засобів у шкіру, зокрема системи, які містять неіїонну поверхнево-активну речовину і холестерин. Неїонні ліпосомні склади, що містять Момазоте"М (гліцерилдилаурат/холестерин/поліоксиетилен-10-стеариловий етер) і Момазоте"М (« (гліцерилдистеарат/холестерин/поліоксиетилен-10-стеариловий етер), застосовували для доставки циклоспорину-А в шар дерми шкіри мишей. Результати показали, що такі неіоногенні ліпосомні системи були ефективними в забезпеченні відкладання циклоспорину А в різних шарах шкіри (Ни еї а. 5.Т.Р.Ріапта. 5сі., 1994, 4(6) 466).
Ліпосоми також включають "просторово стабілізовані" ліпосоми, вираз, що використовується в даному документі, відноситься до ліпосом, що містять один або декілька спеціалізованих ліпідів, які при включенні в ліпосоми призводять до збільшення часу життя в крові порівняно з ліпосомами, в яких відсутні такі спеціалізовані ліпіди. Прикладами просторово стабілізованих
Зо ліпосом є ліпосоми, в яких частина ліпідної складової, що утворює везикулу, ліпосоми (А) містить один або декілька гліколіпідів, таких як моносіалогангліозид Смі, або (В) одержана з одного або декількох гідрофільних полімерів, таких як поліетиленгліколевий (РЕС) фрагмент.
Без поглиблення в теорію, в даній галузі техніки вважають, що щонайменше для просторово стабілізованих ліпосом, що містять гангліозиди, сфінгомієлін або РЕС-похідні ліпіди, збільшений час напівжиття в кровообігу цих просторово стабілізованих ліпосом є результатом зниженого ступеня захоплення клітинами ретикулоендотеліальної системи (КЕ5) (Аїеп еєї а!., РЕВ5 І еНегз, 1987, 223, 42; Ми еї аІ., Сапсег Незеагси, 1993, 53, 3765).
Різні ліпосоми, що містять один або декілька гліколіпідів, відомі з рівня техніки.
РарападЧчіорошов5 ей а. (Апп. М.М. Асай. зЗсі, 1987, 507, 64) описали здатність моносіалогангліозиду Смі, сульфату галактоцереброзиду і фосфатидилінозитолу збільшувати час напівжиття ліпосом у крові. Ці одержані дані були прокоментовані Сабіоп еї аї. (Ргос. Маї).
Асай. 5сі. 0О.5.А., 1988, 85, 6949). У патентах США Мо 4837028 і МО 88/04924, обидва з яких належать АПЙеп еї аї., розкриті ліпосоми, що містять (1) сфінгомієлін і (2) гангліозид Смі, або естери сульфату галактоцереброзиду. У патенті США Мо 5543152 (Умерь еї а!) розкриті ліпосоми, що містять сфінгомієлін. Ліпосоми, що містять 1,2-5п-диміристоїлфосфатидилхолін, розкриті у МО 97/13499 (І іт еї а).
В одному варіанті здійснення використовують катіонні ліпосоми. Катіонні ліпосоми мають перевагу в тому, що вони здатні зливатися з клітинною мембраною. Некатіонні ліпосоми, хоча й не є здатними настільки ефективно зливатися з плазматичною мембраною, поглинаються макрофагами іп мімо, і їх можна застосовувати для доставки засобів на основі ІКМА до макрофагів.
Додаткові переваги ліпосом включають наступні: ліпосоми, одержані з природних фосфоліпідів, є біосумісними та біорозкладними; в ліпосоми може бути включене широке різноманіття водо- та жиророзчинних лікарських засобів; ліпосоми можуть захищати інкапсульовані в їх внутрішніх компартментах засоби на основі ІЕМА від метаболізму та руйнування (Козої у "Рпаптасешіса! Оозаде Еоптв", І ерептап, Вівдег апа ВапкКег (Ед5.), 1988, моїште 1, р. 245). Важливими аспектами в одержанні ліпосомних складів є поверхневий заряд ліпіду, розмір везикули та водний об'єм ліпосом.
Позитивно заряджений синтетичний катіонний ліпід хлорид М-|1-(2,3-діолеїлокси)пропіл|- бо М,М,М-триметиламонію (ФОТМА) можна застосовувати для утворення невеликих ліпосом, які спонтанно взаємодіють з нуклеїновою кислотою з утворенням комплексів ліпід-нуклеїнова кислота, здатних зливатися з негативно зарядженими ліпідами клітинних мембран клітин культури тканин, що зумовлює доставку засобу на основі ІКМА (див., наприклад, РеІдпег, Р. Ї.. еї а!., Ргос. Маї). Асад. 5сі., ОБА 8:7413-7417, 1987; та патент США Мо 4897355 щодо опису ООТМА і його застосування з ДНК).
Аналог рОТМА, 1,2-біс(олеоїлокси)-3-(триметиламоній)пропан (ООТАР), можна застосовувати в комбінації з фосфоліпідом з утворенням везикул, що утворюють комплекс із
ДНК. Гіроїесіп"Мм (ВеШевзда Кезеагсп Іаброгайогіе5, Гейтерсберг, Меріленд) являє собою ефективний засіб для доставки високоаніонних нуклеїнових кислот у живі клітини культури тканин, який містить позитивно заряджені ООТМА-ліпосоми, що спонтанно взаємодіють із негативно зарядженими полінуклеотидами з утворенням комплексів. Якщо використовуються ліпосоми з достатнім позитивним зарядом, то сумарний заряд одержаних комплексів є також позитивним. Позитивно заряджені комплекси, одержані таким способом, самовільно приєднуються до негативно заряджених клітинних поверхонь, зливаються з плазматичною мембраною й ефективно доставляють функціональні нуклеїнові кислоти, наприклад, у клітини культури тканин. Інший комерційно доступний катіонний ліпід, 1,2-біс(олеоїлокси)-3,3- (триметиламоній)пропан ("СОТАР") (Воейгіпдег Мапппеїт, Індіанаполіс, Індіана), відрізняється від ПООТМА тим, що олеїлові фрагменти зв'язані естерними, а не етерними зв'язками.
Інші опубліковані сполуки з катіонними ліпідами включають такі сполуки, які були кон'юговані з рядом фрагментів, у тому числі, наприклад, карбоксиспермін, який був кон'югований з одним із двох типів ліпідів і включає такі сполуки, як 5-карбоксиспермілгліциндіоктаолеоїламід ("005") (Тгапоїесіат "М, Рготеда, Медісон, Вісконсін) і дипальмітоїлфосфатиділетаноламіну 5- карбоксисперміл-амід ("ОРРЕЗ5") (див., наприклад, патент США Мо 5171678).
Інший кон'югат катіонного ліпіду передбачає дериватизацію ліпіду за допомогою холестерину ("ОС-Спої"), і він був складений у вигляді ліпосом у комбінації з ООРЕ (див. сао, Х. апа Ниапо, Г.., Віоспіт. Віорпу5. Ке5. Соттип. 179:280, 1991). Як повідомлялося, ліпополілізин, одержаний шляхом кон'югування полілізину з ООРЕ, є ефективним для трансфекції за присутності сироватки крові (2Ппои, ХХ. еї аї.,, Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1065:8, 1991).
Повідомляється, що у випадку певних клітинних ліній такі ліпосоми, що містять кон'юговані
Зо катіонні ліпіди, проявляють нижчу токсичність і забезпечують ефективнішу трансфекцію, ніж композиції, які містять ООТМА. Інші комерційно доступні продукти на основі катіонних ліпідів включають ОМА ЇІЕ та ОМКІБЕ-НР (місаї!І, Ла-Хойя, Каліфорнія), а також ІіроїГесіатіпе (ОБРА) (іїе ТесПппоіоду, Іпс., Гейтерсберг, Меріленд). Інші катіонні ліпіди, придатні для доставки олігонуклеотидів, описані у МО 98/39359 і УМО 96/37194.
Ліпосомні склади особливо підходять для місцевого введення, при цьому ліпосоми мають деякі переваги порівняно з іншими складами. Такі переваги включають зменшені побічні ефекти, пов'язані з високою системною абсорбцією лікарського засобу, що вводиться, підвищене накопичення лікарського засобу, що вводиться, в необхідній мішені та можливість введення засобу на основі ІЕМА у шкіру. У деяких варіантах здійснення ліпосоми застосовують для доставки засобу на основі ІКМА до епідермальних клітин, а також для підвищення проникнення засобу на основі ІЕМА в дермальні тканини, наприклад в шкіру. Наприклад, ліпосоми можна вводити місцево. Була описана місцева доставка лікарських засобів, складених у вигляді ліпосом, у шкіру (див., наприклад, Уеіпег еї аї., еї аї., Уоигпаї ої Огид Тагодеїіпо, 1992, мої. 2, 405- 410 ї ди Ріез5і5 еї аї., Апіїміга! Везєагспи, 18, 1992, 259-265; Маппіпо, В. 9. апа Гоша-Родетйе, 5.,
Віоїеснпіднез 6:682-690, 1988; Напі, Т. єї ам. Сепе 56:267-276. 1987; Місоїацй, С. єї аІ. Мей. Еп2. 149:157-176, 1987; Змнацйбріпдег, А. М. апа Рарападіорошіов, О. Мей. Еп2. 101:512-527, 1983;
Мапа, С. У. апа Ниапа, Г.., Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 84:7851-7855, 1987).
Також досліджували неіїонні ліпосомні системи з метою визначення їх придатності для доставки лікарських засобів у шкіру, зокрема системи, які містять неїонну поверхнево-активну речовину і холестерин. Неїонні ліпосомні склади, що містять Момазоте (гліцерилдилаурат/холестерин/поліоксиетилен-10-стеариловий етер) і Момазоте ІЇ (гліцерилдистеарат/холестерин/поліоксиетилен-10-стеариловий етер), застосовували для доставки засобу в шар дерми шкіри мишей. Такі склади із засобом на основі ІЇБМА є застосовними для лікування дерматологічного порушення.
Ліпосоми, які включають іІКМА, можуть мати високу здатність до деформації. Така здатність до деформації може дозволити ліпосомам проникати через пору, яка менше середнього радіуса ліпосоми. Наприклад, трансферосоми є типом ліпосом, здатних до деформації. Трансферосоми можна одержувати шляхом додавання до стандартної ліпосомної композиції поверхневих суміжних активаторів, зазвичай поверхнево-активних речовин. Трансферосоми, які містять засіб 60 на основі ІЕМА, можна доставляти, наприклад, підшкірно шляхом ін'єкції для доставки засобу на основі ІЕМА до кератиноцитів шкіри. Для того, щоб пройти через непошкоджену шкіру ссавця, ліпідні везикули повинні проникнути через ряд дрібних пір, діаметр кожної з яких становить менше 50 нм, під впливом відповідного трансдермального градієнта. Крім того, завдяки властивостям ліпідів, такі трансферосоми можуть бути такими, що оптимізуються самовільно (пристосовуються до форми пір, наприклад в шкірі), самовідновлюються, і часто можуть досягати своїх мішеней без розділення на фрагменти, і часто можуть бути самозавантажними.
Інші склади, придатні для реалізації даного винаходу, описані в публікації згідно з РСТ Мо
УМО 2008/042973, повний зміст якої включено в даний документ за допомогою посилання.
Трансферосоми являють собою ще один тип ліпосом і являють собою ліпідні агрегати з високою здатністю до деформації, вони є перспективними кандидатами як засоби доставки лікарських засобів. Трансферосоми можуть бути описані як ліпідні краплини, які мають настільки високу здатність до деформації, що вони легко можуть проникати крізь пори, менші, ніж краплини. Трансферосоми можуть пристосовуватись до навколишнього середовища, в якому їх використовують, наприклад, вони оптимізуються самовільно (пристосовуються до форми пір шкіри), відновлюються самовільно, часто досягають мішеней без розділення на фрагменти і часто можуть навантажуватися самовільно. Щоб одержати трансферосоми до стандартної ліпосомної композиції можна додавати поверхневі суміжні активатори, зазвичай поверхнево-активні речовини. Трансферосоми застосовували для доставки сироваткового альбуміну в шкіру. Як було показано, опосередкована трансферосомами доставка сироваткового альбуміну була настільки ефективною, як підшкірна ін'єкція розчину, що містить сироватковий альбумін.
Поверхнево-активні речовини знаходять широке застосування у складах, таких як емульсії (у тому числі мікроемульсії) та ліпосоми. Найбільш поширеним способом класифікації і ранжування властивостей багатьох різних типів поверхнево-активних речовин, як природних, так і синтетичних, є застосування гідроліпідного балансу (НІ В). Природа гідрофільної групи (також відомої як "голівка" забезпечує найбільш застосовний засіб для розподілу за категоріями різних поверхнево-активних речовин, які застосовуються в складах (Кіедег, у
Рпаптасешіса! Оозаде Еоптвх, Магсеї! ОеккКетг, Іпс., Мем мок, М.У., 1988, р. 285).
Якщо молекула поверхнево-активної речовини не іонізована, то її класифікують як неіонну
Зо поверхнево-активну речовину. Неїонні поверхнево-активні речовини знаходять широке застосування у фармацевтичних і косметичних продуктах, і їх можна застосовувати у широкому діапазоні значень рН. Зазвичай їх значення НІ В знаходяться в діапазоні від 2 до приблизно 18 залежно від їхньої структури. Неїонні поверхнево-активні речовини включають неїонні естери, такі як естери етиленгліколю, естери пропіленгліколю, естери гліцерилу, естери полігліцерилу, естери сорбітану, естери сахарози та етоксильовані естери. У цей клас включені також неїонні алканоламіди й етери, такі як етоксилати жирних спиртів, пропоксильовані спирти та етоксильовані/пропоксильовані блокспівполімери. Поліоксиетиленові поверхнево-активні речовини є найбільш поширеними представниками класу неіонних поверхнево-активних речовин.
Якщо молекула поверхнево-активної речовини несе негативний заряд у разі розчинення або диспергування у воді, то поверхнево-активну речовину класифікують як аніонну. Аніонні поверхнево-активні речовини включають карбоксилати, такі як омилювальні речовини, ациллактилати, ациламіди амінокислот, естери сірчаної кислоти, такі як алкілсульфати та етоксильовані алкілсульфати, сульфонати, такі як алкілбензолсульфонати, ацилізетіонати, ацилтаурати і сульфосукцинати, а також фосфати. Найбільш важливими представниками класу аніонних поверхнево-активних речовин є алкілсульфати та омилювальні речовини.
Якщо молекула поверхнево-активної речовини несе позитивний заряд у разі розчинення або диспергування у воді, то поверхнево-активну речовину класифікують як катіонну. Катіонні поверхнево-активні речовини включають четвертинні солі амонію й етоксильовані аміни.
Четвертинні солі амонію є найбільш застосовуваними представниками цього класу.
Якщо молекула поверхнево-активної речовини здатна нести як позитивний, так і негативний заряд, то поверхнево-активну речовину класифікують як амфотерну. Амфотерні поверхнево- активні речовини включають похідні акрилової кислоти, заміщені алкіламіди, М-алкілбетаїни та фосфатиди.
Було розглянуто застосування поверхнево-активних речовин у готових лікарських формах, складах та в емульсіях (Кіедег, у "Рпагтасешіса! бозаде Еоптв", Магсе! ОеккКег, Іпс., Мемж/ МогК,
М.У., 1988, р. 285).
ІЕМА для застосування у способах за даним винаходом може передбачатися також у вигляді міцелярних складів. "Міцели" в даному документі визначені як конкретний тип бо молекулярного ансамблю, в якому амфіпатичні молекули розташовані у вигляді сферичної структури, так що всі гідрофобні частини молекул спрямовані всередину, залишаючи гідрофільні частини в контакті з навколишньою водною фазою. Протилежне розташування спостерігається, якщо навколишнє середовище є гідрофобним.
Змішаний міцелярний склад, придатний для доставки через трансдермальні мембрани, може бути одержаний шляхом змішування водного розчину композиції з бікМА, Св-
Сггалкілсульфату лужного металу і сполук, що утворюють міцели. Ілюстративні сполуки, що утворюють міцели, включають лецитин, гіалуронову кислоту, фармацевтично прийнятні солі гіалуронової кислоти, гліколеву кислоту, молочну кислоту, екстракт ромашки, екстракт огірка, олеїнову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту, моноолеїн, моноолеати, монолаурати, олію огірочника, олію первоцвіту вечірнього, ментол, тригідроксиоксохоланіл-гліцин і його фармацевтично прийнятні солі, гліцерин, полігліцерин, лізин, полілізин, триолеїн, етери поліоксиетилену та їх аналоги, полідоканол-алкілові етери та їх аналоги, хенодезоксихолат, дезоксихолат і їх суміші. Сполуки, що утворюють міцели, можна додавати у той самий час або після додавання алкілсульфату лужного металу. Змішані міцели будуть формуватися практично у разі будь-якого типу змішування інгредієнтів, але для одержання міцел з меншим розміром потрібне інтенсивне перемішування.
В одному способі одержують першу міцелярну композицію, яка містить композицію з 5ікМА і щонайменше алкілсульфат лужного металу. Потім першу міцелярну композицію змішують щонайменше з трьома сполуками, що утворюють міцели, з утворенням змішаної міцелярної композиції. В іншому способі міцелярну композицію одержують шляхом змішування композиції з 5ікМА, алкілсульфату лужного металу і щонайменше однієї зі сполук, що утворюють міцели, з подальшим додаванням решти сполук, що утворюють міцели, за інтенсивного перемішування.
Фенол та/або м-крезол можна додавати до змішаної міцелярної композиції для стабілізації складу і захисту від росту бактерій. Як альтернатива, фенол та/або м-крезол можна додавати з інгредієнтами, що утворюють міцели. ізотонічний засіб, такий як гліцерин, можна також додавати після утворення змішаної міцелярної композиції.
Для доставки міцелярного складу у вигляді розпилюваного розчину, склад можна помістити в аерозольний розпилювач і розпилювач зарядити газом-витискувачем. Газ-витискувач, який знаходиться під тиском, знаходиться в розпилювачі у рідкій формі. Співвідношення інгредієнтів
Зо коригують так, що водна фаза і фаза газу-витискувача стають єдиним цілим, тобто присутня одна фаза. Якщо присутні дві фази, то необхідно струснути розпилювач перед розпиленням порції вмісту, наприклад через дозувальний клапан. Розпилювана доза фармацевтичного засобу витісняється з дозувального клапана у вигляді дрібнодисперсного розпилюваного розчину.
Гази-витискувачі можуть включати хлорфторвуглеці, що містять водень, фторвуглеці, що містять водень, диметиловий етер і діетиловий етер. У певних варіантах здійснення можна застосовувати НЕА 134а (1,1,1,2-тетрафторетан).
Конкретні концентрації основних інгредієнтів можуть бути визначені за допомогою проведення відносно простих експериментів. Для абсорбції через ротову порожнину часто потрібно збільшити, наприклад щонайменше подвоїти або потроїти, дозу, призначену для ін'єкції або введення через шлунково-кишковий тракт.
В. Ліпідні частинки
ІЕМА, наприклад, 45КМА за даним винаходом, можуть бути повністю інкапсульованими в ліпідному складі, наприклад, в І МР або іншій частинці нуклеїнова кислота-ліпід.
Термін "МР", використовуваний у даному документі, відноситься до стабільної частинки нуклеїнова кислота-ліпід. Як правило, І МР містять катіонний ліпід, некатіонний ліпід і ліпід, який запобігає агрегації частинок (наприклад, кон'югат РЕС-ліпід). ЇМР вельми придатні для системних застосувань, оскільки вони характеризуються тривалим часом життя в кровообігу після внутрішньовенної (і.м.) ін'єкції і накопичуються в дистальних ділянках (наприклад, ділянках, фізично відокремлених від місця введення). МР включають "роРІ Р", яка включає інкапсульований комплекс засіб для конденсації-нуклетнова кислота, який викладено в публікації згідно РСТ Мо УМО 00/03683. Частинки за даним винаходом зазвичай мають середній діаметр від приблизно 50 нм до приблизно 150 нм, частіше від приблизно 60 нм до приблизно 130 нм, частіше від приблизно 70 нм до приблизно 110 нм, найбільш часто від приблизно 70 нм до приблизно 90 нм і є практично нетоксичними. Крім того, нуклеїнові кислоти, коли вони присутні в частинках нуклеїнова кислота-ліпід за даним винаходом, є стійкими у водному розчині до руйнування нуклеазою. Частинки нуклеїнова кислота-ліпід і спосіб їх одержання розкриті, наприклад, у патентах США МоМо 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публікації патенту США Мо 2010/0324120 і публікації згідно РСТ Мо МО 96/40964. бо В одному варіанті здійснення співвідношення ліпіду та лікарського засобу (співвідношення бо маса/маса) (наприклад, співвідношення ліпіду і а5РЕМА) буде знаходитися в діапазоні від приблизно 1:1 до приблизно 50:1, від приблизно 1:1 до приблизно 25:1, від приблизно 3:1 до приблизно 15:1, від приблизно 4:1 до приблизно 10:1, від приблизно 5:1 до приблизно 9:1 або від приблизно 6:1 до приблизно 9:1. Діапазони, проміжні щодо перелічених вище значень, також вважаються частиною даного винаходу.
Катіонний ліпід може являти собою, наприклад, хлорид М,М-діолеїл-М,М-диметиламонію (ВОБАС), бромід М,М-дистеарил-М,М-диметиламонію (ОБАВ), хлорид М-(-(2,3- діолеоїлокси)пропіл)-М,М,М-триметиламонію (ООТАР), хлорид /М-(1-(2,3-діолеїлокси)пропіл)-
М,М,М-триметиламонію (0ОТМА), М,М-диметил-2,3-діолеїлокси)упропіламін (ОООМА), 1,2- дилінолеїлокси-М,М-диметиламінопропан (ОСіпОМА), 1,2-диліноленілокси-М,МІ- диметиламінопропан (ОІ епОМА), 1,2-дилінолеїлкарбамоїлокси-3-диметиламінопропан (ОО іп-О-
БАР), 1,2-дилінолеїлокси-3-(диметиламіно)дацетоксипропан (Оііп-САС), 1,2-дилінолеїлокси-3- морфолінопропан (ОГіп-МА), 1,2-дилінолеоїл-З-диметиламінопропан (ОГіпрАР), 1,2- дилінолеїлтіо-3-диметиламінопропан (ОГіп-5-ОМА), 1-лінолеоїл-2-лінолеїлокси-3- диметиламінопропан (ОГіп-2-ОМАР), хлоридну сіль 1,2-дилінолеїлокси-3-триметиламінопропану (ОЦи-ТМА.СІ), хлоридну сіль 1,2-дилінолеоїл-З-триметиламінопропану (ОГіп-ТАР.СІ), 1,2- дилінолеїлокси-3-(М-метилпіперазино)пропан (ОЇ іп-МР/2) або 3-(М.М-дилінолеїламіно)-1,2- пропандіол (ОГіпАР), 3-(М,М-діолеїламіно)-1,2-пропандіол (ООАР), 1,2-дилінолеїлоксо-3-(2-М,М- диметиламіно)етоксипропан (ОГіп-ЕС-ОМА), /1,2-диліноленілокси-М,М-диметиламінопропан (ОЦиОМА), 2,2-дилінолеїл-4-диметиламінометилі-|1,3|-діоксолан (ОГ іп-К-ОМА) або його аналоги, (ЗаВ,55,бав5)-М,М-диметил-2,2-ді((97,122)-октадека-9,12-дієніл)тетрагідро-Зан- циклопента|ч|(1,3|діоксол-5-амін (АЇМ100), (627,92,282,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраєн- 19-іл-4-(диметиламіно)бутаноат (МС3), 1,1-(2-(4-(2-(2-(біс(2-гідроксидодецил)аміно)етил)(2- гідроксидодецил)аміно)етил)піперазин-1-іл)етилазандіїл)удидодекан-2-ол (Тесі 1) або їх суміш.
Катіонний ліпід може містити від приблизно 20 мол. 95 до приблизно 50 мол. 95 або приблизно 40 мол. 95 від загального вмісту ліпідів, присутніх в частинці.
В іншому варіанті здійснення для одержання наночастинок ліпід-зіКМА можна використовувати сполуку 2,2-дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|-діоксолан. Синтез 2,2- дилінолеїл-4-диметиламіноетил-(|1,3|-діоксолану описаний у попередній заявці на патент США
Мо 61/107998, поданій 23 жовтня 2008 р., яка включена в даний документ за допомогою посилання.
В одному варіанті здійснення частинка ліпід-зіКМА включає 4095 2,2-дилінолеїл-4- диметиламіноетил-|1,3|-діоксолану: 1095 ЮО5РС: 4095 холестерину; 1096 РЕС-С-БОМО (мольний відсоток) з розміром частинок 63,0220 нм і співвідношенням 5ікМА/ліпід, яке становить 0,027.
Ліпід, що піддається іонізації/некатіонний ліпід може являти собою аніонний ліпід або нейтральний ліпід, у тому числі без обмеження дистеароїлфосфатидилхолін (О5РС), діолеоїлфосфатидилхолін (ОРОС), дипальмітоїлфосфатидилхолін (ОРРО), діолеоїлфосфатидилгліцерин (СОР), дипальмітоїлфосфатидилгліцерин (ОРРС), діолеоїлфосфатидилетаноламін (ОРЕ), пальмітоїлолеоїлфосфатидилхолін (РОРОС), пальмітоїлолеоїлфосфатидилетаноламін (РОРЕ), діолеоїлфосфатидилетаноламін-4-(М- малеїмідометил)-циклогексан-1-карбоксилат (ОРЕ-таї), дипальмітоїлфосфатидилетаноламін (ОРРЕ), диміристоїлфосфоетаноламін (ОМРЕ), дистеароїлфосфатидилетаноламін (О5РЕ), 16-
О-монометил-РЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароїл-2-олеоїлфосфатидилетаноламін (ЗОРЕ), холестерин або їх суміш. Некатіонний ліпід може становити від приблизно 5 мол. 95 до приблизно 90 мол. 95, приблизно 10 мол. 95 або приблизно 58 мол. 95, якщо холестерин включений, від загального вмісту ліпідів, присутніх у частинці.
Кон'югований ліпід, який інгібує агрегацію частинок, може являти собою, наприклад, кон'югат поліетиленгліколь (РЕС)-ліпід, у тому числі без обмеження РЕС-діацилгліцерин (САС), РЕС- діалкілоксипропіл (БАА), РЕС-фосфоліпід, РЕС-церамід (Сег) або їх суміш. Кон'югат РЕС-ОАА може являти собою, наприклад, РЕС-дилаурилоксипропіл (Сіг), РЕС-диміристоїлоксипропіл (Сі), РЕа-дипальмітилоксипропіл (Сіє) або РЕС-дистеарилоксипропіл (Сів). Кон'югований ліпід, який запобігає агрегації частинок, може становити від 0 мол. 95 до приблизно 20 мол. 95 або приблизно 2 мол. 95 від загального вмісту ліпідів, присутніх у частинці.
У деяких варіантах здійснення частинка нуклеїнова кислота-ліпід додатково включає холестерин у кількості, наприклад, від приблизно 10 мол. 95 до приблизно 60 мол. 95 або приблизно 48 мол. 95 від загального вмісту ліпідів, присутніх у частинці.
В одному варіанті здійснення ліпідоїд МО98-4НСІ (МУ 1487) (див. заявку на патент США Мо 12/056230, подану 26 березня 2008 р., яка включена в даний документ за допомогою посилання), холестерин (Зідта-АїЇйгісй) і РЕС-церамід С16 (Амапії Роїаг Гіріає) можна бо застосовувати для одержання наночастинок ліпід-а5ЕМА (тобто частинок І МРО1). Маточні розчини кожного в етанолі можуть бути одержані наступним чином: МОУ98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, РЕс-церамід С16, 100 мг/мл. Маточні розчини МОО8, холестерину й РЕС- цераміду С1б6 можна потім об'єднувати, наприклад, у молярному співвідношенні 42:48:10.
Об'єднаний ліпідний розчин можна змішувати з водним розчином а5КМА (наприклад, в ацетаті натрію, рН 5) так, щоб кінцева концентрація етанолу становила приблизно 35-4595, а кінцева концентрація ацетату натрію становила приблизно 100-300 мМ. Наночастинки ліпід-458МА зазвичай утворюються самовільно під час змішування. Залежно від необхідного розподілу частинок за розміром, одержану суміш наночастинок можна продавлювати через полікарбонатну мембрану (наприклад, з відсіканням за розміром 100 нм) із застосуванням, наприклад, екструдера з термоциліндром, такого як Гірех Ехігидег (Могіпегп Гіріав, Іпс). У деяких випадках стадію екструзії можна пропустити. Видалення етанолу й одночасна заміна буфера можуть бути здійснені, наприклад, за допомогою діалізу або тангенціальної потокової фільтрації. Буфер можна замінити, наприклад, фосфатно-сольовим буферним розчином (РВ5Б) зі значенням рН, яке становить приблизно 7, наприклад рнН, яке становить приблизно 6,9, рн, яке становить приблизно 7,0, рН, яке становить приблизно 7,1, рН, яке становить приблизно 7,2, рН, яке становить приблизно 7,3 або рнН, яке становить приблизно 7,4.
Ізомер І МО98 о Ноти рови. Що М. тити пн: їх о Доти нижча Іза МмеЕ 1
Формула 1
Склади І МРО1 описані, наприклад, у публікації міжнародної заявки Мо М/О 2008/042973, яка таким чином включена за допомогою посилання.
Додаткові ілюстративні склади на основі ліпіду-Я05КМА описані в таблиці 1.
Таблиця А
Ліпід, що піддається іонізації/катіонний Катіонний ліпід/некатіонний ' ліпід ліпід/холестерин/кон'югат РЕС-ліпід
Співвідношення ліпід : ріеМА 1,2-Диліноленілокси-М,М- РіпоОМА/ЮРРС/холестерин/РЕО-СОМА
ЗМАЇ Р-ТІ| . з. (57,1/7,1/34,4/1,4) диметиламінопропан (ОГіпоОМА) Ліпід: зіВМА «71 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- Ххто/оррес/холестерин/РЕС-сОМА 2-ХТтО : 57,1/7,1/34,4/1,4 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА -- 7.1 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- хто/овро/холестерин/РЕС-ОМО
І МРОБ : 57,5/7,5/31,5/3,5 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА -- 61 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- хто/овро/холестерин/РЕС-ОМО
І МРОб : 57,5/7,5/31,5/3,5 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА «1111 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- Хтс/озРС/холестерин/РЕС-ОМО
ГМРО7 : 60/7,5/31/1,5 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА -- 61 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- Хтс/озРС/холестерин/РЕС-ОМО
І МРОВ : 60/7,5/31/1,5 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА «1111 2,2-Дилінолеїл-4-диметиламіноетил-|1,3|- Хто/озрС/холестерин/РЕС-ОМО
І МРОЗ : 50/10/38,5/1,5 діоксолан (ХТО) Ліпід : віВМА 10.1 (ЗаН,55,бав)-М,М-диметил-2,2- АЇ М100/О5РС/холестерин/РЕС-ОМО ди(92,1272)-октадека-9,12-
ІГМРІО щодо . 50/10/38,5/1,5 дієніл)тетрагідро-Зан- Ліпід : вІВМА 101 циклопента|Ц9|(1,3|діоксол-5-амін (АСМ100) Я Я
Таблиця А (продовження)
Ліпід, що піддається іонізації/катіонний «. Катіонний ліпід/некатіонний я. ' ліпід ліпід/ухолестерин/кон'югат РЕОС-ліпід
Співвідношення ліпід : ріеМА (62,92,287,317)-гептатриаконта-6,9,28,31- | МО-3/)О5РС/холестерин/РЕС-ОМа
І МРІ11 тетраєн-19-іл-4-(диметиламіно)бутаноат |50/10/38,5/1,5
МОЗ Ліпід : зівМА 10:1 1 (еаче-(еБісо- Тесп С1/О5РС/холестерин/РЕС-ОМО
Мрі2 | ідроксидодецил)аміно)етил)(2- 5О/10/38,5/1,5 гідроксидодецил)аміно)етил)піперазин-1- Ліпід - ві й й щі іпід : БІЕМА 10:1 іл)етилазандіїл)удидодекан-2-ол (Тесп С11
ХТС/5РС/ХхОЛест./РЕС-ОМО
ІМРІЗ |ХТО 50/10/38,5/1,5
Ліпід : БвіеМА: 33:1
МОЗ3/О5РС/холест/РЕС-ОМОа
ІМРІ4 |МОЗ 40/15/40/5
Ліпід : 5іеМА: 11:1
МОЗ3/О5РС/холест/РЕС-ЮО5С/ЗамАс-РЕС- роа
МРТ МОЗ 5О/10/35/4,5/0,5
Ліпід : 5іеМА: 11:1
МОЗ3/О5РС/холест/РЕС-ОМОа
ІМРІбЄ |ІМОЗ 50/10/38,5/1,5
Ліпід : зіеМА: 7:1
МОЗ3/О5РС/холест./РЕС-ЮОБа
ІМРІ7 |МОЗ 50/10/38,5/1,5
Ліпід : 5віеМА: 10:1 кер юн
ІМРІ8 |ІМОЗ 50/10/38,5/1,5
Ліпід : звіеМА: 12:1
МОЗ3/О5РС/холест/РЕС-ОМОа
ІМРІЗ9 ІМОЗ 50/10/35/5
Ліпід : зіеМА: 8:1
МОЗ3/О5РС/холест./РЕС-ОРОа
ІМР2О ІМОЗ 50/10/38,5/1,5
Ліпід : 5віеМА: 10:1
С12-200/05РС/холест./РЕС-ЮО5О
І МР21 С12-200 50/10/38,5/1,5
Ліпід : зіеМА: 7:1
ХТС/5РС/хОЛест./РЕС-ЮО5О
ІМР22 |ХТО 50/10/38,5/1,5
Ліпід : 5віеМА: 10:1
О5РС: дистеароїлфосфатидилухолін;
ОРРС: дипальмітоїлфосфатидилухолін;
РЕС-ЮМа: РЕаС-дидиміристоїлгліцерин (С14-РЕС або РЕС-С14) (РЕС з сер. мол. масою 2000);
РЕС-ЮО5а: РЕС-дистирилгліцерин (С18-РЕС або РЕО-С18) (РЕС з сер. мол. масою 2000);
РЕС-СОМА: РЕС-карбамоїл-1 2-диміристоїлоксипропіламін (РЕС з сер. мол. масою 2000)
Склади, що містять ЗМАГР (1,2-диліноленілокси-М,М-диметиламінопропан (ОГіпОМА)), описані в міжнародній публікації Ме УУО2009/127060, поданій 15 квітня 2009 р., яка включена таким чином за допомогою посилання.
Склади, що містять ХТС, описані в публікації згідно з РСТ Мо М/О 2010/088537, повний зміст якої таким чином включено в даний документ за допомогою посилання.
Склади, що містять МОЗ, описані, наприклад, у публікації США Мо 2010/0324120, поданій 10 червня 2010 р., повний зміст якої таким чином включено за допомогою посилання.
Склади, що містять АЇ МУ-100, описані в публікації згідно з РСТ Мо М/О 2010/054406, повний зміст якої таким чином включено в даний документ за допомогою посилання.
Склади, що містять С12-200, описані в публікації згідно з РСТ Мо УМО 2010/129709, повний зміст якої таким чином включено в даний документ за допомогою посилання.
Композиції та склади для перорального введення включають порошки або гранули, мікрочастинки, наночастинки, суспензії або розчини у воді або неводних середовищах, капсули, желатинові капсули, пакетики з порошком для приготування розчину, таблетки або мінітаблетки.
Потрібними можуть бути загусники, ароматизатори, розчинники, емульгатори, диспергувальні засоби або зв'язувальні речовини. У деяких варіантах здійснення склади для перорального введення є такими, в яких 85ЕМА, описані в даному винаході, вводять у поєднанні з однією або декількома речовинами, що сприяють проникненню, поверхнево-активними речовинами і хелаторами. Придатні поверхнево-активні речовини включають жирні кислоти та/або їх естери або солі, жовчні кислоти та/або їх солі. Придатні жовчні кислоти/солі жовчних кислот включають хенодезоксихолеву кислоту (СОСА) й урсодезоксихенодезоксихолеву кислоту (ШОСА), холеву кислоту, дегідрохолеву кислоту, дезоксихолеву кислоту, глюкохолеву кислоту, глікохолеву кислоту, глікодезоксихолеву кислоту, таурохолеву кислоту, тауродезоксихолеву кислоту, тауро- 24,25-дигідро-фузидат натрію та глікодигідрофузидат натрію. Придатні жирні кислоти включають арахідонову кислоту, ундеканову кислоту, олеїнову кислоту, лауринову кислоту, каприлову кислоту, капринову кислоту, міристинову кислоту, пальмітинову кислоту, стеаринову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеїн, дилаурин, гліцерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнітин, ацилхолін або моногліцерид, дигліцерид або їх фармацевтично прийнятну сіль (наприклад, натрієву). У деяких варіантах здійснення використовують комбінації речовин, що сприяють проникненню, наприклад, жирні кислоти/солі жирних кислот у комбінації з жовчними кислотами/солями жовчних кислот. Однією ілюстративною комбінацією є натрієва сіль лауринової кислоти, капринової кислоти й ШЮСА. Додаткові речовини, що сприяють проникненню, включають поліоксиетилен-9У-лауриловий етер, поліоксиетилен-20-цетиловий етер. Описані в даному винаході ОБКМА можуть бути доставлені перорально, у формі гранул, у тому числі частинок, висушених розпиленням, або в комплексі з утворенням мікро- або наночастинок.
Комплексоутворювачі для аб5хКМА включають поліамінокислоти; поліїміни; поліакрилати; поліалкілакрилати, поліоксетани, поліалкілціаноакрилати; катіонізовані види желатину, альбуміни, види крохмалю, акрилати, поліетиленгліколі (РЕС) і види крохмалю; поліалкілціаноакрилати; ОЕАЕ-похідні поліїміни, полулани, види целюлози і види крохмалю.
Придатні комплексоутворювачі включають хітозан, М-триметилхітозан, полі-і! -лізин, полігістидин, поліорнітин, полісперміни, протамін, полівінілпіридин, політіодіетиламінометилетилен (РТОАБЕ), поліаміностирол (наприклад, п-аміно), полі(метилціаноакрилат), полі(етилціаноакрилат), полі(бутилціаноакрилат), полі(ізобутилціаноакрилат), полі(ізогексилціаноакрилат), РЕАЕ-метакрилат, ОЕАЕ- гексилакрилат, ОЕАЕ-акриламід, ОЕАЕ-альбумін і ОБАЕ-декстран, поліметилакрилат, полігексилакрилат, полі(О,Ї-молочну кислоту), співполімер 0, -молочної та гліколевої кислот (РІ СА), альгінат і поліетиленгліколь (РЕС). Склади для а5КМА для перорального введення та їх одержання докладно описані в патенті США Мо 6887906, публікації патенту США Мо 20030027780 і патенті США Мо 6747014, кожний із яких включений у даний документ за допомогою посилання.
Композиції та склади для парентерального, інтрапаренхіматозного (в головний мозок), підоболонкового, інтравентрикулярного або внутрішньопечінкового введення можуть включати стерильні водні розчини, які також можуть містити буфери, розріджувачі й інші придатні добавки, такі як без обмеження речовини, що сприяють проникненню, сполуки-носії та інші фармацевтично прийнятні носії або наповнювачі.
Фармацевтичні композиції за даним винаходом включають без обмеження розчини, емульсії та склади, що містять ліпосоми. Такі композиції можуть бути одержані з ряду компонентів, які включають без обмеження попередньо одержані рідини, тверді речовини, що емульгуються самовільно, і напівтверді речовини, що емульгуються самовільно. Особливо переважними є склади, які націлюються на печінку під час лікування захворювань печінки, таких як гепатокарцинома.
Фармацевтичні склади за даним винаходом, які з метою зручності можуть знаходитися у вигляді одиничної лікарської форми, можна одержувати згідно з традиційними методиками, добре відомими у фармацевтичній промисловості. Такі методики включають стадію приведення активних інгредієнтів у взаємодію з фармацевтичним(фармацевтичними) носієм(носіями) або наповнювачем(наповнювачами). Як правило, склади одержують шляхом рівномірного і бо ретельного приведення активних інгредієнтів у взаємодію з рідкими носіями або мілкоподрібненими твердими носіями, або й тими, й іншими, а потім, за необхідності, надання продукту форми.
Композиції за даним винаходом можуть бути складені в будь-яку з багатьох можливих лікарських форм, таку як без обмеження таблетки, капсули, желатинові капсули, рідкі сиропи, пластичні гелі, супозиторії та клізми. Композиції за даним винаходом також можуть бути складені у вигляді суспензій у водних, неводних або змішаних середовищах. Водні суспензії додатково можуть містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, у тому числі, наприклад, карбоксиметилцелюлозу натрію, сорбіт та/або декстран. Суспензія може також містити стабілізатори.
С. Додаткові склади і. Емульсії
Композиції за даним винаходом можуть бути одержані і складені у вигляді емульсій.
Емульсії, як правило, є гетерогенними системами з однієї рідини, диспергованої в іншій у формі краплин, діаметр яких зазвичай перевищує 0,1 мкм (див., наприклад, Апзеї!5 РПагтасешіісаї розаде Роптз апа Огид Оеєїїмегу Зувієтв, АПеп, ГМ., Роромісп Ма.., апа Апзеї! НС., 2004, Іірріпсой
УМіШате 8 УМіИКіп5 (8Ій ейа.), Мем МогКк, МУ; Ід50п, у Рпаптасешіса! бозаде Еопт5, Гіерегтап,
Кієдег апа ВапкКег (Ед5.), 1988, Магсе! ОекКег, Іпс., Мем МогК, М.У., моїште 1, р. 199; Козоїї, у
Рпаптасешіса! Розаде ЕРоптх5, Перептап, Нієдег апа ВапКег (Едз.), 1988, Магсе! ОекКкКег, Іпс.,
Мем МогК, М.У., Моїште 1, р. 245; ВіосК, у Рпагтасешіса! Созаде Еогіт5, Іерептап, Кіедег апа
ВапКег (Еа5.), 1988, Магсе! ОекККег, Іпс., Мем МогКк, М.М., моїште 2, р. 335; Нідиспі еї аї., у
Ветіпдіоп'є5 Ріагтасешііса! Зсіеєпсе5, Маск Рибіїзпіпд Со., Еавзіоп, Ра., 1985, р. 301). Емульсії часто являють собою двофазні системи, що містять дві незмішувані рідкі фази, ретельно перемішані та дисперговані одна з одною. Як правило, емульсії можуть являти собою емульсії типу "вода в маслі" (м/о) або "масло у воді" (0/м). Якщо водна фаза є дрібнорозпиленою в загальному об'ємі масляної фази і диспергованою у вигляді найдрібніших краплин у ньому, то одержану композицію називають емульсією типу "вода в маслі" (м/0). Як альтернатива, якщо масляна фаза є дрібнорозпиленою в загальному об'ємі водної фази і диспергованою у вигляді найдрібніших краплин у ньому, то одержану композицію називають емульсією типу "масло у воді" (0/4). Емульсії можуть містити додаткові компоненти додатково до диспергованих фаз і
Зо активний лікарський засіб, який може бути присутнім у вигляді розчину або у водній фазі, або в олійній фазі, або сам по собі як окрема фаза. За необхідності в емульсіях також можуть бути присутні фармацевтичні наповнювачі, такі як емульгатори, стабілізатори, барвники й антиоксиданти. Фармацевтичні емульсії також можуть являти собою численні емульсії, які складаються з більше ніж двох фаз, як, наприклад, у випадку емульсій типу "масло-у-воді-у- маслі" (о/лм/0о) та "вода-в-маслі-у-воді" (м/0/Лм). Ці складні склади часто забезпечують певні переваги, які не забезпечують прості двокомпонентні емульсії. Численні емульсії, в яких окремі масляні краплини емульсії типу олу включають маленькі водні краплини, складають емульсію типу м/о/Лм. Аналогічно цьому, система масляних краплин, що міститься в краплинах води, стабілізованих в масляній диспергувальній фазі, забезпечує емульсію типу о/Лм/о.
Емульсії характеризуються малою термодинамічною стійкістю або її відсутністю. Часто диспергована або дисперсна фаза емульсії добре диспергована в дисперсійній або диспергувальній фазі, і підтримується в такій формі за допомогою емульгаторів або завдяки в'язкості складу. Будь-яка фаза емульсії може бути напівтвердою або твердою, як і у випадку мазевих основ і кремів, подібних до емульсії. Інші способи стабілізації емульсій охоплюють застосування емульгаторів, які можуть бути включені в будь-яку фазу емульсії. Емульгатори можна в цілому розділити на чотири категорії: синтетичні поверхнево-активні речовини, емульгатори, що зустрічаються в природі, абсорбційні основи та високодисперсні тверді речовини (див., наприклад, Апзе!5 РПагтасешісаиІ бозаде Богт5 апа Огид Оеїїмегу Зузіетв,
АПеп, ГМ., Роромісп Ма., апа Апзеї НО., 2004, І Ірріпсой МПШіатв в М/ЇКіпв (8Ій єд.), Мем МоїКк, МУ;
Іазоп, у Рпагтасецшііса! Созаде Еогітв, І іерептап, Кіедег апа ВапкКег (Еаз5.), 1988, Магсе! Оеккег,
Іпс., Мем/ МогК, М.У., моїите 1, р. 199).
Синтетичні поверхнево-активні речовини, також відомі як сурфактанти, знайшли широке застосування у складанні емульсій і були розглянуті в літературі (див., наприклад, Апзеї5
Ріпаптасецшііса! бозаде Бопт5 апа Огпа Оєїїмегу Зувівтв, АПеп, І М., Роромісн Ма.., апа Апзеї НС., 2004, ІПірріпсой УМіПатв»в 8 УМіКіп5 (8ІП ей.), Мем Могк, МУ; Кіедег, у Рпаппасешіса! бозаде Еогтв,
Пебретптап, Нієдег апа ВапкКег (Ед5.), 1988, Магсе! ОекККег, Іпс., Мем/ МогїКк, М.У., моїште 1, р. 285;
Іазоп, у Рпаптасешіса! Созаде ЕРогтв5, Гіерегтап, Кіедег апа ВапкКег (Ед5.), Магсе! Оеккег, Іпс.,
Мем ХогК, М.У., 1988, моЇште 1, р. 199). Поверхнево-активні речовини зазвичай є амфіфільними і містять гідрофільну та гідрофобну частини. Співвідношення гідрофільної та гідрофобної бо природи поверхнево-активної речовини називають гідрофільно-ліпофільним балансом (НІ В), і воно є цінним інструментом у розподілі на категорії і виборі поверхнево-активних речовин під час одержання складів. Поверхнево-активні речовини можна розділити на різні класи, виходячи з природи гідрофільної групи: неїіоногенні, аніонні, катіонні та амфотерні (див., наприклад,
АпзеЇ!5 Рпаптасешіса! бозаде Ропт5 апа Огид ОеєїЇїмегу Зузієтв, АПеп, І М., Роромісн Ма., апа
Апзеї! НС., 2004, І ірріпсоїй УМіШіатве 8 УМіКіп5 (8Іп ейд.), Мем/ МогкК, МУ Кіедег, у Рпагтасеціїсаї! розаде ГРоптв, ІІерептап, Нієдег апа ВапкКег (Еса5.), 1988, Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем Мої, М.У., хоїште 1, р. 285).
Емульгатори, що зустрічаються в природі, застосовувані в емульсійних складах, включають ланолін, бджолиний віск, фосфатиди, лецитин і гуміарабік. Абсорбційні основи, такі як безводний ланолін і гідрофільний вазелін, характеризуються гідрофільними властивостями, так що вони можуть вбирати воду з утворенням емульсій типу м//о, із зберіганням їх напівтвердої консистенції. Мілкоподрібнені тверді речовини також застосовували як придатні емульгатори, зокрема в комбінації з поверхнево-активними речовинами та у в'язких препаратах. Вони включають полярні неорганічні тверді речовини, такі як гідроксиди важких металів, глини, що не розбухають, такі як бентоніт, атапульгіт, гекторит, каолін, монтморилоніт, колоїдний алюмосилікат і колоїдний алюмосилікат магнію, пігменти і неполярні тверді речовини, такі як вуглець або тристеарат гліцерилу.
Велику різноманітність неемульгувальних матеріалів також включають в емульсійні склади, і вони покращують властивості емульсій. Вони включають жири, масла, воски, жирні кислоти, жирні спирти, естери жирних кислот, зволожувачі, гідрофільні колоїди, консерванти й антиоксиданти (ВіосК, у Рпаптасешіса! Созаде Еопт5, Гіерегтап, Кіедег і ВапКег (Еа5.), 1988,
Магсе!ї ОекКкКег, Іпс., Мем/ МоїК, М.М., моїште 1, р. 335; Іа50п, у Рпаптасешіса! бозаде Еоптв,
ШОебрегтап, Кієдег і Вапкег (Еа5.), 1988, Магсеї! ОеккКег, Іпс., Мем МогК, М.У., моїште 1, р. 199).
Гідрофільні колоїди або гідроколоїди включають смоли, що зустрічаються в природі, і синтетичні полімери, такі як полісахариди (наприклад, гуміарабік, агар, альгінову кислоту, карагенан, гуарову камедь, камедь караї та трагакант), похідні целюлози (наприклад, карбоксиметилцелюлозу та карбоксипропілцюелюлозу) і синтетичні полімери (наприклад, карбомери, етери целюлози і карбоксивінілові полімери). Вони диспергуються або набухають у воді з утворенням колоїдних розчинів, які стабілізують емульсії шляхом утворення міцних
Зо міжфазних плівок навколо краплин диспергованої фази, а також шляхом підвищення в'язкості дисперсійної фази.
Оскільки емульсії часто містять деяку кількість інгредієнтів, таких як вуглеводи, білки, стероли та фосфатиди, які можуть легко сприяти зростанню мікроорганізмів, то такі склади часто містять консерванти. Широко застосовувані консерванти, що включають в емульсійні склади, включають метилпарабен, пропілпарабен, четвертинні солі амонію, бензалконію хлорид, естери п-гідроксибензойної кислоти і борну кислоту. Антиоксиданти також зазвичай додають в емульсійні склади для запобігання псуванню складу. Застосовувані антиоксиданти можуть являти собою пастки вільних радикалів, такі як токофероли, алкілгалати, бутильований гідроксианізол, бутильований гідрокситолуол, або відновники, такі як аскорбінова кислота і натрію метабісульфіт, а також синергісти антиоксидантів, такі як лимонна кислота, винна кислота та лецитин.
Застосування емульсійних складів за допомогою дерматологічного, перорального та парентерального шляхів і способи їх виробництва були розглянуті в літературі (див., наприклад,
АпзеЇ!5 Рпаптасешіса! бозаде Ропт5 апа Огпа Оеєїїмегу Зувієтв, АПеп, ГМ., Роромісн Ма., апа
Апзе! НС., 2004, І Ірріпсой ММШат»е 8 УМіКіп5 (81п ейа.), Мем МогКк, МУ; Іазоп, у Рпаппасешісаї! розаде ГРоптв, Іерептап, Нієдег апа ВапкКег (Еса5.), 1988, Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем/ МоїК, М.М., моїште 1, р. 199). Емульсійні склади для пероральної доставки дуже широко застосовують з огляду на зручність складання, а також ефективність з погляду абсорбції та біодоступності (див., наприклад, Апзе!5 Рпаптасешіса! бозаде Богт5 апа Огид Оеїїмегу Зузіетв, АїПеп, ГМ.,
Роромісп МО., апа Апзеї НС., 2004, І ірріпсой УМіПШате 8 УМІКіп5 (8Ій ед.), Мем! МогК, МУ; Козоїї, у
Рпаптасешіса! Розаде ЕРоптх5, Перептап, Нієдег апа ВапкКег (Еаз.), 1988, Магсе! ОеккКег, Іпс.,
Мем МогК, М.У., моїште 1, р. 245; Іазоп, у Рпагтасешіса! Созаде Еоптв, ІПерептап, Нієдег апа
Вапкег (Еа5.), 1988, Магсе! ЮекКкКег, Іпс., Мем/ МогК, М.У., моїште 1, р. 199). Проносні засоби на основі мінеральних масел, жиророзчинні вітаміни і поживні препарати з високим вмістом жиру знаходяться серед матеріалів, які зазвичай вводять перорально у вигляді емульсій типу о/Ли. іі. Мікроемульсії
В одному варіанті здійснення даного винаходу композиції на основі ІКМА та нуклеїнових кислот складені у вигляді мікроемульсій. Мікроемульсія може бути визначена як система з води, масла й амфіфільної речовини, яка є єдиним оптично ізотропним і термодинамічно стабільним бо рідким розчином (див., наприклад, Апзе!5 РПаптасешіса! Бозаде Ропт5 апа Огид Оеїїмегу
Зувівтв, АПеп, І М., Роромісп Ма., апа Апзеї! НС., 2004, І Ірріпсой ММ ППатв 8 УМіЇКіп5 (ВІЙ ед.), Мему чок, МУ; Козоїй, у Рпапгтасешіса! бозаде Еогт5, Перептап, Кіедег апа ВапКег (Едз5.), 1988,
Магсе! ОеккКег, Іпс., Мем/ МогКк, М.У., моїште 1, р. 245). Зазвичай мікроемульсії являють собою системи, які одержують спочатку шляхом диспергування масла у водному розчині поверхнево- активної речовини, а потім додавання достатньої кількості четвертого компонента, як правило, спирту з середньою довжиною ланцюга з одержанням прозорої системи. Таким чином, мікроемульсії також були описані як термодинамічно стійкі, ізотропно чисті дисперсії двох незмішуваних рідин, які стабілізуються міжфазними плівками поверхнево-активних молекул (Гешипод і 5пай, у СопігоПей Кеїеазе ої Огид5: Роїутег5 апа Адодгедаїе Зубіет5, Козоїй, М., Еа., 1989, МСН РибіїзНет5, Мем МогкК, раде5 185-215). Мікроемульсії зазвичай одержують шляхом об'єднання від трьох до п'яти компонентів, які включають олію, воду, поверхнево-активну речовину, вторинну поверхнево-активну речовину й електроліт. Той факт, чи є мікроемульсія емульсією типу "вода в маслі" (м//о) або типу "масло в воді" (0о/м), залежить від властивостей застосовуваного масла та поверхнево-активної речовини, а також від структури й геометричної упаковки полярних голівок і вуглеводневих хвостів молекул поверхнево-активної речовини (Зспой, у Кетіпдіоп'є Ріпаппасеціїса! Зсіепсе5, Маск Рибіїєпіпд Со., Еазіюоп, Ра., 1985, р. 271).
Активно досліджувався феноменологічний підхід із використанням фазових діаграм, і з його допомогою фахівці в даній галузі одержали вичерпні дані про те, як складати мікроемульсії (див., наприклад, Апзе!5 Рпаптасешіса! бозаде Богт5 апа Огид Оеїїмегу Зузіетв5, Аїйеп, ГМ.,
Роромісп МО., апа Апзеї НС., 2004, І ірріпсой УМіПШате 8 УМІКіп5 (8Ій ед.), Мем! МогК, МУ; Козоїї, у
Рпаптасешіса! Розаде ЕРоптх5, Перептап, Нієдег апа ВапКег (Едз.), 1988, Магсе! ОекККег, Іпс.,
Мем МогК, М.У., моїште 1, р. 245; ВіосК, у Рпаптпасешіса! бозаде Еогтв, І іерегтап, Кіедег апа
ВапКег (Еаз.), 1988, Магсе! ЮОекККег, Іпс., Мем/ Ммогк, М.М., моїште 1, р. 335). Порівняно з традиційними емульсіями мікроемульсії мають перевагу солюбілізації водонерозчинних лікарських засобів у складі термодинамічно стійких краплин, що утворюються самовільно.
Поверхнево-активні речовини, застосовувані для одержання мікроемульсій, включають без обмеження іонні поверхнево-активні речовини, неіонні поверхнево-активні речовини, Вгії 96, поліоксиетиленолеїлові етери, естери жирних кислот і полігліцерину, тетрагліцерину монолаурат (МІ 310), тетрагліцерину моноолеат (МОЗ10), гексагліцерину моноолеат (РОЗ10),
Зо гексагліцерину пентаолеат (РОБО0), декагліцерину монокапрат (МСА?750), декагліцерину моноолеат (МО750), декагліцерину секвіолеат (50750), декагліцерину декаолеат (0АО750) окремо або в комбінації зі вторинними поверхнево-активними речовинами. Вторинна поверхнево-активна речовина, що зазвичай є спиртом з коротким ланцюгом, таким як етанол, 1- пропанол і 1-бутанол, слугує для збільшення міжфазної текучості шляхом проникнення у плівку з поверхнево-активної речовини і відповідно створення невпорядкованої плівки внаслідок пустого простору, що утворився серед молекул поверхнево-активної речовини. Однак мікроемульсії можуть бути одержані без застосування вторинних поверхнево-активних речовин, і з рівня техніки відомі системи мікроемульсій без спирту, які емульгуються самовільно. Як правило, водною фазою може бути без обмеження вода, водний розчин лікарського засобу, гліцерин, РЕСЗ300, РЕС400, полігліцерини, пропіленгліколі та похідні етиленгліколю. Масляна фаза може включати без обмеження матеріали, такі як Сарієх 300, Сарієх 355, Сарти! МОМ, естери жирних кислот, середньоланцюгові (С8-С12)моно-, ди- і тригліцериди, поліоксиетильовані естери жирних кислот і гліцерину, жирні спирти, полігліколізовані гліцериди, насичені полігліколізовані С8-С1Огліцериди, рослинні олії та силіконове масло.
Мікроемульсії становлять особливий інтерес з точки зору розчинності лікарського засобу і підвищеної абсорбції лікарських засобів. Ліпідні мікроемульсії (як типу о/Лми, так і типу м/о) були запропоновані для підвищення біодоступності лікарських засобів, у тому числі пептидів, у випадку перорального введення (див., наприклад, патенти США МоМо 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Сопвіапіїіпідез єї а)І., Рнаппасецііса! Везєагсі, 1994, 11, 1385-1390; ВіїзеНеї,
Меїйй. Ріпа. Ехр. Сііп. Рнаптасої., 1993, 13, 205). Мікроемульсії забезпечують переваги у вигляді поліпшеної солюбілізації лікарського засобу, захисту лікарського засобу від ферментативного гідролізу, можливого посилення абсорбції лікарського засобу завдяки індукованим поверхнево- активною речовиною змінам текучості та проникності мембран, зручності одержання, зручності перорального введення порівняно з твердими лікарськими формами, поліпшеної клінічної активності та зменшеної токсичності (див., наприклад, патенти США МоМо 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Сопвіапііпіде5 єї а!., Рнаптасеціїса! Везєагсі, 1994, 11, 1385; Но еї аї.,».
Ріапт. з5сі., 1996, 85, 138-143). Часто мікроемульсії можуть утворюватися самовільно, коли їхні компоненти об'єднують за температури навколишнього середовища. Це може бути особливо переважним, коли складають термолабільні лікарські засоби, пептиди або ікМА. Мікроемульсії 60 також були ефективними у разі трансдермальної доставки активних компонентів як у косметичних, так і фармацевтичних шляхах застосування. Передбачається, що композиції та склади мікроемульсій за даним винаходом будуть сприяти підвищеній системній абсорбції ІЕМА та нуклеїнових кислот зі шлунково-кишкового тракту, а також покращувати локальне клітинне захоплення іІКМА та нуклеїнових кислот.
Мікроемульсії за даним винаходом також можуть містити додаткові компоненти і добавки, такі як сорбітанмоностеарат (сгій 3), Габгазхої і речовини, що сприяють проникненню, для покращення властивостей складу і для підвищення абсорбції ІКМА та нуклеїнових кислот за даним винаходом. Речовини, що сприяють проникненню, застосовувані в мікроемульсіях за даним винаходом, можна класифікувати як такі, що належать до однієї з п'яти широких категорій: поверхнево-активні речовини, жирні кислоти, солі жовчних кислот, хелатувальні засоби та нехелатувальні речовини, відмінні від поверхнево-активних речовин (І ее еї аї., Стіісаї
Кемієм5 іп Тпегарешіс Огид Саїгтіег Зузіетв, 1991, р. 92). Кожний із цих класів обговорювався вище. ії. Мікрочастинки
Засіб на основі ІКМА за даним винаходом може бути включений у частинку, наприклад, мікрочастинку. Мікрочастинки можна одержувати за допомогою сушіння розпиленням, але також можна одержувати іншими способами, у тому числі ліофілізацією, випарюванням, сушінням у псевдозрідженому шарі, сушінням у вакуумі або за допомогою комбінації цих методик. їм. Речовини, що сприяють проникненню
В одному варіанті здійснення в даному винаході використовують різні речовини, що сприяють проникненню, для впливу на ефективну доставку нуклеїнових кислот, зокрема іІКМА, у шкіру тварин. Більшість лікарських засобів присутні в розчині як в іонізованій, так і в неіонізованій формі. Однак, як правило, тільки жиророзчинні або ліпофільні лікарські засоби легко проходять через клітинні мембрани. Було встановлено, що навіть неліпофільні лікарські засоби можуть проходити через клітинні мембрани, якщо мембрана, через яку необхідно пройти, оброблена речовиною, що сприяє проникненню. Додатково до сприяння дифузії неліпофільних лікарських засобів через клітинні мембрани, речовини, що сприяють проникненню, також підвищують проникність для ліпофільних лікарських засобів.
Зо Речовини, що сприяють проникненню, можна класифікувати як такі, що належать до однієї з п'яти широких категорій, тобто поверхнево-активні речовини, жирні кислоти, солі жовчних кислот, хелатувальні засоби та нехелатувальні речовини, відмінні від поверхнево-активних речовин (див., наприклад, Маїтеїеп, М. З!,ипасіапі5 апа роїутег»5 іп агид аеїїмегу, Іпогта Неаїй
Саге, Мем Моїк, МУ, 2002; І ее єї аї., Стйіса! Веміємв іп Тнегарешіс Огид Сатег бузієтв, 1991, р.92). Кожний із вищевказаних класів речовин, що сприяють проникненню, більш докладно описаний нижче.
Поверхнево-активні речовини (або "сурфактанти") є хімічними структурними одиницями, які у разі розчинення у водному розчині знижують поверхневий натяг розчину або міжфазний натяг між водним розчином та іншою рідиною, в результаті чого підвищується абсорбція ІКМА крізь слизову оболонку. Окрім солей жовчних кислот та жирних кислот, ці речовини, що сприяють проникненню, включають, наприклад, лаурилсульфат натрію, поліоксиетилен-9-лауриловий етер і поліоксиетилен-20-цетиловий етер (див., наприклад, МаїЇтвїеп, М. Зипасапів апа роїутегз іп агид аеїїмегу, Іп?огта Неайй Саге, Мем/ Могк, МУ, 2002; І еє єї аї., Стйса! Веміємув іп
ТНнегарешіс Огид Сапіег Зузіет5, 1991, р. 92); а також перфторовані емульсії, такі як ЕС-43 (ТаКапабні еї а!., 9). Рнагт. Ріпаптасої., 1988, 40, 252).
Різні жирні кислоти і їх похідні, які діють як речовини, що сприяють проникненню, включають, наприклад, олеїнову кислоту, лауринову кислоту, капринову кислоту (н-деканову кислоту), міристинову кислоту, пальмітинову кислоту, стеаринову кислоту, лінолеву кислоту, ліноленову кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеїн (1-моноолеоїл-рац-гліцерин), дилаурин, каприлову кислоту, арахідонову кислоту, гліцерин-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнітини, ацилхоліни, їх С1-20алкілові естери (наприклад, метиловий, ізопропіловий і трет-бутиловий) та їх моно- й дигліцериди (тобто олеат, лаурат, капрат, міристат, пальмітат, стеарат, лінолеат тощо) (див., наприклад, Тоийои, Е., еї аІ. Еппапсетепі іп Огид Оеїїмегу, СКС
Ргезв5, Юапмегв, МА, 2006; І еє єї аї., Сийіса! Веміємв іп Тнегарешіс Огпа Сатіег Зузіетв, 1991, р.92; Мигапівні, Стйіса! Веміємув іп Тнегарешіс Огид Сатпіег Зувівтв5, 1990, 7, 1-33; ЕІ Нагігі ев! аї.,
У. Рпагт. Ріагтасої., 1992, 44, 651-654).
Фізіологічна роль жовчі включає сприяння в розподілі та абсорбції ліпідів і жиророзчинних вітамінів (див., наприклад, МаїЇтв5іеп, М. З,ипасіапі5 апа роїутег» іп агид аеїїмегу, Іпїогта Неайй
Саге, Мем/ Могк, МУ, 2002; Вгипіоп, Спаріег 38 у боодтап 5 Сйтап'5 Те РПагтасоїодіса! Вавів 60 ої ТПегареціїсв5, Зп Еда., Нагатап еї аї. Ед5., Мсатгам/-НІЇЇ, Мем МогКк, 1996, рр. 934-935). Різні природні солі жовчних кислот і їх синтетичні похідні діють як речовини, що сприяють проникненню. Таким чином, термін "солі жовчних кислот" включає будь-які компоненти жовчі, що зустрічаються в природі, а також будь-яке з їх синтетичних похідних. Придатні солі жовчних кислот включають, наприклад, холеву кислоту (або її фармацевтично прийнятну натрієву сіль, холат натрію), дегідрохолеву кислоту (дегідрохолат натрію), дезоксихолеву кислоту (дезоксихолат натрію), глюхолеву кислоту (глюхолат натрію), гліхолеву кислоту (гліхолат натрію), глікодезоксихолеву кислоту (глікодезоксихолат натрію), таурохолеву кислоту (таурохолат натрію), тауродезоксихолеву кислоту (тауродезоксихолат натрію), хенодезоксихолеву кислоту (хенодезоксихолат натрію), урсодезоксихолеву кислоту (ШОСА), тауро-24,25-дигідрофузидат натрію (5ТОНЕ), глікодигідрофузидат натрію та лауриловий етер поліоксиетилену 9 (РОЕ) (див., наприклад, МаїЇтвіеп, М. З,ипасіапів апа роїутегз іп агид аеїїмегу,
Іптогта Неапй Саге, Мем Моїк, МУ, 2002; І еє еї аї., Сийіса! Вемієму5 іп Тнегарешіс Огид Сатієг
Зузієтв, 1991, раде 92; Зм/іпуага, Спаріег 39 у Кетіпдіоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсе5, 181 Ейа.,
Сеппаго, єд., Маск Рибіїзпіпу Со., Еавіоп, Ра., 1990, радез 782-783; Мигапівні, Стйіса! Веміемув іп ТНегарешіс Огид Сатієг Зузієтв, 1990, 7, 1-33; Мататоїй еї аї!., ). Рнапт. Ехр. ТНег., 1992, 263, 25; Матавніа еї а!., У. Рнапт. 5сі., 1990, 79, 579-583).
Хелатувальні засоби, які використовуються щодо даного винаходу, можна визначити як сполуки, які видаляють іони металу з розчину шляхом утворення комплексів з ними, в результаті чого підвищується абсорбція ІКМА крізь слизову оболонку. Щодо їх застосування як речовин, що сприяють проникненню, в даному винаході хелатувальні засоби мають додаткову перевагу, також виступаючи як інгібітори ДНКази, оскільки більшість охарактеризованих ДНК- нуклеаз потребують двовалентний іон металу для каталізу й, таким чином, інгібуються хелатувальними засобами (аїгтей, У. Спготаїйодг., 1993, 618, 315-339). Придатні хелатувальні засоби включають без обмеження етилендіамінтетраацетат динатрію (ЕОТА), лимонну кислоту, саліцилати (наприклад, саліцилат, 5-метоксисаліцилат і гомовалінат натрію), М-ацилпохідні колагену, лаурет-9 і М-аміноацилпохідні бета-дикетонів (енаміни) (див., наприклад, Каїдаге, А. еї аІ,, Ехсіріепі демеіортепі ог рНпаптасецшіїса!, Біоїесппоіоду, апа агид аеїЇмегу, САС Ргезв, рапмегв, МА, 2006; І ее сеї аї., Стйїса! Неміємув іп Тпегарешіс Огид Сатіег Зувзіетв, 1991, раде 92;
Мигапівні, Стйїса! Веміему5 іп Тнегарешііс Огид Саїтієг Зувіетв, 1990, 7, 1-33; Вишг єї аї., У. Сопіго!
Коо) Ве!., 1990, 14, 43-51).
Як використовується в даному документі, нехелатувальні сполуки, що сприяють проникненню, відмінні від поверхнево-активних речовин, можуть бути визначені як сполуки, які проявляють невелику активність як хелатувальні засоби або як поверхнево-активні речовини, але які, тим не менш, посилюють абсорбцію іеМА крізь слизову оболонку травного тракту (див., наприклад, Мигапівпі, Стйіса! Кеміем/5 іп Тпегарецііїс Огид Сагпіег Зубієтв5, 1990, 7, 1-33). Цей клас речовин, що сприяють проникненню, включає, наприклад, ненасичені циклосечовини, похідні 1-алкіл- і 1-алкенілазациклоалканону (І ее еї аї., Стйіса! Кеміему5 іп Тпегарешіс Огид
Сагтієг Зубзіетв, 1991, раде 92) та нестероїдні протизапальні засоби, такі як диклофенак натрію, індометацин та фенілбутазон (Хатабзнйа еї а!., У. Рнапт. РНагптасої., 1987, 39, 621-626).
Засоби, які посилюють захоплення ІКМА на клітинному рівні, також можна додавати до фармацевтичних та інших композицій за даним винаходом. Наприклад, катіонні ліпіди, такі як ліпофектин (Чипіспі еї аії, патент США Мо 5705188), катіонні похідні гліцерину та полікатіонні молекули, такі як полілізин (ГоПо еї аїІ., заявка згідно РСТ УМО 97/30731), також, як відомо, посилюють клітинне захоплення азКМА. Приклади комерційно доступних реагентів для трансфекції включають серед інших, наприклад, І іроїесіатіпетм (Іпмігодеп; Карлесбад,
Каліфорнія), І іроїтесіатіпе 20007м (Іпийгодеп; Карлсобад, Каліфорнія), 2931тесіїп "мМ (Іпмігодеп;
Карлсобад, Каліфорнія), СеІШесііп "мМ (Іпмігодеп; Карлобад, Каліфорнія), ОМАЇЕ-С м (Іпмігодеп;
Карлсбад, Каліфорнія), Ргеебзіуїелм МАХ (Іпмігодеп; Карлеобад, Каліфорнія), І іроїесіатіпе м 2000 СО (Іпмігодеп; Карлсобад, Каліфорнія), І іроїесіїатіпе м (Іпмігодеп; Карлеобад, Каліфорнія),
ІЕМАМАХ (Іпмйгодеп; Карлобад, Каліфорнія), Оіїїдотесіатіпетм (Іпийгодеп; Карлсбад,
Каліфорнія), Орійесі"м (Іпмігодеп; Карлобад, Каліфорнія), реагент для трансфекції Х- їетесЕМЕ 02 (Коспе; Грензахерштрассе, Швейцарія), реагент для ліпосомної трансфекції
БОТАР (Грензахерштрассе, Швейцарія), реагент для ліпосомної трансфекції СО5БРЕК (Грензахерштрассе, Швейцарія) або Ридепе (Грензахерштрассе, Швейцарія), реагент
Тгапотесіатое (Рготеда; Медісон, Вісконсин), реагент для трансфекції ТгапзРазі "м (Рготеда;
Медісон, Вісконсин), реагент Тіїх"7ми-20 (Рготеда; Медісон, Вісконсин), реагент Тіх"м-50 (Рготеда;
Медісон, Вісконсин), ОгеатЕесім (0727 Віозсіепсе5; Марсель, Франція), ЕсоТгапетесїі (07
Віозсіепсе5; Марсель, Франція), реагент для трансфекції ТгапоРаз52 01 (Мем Епдіапа Віоїарв;
Іпсвіч, Массачусетс, США), ГуомМес'"м/Л їробеп'м (Іпмігодеп; Сан-Дієго, Каліфорнія, США), бо реагент для трансфекції РегРесіїп (Сепіапіїв; Сан-Дієго, Каліфорнія, США), реагент для трансфекції МенгоРОКТЕК (Сепіапіів; Сан-Дієго, Каліфорнія, США), реагент для трансфекції
СепеРОКТЕК (Сепіапії5; Сан-Дієго, Каліфорнія, США), реагент для трансфекції зепеРОКТЕК 2 (Сепіапіїз; Сан-Дієго, Каліфорнія, США), реагент для трансфекції Суогесііп (Сепіапії5; Сан-
Дієго, Каліфорнія, США), реагент для трансфекції ВаспоРОкКтТЕК (Сепіапіїє; Сан-Дієго,
Каліфорнія, США), реагент для трансфекції ТтодапРОКТЕК "м (Сепіапіїв; Сан-Дієго, Каліфорнія,
США), КірогГесі (Віоїїпе; Тонтон, Массачусетс, США), РіазЕесі (Віоїїпе; Тонтон, Массачусетс,
США), ОпігЕСТОК (В-Вгідде Іпгегпайопаї!; Маунтін-В'ю, Каліфорнія, США), ЗигегЕСТОК (В-
Вгідде Іпієгпайопаї; Маунтін-В'ю, Каліфорнія, США) або Нігесі м (В-Вгідде Іпіегпайіопаї, Маунтін-
В'ю, Каліфорнія, США).
Для посилення проникнення введених нуклеїнових кислот можна використовувати інші засоби, у тому числі гліколі, такі як етиленгліколь і пропіленгліколь, піроли, такі як 2-пірол, азони та терпени, такі як лімонен і ментон. м. Носії
Певні композиції за даним винаходом також містять у складі сполуки-носії.
Використовуваний у даному документі термін "сполука-носій" або "носій" може стосуватися нуклеїнової кислоти або її аналога, які є інертними (тобто не мають біологічної активності рег зе), але розпізнаються як нуклеїнова кислота процесами іп мімо, які знижують біодоступність нуклеїнової кислоти з біологічною активністю, наприклад, шляхом руйнування біологічно активної нуклеїнової кислоти або шляхом сприяння її видаленню з кровообігу. Введення нуклеїнової кислоти разом зі сполукою-носієм, зазвичай з надлишком останньої речовини, може зумовлювати значне зменшення кількості нуклеїнової кислоти, що переробляється печінкою, нирками або іншими позасудинними депо, можливо внаслідок конкуренції між сполукою-носієм і нуклеїновою кислотою за спільний рецептор. Наприклад, переробку частково фосфотіоатної а5КМА тканиною печінки можна зменшити у випадку її введення спільно з полі"ннозиновою кислотою, сульфатом декстрану, поліцитидиновою кислотою або 4-ацетамідо-4"- ізотіоціаностильбен-2,2'-дисульфокислотою (Міуао еї аі., О5КМА Кев. ЮОем., 1995, 5, 115-121;
ТаКакКитга єї а!., ОБАМА 8 Мисі. Асіа Огид Оеєм., 1996, 6, 177-183. мі. Наповнювачі
На відміну від сполуки-носія "фармацевтичний носій" або "наповнювач" являє собою
Зо фармацевтично прийнятний розчинник, суспендувальний засіб або будь-яке інше фармакологічно інертне середовище для доставки однієї або декількох нуклеїнових кислот в організм тварини. Наповнювач може являти собою рідку або тверду речовину, і його вибирають з урахуванням передбачуваного способу введення з тим, щоб забезпечити необхідний загальний об'єм, консистенцію тощо у разі об'єднання з нуклеїновою кислотою та іншими компонентами даної фармацевтичної композиції. Типові фармацевтичні носії включають без обмеження зв'язувальні засоби (наприклад, прежелатинізований маїсовий крохмаль, полівінілпіролідон або гідроксипропілметилцелюлозу тощо); заповнювачі (наприклад, лактозу та інші цукри, мікрокристалічну целюлозу, пектин, желатин, сульфат кальцію, етилцелюлозу, поліакрилати або гідрофосфат кальцію тощо); змащувальні речовини (наприклад, стеарат магнію, тальк, кремнезем, колоїдний діоксид кремнію, стеаринову кислоту, стеарати металів, гідрогенізовані рослинні олії, кукурудзяний крохмаль, полієтиленгліколі, бензоат натрію, ацетат натрію тощо); розпушувачі (наприклад, крохмаль, крохмальгліколят натрію тощо) та змочувальні засоби (наприклад, лаурилсульфат натрію тощо).
Фармацевтично прийнятні органічні або неорганічні наповнювачі, придатні для введення, відмінного від парентерального, які не вступають в реакцію з нуклеїновими кислотами несприятливим чином, також можна застосовувати для складання композицій за даним винаходом. Придатні фармацевтично прийнятні носії включають без обмеження воду, розчини солей, спирти, поліетиленгліколі, желатин, лактозу, амілозу, стеарат магнію, тальк, кремнієву кислоту, в'язкий парафін, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон тощо.
Склади для місцевого застосування нуклеїнових кислот можуть включати стерильні та нестерильні водні розчини, неводні розчини в звичайних розчинниках, таких як спирти, або розчини нуклеїнових кислот в рідких або твердих масляних основах. Розчини також можуть містити буфери, розріджувачі та інші придатні добавки. Можна застосовувати фармацевтично прийнятні органічні або неорганічні наповнювачі, придатні для введення, відмінного від парентерального, які не вступають в реакцію з нуклеїновими кислотами несприятливим чином.
Придатні фармацевтично прийнятні наповнювачі включають без обмеження воду, розчини солей, спирт, поліетиленгліколі, желатин, лактозу, амілозу, стеарат магнію, тальк, кремнієву кислоту, в'язкий парафін, гідроксиметилцелюлозу, полівінілпіролідон тощо. мі. Інші компоненти 60 Композиції за даним винаходом можуть додатково містити інші допоміжні компоненти, що традиційно зустрічаються у фармацевтичних композиціях, за рівнів застосування, встановлених у даній галузі техніки. Таким чином, наприклад, композиції можуть містити додаткові сумісні фармацевтично активні матеріали, такі як, наприклад, протисвербіжні засоби, в'яжучі засоби, місцеві анестетики або протизапальні засоби, або можуть містити додаткові матеріали, застосовні для фізичного складання композицій за даним винаходом у різних лікарських формах, такі як барвники, ароматизувальні засоби, консерванти, антиоксиданти, замутнювачі, загусники та стабілізатори. Однак такі матеріали у разі додавання не повинні надмірно конфліктувати з біологічними активностями компонентів композицій за даним винаходом.
Склади можна стерилізувати і, за необхідності, змішувати з допоміжними засобами, наприклад, змащувальними речовинами, консервантами, стабілізаторами, змочувальними засобами, емульгаторами, солями для здійснення впливу на осмотичний тиск, буферами, забарвлювальними речовинами, ароматизаторами та/або запашними речовинами тощо, які не взаємодіють несприятливим чином із нуклеїновою(нуклеїновими) кислотою(кислотами) складу.
Водні суспензії можуть містити речовини, які підвищують в'язкість суспензії, у тому числі, наприклад, карбоксиметилцеллюлозу натрію, сорбіт та/"або декстран. Суспензія може також містити стабілізатори.
У деяких варіантах здійснення фармацевтичні композиції, описані в даному винаході, містять (а) одну або декілька сполук на основі іІКМА та (Б) один або декілька засобів, які діють за механізмом, відмінним від ІКМА, та які є застосовними в лікуванні гемолітичного порушення.
Приклади таких засобів включають без обмеження протизапальний засіб, засіб проти стеатозу, противірусний засіб та/або засіб проти фіброзу.
Крім того, інші речовини, зазвичай застосовувані для захисту печінки, такі як силімарин, також можна застосовувати в поєднанні з ІКМА, описаними в даному документі. Інші засоби, застосовні для лікування захворювань печінки, включають телбівудин, ентекавір та інгібітори протеаз, такі як телапревір та інші, розкриті, наприклад, у публікаціях заявок на патенти США
МоМо 2005/0148548, 2004/0167116 та 2003/0144217 Типод еї аї., а також у публікації заявки на патент США Мо 2004/0127488 Нагйе еї аї.
Токсичність і терапевтичну ефективність таких сполук можна визначити за допомогою стандартних фармацевтичних процедур у культурах клітин або в експериментальних тварин, наприклад, для визначення 050 (дози, летальної для 5095 популяції) і ЕО5О (дози, терапевтично ефективної для 5095 популяції). Співвідношення доз між токсичною і терапевтичною діями являє собою терапевтичний індекс, і його можна виражати як співвідношення ГО050/ЕЮО50О. Переважними є сполуки, які характеризуються високим терапевтичним індексом.
Дані, одержані в аналізах з клітинними культурами і дослідженнях на тваринах, можна застосовувати під час складання ряду доз для застосування у людей. Як правило, доза композицій, описаних у даному винаході, знаходиться в діапазоні циркулювальних концентрацій, який включає ЕО50О з малою токсичністю або без неї. Доза може варіюватися в цьому діапазоні залежно від застосовуваних лікарської форми і шляху введення. Для будь-якої сполуки, застосовуваної в способах, описаних у даному винаході, терапевтично ефективну дозу можна спочатку встановити за результатами аналізів на клітинній культурі. Дозу можна складати в тваринних моделях з одержанням діапазону концентрацій сполуки або, за необхідності, поліпептидного продукту з цільовою послідовністю, що циркулюють у плазмі крові (наприклад, для досягнення зменшеної концентрації поліпептиду), який включає ІС5О (тобто концентрацію досліджуваної сполуки, за якої досягають напівмаксимального інгібування симптомів), що визначають у культурі клітин. Таку інформацію можна використовувати для більш точного визначення застосовних у людей доз. Рівні у плазмі крові можна визначати, наприклад, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії.
Окрім їх введення, обговорюваного вище, іЕМА, описані в даному винаході, можна вводити в комбінації з іншими відомими засобами, ефективними в лікуванні патологічних процесів, опосередковуваних експресією ТТК. У будь-якому випадку, лікар-куратор може коригувати кількість і часові рамки введення ІКМА, виходячи з результатів, що спостерігаються під час застосування стандартних засобів вимірювання ефективності, відомих із рівня техніки або описаних у даному документі.
МІ. Способи інгібування експресії ТТК
У даному винаході також передбачено способи інгібування експресії транстиретину (ТТЕ) у клітині. Способи передбачають приведення клітини в контакт із засобом для ЕМАЇ, наприклад, двонитковим засобом для ЕКМАЇ, у кількості, ефективній для інгібування експресії ТТЕ в клітині, завдяки чому здійснюється інгібування експресії ТТЕ. у клітині. 60 Приведення клітини в контакт із засобом для ЕМАЇї, наприклад, двонитковим засобом для
ЕМАЇ, можна виконувати іп міїго або іп мімо. Приведення клітини в контакт із засобом для ЕМАЇ іп мімо включає приведення клітини або групи клітин в організмі суб'єкта, наприклад суб'єкта- людини, в контакт із засобом для ЕМАЇї. Також можливі комбінації способів приведення клітини або групи клітин у контакт іп міїго та іп мімо. Приведення клітини або групи клітин у контакт може бути безпосереднім або опосередкованим, як обговорюється вище. Більше того, приведення клітини або групи клітин у контакт можна виконувати за допомогою націлювального ліганду, в тому числі будь-якого ліганду, описаного в даному документі або відомого з рівня техніки. У переважних варіантах здійснення націлювальний ліганд являє собою вуглеводний фрагмент, наприклад ліганд, який являє собою саїЇМАсз, або будь-який інший ліганд, який спрямовує засіб для КМАЇ до місця, що становить інтерес, наприклад печінки суб'єкта.
Термін "інгібування", використовуваний у даному документі, використовують взаємозамінно зі "зниженням", "сайленсингом", "деактивацією", "пригніченням" та іншими подібними термінами, і він включає будь-який рівень інгібування. Інгібування переважно включає статистично значуще або клінічно значуще інгібування.
Передбачається, що фраза "інгібування експресії ТТК" стосується інгібування експресії будь-якого гена ТТЕ (такого як, наприклад, ген ТТЕ миші, ген ТТК пацюка, ген ТТК мавпи або ген ТТК людини), а також варіантів або мутантних форм гена ТТЕК. Таким чином, ген ТТЕ може являти собою ген ТТК дикого типу, мутантний ген ТТК (такий як мутантний ген ТТК, що зумовлює відкладання амілоїду) або трансгенний ген ТТК, коли мова йде про клітину, групу клітин або організм, підданих генетичній маніпуляції. "Інгібування експресії гена ТТК" включає будь-який рівень інгібування експресії гена ТТ, наприклад, щонайменше часткове пригнічення експресії гена ТТК. Експресію гена ТТК можна оцінювати, виходячи з рівня або зміни рівня будь-якої змінної, пов'язаної з експресію гена ТТ, наприклад, рівня мРНК ТТК, рівня білка ТТК або кількості або ступеня впливу відкладень амілоїду. Цей рівень можна оцінювати в окремій клітині або в групі клітин, у тому числі, наприклад, у зразку, одержаному з організму суб'єкта.
Інгібування можна оцінювати за зниженням абсолютного або відносного рівня однієї або декількох змінних, пов'язаних з експресією ТТЕ, порівняно з контрольним рівнем. Контрольним рівнем може бути будь-який тип контрольного рівня, який використовують у даній галузі, наприклад, вихідний рівень до введення дози або рівень, визначений у подібного суб'єкта, клітини або зразка, які не оброблені або оброблені контролем (таким як, наприклад, контроль тільки з буфером або контроль з неактивним засобом).
У деяких варіантах здійснення способів за даним винаходом експресія гена ТТК інгібується щонайменше на приблизно 595, щонайменше на приблизно 1095, щонайменше на приблизно 1595, щонайменше на приблизно 2095, щонайменше на приблизно 2595, щонайменше на приблизно 3095, щонайменше на приблизно 3595, щонайменше на приблизно 4095, щонайменше на приблизно 4595, щонайменше на приблизно 5095, щонайменше на приблизно 5595, щонайменше на приблизно 6095, щонайменше на приблизно 6595, щонайменше на приблизно 7095, щонайменше на приблизно 7595, щонайменше на приблизно 8095, щонайменше на приблизно 8595, щонайменше на приблизно 9095, щонайменше на приблизно 9195, щонайменше на приблизно 9295, щонайменше на приблизно 9395, щонайменше на приблизно 9495, щонайменше на приблизно 9595, щонайменше на приблизно 9695, щонайменше на приблизно 9795, щонайменше на приблизно 9895, щонайменше на приблизно 9995 або до рівня, нижчого за рівень виявлення в аналізі. У деяких варіантах здійснення інгібування експресії гена ТТК зумовлює нормалізацію рівня експресії гена ТТЕ, так що різниця між рівнем до обробки та нормальним контрольним рівнем знижується щонайменше на 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595, 6095, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095 або 9595. У деяких варіантах здійснення інгібування являє собою клінічно значуще інгібування.
Інгібування експресії гена ТТЕ може проявлятися як зниження кількості мРНК, що експресується першою клітиною або групою клітин (такі клітини можуть бути присутніми, наприклад, у зразку, одержаному з організму суб'єкта), в яких транскрибується ген ТТК і яку або які було оброблено (наприклад, шляхом приведення клітини або клітин в контакт із засобом для
ЕМАЇ за даним винаходом або шляхом введення засобу для ЕМАЇ за даним винаходом суб'єкту, в організмі якого клітини є чи були присутніми) таким чином, щоб експресія гена ТК інгібувалася, порівняно з другою клітиною або групою клітин, по суті ідентичних першій клітині або групі клітин, але яку або які не було оброблено (контрольною(контрольними) клітиною(клітинами)). У переважних варіантах здійснення інгібування оцінюють шляхом вираження рівня мРНК в оброблених клітинах як відсоткової долі від рівня мРНК в контрольних клітинах за допомогою наступної формули: (516)
((МРНК в контрольних клітинах)-"імРНК в оброблених клітинах)/МмРНК в контрольних клітинах))"1009о
Як альтернатива, інгібування експресії гена ТТК можна оцінювати за зниженням параметра, функціонально пов'язаного з експресією гена ТТК, наприклад, експресії білка ТТЕ, рівня ретинол-зв'язувального білка, рівня вітаміну А або присутності відкладень амілоїду, які містять
ТТЕ. Сайленсинг гена ТТЕ можна виявити в будь-якій клітині, що експресує ТТЕ конститутивно або за допомогою генної інженерії, і за допомогою будь-якого аналізу, відомого з рівня техніки.
Печінка є основним місцем експресії ТТК. Інші важливі місця експресії включають судинне сплетіння, сітківку та підшлункову залозу.
Інгібування експресії біль»а ТК може проявлятися як зниження рівня білка ТТК, який експресується клітиною або групою клітин (наприклад, рівня білка, експресованого у зразку, одержаному з організму суб'єкта). Як пояснювалося вище щодо оцінки пригнічення експресії
МРНК, інгібування рівнів експресії білка в обробленій клітині або групі клітин можна аналогічно виражати як відсоткову долю від рівня білка в контрольній клітині або групі клітин.
Контрольна клітина або група клітин, які можна використовувати для оцінки інгібування експресії гена ТТЕ, включають клітину або групу клітин, які ще не були приведені в контакт із засобом для КМАЇї за даним винаходом. Наприклад, контрольна клітина або контрольна група клітин можуть бути одержані з організму окремого суб'єкта (наприклад, суб'єкта-людини або суб'єкта-тварини) перед лікуванням суб'єкта засобом для ЕМАЇ.
Рівень мРНК ТТК, яка експресується клітиною або групою клітин, або рівень циркулювальної МРНК ТТК можна визначити за допомогою будь-якого відомого з рівня техніки способу оцінки експресії МРНК. В одному варіанті здійснення рівень експресії ТТЕ у зразку визначають шляхом виявлення полінуклеотиду, що транскрибується, або його частини, наприклад, мРНК гена ТТК. РНК можна екстрагувати з клітин за допомогою методик екстрагування РНК, у тому числі, наприклад, з використанням екстрагування за допомогою кислого фенолу/гуанідинізотіоціанату (КМА70! В; Віодепеві5), наборів для одержання РНК
ЕМеазу (Оіадеп) або РАХдепе (РгеАпаїуіїх, Швейцарія). Типові формати аналізів, в яких використовують гібридизацію рибонуклеїнових кислот, включають ядерні кінетичні аналізи, КТ-
РСР, аналізи з захистом від дії РНКаз (Меп еї аї!., Мис. Асід5 Кев. 12:7035), нозерн-блотинг, гібридизацію іп 5їйш та мікроматричний аналіз. Циркулювальну МРНК ТТЕ можна виявляти за допомогою способів, описаних у РСТ/О52012/043584, повний зміст якої таким чином включено в даний документ за допомогою посилання.
В одному варіанті здійснення рівень експресії ТТК визначають за допомогою зонда для нуклеїнової кислоти. Термін "зонд", використовуваний у даному документі, стосується будь-якої молекули, здатної селективно зв'язуватися з конкретним ТТК. Зонди можуть бути синтезовані фахівцем у даній галузі або одержані з відповідних біологічних препаратів. Зонди можуть бути спеціально сконструйовані, щоб містити мітку. Приклади молекул, які можна використовувати як зонди, включають без обмеження РНК, ДНК, білки, антитіла та органічні молекули.
Виділені мРНК можна використовувати в аналізах на основі гібридизації або ампліфікації, які включають без обмеження аналізи, що являють собою саузерн- або нозерн-блотинг, аналізи з використанням полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) і матриці зі зондами. Один спосіб визначення рівнів мРНК включає приведення виділеної мРНК у контакт із молекулою нуклеїнової кислоти (зондом), яка може гібридизуватися з мРНК ТТК. В одному варіанті здійснення мРНК іммобілізують на твердій поверхні та приводять у контакт із зондом, наприклад, шляхом пропускання виділеної мРНК через агарозний гель і перенесення мРНК з гелю на мембрану, таку як нітроцелюлоза. В альтернативному варіанті здійснення зонд(зонди) іммобілізують на твердій поверхні та мРНК приводять у контакт із зондом(зондами), наприклад на генному мікрочіпі АПутеїгіх. Фахівець у даній галузі може легко адаптувати відомі способи виявлення мРНК для застосування у визначенні рівня мРНК ТТ.
Альтернативний спосіб визначення рівня експресії ТТК у зразку включає спосіб ампліфікації нуклеїнових кислот та/або зворотної транскрипції (з одержанням кДНК), наприклад, мРНК у зразку, наприклад, за допомогою КТ-РСК (експериментальний варіант здійснення викладено в
Миїйї5, 1987, патент США Мо 4683202), лігазної ланцюгової реакції (Вагапу (1991) Ргос. Маї).
Асад. сі. БА 88:189-193), самопідтримуваної реплікації послідовності ((зчагеїїї еї аїЇ. (1990)
Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 87:1874-1878), системи транскрипційної ампліфікації (Куй еї аї. (1989) Рос. Май. Асад. сі. ОБА 86:1173-1177), О-бета-реплікази (І іхагаії еї аї. (1988)
Віо/Тесппоіоду 6:1197), реплікації за типом "кільця, що котиться" (І ігагаї еї аІ., патент США Мо 5854033) або будь-якого іншого способу ампліфікації нуклеїнових кислот, за яким іде виявлення бо ампліфікованих молекул за допомогою методик, добре відомих фахівцям у даній галузі. Ці схеми виявлення особливо придатні для виявлення молекул нуклеїнової кислоти, якщо такі молекули присутні в дуже малих кількостях. У конкретних аспектах даного винаходу рівень експресії ТТЕ визначають за допомогою кількісної КТ-РСК з флуорогенними зондами (тобто системи ТадМмап М),
Рівні експресії мРНК ТТЕ можна контролювати за допомогою мембранного блоту (як, наприклад, застосовуваного в аналізі гібридизації, такого як нозерн, саузерн, дот тощо) або мікролунок, пробірок для зразків, гелів, гранул або волокон (або будь-якої твердої основи, що містить зв'язані нуклеїнові кислоти). Див. патенти США МоМе 5770722, 5874219, 5744305, 5677195 і 5445934, які включено в даний документ за допомогою посилання. Визначення рівня експресії ТТК може також включати застосування зондів для нуклеїнової кислоти в розчині.
У переважних варіантах здійснення рівень експресії мРНК оцінюють за допомогою аналізів з розгалуженою ДНК (БОМА) або ПЛР у режимі реального часу (ДРСК). Застосування цих способів описано та проілюстровано у прикладах, представлених у даному документі.
Рівень експресії білла ТТЕ можна визначити за допомогою будь-якого відомого з рівня техніки способу вимірювання рівнів білка. Такі способи включають, наприклад, електрофорез, капілярний електрофорез, високоефективну рідинну хроматографію (НРІС), тонкошарову хроматографію (ТІ С), гіпердифузну хроматографію, реакції преципітації в рідини або гелі, абсорбційну спектроскопію, колориметричні аналізи, спектрофотометричні аналізи, проточну цитометрию, імунодифузію (одиночну або подвійну), імуноелектрофорез, вестерн-блотинг, радіоїмунологічний аналіз (КІА), твердофазні імуноферментні аналізи (ЕГІЗА), імунофлуоресцентні аналізи, електрохемілюмінесцентні аналізи тощо.
У деяких варіантах здійснення ефективність способів за даним винаходом можна контролювати шляхом виявлення або контролю зниження відкладання ТТЕ амілоїду. Зниження відкладання ТТК амілоїду, як використовується в даному документі, включає будь-яке зменшення розміру, кількості або тяжкості впливу відкладень ТТК або попередження або зниження утворення відкладень ТТК в органі або ділянці організму суб'єкта, яке можна оцінювати іп мійго або іп мімо за допомогою будь-якого способу, відомого з рівня техніки.
Наприклад, деякі способи оцінки відкладень амілоїду описані в Сегі7, М.А. 5 Ка|иКитаг, 5.М. (Едікогв) (2010), Атуїоідовів: Оіадпові5 апа Тгеайтепі, Мем/ ок: Нитапа Рге55. Способи оцінки
Зо відкладень амілоїду можуть включати біохімічні аналізи, а також візуальну або комп'ютерну оцінку відкладень амілоїду, які роблять видимими, наприклад, за допомогою імуногістохімічного забарвлювання, флуоресцентного мічення, світлової мікроскопії, електронної мікроскопії, флуоресцентної мікроскопії або інших типів мікроскопії. Для оцінки відкладень амілоїду можна використовувати інвазивні або неінвазивні методи візуалізації, які включають, наприклад, СтТ-,
РЕТ- або ММЕ/МРНІ-візуалізацію.
За допомогою способів за даним винаходом можна знижувати кількість відкладень ТТЕК у будь-якій кількості тканин або ділянок організму, які включають без обмеження серце, печінку, селезінку, стравохід, шлунок, кишківник (клубову кишку, дванадцятипалу кишку та ободову кишку), головний мозок, сідничний нерв, дорсальний корінцевий ганглій, нирку та сітківку.
Термін "зразок", використовуваний у даному документі, відноситься до сукупності подібних рідин, клітин або тканин, виділених із організму суб'єкта, а також рідин, клітин або тканин, присутніх в організмі суб'єкта. Приклади біологічних рідин включають кров, сироватку крові і серозні рідини, плазму крові, лімфу, сечу, спинномозкову рідину, слину, внутрішньоочні рідини тощо. Зразки тканин можуть включати зразки з тканин, органів або локальних ділянок.
Наприклад, зразки можуть бути одержані з конкретних органів, частин органів або рідин або клітин у даних органах. У певних варіантах здійснення зразки можуть бути одержані з печінки (наприклад, зі всієї печінки або з певних сегментів печінки або певних типів клітин печінки, таких як, наприклад, гепатоцити), сітківки або частин сітківки (наприклад, пігментного епітелію сітківки), центральної нервової системи або частин центральної нервової системи (наприклад, шлуночків або судинного сплетіння) або підшлункової залози або певних клітин або частин підшлункової залози. У переважних варіантах здійснення "зразок, одержаний від суб'єкта" стосується крові, взятої в суб'єкта, або плазми крові, одержаної з неї. У додаткових варіантах здійснення "зразок, одержаний від суб'єкта" стосується тканини печінки або тканини сітківки, одержаних від суб'єкта.
У деяких варіантах здійснення способів за даним винаходом засіб для ЕМАЇ вводять суб'єкту так, що засіб для КМАї доставляється до конкретного місця в організмі суб'єкта. Інгібування експресії ТТЕ можна оцінювати за допомогою вимірювань рівня або зміни рівня мРНК ТТЕ. або білка ТТЕК у зразку, одержаному з рідини або тканини з конкретного місця в організмі суб'єкта. У переважних варіантах здійснення місце вибране з групи, що складається з печінки, судинного 60 сплетіння, сітківки та підшлункової залози. Місце також може являти собою підрозділ або підгрупу клітин з будь-якого з вищезазначених місць (наприклад, гепатоцити або пігментний епітелій сітківки). Місце також може включати в себе клітини, які експресують конкретний тип рецептора (наприклад, гепатоцити, які експресують асіалоглікопротеїновий рецептор).
МІ. Способи лікування або попередження ТТК-асоційованого захворювання
У даному винаході також передбачено способи лікування або попередження ТТЕ- асоційованого захворювання в суб'єкта. Способи передбачають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості засобу для КМАЇ за даним винаходом.
Як використовується в даному документі, "суб'єктом" є тварина, така як ссавець, у тому числі примат (такий як людина, примат, відмінний від людини, наприклад, мавпа та шимпанзе), ссавець, відмінний від примата (такий як корова, свиня, верблюд, лама, кінь, коза, кріль, вівця, хом'як, морська свинка, кіт, собака, пацюк, миша, кінь та кит), або птах (наприклад, качка або гуска). Суб'єкт може передбачати трансгенний організм.
У варіанті здійснення суб'єктом є людина, така як людина, яку піддають лікуванню або оцінюють стосовно захворювання, порушення або стану, на які буде сприятливо впливати зниження експресії гена ТТЕК; людина, яка має ризик виникнення захворювання, порушення або стану, на які буде сприятливо впливати зниження експресії гена ТТК; людина, яка має захворювання, порушення або стан, на які буде сприятливо впливати зниження експресії гена
ТТЕ; та/або людина, яку піддають лікуванню захворювання, порушення або стану, на які буде сприятливо впливати зниження експресії гена ТТК, як описано в даному документі.
У деяких варіантах здійснення суб'єкт страждає на ТТЕК-асоційоване захворювання. В інших варіантах здійснення суб'єктом є суб'єкт з ризиком розвитку ТТК-асоційованого захворювання, наприклад, суб'єкт з мутацією гена ТТЕК, асоційованою з розвитком ТТК-асоційованого захворювання (наприклад, до початку проявів ознак або симптомів, які свідчать про розвиток пов'язаного з ТТК амілоїдозу), суб'єкт з ТТК-асоційованим захворюванням у родинному анамнезі (наприклад, до початку проявів ознак або симптомів, які свідчать про розвиток пов'язаного з ТТЕ амілоїдозу) або суб'єкт, який має ознаки або симптоми, які свідчать про розвиток пов'язаного з ТТЕК амілоїдозу. "ТТВ-асоційоване захворювання", як використовується в даному документі, включає будь-
Зо яке захворювання, що спричинюється або асоційоване з утворенням відкладень амілоїду, в яких попередники фібрил складаються з варіанту білка ТТ або його форми дикого типу.
Мутантний ТТК та його форма дикого типу зумовлюють різні форми відкладання амілоїду (амілоїдозу). Амілоїдоз передбачає утворення та агрегацію неправильно згорнутих білків, в результаті чого формуються позаклітинні відкладення, які погіршують функцію органу. Клінічні синдроми, асоційовані з агрегацією ТТЕ, включають, наприклад, сенільний системний амілоїдоз (55А); системний сімейний амілоїдоз; сімейну амілоїдну полінейропатію (БАР); сімейну амілоїдну кардіоміопатію (БАС) та лептоменінгеальний амілоїдоз, також відомий як лептоменінгеальний або менінгоцереброваскулярний амілоїдоз, амілоїдоз центральної нервової системи (СМ5) або амілоїдоз МІЇ форми.
В одному варіанті здійснення засоби для ЕМАЇ за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на сімейну амілоїдну кардіоміопатію (БАС). В іншому варіанті здійснення засоби для ЕМАіЇ за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на ЕБАС зі змішаним фенотипом, тобто суб'єкту, який має як погіршення серцевої діяльності, так і неврологічні погіршення. У ще одному варіанті здійснення засоби для КМАЇї за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на БАР зі змішаним фенотипом, тобто суб'єкту, який має як неврологічні погіршення, так і погіршення серцевої діяльності. В одному варіанті здійснення засоби для КМАЇ за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на ЕАР, яку лікували шляхом ортотопічної трансплантації печінки (ОЇ Т). В іншому варіанті здійснення засоби для
ЕМАЇ за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на сенільний системний амілоїдоз
БО (55А). В інших варіантах здійснення способів за даним винаходом засоби для КМАЇї за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на сімейну амілоїдну кардіоміопатію (БАС) та сенільний системний амілоїдоз (55А). ТТК із нормальною послідовністю спричинює амілоїдоз серця у людей похилого віку і називається сенільним системним амілоїдозом (554А) (також має назву сенільний амілоїдоз серця (5СА) або амілоїдоз серця). 55А часто супроводжується мікроскопічними відкладеннями у багатьох інших органах. Мутації ТТК зумовлюють прискорення процесу утворення амілоїду з ТТК і є найважливішим фактором ризику розвитку клінічно значущого пов'язаного з ТТК амілоїдозу (який також має назву АТТК (амілоїдоз транстиретинового типу)). Відомо, що більш ніж 85 амілоїдогенних варіантів ТТА спричинюють системний сімейний амілоїдоз. 60 У деяких варіантах здійснення способів за даним винаходом засоби для КМАЇ за даним винаходом вводять суб'єктам, які страждають на сімейну амілоїдну полінейропатію (БАР), пов'язану з транстиретином (ТТК). Такі суб'єкти можуть страждати від очних проявів, таких як помутніння скловидного тіла та глаукома. Фахівцю в даній галузі відомо, що амілоїдогенний транстиретин (АТТЕ), який синтезується пігментним епітелієм сітківки (КРЕ), відіграє важливі ролі у прогресуванні амілоїдозу ока. У попередніх дослідженнях було показано, що панретинальна лазерна фотокоагуляція, за допомогою якої знижували кількість клітин КРЕ, попереджала прогресування відкладання амілоїду в скловидному тілі, що вказувало на те, що ефективне пригнічення експресії АТТК в КРЕ може стати новим видом терапії амілоїдозу ока (див., наприклад, Каууаїї, Т., еї аї.,, ОрпїйпаіІтоїоду. (2010) 117: 552-555). Способи за даним винаходом є застосовними для лікування очних проявів БАР, пов'язаної з ТТК, наприклад, амілоїдозу ока. Засіб для ЕМАїЇ можна доставляти способом, придатним для націлювання на конкретну тканину, таку як око. Способи доставки в око включають ретробульбарну ін'єкцію, ін'єкцію під шкіру повіки, субкон'юнктивальну, субтенонову ін'єкцію, ін'єкцію в передню камеру ока або інтравітреальну ін'єкцію (або внутрішню ін'єкцію або інфузію). Конкретні склади для доставки в око включають очні краплі або мазі.
Іншим ТТК-асоційованим захворюванням є гіпертироксинемія, також відома як "дистранстиретинемічна гіпертироксинемія" або "диспреальбумінемічна гіпертироксинемія". Цей тип гіпертироксинемії може бути спричинений підвищеним зв'язуванням тироксину з ТК внаслідок того, що мутантна молекула ТТК має підвищену афінність до тироксину. Див., наприклад, Мозез еї аї. (1982) 9. Сіїп. Іпмеві., 86, 2025-2033.
Засоби для КМАї за даним винаходом можна вводити суб'єкту за допомогою будь-якого способу введення, відомого з рівня технікию, у тому числі без обмеження підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньоочного, внутрішньобронхіального, внутрішньоплеврального, внутрішньочеревного, внутрішньоартеріального, лімфатичного, спинномозкового і будь-яких їх комбінацій.
У переважних варіантах здійснення засоби вводять суб'єкту підшкірно. У деяких варіантах здійснення суб'єкту вводять одноразову дозу засобу для КМАїЇ шляхом підшкірної ін'єкції, наприклад, ін'єкції у черевну порожнину, стегно або плече. В інших варіантах здійснення суб'єкту вводять дробову дозу засобу для ЕМАі шляхом підшкірної ін'єкції. В одному варіанті
Зо здійснення дробову дозу засобу для КМАЇ вводять суб'єкту шляхом підшкірної ін'єкції у два різні анатомічні місця розташування в організмі суб'єкта. Наприклад, суб'єкту можна підшкірно вводити шляхом ін'єкції дробову дозу приблизно 250 мг (наприклад, приблизно половину дози 500 мг) у праву руку і приблизно 250 мг у ліву руку. У деяких варіантах здійснення даного винаходу підшкірне введення являє собою самостійне введення за допомогою, наприклад, попередньо заповненого шприца або автоматичного медичного шприца. У деяких варіантах здійснення доза засобу для КМАЇ для підшкірного введення міститься в об'ємі, який є меншим за один мл або дорівнює одному мл, наприклад, фармацевтично прийнятного носія.
У деяких варіантах здійснення введення здійснюють за допомогою ін'єкції депо-препарату.
Ін'єкція депо-препарату може вивільняти засіб для ЕМАїі стійким чином протягом тривалого періоду часу. Таким чином, шляхом ін'єкції депо-препарату можна знизити частоту введення доз, необхідних для одержання потрібного ефекту, наприклад потрібного інгібування експресії
ТТК або терапевтичного або профілактичного ефекту. Ін'єкція депо-препарату може також забезпечувати більш стійкі концентрації в сироватці крові. Ін'єкції депо-препарату можуть включати підшкірні ін'єкції або внутрішньом'язові ін'єкції. У переважних варіантах здійснення ін'єкція депо-препарату являє собою підшкірну ін'єкцію.
У деяких варіантах здійснення введення здійснюють за допомогою насоса. Насос може бути зовнішнім насосом або насосом, який імплантують хірургічним шляхом. У певних варіантах здійснення насос являє собою підшкірно імплантований осмотичний насос. В інших варіантах здійснення насос являє собою інфузійний насос. Інфузійний насос можна застосовувати для внутрішньовенних, підшкірних, артеріальних або епідуральних інфузій. У переважних варіантах здійснення інфузійний насос являє собою насос для підшкірних інфузій. В інших варіантах здійснення насос являє собою насос, імплантований хірургічним шляхом, який доставляє засіб для КМАЇ в печінку.
У варіантах здійснення, в яких засіб для ЕМАЇ вводять за допомогою насоса для підшкірних інфузій, одноразову дозу засобу для КМАї можна вводити суб'єкту протягом періоду часу, що становить від приблизно 45 хвилин до приблизно 5 хвилин, наприклад, приблизно 45 хвилин, приблизно 40 хвилин, приблизно 35 хвилин, приблизно 30 хвилин, приблизно 25 хвилин, приблизно 20 хвилин, приблизно 15 хвилин, приблизно 10 хвилин або приблизно 5 хвилин.
Інші способи введення включають епідуральне, внутрішньоцеребральне, бо інтрацеребровентрикулярне, назальне введення, внутрішньоартеріальне, внутрішньосерцеве,
внутрішньокісткову інфузію, підоболонкове, а також у скловидне тіло і легеневе. Спосіб введення можна вибирати з урахуванням того, чи необхідним є місцеве або системне лікування, і з урахуванням ділянки, яка підлягає лікуванню. Шлях і місце введення можна вибирати для посилення цілеспрямованої дії.
У деяких варіантах здійснення засіб для КМАЇї вводять суб'єкту в кількості, ефективній для інгібування експресії ТТК у клітині в організмі суб'єкта. Кількість, ефективну для інгібування експресії ТТК у клітині в організмі суб'єкта можна оцінювати за допомогою способів, обговорюваних вище, у тому числі способів, які передбачають здійснення оцінки інгібування експресії МРНК ТТЕ, білка ТТЕ або пов'язаних змінних, таких як відкладення амілоїду.
У деяких варіантах здійснення засіб для КМАїі вводять суб'єкту у терапевтично або профілактично ефективній кількості.
Передбачається, що "терапевтично ефективна кількість", як використовується в даному документі, включає кількість засобу для ЕМАЇ, яка у разі введення пацієнту з метою лікування
ТТА-асоційованого захворювання, є достатньою для ефективного лікування захворювання (наприклад, шляхом зменшення інтенсивності, послаблення або підтримання наявного захворювання або одного або декількох симптомів захворювання). "Терапевтично ефективна кількість" може варіюватися залежно від засобу для КМАїЇ, шляху введення засобу, захворювання та його тяжкості, а також анамнезу захворювання, віку, ваги, родинного анамнезу, генетичної будови, стадії патологічних процесів, опосередкованих експресією ТТЕ, типів попереднього або супутнього лікування, за наявності такого, та інших індивідуальних особливостей пацієнта, який підлягає лікуванню.
Передбачається, що "профілактично ефективна кількість", як використовується в даному документі, включає кількість засобу для КМАЇ, яка у разі введення суб'єкту, який ще не відчуває або в якого ще не проявляються симптоми ТТК-асоційованого захворювання, але який може мати схильність до захворювання, є достатньою для попередження захворювання або одного або декількох симптомів захворювання або їх послаблення. Симптоми, які можуть бути послаблені, включають сенсорну нейропатію (наприклад, парестезію, гіпестезію дистальних відділів кінцівок), вегетативну нейропатію (наприклад, дисфункцію шлунково-кишкового тракту, як, наприклад, виразку шлунку, або ортостатичну гіпотензію), моторну нейропатію, судомні напади, деменцію, мієлопатію, полінейропатію, синдром зап'ястного каналу, вегетативну недостатність, кардіоміопатію, помутніння скловидного тіла, ниркову недостатність, нефропатію, суттєво знижений тВМІ (модифікований індекс маси тіла), дисфункцію черепних нервів і решітчасту дистрофію рогівки. Ослаблення захворювання включає уповільнення перебігу захворювання або зниження тяжкості захворювання, яке розвинеться пізніше. "Профілактично ефективна кількість" може варіюватися залежно від засобу для КЕМАЇї, шляху введення засобу, ступеня ризику розвитку захворювання та анамнезу захворювання, віку, ваги, родинного анамнезу, генетичної будови, типів попереднього або супутнього лікування, за наявності такого, та інших індивідуальних особливостей пацієнта, який підлягає лікуванню. "Терапевтично ефективна кількість" або "профілактично ефективна кількість" також включає кількість засобу для ЕМАЇї, яка спричинює деякий бажаний локальний або системний ефект за прийнятного співвідношення користь/ризик, прийнятому щодо будь-якого лікування. Засоби для
ЕМАЇ, використовувані у способах за даним винаходом, можна вводити у кількості, достатній для досягнення прийнятного співвідношення користь/ризик, прийнятого щодо такого лікування.
Використовувані в даному документі фрази "терапевтично ефективна кількість" і "профілактично ефективна кількість" також включають кількість, яка забезпечує сприятливий ефект під час лікування, попередження або контролю патологічних процесів або симптому(симптомів) патологічних процесів, опосередкованих експресією ТТК. Симптоми пов'язаного з ТТК амілоїдозу включають сенсорну нейропатію (наприклад, парестезію, гіпестезію дистальних відділів кінцівок), вегетативну нейропатію (наприклад, дисфункцію шлунково-кишкового тракту, як, наприклад, виразку шлунку, або ортостатичну гіпотензію), моторну нейропатію, судомні напади, деменцію, мієлопатію, полінейропатію, синдром зап'ястного каналу, вегетативну недостатність, кардіоміопатію, помутніння скловидного тіла, ниркову недостатність, нефропатію, суттєво знижений тВМІ (модифікований індекс маси тіла), дисфункцію черепних нервів і решітчасту дистрофію рогівки.
В одному варіанті здійснення, наприклад, якщо суб'єкт має БАР, БАР зі змішаним фенотипом, ЕАС зі змішаним фенотипом або ЕАР, та у нього проводили ОЇ Т, лікування суб'єкта за допомогою засобу на основі й5КМА за даним винаходом уповільнює прогресування нейропатії. В іншому варіанті здійснення, наприклад, якщо суб'єкт має ЕАР, ЕАР зі змішаним фенотипом, РАС зі змішаним фенотипом, 55А або ЕАР, та у нього проводили ОЇ, лікування бо суб'єкта за допомогою засобу на основі ахеЕМА за даним винаходом уповільнює прогресування нейропатії та кардіоміопатії.
Наприклад, в одному варіанті здійснення за допомогою способів за даним винаходом уповільнюють, зменшують або затримують неврологічне погіршення. Будь-яку придатну систему вимірювання неврологічного погіршення можна використовувати для визначення того, чи відбулося в суб'єкта зменшення, уповільнення або затримання неврологічного погіршення.
Однією з придатних систем вимірювання є шкала оцінки нейропатичних порушень (МІ5). МІЗ стосується бальної системи, за допомогою якої вимірюють слабкість, чутливість та рефлекси, зокрема, стосовно до периферичної невропатії. У балах за шкалою МІЗ оцінюють стандартну групу м'язів щодо слабкості (1 означає 2595 слабкість, 2 означає 5095 слабкість, З означає 7595 слабкість, 3,25 означає рух проти сили тяжіння, 3,5 означає рух в умовах усунення сили тяжіння, 3,75 означає тремтіння м'язів без руху, і 4 означає паралізованість), стандартну групу м'язів щодо рефлексів на розтягнення (0 означає нормальні, 1 означає зменшені, 2 означає відсутні), а також відчуття дотику і тиску, вібрації, положення і руху суглобів та уколу булавкою (всі з яких оцінюють на вказівному пальці та великому пальці ноги: 0 означає нормальні, 1 означає зменшені, 2 означає відсутні). Оцінки коригують з урахуванням віку, статі та фізичної форми.
В одному варіанті здійснення за допомогою способів за даним винаходом знижують бал за шкалою МІ5 щонайменше на 10595. В інших варіантах здійснення способи за даним винаходом зумовлюють зниження балу за шкалою МІ5 щонайменше на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 або щонайменше на 5095. В інших варіантах здійснення за допомогою способів затримують збільшення балу за шкалою МІ5, наприклад, спосіб зумовлює збільшення балу за шкалою МІ5 на 095. У ще декількох інших варіантах здійснення за допомогою способів за даним винаходом уповільнюють швидкість збільшення балу за шкалою МІ5, наприклад, швидкість збільшення балу за шкалою МІЗ у суб'єкта, який одержував лікування засобом для КМАїі за даним винаходом, порівняно зі швидкістю збільшення балу за шкалою МіІЗ у суб'єкта, який не одержував лікування засобом для КМАЇ за даним винаходом.
Способи визначення балу за шкалою МІЗ у суб'єкта-людини добре відомі фахівцю у даній галузі і можуть бути знайдені, наприклад, у Буск, РУ еї аї., (1997) Меигоіоду 1997. 49(1): ро5. 229- 239; Буск РУ). (1988) Мивсіє Мегуе. дап; 11(1):21-32.
Іншою придатною системою вимірювання неврологічного погіршення є модифікована шкала
Зо оцінки нейропатичних порушень (пМІ5З-7). Як відомо середньому фахівцю в даній галузі, тМіІ5-7 стосується оцінки неврологічного погіршення (МІ5) на підставі клінічного обстеження в поєднанні з електрофізіологічним вимірюваннями функцій великих та малих нервових волокон (МО5 та О5тТ) і вимірюванням вегетативних функцій (постуральних змін кров'яного тиску).
Шкала тМІЗ-7 є модифікацією шкали МІЗж-7 (яка являє собою МІ5 з додатковими сімома тестами). За шкалою МІ5-7 аналізують слабкість і рефлекси м'язів на розтягнення. П'ять з семи тестів включають критерії нервової провідності. Ці критерії являють собою амплітуду складного потенціалу дії м'яза, який виникає під час подразнення перонеального нерва, швидкість проведення імпульсу по руховому нерву та дистальну латентність рухового нерва (ММОЇ),
ММОЇ великогомілкового нерва та амплітуди потенціалів дії чутливого литкового нерва. Ці значення коригують з урахуванням змінних віку, статі, зросту і ваги. Решта два з семи тестів включають поріг чутливості до вібрації та зменшення частоти серцевих скорочень під час глибокого дихання.
Шкала тМіІЗж/ є модифікацією МІЗ-7, яка враховує застосування гнучкого кількісного сенсорного тестування за соматотопічним принципом, нових оцінок вегетативних функцій, і застосування амплітуд складних потенціалів дії м'язів, які виникають під час подразнення ліктьового, перонеального та великогомілкового нервів, а також потенціалів дії чутливих нервів для ліктьового та литкового нервів (Зйапргазеїї, М. еї аї., (2014) 9. Мешгої. зсі., 344(1-2): розв. 121-128).
В одному варіанті здійснення за допомогою способів за даним винаходом знижують бал за шкалою тМіІЗ-7 щонайменше на 1095. В інших варіантах здійснення способи за даним винаходом зумовлюють зниження балу за шкалою тМіІЗ-7 щонайменше на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40 або щонайменше на 5095. В інших варіантах здійснення за допомогою способів затримують збільшення балу за шкалою тМіІ5-7, наприклад, спосіб зумовлює збільшення балу за шкалою тМІ5-7 на 095. У ще декількох інших варіантах здійснення за допомогою способів за даним винаходом уповільнюють швидкість збільшення балу за шкалою МІ5-7, наприклад, швидкість збільшення балу за шкалою МІ5-7 у суб'єкта, який одержував лікування засобом для КМАЇ за даним винаходом, порівняно зі швидкістю збільшення балу за шкалою Мі5З--7 у суб'єкта, який не одержував лікування засобом для КМАЇ за даним винаходом.
За допомогою терапевтичних і профілактичних способів за даним винаходом також можна 60 поліпшувати інші клінічні параметри, такі як здатність до ходьби, у суб'єкта, якого піддають лікуванню. Наприклад, протягом періоду лікування або після нього суб'єкт може мати підвищену здатність переносити фізичні навантаження або активність.
Будь-яку придатну систему вимірювання здатності переносити фізичні навантаження можна застосовувати для визначення того, чи має суб'єкт підвищену здатність переносити фізичні навантаження або активність. Однією придатною системою вимірювання є тест з б6-хвилинною ходьбою (6ММУТ), за допомогою якого вимірюють те, як далеко суб'єкт може пройти за 6 хвилин, тобто пройдену відстань за 6 хвилин (6МУУО). В одному варіанті здійснення способи за даним винаходом забезпечують для суб'єкта збільшення ЄМУМО від вихідного рівня щонайменше до значення, яке відповідає щонайменше приблизно 10 хвилинам, наприклад, приблизно 10, 15, 20 або приблизно 30 хвилинам.
Терапевтично ефективна кількість і профілактично ефективна кількість засобу для ЕМАЇ за даним винаходом також включає кількість, яка поліпшує один або декілька параметрів якості життя порівняно з вихідним рівнем, наприклад, забезпечує збільшення балу щонайменше за однією з функціональних шкал анкети оцінки стану здоров'я 5Е-36Ф; та/або збільшення тривалості життя; та/або зменшення частоти госпіталізацій.
Можна застосовувати будь-яку придатну систему вимірювання якості життя. Наприклад, в анкеті оцінки стану здоров'я 5Е-36Ф представлена самозаповнювана багатопунктова шкала, за якою вимірюють вісім параметрів здоров'я: фізичне функціонування, обмеження рольового функціонування через проблеми з фізичним здоров'ям, інтенсивність болю, загальний стан здоров'я, життєву активність (енергійність та втому), соціальне функціонування, обмеження рольового функціонування через емоційні проблеми та психічне здоров'я (психологічний дистрес та психологічне благополуччя). В анкеті також представлено узагальнений фізичний компонент та узагальнений психічний компонент. В одному варіанті здійснення способи за даним винаходом забезпечують для суб'єкта поліпшення щонайменше одного з параметрів ЗЕ- 36, пов'язаних із фізичним здоров'ям (фізичного здоров'я, рольового функціонування, зумовленого фізичним станом, інтенсивності болю та/або загального стану здоров'я), та/або щонайменше одного з параметрів 5Е-36, пов'язаних із психічним здоров'ям (життєвої активності, соціального функціонування, рольового функціонування, зумовленого емоційним станом, та/або психічного здоров'я), порівняно з вихідним рівнем. Таке поліпшення може
Зо виражатися у збільшенні будь-якого одного або декількох параметрів щонайменше на 1 одиницю шкали, наприклад, щонайменше на 2 або щонайменше на З одиниці.
За допомогою способів за даним винаходом можна також поліпшити прогноз для суб'єкта, якого піддають лікуванню. Наприклад, способи за даним винаходом можуть забезпечувати для суб'єкта зниження ймовірності настання явища клінічного погіршення протягом періоду лікування.
Дозу засобу для КМАЇ, яку вводять суб'єкту, можна підібрати, врівноважуючи ризики і користі конкретної дози, наприклад, для досягнення потрібного рівня пригнічення експресії гена ТТК (який визначають, наприклад, виходячи з пригнічення експресії мРНК ТТЕ, експресії білка ТТК або зниження відкладання амілоїду, як визначено вище) або потрібного терапевтичного або профілактичного ефекту, водночас уникаючи небажаних побічних ефектів.
В одному варіанті здійснення засіб на основі ІЕМА за даним винаходом вводять суб'єкту в дозі за вагою. "Доза за вагою" (наприклад, доза в мг/кг) являє собою дозу засобу на основі
ІЕМА, яка буде змінюватися залежно від ваги суб'єкта. В іншому варіанті здійснення засіб на основі ІКМА вводять суб'єкту у фіксованій дозі. "Фіксована доза" (наприклад, доза в мг) означає, що для всіх суб'єктів застосовують одну дозу засобу на основі ІКМА незалежно від будь-яких конкретних пов'язаних із суб'єктом факторів, таких як вага. В одному конкретному варіанті здійснення фіксована доза засобу на основі ІЇБМА за даним винаходом встановлена з урахуванням попередньо визначених ваги або віку.
Суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість ІЕМА, як, наприклад, приблизно 0,01 мг/кг, 0,02 мг/кг, 0,03 мг/кг, 0,04 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,2 мг/кг, 0,25 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,35 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,45 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,55 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,65 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,75 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,85 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,95 мг/кг, 1,0 мг/кг, 1,1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,3 мг/кг, 1,4 мг/кг, 1,5 мг/кг, 1,6 мг/кг, 1,7 мг/кг, 1,8 мг/кг, 1,9 мг/кг, 2,0 мг/кг, 2,1 мг/кг, 2,2 мг/кг, 2,3 мг/кг, 2,4 мг/кг, 2,5 мг/кг а5ЕМА, 2,6 мг/кг азЕМА, 2,7 мг/кг азеМА, 2,8 мг/кг азеЕМА, 2,9 мг/кг азеМА, 3,0 мг/кг азеМА, 3,1 мг/кг азхеМА, 3,2 мг/кг азКМА, 3,3 мг/кг а5зЕМА, 3,4 мг/кг азЕМА, 3,5 мг/кг а5КМА, 3,6 мг/кг азКМА, 3,7 мг/кг а5зЕеМА, 3,8 мг/кг азеМА, 3,9 мг/кг азеМА, 4,0 мг/кг азЕеЕМА, 4,1 мг/кг азеЕМА, 4,2 мг/кг а5еМА, 4,3 мг/кг азЕМА, 4,4 мг/кг азеМА, 4,5 мг/кг азеЕМА, 4,6 мг/кг азеМА, 4,7 мг/кг азеМА, 4,8 мг/кг азеМА, 4,9 мг/кг азеЕМА, 5,0 мг/кг азЕМА, 5,1 мг/кг азеЕМА, 5,2 мг/кг азеЕМА, 5,3 мг/кг азеМА, 5,4 мг/кг азеМА, 5,5 мг/кг азеМА, 5,6 мг/кг азеМА, 5,7 мг/кг азЕМА, 5,8 мг/кг азеЕМА, 5,9 мг/кг азеМА, 6,0 60 мг/кг азКМА, 6,1 мг/кг азЕМА, 6,2 мг/кг а5КМА, 6,3 мг/кг азЕеМА, 6,4 мг/кг азКМА, 6,5 мг/кг азеЕМА,
6,6 мг/кг азеЕМА, 6,7 мг/кг азЕМА, 6,8 мг/кг азеМА, 6,9 мг/кг азеЕМА, 7,0 мг/кг азЕеЕМА, 7,1 мг/кг азеМА, 7,2 мг/кг азеМА, 7,3 мг/кг азеМА, 7,4 мг/кг азеМА, 7,5 мг/кг азеМА, 7,6 мг/кг азеМА, 7,7 мг/кг азЕМА, 7,8 мг/кг азеМА, 7,9 мг/кг азеЕМА, 8,0 мг/кг азеМА, 8,1 мг/кг азеМА, 8,2 мг/кг азеМА, 8,3 мг/кг азЕМА, 8,4 мг/кг азеЕМА, 8,5 мг/кг азеМА, 8,6 мг/кг азеЕМА, 8,7 мг/кг азеМА, 8,8 мг/кг а5КМА, 8,9 мг/кг азеЕМА, 9,0 мг/кг а5зКМА, 9,1 мг/кг азКМА, 9,2 мг/кг азЕМА, 9,3 мг/кг азКМА, 9,4 мг/кг азЕМА, 9,5 мг/кг азеМА, 9,6 мг/кг азеЕМА, 9,7 мг/кг азеМА, 9,8 мг/кг азеМА, 9,9 мг/кг азеМА, 9,0 мг/кг азеМА, 10 мг/кг азЕМА, 15 мг/кг азЕМА, 20 мг/кг азеЕМА, 25 мг/кг азхЕМА, 30 мг/кг азхеМА, 35 мг/кг а5зеМА, 40 мг/кг а5КЕМА, 45 мг/кг азКМА або приблизно 50 мг/кг азКМА. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
У певних варіантах здійснення, наприклад, якщо композиція за даним винаходом містить а5зКМА, описану в даному документі, та ліпід, суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість
ІЕМА, як, наприклад, від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,2 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,2 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,3 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,3 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,4 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,4 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 1,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 1,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 2 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг, від приблизно 2 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно З мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно З мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 3,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 4,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 5,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно б мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 6,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 7 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 7,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 8 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 8,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 9 мг/кг до
Ко) приблизно 10 мг/кг або від приблизно 9,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
Наприклад, а5ЕМА можна вводити в дозі, що становить приблизно 0,1,0,2,0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,0,8,0,9,1,1,1,1,2,1,3,1,4,1,5,1,6,1,7,1,8,1,952,21,22,2,3,2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, З, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,4,1,4,2,4,3,44, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6,5,7,5,8,5,9,6,6,1,6,2,6,3,6,4,6,5,6,6,6,7,6,8,6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9, 91, 92, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 або приблизно 10 мг/кг. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
У деяких варіантах здійснення, наприклад, якщо композиція за даним винаходом містить а5КМА, описану в даному документі, та М-ацетилгалактозамін, суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість ІЕМА, як, наприклад, від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,01 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,05 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,15 мг/кг до приблизно З мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,2 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,2 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,3 мг/кг до приблизно З мг/кг, від приблизно 0,3 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,3 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,4 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,4 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 0,6 мг/кг до приблизно З мг/кг, від
БО приблизно 1 мг/кг до приблизно З мг/кг, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 1 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 1,25 мг/кг до приблизно З мг/кг, від приблизно 1,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 1,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 2 мг/кг до приблизно 2,5 мг/кг, від приблизно 2 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно З мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно З мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 3,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4,5 мг/кг до приблизно 5 мг/кг, від приблизно 4 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 4,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 5,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно б мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 6,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 7 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від 60 приблизно 7,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 8 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 8,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг, від приблизно 9 мг/кг до приблизно 10 мг/кг або від приблизно 9,5 мг/кг до приблизно 10 мг/кг. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
Наприклад, 85ЕМА можна вводити в дозі, що становить приблизно 0,1,0,15,0,2,0,3,0,4, 0,5, 0,6,0,7,0,8,0,951,1,1,1,2,1,25,1,3,1,4,1,5,1,6,1,7,1,5,1,992,21,22,2,3,2,4,2,5, 2,6, 2,7, 2,8,2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,4,1,42, 43,44, 4,5, 4,6, 4,7,4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8,5,9,6,6,1,6,2,6,3,6,4,6,5,6,6,6,7,6,8,6,9, 7, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9,8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5,8,6, 8,7, 8,8,8,9,9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 або приблизно 10 мг/кг. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
В інших варіантах здійснення, наприклад, якщо композиція за даним винаходом містить а5зКМА, описану в даному документі, та М-ацетилгалактозамін, суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість ІЕМА, як, наприклад, дозу, що становить від приблизно 0,1 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 0,25 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 0,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 0,75 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 1 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 1,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 2 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 2,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно З до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 3,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 4 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 4,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 7,5 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 10 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 15 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 30 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 35 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 40 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 45 до приблизно 50 мг/кг, від приблизно 0,1 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 0,25 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 0,5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 0,75 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 1 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 1,5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 2 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 2,5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно З до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 3,5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 4 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 4,5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 5 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 7,5 до приблизно
Ко) 45 мг/кг, від приблизно 10 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 15 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 30 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 35 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 40 до приблизно 45 мг/кг, від приблизно 0,1 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 0,25 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 0,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 0,75 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 1 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 1,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 2 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 2,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно З до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 3,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 4 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 4,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 7,5 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 10 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 15 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 30 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 35 до приблизно 40 мг/кг, від приблизно 0,1 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 0,25 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 0,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 0,75 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 1 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 1,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 2 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 2,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно З до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 3,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 4 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 4,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 7,5 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 10 до приблизно 30
БО мг/кг, від приблизно 15 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 20 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 25 до приблизно 30 мг/кг, від приблизно 0,1 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 0,25 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 0,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 0,75 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 1 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 1,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 2 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 2,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно З до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 3,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 4 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 4,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 7,5 до приблизно 20 мг/кг, від приблизно 10 до приблизно 20 мг/кг або від приблизно 15 до приблизно 20 мг/кг. В одному варіанті здійснення, якщо композиція за даним винаходом містить азКМА, описану в даному 60 документі, та М-ацетилгалактозамін, суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість від приблизно 10 до приблизно 30 мг/кг а5КМА. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
Наприклад, суб'єктам можна вводити терапевтичну кількість ІЕМА, як, наприклад, приблизно 01,0,2,0,3,0,4,0,5,0,6,0,7,0,8,0,9,1,1,1,1,2,1,25,1,3,1,4,1,5,1,6,1,7,1,8,1,992,21,2,2, 2,3,2,4,2,5,2,6,2,7,2,8,2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9,4,4,1,4,2,4,3,4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9,6,6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9,8, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9,9, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5, 21, 21,5, 22, 22,5, 23, 23,5, 24, 24,5, 25, 25,5, 26, 26,5, 27, 27,5, 28, 28,5, 29, 29,5, 30, 31, 32, 33, 34, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, А1, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 або приблизно 50 мг/кг. Значення і діапазони, проміжні щодо перелічених значень, також вважаються частиною даного винаходу.
У деяких варіантах здійснення засіб для КМАї вводять у фіксованій дозі, що становить від приблизно 25 мг до приблизно 900 мг, наприклад, від приблизно 25 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 650 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 550 мг, від приблизно 25 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 650 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 550 мг, від приблизно 100 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 650 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 550 мг, від приблизно 200 мг до приблизно 500 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 650 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 550 мг, від приблизно 300 мг до приблизно 500 мг, від
Ко) приблизно 400 мг до приблизно 850 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 800 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 750 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 700 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 650 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 600 мг, від приблизно 400 мг до приблизно 550 мг або від приблизно 400 мг до приблизно 500 мг.
У деяких варіантах здійснення засіб для КЕМАі вводять у фіксованій дозі, що становить приблизно 12,5 мг, приблизно 15 мг, приблизно 20 мг, приблизно 25 мг, приблизно 30 мг, приблизно 35 мг, приблизно 40 мг, приблизно 45 мг, приблизно 50 мг, приблизно 55 мг, приблизно 60 мг, приблизно 65 мг, приблизно 70 мг, приблизно 75 мг, приблизно 80 мг, приблизно 85 мг, приблизно 90 мг, приблизно 95 мг, приблизно 100 мг, приблизно 110 мг, приблизно 120 мг, приблизно 125 мг, приблизно 130 мг, приблизно 140 мг, приблизно 150 мг, приблизно 160 мг, приблизно 170 мг, приблизно 175 мг, приблизно 180 мг, приблизно 190 мг, 200 мг, приблизно 225 мг, приблизно 250 мг, приблизно 275 мг, приблизно 300 мг, приблизно 325 мг, приблизно 350 мг, приблизно 375 мг, приблизно 400 мг, приблизно 425 мг, приблизно 450 мг, приблизно 475 мг, приблизно 500 мг, приблизно 525 мг, приблизно 550 мг, приблизно 575 мг, приблизно 600 мг, приблизно 625 мг, приблизно 650 мг, приблизно 675 мг, приблизно 700 мг, приблизно 725 мг, приблизно 750 мг, приблизно 775 мг, приблизно 800 мг, приблизно 825 мг, приблизно 850 мг, приблизно 875 мг або приблизно 900 мг.
У певних варіантах здійснення засіб для КМАі вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575 або приблизно 600 мг один раз на квартал (тобто один раз на три місяці). В одному варіанті здійснення введення являє собою підшкірне введення, наприклад, самостійне введення за допомогою, наприклад, попередньо заповненого шприца або автоматичного медичного шприца. У деяких варіантах здійснення доза засобу для ЕМАЇ для підшкірного введення міститься в об'ємі, який є меншим за один мл або дорівнює одному мл, наприклад, фармацевтично прийнятного носія.
У деяких варіантах здійснення засіб для КМАії вводять двома або більше дозами. За необхідності полегшити проведення повторюваних або частих інфузій, може бути доцільною імплантація пристрою для доставки, наприклад, насоса, напівпостійного стента (наприклад, внутрішньовенного, внутрішньочеревного, інтрацистернального або внутрішньосуглобового) або ємності. У деяких варіантах здійснення число або кількість послідовних доз залежить від 60 досягнення необхідного ефекту, наприклад, пригнічення експресії гена ТТЕ, або досягнення терапевтичного або профілактичного ефекту, наприклад, зниження відкладання амілоїду або зниження інтенсивності симптому ТТК-асоційованого захворювання.
У деяких варіантах здійснення засіб для КМАЇї вводять відповідно до схеми. Наприклад, засіб для КЕМАїЇ можна вводити два рази на тиждень, три рази на тиждень, чотири рази на тиждень або п'ять разів на тиждень. У деяких варіантах здійснення схема передбачає введення з рівними інтервалами, наприклад, один раз на годину, кожні чотири години, кожні шість годин, кожні вісім годин, кожні дванадцять годин, один раз на день, кожні 2 дні, кожні З дні, кожні 4 дні, кожні 5 днів, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на місяць або один раз на три місяці. В одному варіанті здійснення дозу, що становить 0,3 мг/кг, 0,6 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2, 2,5 мг/кг або З мг/кг, вводять один раз на місяць. В іншому варіанті здійснення дозу, що становить 0,3 мг/кг, 0,6 мг/кг, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2, 2,5 мг/кг або З мг/кг, вводять один раз на три місяці.
В інших варіантах здійснення схема передбачає введення з невеликим інтервалом з подальшим більш тривалим періодом часу, протягом якого засіб не вводять. Наприклад, схема може передбачати початковий набір доз, які вводять за порівняно короткий період часу (наприклад, приблизно кожні 6 годин, приблизно кожні 12 годин, приблизно кожні 24 години, приблизно кожні 48 годин або приблизно кожні 72 години), з наступним більш тривалим періодом часу (наприклад, приблизно 1 тиждень, приблизно 2 тижні, приблизно З тижні, приблизно 4 тижні, приблизно 5 тижнів, приблизно 6 тижнів, приблизно 7 тижнів, приблизно 8 тижнів, приблизно 9 тижнів, приблизно 10 тижнів, приблизно 11 тижнів або приблизно 12 тижнів), протягом якого засіб для ЕМАЇї не вводять. В одному варіанті здійснення засіб для ЕМАЇ спочатку вводять один раз на годину, а згодом вводять з тривалішим інтервалом (наприклад, один раз на день, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на місяць або один раз на три місяці). В іншому варіанті здійснення засіб для КМАЇї спочатку вводять один раз на день, а згодом вводять з тривалішим інтервалом (наприклад, один раз на тиждень, один раз на два тижні, один раз на місяць або один раз на три місяці). У певних варіантах здійснення триваліший інтервал збільшується з плином часу, або його визначають, виходячи з досягнення потрібного ефекту.
У конкретному варіанті здійснення засіб для ЕМАі вводять один раз на день протягом
Ко) першого тижня з наступним введенням доз один раз на тиждень, один раз на місяць або один раз на три місяці, починаючи з восьмого дня введення. В іншому конкретному варіанті здійснення засіб для КМАЇ вводять через день протягом першого тижня з наступним введенням доз один раз на тиждень, один раз на місяць або один раз на три місяці, починаючи з восьмого дня введення. В іншому варіанті здійснення засіб для КМАЇї вводять один раз на день протягом п'яти днів першого тижня з наступним введенням доз один раз на тиждень, один раз на місяць або один раз на три місяці.
Будь-яку з цих схем необов'язково можна повторювати із забезпеченням одного або декількох повторів. Число повторів може залежати від досягнення потрібного ефекту, наприклад, пригнічення експресії гена ТТЕ, рівня ретинол-зв'язувального білка, рівня вітаміну А, та/лабо досягнення терапевтичного або профілактичного ефекту, наприклад, зниження відкладання амілоїду або зниження інтенсивності симптому ТТК-асоційованого захворювання.
У деяких варіантах здійснення засіб для ЕМАї вводять разом з іншими терапевтичними засобами або іншими схемами терапії. Наприклад, інші засоби або інші схеми терапії, придатні для лікування ТТК-асоційованого захворювання, можуть включати трансплантацію печінки, за допомогою якої можна знизити рівні мутантного ТТК в організмі; тафамідіс (віндакель), який кінетично стабілізує тетрамерний ТТК, попереджаючи дисоціацію тетрамеру, необхідну для амілоїдогенезу ТТК; та діуретики, які можна використовувати, наприклад, для зменшення набряку у випадку пов'язаного з ТТК амілоїдозу із залученням серця.
В одному варіанті здійснення суб'єкту вводять початкову дозу та одну або декілька підтримувальних доз засобу для КМАЇї. Підтримувальна доза або дози можуть бути такими ж, як і початкова доза, або нижчими за неї, наприклад, становити половину початкової дози. Схема підтримувальної терапії може включати лікування суб'єкта дозою або дозами в діапазоні від 0,01 мкг до 15 мг/кг ваги тіла на день, наприклад, 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг, 2,5 мг/кг, З мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 10 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,15 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,01 мг/кг, 0,001 мг/кг або 0,00001 мг/кг ваги тіла на день, або дозою або дозами, що становлять від приблизно 12,5 мг до приблизно 900 мг, наприклад, приблизно 25 мг, приблизно 30 мг, приблизно 35 мг, приблизно 40 мг, приблизно 45 мг, приблизно 50 мг, приблизно 55 мг, приблизно 60 мг, приблизно 65 мг, приблизно 70 мг, приблизно 75 мг, приблизно 80 мг, приблизно 85 мг, приблизно 90 мг, приблизно 95 мг, приблизно 100 мг, приблизно 125 мг, приблизно 150 мг, приблизно 175 мг, 200 60 мг, приблизно 225 мг, приблизно 250 мг, приблизно 275 мг, приблизно 300 мг, приблизно 325 мг,
приблизно 350 мг, приблизно 375 мг, приблизно 400 мг, приблизно 425 мг, приблизно 450 мг, приблизно 475 мг, приблизно 500 мг, приблизно 525 мг, приблизно 550 мг, приблизно 575 мг, приблизно 600 мг, приблизно 625 мг, приблизно 650 мг, приблизно 675 мг, приблизно 700 мг, приблизно 725 мг, приблизно 750 мг, приблизно 775 мг, приблизно 800 мг, приблизно 825 мг, приблизно 850 мг, приблизно 875 мг або приблизно 900 мг на тиждень. Підтримувальні дози, наприклад, вводять не частіше ніж один раз на 2 дні, один раз на 5 днів, один раз на 7 днів, один раз на 10 днів, один раз на 14 днів, один раз на 21 день, один раз на 30 днів або один раз на 90 днів. Крім того, схема лікування може зберігатися протягом періоду часу, який буде варіюватися залежно від природи конкретного захворювання, його тяжкості та загального стану пацієнта. У певних варіантах здійснення дозу можна доставляти не частіше ніж один раз на день, наприклад, не частіше ніж один раз на 24, 36, 48 або більше годин, наприклад, не частіше ніж один раз на 5 або 8 днів. Після лікування в пацієнта можна контролювати зміни його/її стану.
Дозу засобу для ЕМАЇ можна збільшити у випадку, якщо пацієнт незначною мірою відповідає на поточні рівні доз, або дозу можна зменшити, якщо спостерігається полегшення симптомів хворобливого стану, якщо хворобливий стан був послаблений або у разі спостереження небажаних побічних ефектів.
МІ. Набори
У даному винаході також передбачено набори для здійснення будь-якого зі способів за даним винаходом. Такі набори містять один або декілька засобів для ЕКМАЇ та інструкції із застосування, наприклад, інструкції щодо інгібування експресії ТТ в клітині шляхом приведення клітини в контакт із засобом(засобами) для ЕМАЇї в кількості, ефективній для інгібування експресії ТТ. Набори можуть необов'язково додатково містити засоби для приведення клітини в контакт із засобом для ЕМАЇї (наприклад, пристрій для ін'єкції або інфузійний насос) або засоби для вимірювання ступеня інгібування експресії ТТЕ (наприклад, засоби для вимірювання ступеня інгібування експресії мРНК ТТЕ або білка ТТЕ). Такі засоби для вимірювання ступеня інгібування експресії ТТЕ можуть включати в себе засоби для одержання зразка від суб'єкта, такого як, наприклад, зразка плазми крові. Набори за даним винаходом необов'язково можуть додатково містити засоби для введення засобу(засобів) для
ЕМАЇ суб'єкту або засоби для визначення терапевтично ефективної або профілактично
Зо ефективної кількості.
Засоби для КМАЇ, придатні для включення в набори за даним винаходом, включають будь- які з засобів для КМАЇ, наведені в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 або 7. В одному варіанті здійснення засіб для ЕМАЇ вибраний із групи, що складається з АЮ-66016, АО-65492, АО-66017 та АО-66018.
Засіб для КЕМАЇ може бути передбачений у будь-якій зручній формі, такій як розчин у стерильній воді для ін'єкцій. Наприклад, засіб для ЕМАі може бути передбачений у вигляді розчину з концентрацією 500 мг/мл, 450 мг/мл, 400 мг/мл, 350 мг/мл, 300 мг/мл, 250 мг/мл, 200 мг/мл, 150 мг/мл, 100 мг/мл або 50 мг/мл у стерильній воді для ін'єкцій.
Даний винахід додатково проілюстровано наступними прикладами, які не слід тлумачити як обмежувальні. Зміст усіх посилань та опублікованих патентів і заявок на патенти, цитованих у всій даній заявці, таким чином включено в даний документ за допомогою посилання.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Стабільність та активність сайленсингу іп міго в хімічно модифікованих засобів для КМАЇ, які цілеспрямовано впливають на ТтК
У наступних експериментах було продемонстровано сприятливі ефекти певних хімічних модифікацій, які включають не більше 8 2'-фтор-модифікацій на сенсовій нитці, не більше 6 2'- фтор-модифікацій на антисенсовій нитці, шість фосфотіоатних міжнуклеотидних зв'язків та ліганд, наприклад ліганд саіМАсз, щодо активності сайленсингу в засобів для КМАЇ, які цілеспрямовано впливають на ТТК. Послідовності досліджуваних засобів наведені в таблиці 1 нижче.
Послідовності біЕБМА для ТТК синтезували в 1-мікромолярному масштабі на синтезаторі
Мегтаде 192 (ВіоАшотайоп) з використанням фосфорамідатної хімії за опосередкування твердої основи. Тверда основа являла собою скляну основу з заданим розміром пор (500 А), навантажену спеціально розробленим лігандом СсаїЇМАс, або універсальну тверду основу (АМ
Віоспептіса!). Допоміжні реагенти для синтезу, 2-Е- та 2-О-метил-РНК («ла дезоксифосфорамідити, одержували від Тпегто-Різпег (Мілуокі, Вісконсин) та Нопдепе (Китай). 2'Е, 2'-О-метил, ОМА (глікольнуклеїнові кислоти), 5'-фосфат та модифікації видалення азотистої основи вводили 3 використанням відповідних фосфорамідитів. Синтез окремих ниток, кон'югованих із самМАс на 3'-кінці, здійснювали на модифікованій саМАс СРО-основі. бо Спеціально розроблену універсальну тверду СРО-основу застосовували для синтезу окремих антисенсових ниток. Час зв'язування для всіх фосфорамідитів (100 мМ в ацетонітрилі) становив хвилин з використанням 5-етилтіо-1 Н-тетразолу (ЕТТ) як активатора (0,6 М в ацетонітрилі).
Фосфотіоатні зв'язки утворювали З використанням 50 ММ розчину 3- ((диметиламінометиліден)аміно)-3іН-1,2,4-дитіазол-З-тіону (0ОТТ, одержаного від Спетдепев5 5 (Вілмінгтон, Массачусетс, США)) у безводному ацетонітрилі/піридині (1:1 об'єм/об'єм). Час окиснення становив З хвилини. Всі послідовності синтезували з видаленням зрештою групи
ОМТ (без ОМТ").
Після завершення твердофазного синтезу олігорибонуклеотиди відщеплювали від твердої основи, і з них видаляли захисні групи в запечатаних планшетах із 96 глибокими лунками з використанням 200 мкл реагента, що являє собою водний метиламін, при 60 "С протягом 20 хвилин. Наприкінці стадії відщеплення та видалення захисних груп планшету для синтезу дозволяли нагрітися до кімнатної температури, і його вміст осаджували шляхом додавання 1 мл суміші ацетонітрил'етанол (9:11). Планшети охолоджували при -80"С протягом 2 год., і надосадову рідину обережно зливали за допомогою багатоканальної піпетки. Осад з олігонуклеотидами ресуспендували в 20 мМ буфера МаоОАс та знесолювали з використанням колонки для ексклюзійної хроматографії НіТгар на 5 мл (СЕ Неайвсаге) на системі АКТА Ригійег, обладнаній пристроєм автоматичної подачі зразків АЗО5 та колектором фракцій Егас 950.
Знесолені зразки збирали в 96-лункові планшети. Зразки з кожної послідовності аналізували за допомогою І С-М5 для підтвердження ідентичності, УФ-випромінювання (260 нм) для кількісного визначення, а вибраний набір зразків аналізували за допомогою ІЕХ-хроматографії для визначення чистоти.
Гібридизацію окремих ниток ТТК здійснювали на автоматичному пристрої Тесап для маніпуляції з рідинами. Еквімолярні суміші сенсових та антисенсових окремих ниток об'єднували та забезпечували гібридизацію в 9б-лункових планшетах. Після об'єднання окремих комплементарних ниток 96-лунковий планшет щільно запечатували та нагрівали в печі при 100 "С протягом 10 хвилин, і йому дозволяли повільно досягти кімнатної температури протягом періоду 2-3 годин. Концентрацію кожного дуплекса нормалізували до 10 мкМ в 1Х
РВ5.
Ці дуплекси аналізували стосовно метаболічної стабільності іп міго за допомогою аналізу
Зо стабільності в цитозолі пацюків. Для проведення такого аналізу цитозоль печінки самиці пацюка (Хепоїесі, Мо за кат. К1500.С) розморожували до кімнатної температури і розводили до 1 мг/мл у 50 мМ буфері Тгіб5-НСЇІ, рН 7,4, 5 мМ МосіІ2. Зразки для моменту часу двадцять чотири години одержували шляхом змішування 100 мкл 1 мг/мл цитозолю з 25 мкл 0,4 мг/мл зразка 5ікМА у мікроцентрифужній пробірці та інкубування протягом 24 годин в термоміксері для пробірок
Еррепаогі зі встановленими параметрами 37 "С та 300 об./хв. Після 24 годин інкубування до кожного зразка додавали 300 мкл завантажувального буфера для лізису Рпепотепех (Мо за кат.
АІ 0-8498) та 12,5 мкл 0,4 мг/мл внутрішнього стандарту 5іеМА. Зразки для моменту часу нуль годин одержували шляхом змішування 100 мкл 1 мг/мл цитозолю з 25 мкл 0,4 мг/мл зразка 5ікМА, 300 мкл завантажувального буфера для лізису Рпепотепех та 12,5 мкл 0,4 мг/мл внутрішнього стандарту зікМА. 5ІКМА екстрагували зі зразків для моменту часу 24 години та зразків для моменту часу 0 годин із використанням стартового набору Рпепотепех Сіагу ОТХ (Мо за кат. КБО-8494). Після екстрагування зразків їх переносили в мікроцентрифужну пробірку та повністю висушували за допомогою концентратора І абсопсо СепігімМар (Мо за кат. 7810010).
Потім зразки ресуспендували за допомогою 500 мкл води, яка не містила нуклеаз. П'ятдесят мкл кожного зразка проганяли на Адіїепі Тесппоїодіез 1260 Іпппйу Віпагу С в системі Адіїепі
Тесппоодіеє 6130 для квадрупольної ГС/М5. Прогін в аналізі здійснювали з використанням двоколонкової схеми організації в режимі регенерації. Прогін здійснювали за допомогою способу, який передбачає використання насоса для чотирикомпонентних сумішей, протягом 12,20 хвилин зі швидкістю 0,400 мл/хв. за наступним графіком. 595 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НРЇР), 9595 буфера В (10095 метанол) 595 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НРЇР), 9595 буфера В (10095 метанол)
Прогін здійснювали за допомогою способу, який передбачає використання насоса для двокомпонентних сумішей, протягом 12,20 хв. зі швидкістю 0,700 мл/хв. за наступним графіком.
6000 (10096буферад(16бмМТЕА, 200 ММ НРІ)Ї //:////:/3//:/: 5 6095 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НРЇІР), 4095 буфера В (10095 АСМ)
Температуру як лівої, так і правої колонки було встановлено на 75,00 С. Уф-сигнал вимірювали на довжині хвилі 260 нм. Відсотковий залишок кожної нитки розраховували за допомогою наступного рівняння:
Фо залишку нитки - 100(площа піканитка 24 год/ площа піканитка о год. (ПЛОЩІ Пікастандарт 24 гд/ ПЛОЩА піКастандарт 0 год.)).
Результати цих двадцятичотирьохгодинних аналізів стабільності в цитозолі демонструють, що всі дуплекси мають високу стабільність.
Підгрупу цих засобів також оцінювали стосовно метаболічної стабільності іп мійго за допомогою аналізу стабільності у тритосомах. Для аналізів стабільності у тритосомах тритосоми печінки щурів (продукт РК14044, спеціально розроблений Хепоїесп) розморожували до кімнатної температури та розводили до 0,5 одиниці/мл кислої фосфатази в буфері з 20 мМ цитрату натрію, рН 5,0. Зразки для моменту часу двадцять чотири години одержували шляхом змішування 100 мкл 0,5 одиниці/мл тритосом з кислою фосфатазою з 25 мкл 0,4 мг/мл зразка 5іКМА в мікроцентрифужній пробірці та інкубування протягом двадцяти чотирьох годин в термоміксері для пробірок Еррепадогі зі встановленими параметрами 37 "С та 300 об./хв. Після двадцяти чотирьох годин інкубування до кожного зразка додавали 300 мкл завантажувального буфера для лізису Рпепотепех (Мо за кат. АГО-8498) та 12,5 мкл 0,4 мг/мл внутрішнього стандарту 5ікМА. Зразки для моменту часу 0 годин одержували шляхом змішування 100 мкл 0,5 одиницілмл тритосом з кислою фосфатазою з 25 мкл 0,4 мг/мл зразка 5ікМА, 300 мкл завантажувального буфера для лізису Рпепотепех та 12,5 мкл 0,4 мг/мл внутрішнього стандарту зікМА. 5ІКМА екстрагували зі зразків для моменту часу двадцять чотири години та зразків для моменту часу 0 годин із використанням стартового набору Рпепотепех Сіагу ОТХ (Мо за кат. КБО-8494). Після екстрагування зразків їх переносили в мікроцентрифужну пробірку та повністю висушували за допомогою концентратора І арсопсо СепігіМар (Мо за кат. 7810010).
Потім зразки ресуспендували за допомогою 500 мкл води, яка не містила нуклеаз. П'ятдесят мкл кожного зразка проганяли на Адііїепі ТесппоЇодієх 1260 Іппїпйу Віпагу С в системі Адіїепі
Тесппоодіеє 6130 для квадрупольної ГС/М5. Прогін в аналізі здійснювали з використанням
Зо двоколонкової схеми організації в режимі регенерації. Прогін здійснювали за допомогою способу, який передбачає використання насоса для чотирикомпонентних сумішей, протягом 12,20 хвилин зі швидкістю 0,400 мл/хв. за наступним графіком. 595 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НРЇР), 9595 буфера В (10095 метанол) 595 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НЕЇР), 9595 буфера В (10095 метанол)
Прогін здійснювали за допомогою способу, який передбачає використання насоса для двокомпонентних сумішей, протягом 12,20 хв. зі швидкістю 0,700 мл/хв. за наступним графіком. 6000 (10096буферад(16бмМТЕА, 200 ММ РІ) //:///СС://: 5: з 6095 буфера А (16 мМ ТЕА, 200 мМ НРЇІР), 4095 буфера В (10095 АСМ)
Температуру як лівої, так і правої колонки було встановлено на 75,00 С. Уф-сигнал вимірювали на довжині хвилі 260 нм. Відсотковий залишок кожної нитки розраховували за допомогою наступного рівняння:
Фо залишку нитки - 100(площа піканитка 24 год/ площа піканитка о год. (ПЛОЩІ Пікастандарт 24 гд/ ПЛОЩА піКастандарт 0 год.)).
Результати двадцятичотирьохгодинних аналізів стабільності у тритосомах, наведені на фігурі 1, демонструють, що всі дуплекси мають високу стабільність у тритосомах.
Таблиця 1
Модифіковані послідовності сенсової та антисенсової ниток ОБКЕМА для ТтК
ЗЕ ІО . . | 5Е
ІО Іо .І Послідовність сенсової нитки, | ОО Іантисен Послідовність антисенсової (Ф. сенсової б - нитки, дуплекса НИТКИ 5-3 ІО | сової в'-З ІО
МОЇ нитки МІФ) 51547 |106305 | талоАї 96 102978 | гТисСтсСтазиївс 58142 |117240 | ссталідлАі 96 117241 | аліистсСтазивс 64527 /|128512 |а! 96 128525 | исссазивс 65367 |/|128499 | ааоАІІ 96 128520 | сазивс 65489 2 /|131365 | 196 128520 | сазивс 65481 131354 | ада! 96 131364 | уисссазивс 65488 /)131354 | да! 96 131358 | исссазивс 65496 /|131354 | ада! 96 131360 | гТисссазивс 65491 128557 | ада! 96 128525 | исссазивс 65495 /|131353 | ада! 96 128516 | гТисссазивс до-/|А- ивовдоАТ ЛИСТА Шаасс | ов |А- оеСівиодоасао с а 65367 |/|128499 | аадАт 96 128520 вивс 65493 /|128512 |а! 96 131366 | сссазивс 65494 /|128512 |а! 96 1285256 | аисссазивс 64527 /|128512 |а! 96 128525 | исссазивс
Таблиця 2
Скорочення нуклеотидних мономерів, використовувані в представленні послідовності нуклеїнової кислоти. Слід розуміти, що ці мономери, якщо вони присутні в олігонуклеотиді, взаємно зв'язані між собою 5'-3'--фосфодіестерними зв'язками
Таблиця 2 (продовження) а 11111111 |2-О-МетиладенозинЗ-фосфат.у//:/ С: оС: |У Х 49 00 |2ЗО-МетилгуанозинЗ-фосфато//://:СС/:/ СС: С" "ОЇ
М трис(ЗаімАс-алкіл)-амідодеканої п) 4-тідроксипролінол-Нур-(ба!мАс-алкіл). 2-Гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфат (позбавлена азотистої основи 2'-ОМе-фураноза) 1111111 |Фосфат7/////////71111111111111111111111111111111111
Конструювали та синтезували додатковий набір засобів, які цілеспрямовано впливають на
ТТЕ. Послідовності цих засобів наведені в таблиці З нижче.
Ці додаткові засоби оцінювали в аналізах іп міго. Зокрема, ІСзо для кожного засобу на основі
ІЕМА визначали в клітинах НерзВ (лінія клітин гепатоми людини) або первинних гепатоцитах яванської макаки (І їе ТесппоЇодіе5) шляхом стандартної зворотної трансфекції за допомогою
Проїесіатіпе КМАЇМАХ. Клітини Нерзр культивували в ЕМЕМ з 1095 ЕВ5, а первинні гепатоцити яванської макаки розморожували безпосередньо перед застосуванням і культивували у УМУМЕМ з 10956 ЕВ5. Зворотну трансфекцію здійснювали шляхом додавання 5 мкл РНК-дуплекса на лунку в 384-лунковий планшет разом із 4,9 мкл Оріїі-МЕМ з 0,1 мкл Ііроїесіатіпе КМАЇМАХ на лунку (Іпмігодеп, Карлобад, Каліфорнія, Мо за кат. 13778-150) та інкубування за кімнатної температури протягом 15-20 хвилин. Потім після інкубування до кожної лунки додавали 40 мкл повного ростового середовища без антибіотиків, яке містило 5000 клітин НерзВ або первинних гепатоцитів яванської макаки. Для первинних гепатоцитів використовували планшети, вкриті колагеном. Клітини інкубували протягом 24 годин при 37 "С в атмосфері 595 СО» перед здійсненням лізису та аналізу МРНК ТТК та САРОН за допомогою КТ-ДРСК. Для визначення
ІСво оцінювали вісім різних концентрацій 5ікМА в діапазоні від 10 нМ до 0,38 ФМ, ії рівні
ТТРЕУ/ЗАРОБН для клітин, трансфікованих 5ікМА, нормалізували стосовно клітин, трансфікованих 10 нМ 5ікМА для гена люциферази.
Після інкубування із віКМА для ТТ протягом 24 годин оцінювали сайленсинг в умовах вільного поглинання у первинних гепатоцитах яванського макака. Спосіб був аналогічним описаному вище за винятком того, що 5 мкл повного ростового середовища заміняли на 5 мкл,
які містили Гіроїесіатіпе КМАЇМАХ та Оріі-МЕМ. Наступний аналіз мРНК ТТК та сАРОН здійснювали, як описано вище. Для побудування стандартної кривої залежності доза-ефект 5іКМА титрували від 500 нМ до 0,18 пМ шляхом б-разового серійного розведення за вісьмома точками.
Результати цих аналізів (наведені в таблиці 4) демонструють, що всі дуплекси дієво інгібують експресію мРНК ТТ.
Стабільність цих додаткових засобів іп мійго також оцінювали за допомогою аналізів стабільності в цитозолі та тритосомах, описаних вище.
Результати двадцятичотирьохгодинного аналізу стабільності в цитозолі наведені на фігурі 2А, а результати двадцятичотирьохгодинного аналізу стабільності у тритосомах наведені на фігурі 28, і вони демонструють, що всі дуплекси мають високу стабільність у тритосомах і цитозолі пацюків.
Таблиця З
Модифіковані послідовності сенсової та антисенсової ниток аО5КМА для ТТК
ІО ІО Послідовність сенсової ФЕО ІО Послідовність антисенсової ФЕО дуплекс |сенсово нитки, р мо |знтисенсо нитки, І МО а ї нитки 5-3 вої нитки 5-3 66016 |131354 | ссаада! 96 10 ссазивс або 6 65492 |131354 | ссаада! 96 10 исссавивс або 7 66017 |131354 | ссаада! 96 10 Тисссавивс або 8 66018 |131354 | ссаада! 96 10 аАйтисссавивс або 9
Таблиця 4
Активність додаткових засобів для ЕМАЇ ТТЕ іп міто о |АО-66016(65367А5) АО-65492(0) | АО-66017(00) | АО-66018(УРи)
Вільне Вільне Вільне Вільне ія ня ія ня ія ня ія ня відсутні відсутні відсутні відсутні
Гепатоци ти Я 0235 | 557 0,21 3,629) 0026 | 0284 | 0015 | 0191 яванської макаки
Приклад 2. Сайленсинг ТТ іп мімо
Ефективність іп мімо додаткових засобів, описаних вище, оцінювали на трансгенних мишах, які експресували варіант ТТК людини із заміною валіну 30 на метіонін (пТТК МЗОМ) (див., наприклад, Мадаїа, еї а. (1995) 9) Віоспет. 117:169-175; Коппо, єї аії. (1997) Ат у Раїтої. 150(4):1497-508). Відомо, що варіант МЗОМ ТТК спричинює в людей сімейну амілоїдну полінейропатію І типу. Див., наприклад, І орацо, Г.. (2003) У Мерпгої., 16(3):438-42.
Мишам з ТТК УЗОт у віці одинадцяти-тринадцяти місяців підшкірно вводили одноразову дозу 1 мг/кг або 2,5 мг/кг засобів, і в сироватці крові тварин визначали рівень ТТК до прийому дози та в дні 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 56, 70 та 84 після прийому дози. Коротко, рівні ТТК аналізували за допомогою валідованого твердофазного імуноферментного аналізу ТТК (ЕГІЗА) (див., наприклад, СоеїЇйо, еї аїЇ. (2013) М ЕпдІ 9У Мей 369:819). Дев'яностошестилункові імунологічні мікропланшети вкривали при 4 "С антитілом рАБр кроля до ТТК людини (Арсат) за 24 години до початку аналізу білка ТТК в сироватці крові за методом ЕГІЗА. У день аналізу планшети промивали за допомогою ТВ5-Т та блокували за допомогою 1х Роуегріоск (Віодепех)
Зо протягом 2 годин за кімнатної температури. Зразки сироватки крові розводили в 15000 разів за допомогою 1Х РомегбріоскК. Калібрувальну криву для ТТК людини за 12 точками будували з використанням стандартного білка ТТ людини (Зідта-АїІайгіси, Р1742), застосовуючи 1,6бх серійні розведення в діапазоні від 250 до 0 нг/мл. Після блокування у планшет додавали стандарти та зразки в об'ємах 100 мкл і залишали інкубуватися протягом 2 годин за кімнатної температури. Планшети промивали за допомогою ТВ5-Т та інкубували протягом 1 години за кімнатної температури з первинним антитілом вівці до ЯТТК (АбСат), розведеним 1:2500 у 1Х
Роугегріоск. Після промивання за допомгою ТВ5-Т планшети інкубували протягом 1 години за кімнатної температури зі вторинним антитілом віслюка до імуноглобулінів вівці, кон'югованим з лужною фосфатазою (АБСат), розведеним 3:10000 у 1Х РожегріосК. Планшети промивали за допомогою ТВ5-Ї і додавали одержаний субстрат (таблетки п-нітрофенілфосфату
ЗІСМАРАЗТ М) в об'ємі 100 мкл на лунку та залишали для реакції протягом 30 хвилин за кімнатної температури у темряві. Реакційні суміші гасили за допомогою 0,05 мл 1 М Маон на лунку. Поглинання при 405 нм прочитували на планшет-рідері ЗзресігамМах, і дані апроксимували 4-параметричною кривою для визначення рівнів білка ТТК у сироватці крові в мкг/мл. Рівні білків окремих тварин нормалізували стосовно їх відповідних індивідуальних значень рівнів білків у плазмі крові до прийому дози для визначення залишкової долі ТТЕ порівняно з кількістю до прийому дози.
Результати експериментів з одноразовою дозою 1 мг/кг наведені на фігурі 3, а результати експериментів з одноразовою дозою 2,5 мг/кг наведені на фігурі 4. Результати демонструють, що всі засоби дієво та тривало інгібують експресію ТТЕ з досягненням найбільшого зниження приблизно в день 7 після введення. Результати також демонструють, що в день 42 після введення одноразової дози 1 мг/кг АЮ-65492, АО-66017 або АО-66018 пригнічення експресії ТК у сироватці крові залишається на рівні більше 4095, і в день 42 після введення одноразової дози 2,5 мг/кг АО-65492 або АЮ-66018 пригнічення експресії ТТК у сироватці крові залишається на рівні більше 6095. Відновлення до початкових концентрацій ТТЕ. у сироватці крові відбувається між днями 56 та 84 після введення одноразової дози 1 мг/кг та між днями 70 та 84 після введення одноразової дози 2,5 мг/кг.
Розрахункова ефективна доза для 8095 сайленсингу в тварин (ЕЮво) становила 1 мг/кг.
Таким чином, ці дані вказують на те, що АО-65492, АО-66016, АО-66017 та АО-66018 є ефективними для лікування суб'єкта, який має ТТЕ-асоційоване порушення, за схемами
Зо введення низької дози та/або введення дози один раз на місяць.
Приклад 3. Пошукове дослідження токсичності в пацюків
На пацюках також здійснювали доклінічні дослідження токсичності АЮ-66016, АО-65492, АО- 66017 та АО-66018. Коротко, в дні 1, 8 та 15 п'яти самцям пацюків на групу підшкірно вводили дозу 30 мг/кг або 100 мг/кг АБ-66016, АО-65492, АО-66017 або АО-66018. Контрольним тваринам вводили плацебо в дні 1, 8 та 15. У день 16 всіх тварин умертвляли. До умертвіння в тварин щодня контролювали будь-які клінічні симптоми та щотижня вимірювали значення ваги тіла. Після умертвіння тваринам проводили розтин, і зразки аналізували за допомогою повної панелі біохімічних, гематологічних та коагуляційних аналізів сироватки крові, шляхом гістопатологічного аналізу печінки та нирок та стосовно концентрації печінкових трансаміназ.
Результати цих аналізів демонструють, що АЮ-66016, АО-65492, АО-66017 та АО-66018 характеризуються доброю клінічною стерпністю без небажаних клінічних ознак або змін ваги тіла.
Приклад 4. Ефективність введення декількох доз АЮ-65492 та АО-66017
Оцінювали ефект схеми введення декількох доз АЮ-65492 та АЮ-66017 стосовно експресії білка ТТЕ в мишей, трансгенних (Та9) за ЯТТК УЗОМ.
В одній групі експериментів мишам з пТТК УЗОМ у віці одинадцяти-тринадцяти місяців підшкірно вводили дозу 2 мг/кг АЮО-65492 один раз на тиждень протягом трьох тижнів (ОМУХЗ), і рівень білка ТТК визначали в сироватці крові тварин до прийому дози та в дні 7, 14, 17 та 21 після прийому дози, як описано вище.
На фігурі 5 продемонстровано, що шляхом введення АЮ-65492 Тд-мишам з ПТК УЗОМ за схемою введення доз ОМУХЗ досягалося і підтримувалося більше ніж 9095 пригнічення експресії білка ТТЕ у сироватці крові.
В іншій групі експериментів Тд-мишам з пЯТТК УЗОМ у віці одинадцяти-тринадцяти місяців підшкірно вводили АОЮ-65492 та АЮ-66017 у дозі 0,3 мг/кг один раз на місяць протягом чотирьох місяців (СМха4 у кількості 0,3 мг/кг), У дозі 1 мг/кг один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМА у кількості 1 мг/кг) або у дозі З мг/кг один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМА у кількості З мг/кг). Рівні білка ТТЕ у сироватці крові визначали, як описано вище, до прийому дози та вв дні 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 84, 91, 98 та 185 після прийому дози.
Як показано на фігурах бА-6С, рівні нокдауну ТТК в день 7 після прийому дози були бо аналогічними після прийому другої, третьої та четвертої доз, і найбільше зниження експресії
ТТЕ, яке досягалося в дозі З мг/кг, 1 мг/кг та 0,3 мг/кг, становило відповідно більше 80905, приблизно 70-8595 та приблизно 25-35965. На цих графіках також продемонстровано, що АЮ- 65492 забезпечує більш стійкий рівень сайленсингу ТТЕК, ніж АЮ-66017, протягом більше ніж 100 днів після прийому кінцевої дози, при цьому залишкове пригнічення експресії ТТК становить приблизно 6095, 4095 та приблизно 3595 при З мг/кг, 1 мг/кг та 0,3 мг/кг відповідно. Більше того, для АЮ-65492 введення декількох доз (0Мх4) має адитивний ефект у дозі 0,3 мг/кг, зумовлюючи приблизно 4095 нокдаун ТТК після прийому четвертої щомісячної дози, порівняно з першою дозою, для якої нокдаун становить приблизно 25-3595. Крім того, хоча перед кожною щомісячною дозою на всіх рівнях дози для кожного засобу спостерігалося деяке відновлення рівнів білка ТТК, як для одноразової підшкірної дози, розрахункова ефективна доза для досягнення 8095 нокдауну (ЕЮОво) у схемах введення декількох доз становила приблизно 1 мг/кг.
Таким чином, фармакодинамічна активність і кінетичні характеристики обох сполук у всіх трьох схемах введення доз були порівнянними з фармакодинамічною активністю та кінетичними характеристиками тих самих сполук у разі їх введення в одноразовій дозі.
Приклад 5. Сайленсинг ТТК у приматів, відмінних від людини
Як продемонстровано у вищенаведених прикладах, АЮ-65492 та АО-66017 характеризуються доброю стерпністю та дієво і тривало пригнічують рівні білка ТТ іп мімо.
Відповідно, ефективність АЮ-65492 та АЮОБ-66017 додатково вивчали шляхом введення різних доз і застосування різних схем введення доз цих засобів на основі ІКМА в яванських макак. На фігурі 7 наведено загальний принцип цього дослідження. Коротко, чотирьом групам, групам 1, 2, 4 та 5, підшкірно вводили одноразову дозу 0,3 мг/кг (групи 1 та 4) або одноразову дозу 1 мг/кг (групи 2 та 5) засобу на основі ІКМА. Чотирьом іншим групам, групам З та 6-8, вводили дозу 1 мг/кг один раз на місяць протягом 4 місяців (0Мха4) (групи 7 та 8) або дозу З мг/кг один раз на місяць протягом 4 місяців (0Мха4) (групи З та 6). Сироватку крові збирали у дні -7 та -1 до початку прийому дози та дні 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105 та 119 після початку прийому дози; плазму крові збирали в день 1 до прийому дози та через 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 та 168 годин після прийому дози. Рівень білка ТТК у сироватці крові визначали, як описано вище.
На фігурі ВА наведено результати дослідження з одноразовою дозою 0,3 мг/кг, на фігурі 88 наведено результати дослідження з одноразовою дозою 1 мг/кг, і на фігурі 8С наведено результати дослідження з одноразовою дозою З мг/кг. З метою порівняння на фігурі 88 також зображено ефект від введення одноразової підшкірної дози 2,5 мг/кг АЮ-51547 стосовно експресії ТІК у яванських макак, і на фігурі 8С також зображено ефект від введення одноразової підшкірної дози 5 мг/кг АЮ-51547 стосовно експресії ТТК у яванських макак. На цих графіках продемонстровано, що ЕЮОво засобів на основі ІЕМА як у випадку АО-65492, такі у випадку АЮ-66017 становить приблизно 0,3 мг/кг, що найбільше зниження експресії ТТЕ для обох доз та для обох засобів на основі ІЕМА досягається приблизно в день 28, і що АЮ-65492 є більш ефективним у пригніченні експресії білка ТТК, ніж АО-66017, на більш високому рівні дози у разі введення одноразової дози. На графіках також продемонстровано, що АЮ0-65942 забезпечує більш ніж 9095 стійке пригнічення експресії ТТК аж до дня 42 після введення одноразової дози 1 мг/кг та більш ніж 8095 пригнічення експресії ТТЕ аж до дня 63, при цьому до дня 119 після введення дози залишкове пригнічення експресії ТТК становить приблизно 4095, і що АО-66017 забезпечує максимальне пригнічення експресії ТТК на рівні 7395 після введення одноразової дози 1 мг/кг з відновленням експресії ТТК, яке починається до дня 35, і відновленням до значень у межах приблизно 2095 від вихідного рівня до дня 119 після введення дози.
На фігурі ЗА наведено результати дослідження з декількома дозами 1 мг/кг, і на фігурі 98 наведено результати дослідження з декількома дозами З мг/кг АЮ-65492 та АО-66017. З метою порівняння на фігурі 9А також зображено ефект від введення дози 5 мг/кг АЮ-51547 один раз на день протягом 5 днів (перші п'ять стрілок, що відповідають дням 0-4) з наступним введенням дози 5 мг/кг один раз на тиждень протягом чотирьох тижнів (стрілки, що відповідають дням 7, 14,21 та 28) (00О0х5, ОМу/х4) стосовно експресії ТІК в яванських макак. На графіках продемонстровано, що обидва засоби на основі ІКМА забезпечують сильне пригнічення експресії білка ТТЕ, і що обидва засоби на основі ІЕМА повністю пригнічують експресію білка
ТТК між днями 21 та 28 у дозі З мг/кг. На графіках також продемонстровано, що АЮ-65492 є більш ефективним, ніж АО-66017, у дозі 1 мг/кг. Крім того, на графіках продемонстровано, що найбільше зниження експресії ТТК для обох засобів на основі ІКМА при 1 мг/кг досягається між днями 35 та 42 з більш ніж 8595 пригніченням перед прийомом другої щомісячної дози АЮ-65492 і приблизно 7095 пригніченням перед прийомом другої щомісячної дози АО-66017. Після 60 введення третьої та четвертої щомісячних доз АЮ-65492 та АО-66017 досягали підтримання пригнічення на рівні приблизно 9595 та 8595 відповідно.
Більше того, як продемонстровано на фігурі 1Т0А, щомісячне введення дози (0Мх4) Аб- 65492 зумовлює підтримання більш ніж 9595 пригнічення експресії ТТЕ і, як продемонстровано на фігурі 108, введення декількох доз (0Мх4) АО-66017 має адитивний ефект у дозі 1 мг/кг. На фігурі 108 також продемонстровано, що після введення другої щомісячної дози АЮ-6601 7 спостерігається 8595 пригнічення експресії білка ТТК, і що це пригнічення підтримується третьою та четвертою щомісячними дозами.
Приклад 6. Конструювання та синтез хімічно модифікованих засобів, які цілеспрямовано впливають на ТТК
Додаткові двониткові засоби для КМАЇї, що цілеспрямовано впливають на ТТК, в яких практично всі нуклеотиди сенсової нитки та практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди та які містять антисенсову нитку, що містить ділянку комплементарності до 5ЕО ІО МО: 2, конструювали та синтезували, як описано вище.
Нуклеотидні послідовності сенсової та антисенсової ниток цих засобів наведені в таблиці 5.
Раздел 1.02 Приклад 7. Конструювання та синтез хімічно модифікованих засобів, які цілеспрямовано впливають на ТтК
Додаткові двониткові засоби для МАіЇ, що цілеспрямовано впливають на ТТЕ, конструювали та синтезували, як описано вище.
Нуклеотидні послідовності немодифікованих сенсових та антисенсових ниток цих засобів наведені в таблиці 6, а нуклеотидні послідовності модифікованих сенсових та антисенсових ниток цих засобів наведені в таблиці 7.
Таблиця 5
Модифіковані послідовності сенсової та антисенсової ниток а5хЕМА для ТТтК
І ІО Послідовність сенсової ЕО антисенс Послідовність ЗЕ дуплекса сенсової нитки, І МО -ової антисенсової нитки, ІО нитки 5-8 5-83 МІФ) нитки ассаада! 96 аАтисссазивс ассаада! 96 Атисссазивс ассаада! 96 АтТайсссазивс ловент але ди Б тою ост 1 ассаада! 96 АтТайсссазивс аааздча! 96 ашсссазивс лоент атек НК стен рн 1 ассаада! 96 Атисссазивс лоток ато Кріт у тет нини 1 аазда! 96 сссавзивзс асСісаада! 96 аАтисссазивс ассаада! 96 тиссцазиви товене атек дно стер сирен Го ассаада! 96 аАтисссазивс аассааолії 96 сссазивс аааздча! 96 сссавзивзс саада! 96 ссб5свза ассаада! 96 Тайсссазивс ссаазда! 96 Атисссазивс
Таблиця 5 (продовження)
ІО Послідовність сенсової Іо Послідовність ЗЕО
ІО . ЗЕО |антисенс . І плекса | бенсової нитки, ІЮМО о ової антисенсової нитки, ду нитки 5-3 5-3 МІФ) нитки дО-в54Ва | д-131355 | У5999а001иСТАТдИаа вв д.131357 н5СтишдстицасацдАталі ссаада! 96 исссавивс
АО-65477 | А-131353 | Н5О5992иШ1иСТАгТдМа д-128517 5СівийдСтицасацдАа асСісаада! 96 Тисссазивс
Й Й дзазашлистАтдиаас Й изСівииддицнасайдАтТаай
А0-65497 | А-131367 саача! 96 А-131368 ссвива 110
Й Й дзаашлистАтдиаасс Й изСтиддинасацдАтТааийс
А0О-65475 | А-131370 авоа! 96 А-131371 свсва 111 издзадайштистАг дна 70 |Алгви изСівидО иасацдАтад 2
А0О-65480 | А-131354 ассазаа! 96 70 |А-128517 писссавивс 112
АО-65479 | Д-131372 ововамиисл то очаасса д-131369 еСівниодиасацоліааи
Й издзадайштистА дина изСівидетиАїсацаАта лО-65492 І ассаада! 96 72 АТисссазивс Ши издзддайисайТдиаас 73 |Аловвов РизаСзипдаичаайСацчда ЩО дО-в5а49А 1285120 |ааада! 96 73 |Ал128526 Ааайисссавивс 115
Й Й издзддашнисай Тдаоаас Й РизаСзидачаайСацаа
А0О-65499 | А-128557 Уузаазааз! 96 74 |А-128526 дазисссавивс 116
АО-65491 | Д-128557 | У595998ийИисай Тдчаас д-12в5об н5аСзицддичайСацдад
УЗааадза! 96 аайсссавзивс
Й А- издзддашнисай Тдаоаас Й ІлваСзидайчаадСацоа лО-65498 1285121 |ааада! 96 176 |А791375 Ааайисссавивс 118
АО-65490 | Д-128512 | 0595998 йисайд Тдцаас д-128553 н5аСвипддичайСвацоа ааада! 96 Авзааийсссавивс
АО-64520 | Д-128557 | У595998ицисай Тдцчаас д-128553 н5аСвипддичайСвацоа
УЗааадза! 96 Авзааийсссавивс
АО-64527 | Д-128512 | 0595998 йисайд Тдцаас д-12в5об н5аСзицддичайСацдад ааада! 96 аайсссавзивс
АО-65472 | Д-131376 | 9595аиисааТдцаасаа во д.131377 н5аСвицддичайСацдад ада! 96 аайссзсоза
Й Й издзддашнисай Тдаоаас Й изСівииддицнасайдАтТаай
А0О-65486 | А-128557 УзЗаааоа! 96 81 |А-128520 сссавивс 123
Й Й дздзашисай Тдиаасаа Й изасСзицддичайСаццаалх
А0О-65472 | А-131376 ада! 96 82 |А-131377 ависсвсва 124
АО-64515 І издзддайисайТдиаас в изаСзииддичадйСацдад
Сап)аада! 96 аайсссавивс
АО-64536 І издзддайисайТдиаас КЗ изаСзииддичайСзацйда
Сап)аада! 96 Авзааийсссавивс
АО-65471 І издзддайисайТдиаас в изСівииддичасайдАїааи
Сап)аада! 96 сссавзивс
АО-65483 І издзддайисайТдиаас в РизаСзипдаичаайСацчда
Сап)аада! 96 Ааайсссазивс
Й Й тДастдАтТ Ши СТАТТЯ Й РистластОтОтастапцдА
АО-59152 | А-106305 аассСталіддА 96 87 |Ал119923 таагтистестазивс 129
Й Й тДастдАтТ Ши СТАТТЯ Й Ста стттастапдА лО-65476 | А-106305 аассСталіддА 96 88 ГА-ТЗ1351 таагтистестазивс 130
ОївазСтдАТШТСТАТТа ва |Алгваов РизСівиШтдДстиШастацйо КІ ло-б4480 | А-128493 | мадіссталідАт 96 Аг128495І діадгиСісставивс 181
ОТСТаАТШТиСТАТТ во | овуво. исттасеилластацдд Кк
АО-51547 | Л-"106305 | засстадідАя 96 1029782 | адиСісСтавивс 132
Таблиця 5 (продовження) дуплекса НИТКИ вБ- 8 І МОЇ -ової вБ- З МО нитки
Таблиця 6
Немодифіковані послідовності сенсової та антисенсової ниток О5КМА для ТтК
Сайт початку дуплекса (5-3) МО | стосовно нитки (5'-3") МО
ММ 000371.
Таблиця 6 (продовження)
Сайт початку
ІО Послідовність сенсової нитки шк и Послідовність антисенсової шк дуплекса (5-3) МО | стосовно нитки (5'-3") МО
ММ 000371. 2
ОПОООАСОДАдаСАсСОС ААДАСАСО,СОООАСОДАА
ООАСОАДАаСАСООШИ ОО,АДААСАСООССООАС
ПИБОВВЬ ОСА ОААдА
СОАддасСАсОСООООСА ОАХапйпСАААДАСАСОасСО ци
СОАддасСАсОСООООСА ОАХапОсСАААДАСАСОаСЦИ
ОТ (ссод ПАСА
СОАддасСАсОСООООСА ОАХапОсСАААДАСАСОаСЦИ
ПОЕМ ссд ПАСА васСАСпАСАСААОДАдДАС ОААОООООАОО ОВО СИ васСАСпАСАСААОДАдДАС ОААОООООАОО ОВО СИ васСАСпАСАСААОДАдДАС ОААОООООАОО ОВО СИ
САСпСАСАСААОААДАСАЇ Ада,ааААдОвООООАОО0ОСи
ПОЧЕВ |Оссу суасс
САСпСАСАСААОААДАСАЇ Ада,ааААдОвООООАОО0ОСи
ПОЕТ |Оссу сувсс
САСпСАСАСААОААДАСАЇ Ада,ааААдОвООООАОО0ОСи
ООЕВНе |Оссу суссс
СААОДААДАСАиССОСИ ОООСАСАССААОО ОА
ЛО 68327 | сддА ее
СААОДААДАСАиССОСИ ОООСАСАССААОО ОА
ПЕРЕ |оддА пси
СААОДААДАСАиССОСИ ОООСАСАССААОО ОА
ЛО ВО | бддА росус
Таблиця 7
Модифіковані послідовності сенсової та антисенсової ниток азЕМА для ТТК
ІО дуплекса | Послідовність сенсової нитки (5'-3') т Послідовність антисенсової | ЗЕЮ ду д МО нитки (5-3) І МО
АО-68322 авизодоа ііі Атиомаассаааі. ивОївиво тил іСіаноалтаціссо
АО-60668 Аївизстдаташти шлСТАТиСстиАтасті 200 из висту АсАтидайташсс 282 сАталіі 96 ІСАїи5с5с
АО-68330 авизодоа ііі Атиомаассаааі. овОївноо'масачоаліацісссви во ТДАТШСТАг В алісста 202 изСівилтасти ласСтацдАтадтис за
АО-64474 дюдноб 202 | ставивс 234
АО-65468 чвозодаиці осі АТО іомавссааоа!. чеСівнио сі ці Аісаноліайтисо
АО-65492 издздадайштистАгтдиаассааода!. изСівидаїиАїсацдАталтиссс 96 авивс
Таблиця 7 (продовження)
ІО дуплекса | Послідовність сенсової нитки (5-3) т Послідовність антисенсової | ЗЕО ду А Мо нитки (5-3) ІЮ МО
АО-65480 чвозодаиці осі АТО іомавссааоа!. чеСівниосбінчасаноліаліисоса
АО-60636 ОтвивІЛеАТи СТИ АТАТСТсАТастасти одб а5зАївиАісОїсОТи Сіда | одв
АтТиШТ 96 таАтТазивс
АО-68320 вивисацівічАїАСісавовочанці. авдівиасцїсОгОіоочидісАтида
АО-68326 вивисацівічАїАСісавовочанці. авдівцасрїсинодмиіолва
ШвдзШаліссталістатюатисіс 209! азАївистоАтатастиси да ги о ИН 209 | цогаставиза ги
АО-68331 издзиаассіалдістАгдиациссациці. азАїзиддА ап АсисиОгдсти 96 Ччасазиво
АО-68315 возиаассталісїАіючаниссамці. авлівиоліамасися Шдстица до-б68319 | азазссаастаст т Агтиссациниці. азАїзааайтдаАтацасиїсити 96 дайивзавзс
АїзазСісАтастаситлАтишестаиє азАїзаАтайтдаетаАйтасисиї
АО-б0612 | ЦОЮОп ов исідгивавс до-68316 | азазссаастасттАгиссациниці. азАїзааайтддаацасісИтида 96 цивзавзс азАїзаАатсАтсЯсСтиЧАт и
АОР-60664 ОтвизШЛитастиАТАТАТдСтастисці 21518А 247
От 96 таАтТазиво
АО-68321 изизиичастиАгАгАЇдсадидицииі. азАїзаасАїсіЛСисииЧАго Ша 96 аааазиво
АО-68318 пвивииасішАтАгАіосанонимці. авдівааслісидсниилоціваа
Й МгвизАїсОтайтаситстАт Ота тити изйвдАтаАтастастидсОт и лО-60665 Стадті 96 218 асииАїТазаза 250
СтвизАгалідстасти сти лиШіслїс узлівостисталталісасогюсі
АО-60642 СТАН 96 219 | 251 тиАїдзиза до-б8329 | с5изааадстастстиицисассца!- изАї5ддиСтаааасаси т Сіци 96 цадзиза до-б8334 | с5изааадстастстиицисассца!- изАїзддисталдгАгасаситсти 96 ичадзиза
АО-68328 овозсавасіасіАтАтивавасанизі пеліваио і оичаммо Соуси до-б8333 | 9505садастасіАгАгиаааасациа!. изАїзандшти т тацидио 96 Тсидсс5и5а
Й сивазСтастастастАтАтиАталтаст изАїзайтоти т Ат леОї 2О-60639 |аршАя ов 224 оудсісвива 256
СтвазСстастасталі А галаста|ці ЕЗ азсівдАтайдитишайви? ЕЕ лО-60643 иСтсШт 96 225 сілеШгав5свс 257 до-б8317 | сзаздадасталі г Атааасациссчці. азсіздаайтдииицайшто їси 96 сид5о5с до-б8335 | сзаздадасталі т Атааасациссиі. азсіздаашто т Отицац Шо с 96 исиав5с5с до-б8327 | сзазацаалтастАттиссидидааа!.- изШвисаСтаддааш ти ча 96 иЧд5ибс до-б8332 | сзазацаалтастАттиссидидааа!.- изШвисастасистаана ШТ 96 чашшдзивс
Таблиця 7 (продовження)
Юр Послі й . в'-щ шк Послідовність антисенсової | 5ЕО дуплекса ослідовність сенсової нитки (5'-3') МО нитки (5-3) ІЮ МО алі! 96 ТиОтдзи5с
Приклад 8. Введення АОЮ-65492 яванським макакам
Ефективність АЮО-65492 додатково оцінювали шляхом введення яванським макакам.
У першій групі експериментів чотирьом групам (групи 1, 2, З та 7) підшкірно вводили одноразову дозу 0,3 мг/кг (група 1); одноразову дозу 1 мг/кг (група 2); дозу 1 мг/кг один раз на місяць протягом 4 місяців (ОМХха4) (група 7) або дозу З мг/кг один раз на місяць протягом 4 місяців (ОМха4) (група 3).
Сироватку крові, плазму крові та вибіркові зразки печінки збирали до прийому дози та в дні
З, 7,10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 126, 154, 175, 203, 230, 260, 290, 310, 335 та 364 в групах З та 4.
У групах 1 та 2 сироватку крові збирали у дні -7 та -1 до початку прийому дози та в дні 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 105 та 119 після прийому дози; плазму крові збирали в день 1 до прийому дози та через 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 та 168 годин після прийому дози.
У групах З та 7 сироватку крові збирали у дні -7 та -1 до початку прийому дози та в дні 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, 98, 112, 127, 155, 176, 204, 232, 260, 288, 316, 344 та 372 після прийому дози; плазму крові збирали в день 1 до прийому дози та через 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 та 168 годин після прийому дози; плазму крові також збирали в день 85 до прийому дози та через 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 96 та 168 годин після прийому дози.
У групі 7 вибіркові зразки печінки збирали в день 1 за вісім годин до прийому дози (тобто вибірковий зразок печінки суб'єкта збирали за 8 годин до введення дози АЮ-65492 суб'єкту) та в день 7; день 22; день 29 за вісім годин до прийому дози; день 57 за вісім годин до прийому дози; день 85 за вісім годин до прийому дози; день 91; день 106 та день 141 після прийому дози.
У групі З вибіркові зразки печінки збирали після прийому дози в день 29 за вісім годин до прийому дози; день 57 за вісім годин до прийому дози; день 85 за вісім годин до прийому дози; день 91, день 106 та день 141.
Рівень білка ТТЕ у сироватці крові визначали, як описано вище.
Зо На фігурі 11 наведені результати цих досліджень і показане сильне пригнічення експресії
ТТЕ, яке досягається шляхом введення АЮ-65492. Дані демонструють, що АЮ-65492 забезпечує більш ніж 9095 стійке пригнічення експресії ТТК протягом приблизно 6 тижнів та 17 тижнів після прийому заключної дози в рамках введення дози 1 мг/кг (група 7) АЮО-65492 або З мг/кг (група 3)
АО-65492 один раз на місяць протягом чотирьох місяців (0ОМх4) відповідно. Дані також демонструють приблизно 4095 пригнічення експресії ТТК через 17 тижнів після прийому заключної дози в рамках введення дози 1 мг/кг АЮ-65492 (група 7) один раз на місяць протягом чотирьох місяців (ОМХх4).
Дані вказують на те, що введення доз АЮ-65492 суб'єктам-людям один раз на три місяці буде ефективним у пригніченні експресії ТТК на рівні дози, проміжному між 1 мг/кг та З мг/кг, наприклад 2 мг/кг, якщо припускати перехід 1:1 між введенням доз яванським макакам і людям.
У другій групі експериментів трьом групам (групи 9, 10 та 11; див. фігуру 12) підшкірно вводили дозу 0,3 мг/кг один раз на місяць протягом 6 місяців (0Мх6б) (група 9); дозу 0,6 мг/кг один раз на місяць протягом 6 місяців (ОМХхб) (група 10) або початкову дозу 1 мг/кг з наступним введенням підтримувальної дози 0,3 мг/кг один раз на місяць протягом одного місяця (ОМХ1) після введення початкової дози протягом п'яти місяців (ОМх5) (група 11).
Зразки сироватки крові збирали у дні -7 та -1 до початку прийому дози та в дні 4, 8, 11, 15, 22,29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78, 85, 92, 99, 113, 127, 155, 176 та 204, 232, 260 та 288 після початку прийому дози. Рівень білка ТТЕ у сироватці крові визначали, як описано вище.
На фігурі 13 наведені результати цих досліджень і продемонстровано сильне пригнічення експресії ТТЕ, яке досягається за допомогою АЮ-65492 після введення дози 0,6 мг/кг один раз на місяць протягом двох місяців (0Мх2), що є порівнянним з пригніченням експресії ТТК після введення початкової дози 1 мг/кг. Дані також демонструють, що АЮО-65492 забезпечує приблизно 8095 стійке пригнічення експресії ТТ після введення дози 0,3 мг/кг один раз на місяць протягом двох місяців; при цьому в трьох з чотирьох мавп було досягнуто 6095 - 8595 пригнічення експресії ТТК після введення доз 0,3 мг/кг АО-65492 один раз на місяць протягом двох місяців. Після введення одноразової дози 1 мг/кг було продемонстровано пригнічення експресії ТТК на рівні до 9095, при цьому друга доза 0,3 мг/кг підтримувала найбільше зниження протягом трьох тижнів після прийому другої дози.
Еквіваленти
Фахівці у даній галузі розпізнають або будуть здатні визначити, використовуючи лише стандартний експериментальний підхід, багато еквівалентів до конкретних варіантів здійснення та способів, описаних у даному документі. Передбачається, що такі еквіваленти охоплені обсягом наступної формули винаходу.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105» АГММІ АМ РНАВНМАСЕШТІСАЇ 5, ІМО. «120» КОМПОЗИЦІЇ НА ОСНОВІ ІЕМА ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (ТТЕ) І СПОСОБИ ЇХ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ
ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ ТТВ-АСОЦІЙОВАНИХ ЗАХВОРЮВАНЬ «130» 121301-03020 -140» «1415 «150» б2/287,518 «1515 2016-01-27 «150» 62/199,563 «1515 2015-07-31
Зо -1605 262 «170» Расгепіп версія 3.5 «21051 «2115» 938 «2122 ДНК «213» Ното зарієпе «4005 1 дкдасіаад ісааіааїса дааїсадсад двщшосадіє аданддсад ддагаадсад бо ссіадсісад чадаадщад їаїаааадсс ссаддсіддо адсадссаїс асадаадієс 120 асісансії ддсаддаща сисісаїсо Ісідсіссіс сісідссно сіддасідої 180 ашощісї даддсщдосс сіасддосас сддідаасс аадідіссісідаюдісаа 240 аднсіадаї дсідіссдад дсадієсюс саїсааціод дссодса дісадааа 300 доасдсщдаї дасассюдоу адссашос сісюддааа ассадщдаді сюдададсі 360 дсадодсіс асаасщадо аддаащої адаадддаца (асааадіюд аааїйадасає 420 сааа(снцас юдаадодсас нддсаїсіс сссацсосаї дадсасад аддюдан 480 сасадссаас дасіссддсс сссдосодсіа сассацоусс дсссідсда дсосссіасіс 540 сіацссасс асддсідісо Ісассааїсс сааддааюа додасицсіс сіссадюда 60 ссщдааддас даддчаюдо ашсаюіа ассаададіа посанш асіааадсад 660 дщшсасс ісагасіа юйадааді ссаддсадад асаааааас ацссідїда 720 ааддсасцш ісацссасі Чаасндаї Шааай ссосцацді сссцссааа 780 ааааададаа ісаааацшії асааадааїс аааддаацс (адааадіа сіддодсадаа 840 сосіаддада даїссааац (ссаноісі (дсаадсааа дсасоїаца аайашюайєсі 900 дсадссаца аааадасаса псщіаааа аааааааа 938 «21052 «2115 21 «2122 РНК «213» Штучна послідовність
Зо «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «40052 идддайциса идиаассаад а 21 «2105 3 «2115 23 «2122 РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» З исиддицчас аидааацйссс айс 23 «21054 «2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 4 даюдддай сащіаасса ада 23 «21055 «2115» 650 «212» ДНК «213» Ното зарієпе «4005 5 асадаацдієс асісацсії ддсаддаюа снсісаїсо ісідсіссіс сісюссно бо сюдасюаді ашоцісї даддсюдсс сіасдддсас сддідаайсс аадідієсіс 120 щаюдісаа адксіадаї дсідіссдад дсадіссідс саїсаашід дссоюсаюд 180 щисадааа ддсюсщаї дасассюдо адссашос сісюодааа ассадідаді 240
Зо сюдададсі дсадчоодсіс асаасідадд аддаащої адаадддагаіасааадюд /-З00 ааагадасас саааїсцас ддаадосас кддсаїсіс сссацосаї дадсасад 360 аддаюдіак сасадссаас дасіссддсес сссдссоусіа сассацодсс дсссюсщда 420 дссссіасіс сіацйсосасс асддсідісод ісассааїсс сааддаада додасісіс 480 сіссадідда ссідааддас даддчаюдо ашсайщіа ассаададіа йссанш 540 асіааадсад щішсасс ісагаюсіа дцадааді ссаддсадад асааїаааас 600 айссідіда ааддсасщ Ісайссааа аааааааааа аааааааааа 650
«2105 6 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 6 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -21057 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 7 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105» 8 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 8 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«21059 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 9 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 10 пдддашниса пдиаассаад а 21 -210511 -2115 16 «212» Білок «213» Невідомо «220» «223» Опис невідомого: КЕСЕ-пептид «4005 11
Аа Аа Маї Аа ГІ єи І єси Рго Аа Маї І еєи І еи Аа ГГ єи І ви Аа Рго 1 5 10 15 -210512 0) «211511 «212» Білок «213» Невідомо «220» «223» Опис невідомого: Аналогічний КЕСОЕ-пептид «4005 12
Аа Аа! єи ГГ еи Ріо Маї І еи І еи Айа Аа Рго 1 5 10 -2105 13 «211513 «212» Білок «213» Вірус імунодефіциту людини
«4005 13 ау Аго Гуз Гуз Аг Аго СіІп Агу Ага Аго Рго Рго Сп 1 5 10 -2105» 14 -2115 16 «212» Білок «213» ЮОгозорніїа 5р. «400» 14
Ага СіІп Пе І уз Пе Тір Рне Сп Авзп Ага Аго Меї Гуз Тгр Гуз І ув 1 5 10 15 -2105 15 «211521 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 15 пдддацииса пдиаассаад а 21 -210516 0) «211521 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 16 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105 17 «211521 «212» ДНК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 17 пдддайниса диаасааада 21
-2105 18 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 18 идддайциса идиаассаад а 21 -2105 19 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 19 идддайциса дпаасааад а 21 -210» 20 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 20 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105 21 «2115 21 «2122» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 21 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105 22 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 22 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105» 23 0) «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «221» модифікована основа «222» (17)..(17) «223» Нуклеотид з 2-гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфатом (позбавленою азотистої основи 2'-ОМе-фуранозою)
«400» 23 пдддайниса диааспаада 21
«-210» 24 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 24 идддайциса идиаассаад а 21 -210» 25 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 25 пдддашниса идиаассаад а 21 0) -210» 26 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 26 пдддайниса диаасааада 21 «-2105 27
«2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 27 пдддайниса диаасааада 21 -210» 28 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 28 пдддайниса диаасааада 21 0) -210» 29 -2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 29 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«210» 30 -2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 30 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 31 «8115 23 -212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 31 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 32 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 32 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«210» 33 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 33 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105» 34 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 34 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 35 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 35 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«210» 36 «2115 23 «212» РНК 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 36 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 37 «8115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 37 исиддицчас айдааацйссс ас 23 «210» 38 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 38 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 39 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 39
Зо исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105» 40 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 40 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -210» 41
-2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 41 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105» 42 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 42 исиддицчас аидааацйссс айс 23 0) -210» 43 «2115 21 -2122 РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 43 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105» 44 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 44 пдддашниса идиаассаад а 21 -210» 45 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 45 пдддашниса идиаассаад а 21 -210» 46 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 46
Зо идддайциса идиаассаад а 21 -2105» 47 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 47 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 48
«2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 48 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-210» 49 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 49 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 50 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 50 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 51 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 51 идддайциса идиаассаад а 21
-2105 52 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005 52 пдддашниса идиаассаад а 21 «2105 53 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 53 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105» 54 «2115 21 «212» РНК 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 54 пдддашниса идиаассаад а 21 «2105 55 «211521 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005 55 пдддайниса диаасааада 21 «2105 56 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 56 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105 57 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» 0) «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 57 пдддайниса диаасааада 21
«2105» 58 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 58 идддайциса идиаассаад а 21
«2105» 59 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 59 цаддашиса пдиаассаад а 21 «210» 60 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 60 пдддашниса пдиаассаад а 21
-2105 61 «2115 21 «212» РНК 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 61 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105 62 «211521 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 62 пдддайниса диаасааада 21 «210» 63 «2115 19 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 63 ддаашисацд паассаада 19 -2105» 64 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 64
Зо идддайциса идиаассаад а 21 «2105» 65 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 65 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 66
«2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 66 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105 67 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 67 пидддацниса идиаассаад а 21 «210» 68 -2115 19 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» 0) «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 68 ддаашисацд паассаада 19
«210» 69 -2115 19 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 69 ддаашисацд паассаада 19
-2105» 70 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 70 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105 71 -2115 19 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 71 ддаашисацд паассаада 19
-2105 72 «2115 21 «212» РНК 0) «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 72 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105 73 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 73 пдддайниса диаасааада 21 -210» 74 «211521 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «221» модифікована основа «222» (17)..(17) «223» Нуклеотид з 2-гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфатом (позбавленою азотистої основи 2'-ОМе-фуранозою) «400» 74 пдддайниса диааспаада 21
-2105 75 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «220» «221» модифікована основа «222» (17)..(17)
«223» Нуклеотид з 2-гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфатом (позбавленою азотистої основи 2'-ОМе-фуранозою) «4005» 75 пдддайниса диааспаада 21 -2105 76 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 76 идддайциса дпаасааад а 21 -2105 77 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 77 идддайциса дниаасааад а 21 -2105» 78 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «220» «221» модифікована основа «222» (17)..(17) «223» Нуклеотид з 2-гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфатом (позбавленою азотистої основи 2'-ОМе-фуранозою)
«400» 78 пдддайниса диааспаада 21 «210» 79 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 79 пдддайниса диаасааада 21 «210» 80 -2115 19 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 80 ддаашисаю паасааада 19 «210» 81
«2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «221» модифікована основа «222» (17)..(17) «223» Нуклеотид з 2-гідроксиметилтетрагідрофуран-4-метокси-3-фосфатом (позбавленою азотистої основи 2'-ОМе-фуранозою) «400» 81 пдддайниса диааспаада 21
-2105» 82 -2115 19 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид 0) «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 82 ддаашисаю паасааада 19
«210» 83 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220»
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 83 пидддашйииса диаассаада 21
-210» 84 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 84 пидддашйииса диаассаада 21
«210» 85 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид 0) «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 85 пидддашйииса диаассаада 21
«210» 86 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220»
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 86 пидддашйииса диаассаада 21
-210» 87 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 87 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 88 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 88 пдддашниса идиаассаад а 21
«210» 89 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 89 идддайциса идиаассаад а 21 «210» 90 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 90 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 91 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 91 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105 92 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 92 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 93 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 93 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-210» 94 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 94 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 95 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 95 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 96 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 96 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105» 97 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 97 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 98 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 98 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«210» 99 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 99 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 100 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005100 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105101 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 101 исишддицас адаааийсси ап 23
-2105102 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005102 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 103 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 103 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«2105104 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 104 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 105 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 105 исипддицас апдаааєссс а 21 «2105» 106 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 106 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 107 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 107 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 108 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 108 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 109 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 109 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 110 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 110 исипддицас апдааансси а 21 «2105 111 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 111 исипддицас апдаааєссс а 21
-2105 112 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 112 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105 113 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 113 исипддицас апдаааєссс а 21
-2105 114 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид -400» 114 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 115 «2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 115 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 116 «2115 23 «212» ДНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 116 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 117 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид -4005 117 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 118 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 118 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 119 -2115 23 «212» ДНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 119 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «-2105 120 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 120 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 121 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 121 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 122 «2115 21 «212» ДНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 122 исишддицас аидааацйссс а 21 -2105 123 -2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 123 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105» 124 «2115 21 «212» ДНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 124 исипддицас апдаааєссс а 21 -2105» 125 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 125 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 126 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220» «223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 126 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 127 -2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид -4005 127 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 128 -2115 23 «212» ДНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «220»
«223» Опис об'єднаної молекули ДНК/РНК: Синтетичний олігонуклеотид «400» 128 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«210» 129 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 129 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 130 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 130 исиддицчас аидааацйссс айс 23
«2105 131 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 131 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105132 «2115 23 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 132 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105» 133 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 133 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 134 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 134 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105» 135 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 135 апдддайццс айдиаассаа а 21
-2105» 136 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 136 апдддашцис ашдиаассаа а 21 -2105» 137 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 137 апдддайццс айдиаассаа а 21 «2105» 138 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 138 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105» 139 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 139 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 140 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 140 пдддашниса идиаассаад а 21
-2105» 141 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 141 идддайциса идиаассаад а 21 -2105 142 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 142 ишсацйдиаа ссаададиаци и 21 «210» 143 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 143 ишсацйдиаа ссаададиаци и 21
-210» 144 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 144 ишсацйдиаа ссаададиаци и 21 «-210» 145 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 145 идиоаассаад адоациссацй и 21
-210» 146 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 146 идиаассаад адоациссац и 21 -2105 147 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 147 идиоаассаад адоациссацй и 21 «210» 148 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 148 аассаадади айшссашшши и 21
-210» 149 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 149 аассаадади айшссашшши и 21 -2105 150 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 150 аассаадади айшссашшши и 21
-2105 151 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 151 ишшицасиаа адсадидини и 21 -2105 152 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005 152 ишинасиаа адсадидици и 21 «2105» 153 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 153 ишинасиаа адсадидици и 21
«-210» 154 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 154 ипасцааадс адидиициса а 21 -2105 155 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 155 сцрааадсади дишисасси а 21
-2105 156 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 156 суааадсади дицисасси а 21 «2105 157 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 157 сцрааадсади дишисасси а 21 «2105» 158 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 158 ддсададаса апаааасаци а 21
-2105 159 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 159 ддсададаса апаааасаци а 21 -2105 160 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 160 ддсададаса апаааасаци а 21
-2105 161 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 161 сададасааи аааасацисс и 21 -2105 162 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«4005» 162 сададасааи ааваасацисс и 21 «2105» 163 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 163 сададасааи ааваасацисс и 21
«-210» 164 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 164 саацааааса цшссидидаа а 21 -2105» 165 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 165 саацааааса цшссидидаа а 21
-2105» 166 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 166 саанааааса пшссидидаа а 21 -2105 167 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 167 ишддицаса идааайссса сс 23 «2105» 168 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 168 ишддицаса идааайссса сс 23
-2105» 169 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 169 ишддицаса идааайссса сс 23 «2105» 170 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 170 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 171 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005 171 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -2105 172 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 172 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105» 173 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 173 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-2105 174 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 174 аацасисицд дипасацдаа айс 23 «2105175 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 175 аацасисицд дипасацдаа айс 23
«2105176 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 176 аацасисицд дипасацдаа айс 23 -2105177 «2115 23 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
-4005 177 аанддаацас исипддинас ацд 23 «2105» 178 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 178 аанддаацас исипддинас ацд 23
-2105 179 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 179 аанддаацас исипддинас ацд 23 -2105» 180 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 180 ааааацддаа пасисицдди пас 23
-2105 181 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 181 ааааацддаа пасисицдди пас 23 -2105 182 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 182 ааааацддаа пасисицдди пас 23 «2105» 183 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 183 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23
-2105» 184 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 184 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23 -2105» 185 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 185 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23
-210» 186 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 186 идаааасас идсишадна ааа 23 «210» 187 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 187 паддидаааа сасидсицца да 23 -210» 188 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 188 паддидаааа сасидсицца да 23
-210» 189 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 189 паддидаааа сасидсицца да 23 -2105» 190 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 190 паандицица пшдисисидс сид 23
«2105» 191 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 191 паандицица пшдисисидс сид 23 «2105» 192 «2115 23 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 192 паандицица пшдисисидс сид 23 «2105» 193 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 193 аддааидици чапидисиси дос 23
-2105» 194 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 194 аддааидици чапидисиси дос 23 -2105» 195 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 195 аддааидици чапидисиси дос 23
-210» 196 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 196 ишсасадда аидииичацйи дис 23 -2105 197 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 197 ишсасадда аидииичацйи дис 23 «210» 198 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 198 ишсасадда аидииичацйи дис 23
-2105» 199 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 199 апдддайццс айдиаассаа а 21 -210» 200 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 200 апдддайццс айдиаассаа а 21
«2105» 201 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 201 апдддашцис ашдиаассаа а 21 «2105» 202 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 202 пдддашниса идиаассаад а 21 «210» 203 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 203 пдддашниса идиаассаад а 21
«-210» 204 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 204 пдддашниса идиаассаад а 21 -2105» 205 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 205 пдддашниса идиаассаад а 21
-210» 206 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 206 ишсацдиаа ссаададиац и 21 «210» 207 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 207 ишсацйдиаа ссаададиаци и 21 «210» 208 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 208 ишсацйдиаа ссаададиаци и 21
-210» 209 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 209 идиоаассаад адоациссацй и 21 -2105» 210 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 210 идиоаассаад адоациссацй и 21
«-2105 211 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 211 идиаассаад адоациссац и 21 -2105 212 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 212 аассаадади айшссашшши и 21 -2105» 213 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 213 аассаадади айшссашшши и 21
«210» 214 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 214 аассаадади айшссашшши и 21 «2105» 215 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 215 ишинасиаа адсадидици и 21
«2105» 216 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «4005» 216 ишшицасиаа адсадидини и 21 -2105 217 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 217 ишинасиаа адсадидици и 21 «2105» 218 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 218 ипасцааадс адидиициса а 21
-210» 219 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 219 сцрааадсади дишисасси а 21 «-210» 220 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 220 сцрааадсади дишисасси а 21
-210» 221 «2115 21 «2122» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 221 суааадсади дицисасси а 21 «2105» 222 «2115 21 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 222 ддсададаса апаааасаци а 21 «210» 223 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 223 ддсададаса апаааасаци а 21
«210» 224 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 224 ддсададаса апаааасаци а 21 «-210» 225 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 225 сададасааи ааваасацисс и 21
«-210» 226 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 226 сададасааи аааасацисс и 21 «2105» 227 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 227 сададасааи ааваасацисс и 21 -210» 228 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 228 саацааааса цшссидидаа а 21
«-210» 229 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 229 саацааааса цшссидидаа а 21 -210» 230 «2115 21 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 230 саацааааса цшссидидаа а 21
«2105» 231 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 231 ишддицаса идааайссса сс 23 «2105» 232 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 232 ишддицаса идааайссса сс 23 «210» 233 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 233 ишддицаса идааайссса сс 23
«210» 234 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 234 исиддицчас аидааацйссс айс 23 -210» 235 «8115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 235 исиддицчас аидааацйссс айс 23
-210» 236 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 236 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «2105» 237 «2115 23 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 237 исиддицчас аидааацйссс айс 23 «210» 238 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 238 аацасисицд дипасацдаа айс 23
-210» 239 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 239 аацасисицд дипасацдаа айс 23 «210» 240 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 240 аацасисицд дипасацдаа айс 23
«-210» 241 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 241 аанддаацас исипддинас ацд 23 «210» 242 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 242 аанддаацас исипддинас ацд 23 «210» 243 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 243 аанддаацас исипддинас ацд 23
«210» 244 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 244 ааааацддаа пасисицдди пас 23 «210» 245 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 245 ааааацддаа пасисицдди пас 23
«210» 246 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 246 ааааацддаа пасисицдди пас 23 «-2105» 247 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 247 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23 «210» 248 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220»
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 248 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23
«210» 249 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 249 аааасасидс ишшадиаааа ацд 23 -210» 250 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 250 идаааасас идсишадна ааа 23
«2105» 251 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 251 паддидаааа сасидсицца да 23 «2105» 252 «2115 23 «212» РНК
«213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 252 паддидаааа сасидсицца да 23 «210» 253 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 253 паддидаааа сасидсицца да 23
«210» 254 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 254 паандицица пшдисисидс сид 23 -2105» 255 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 255 паандицица пшдисисидс сид 23
«-210» 256 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність
«220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 256 паандицица пшдисисидс сид 23 -2105 257 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид
«400» 257 аддааидици чапидисиси дос 23 «210» 258 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність 0) «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 258 аддааидици чапидисиси дос 23
«-210» 259 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 259 аддааидици чапидисиси дос 23 «210» 260 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 260 ишсасадда аидииичацйи дис 23 «210» 261 «2115 23 «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 261 ишсасадда аидииичацйи дис 23 «210» 262 «2115 23
Зо «212» РНК «213» Штучна послідовність «220» «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний олігонуклеотид «400» 262 ишсасадда аидииичацйи дис 23

Claims (3)

40 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇї) для інгібування експресії транстиретину (ТТК) у клітині, де вказаний засіб для МАї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, 45 комплементарну до 5ЕО ІЮ МО: 2 (-ОСсапАОООСАОСОААССААСА-З), де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди,
де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом, і де ліганд являє собою одну або більше похідних саіІМАс, приєднаних через двовалентний або тривалентний розгалужений лінкер.
2. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де вказаний двонитковий засіб для КМАЇї представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'-Ма- Ум м-Мь-3", антисенсова нитка: 3'-пр'-Ма- У 7 -Мь'-5", (Ше) де Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр' зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Ма і Ме" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0- 25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їхніми комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із УМ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів.
3. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 2, де мотив УУУ знаходиться в сайті розщеплення сенсової нитки або поруч з ним.
4. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 2, де мотив У знаходиться в положеннях 11, 12 і 13 від 5'-кінця антисенсової нитки.
5. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 2, де нуклеотиди У містять 2'-фтор-модифікацію.
6. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 2, де нуклеотиди У містять 2'-О-метил-модифікацію.
7. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 1, де довжина двониткової ділянки становить 15-30 пар нуклеотидів.
8. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 7, де довжина двониткової ділянки становить 17-23 пари нуклеотидів.
9. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 7, де довжина двониткової ділянки становить 17-25 пар нуклеотидів.
10. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 9, де довжина двониткової ділянки становить 23-27 пар нуклеотидів.
11. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 9, де довжина двониткової ділянки становить 19-21 пару нуклеотидів.
12. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де довжина двониткової ділянки становить 21-23 пари нуклеотидів.
13. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де кожна нитка містить 15-30 нуклеотидів.
14. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де кожна нитка містить 19-30 нуклеотидів.
15. Двонитковий засіб для КМАї за п. 1, де модифікації нуклеотидів вибрані з групи, що складається з дезоксинуклеотиду, 3'-кінцевого дезокситимінового (ат) нуклеотиду, 2'-О-метил- модифікованого нуклеотиду, 2'-фтор-модифікованого нуклеотиду, 2'-дезокси-модифікованого нуклеотиду, замкненого нуклеотиду, незамкненого нуклеотиду, конформаційно обмеженого нуклеотиду, конформаційно утрудненого етилом нуклеотиду, позбавленого азотистої основи нуклеотиду, 2'-аміно-модифікованого нуклеотиду, 2'-О-аліл-модифікованого нуклеотиду, 2'-0- алкіл-модифікованого нуклеотиду, 2'-гідроксил-модифікованого нуклеотиду, 2'-метоксіетил- модифікованого нуклеотиду, 2'-О-алкіл-модифікованого нуклеотиду, морфолінового нуклеотиду, фосфорамідату, нуклеотиду, який містить неприродну основу, тетрагідропіран-модифікованого нуклеотиду, 1,5-ангідрогекситол-модифікованого нуклеотиду, циклогексеніл-модифікованого нуклеотиду, нуклеотиду, що містить фосфотіоатну групу, нуклеотиду, який містить метилфосфонатну групу, нуклеотиду, що містить 5'-фосфат, і нуклеотиду, який містить міметик Б-фосфату, та їхніх комбінацій.
16. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 15, де модифікації нуклеотидів являють собою 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікації.
17. Двонитковий засіб для КМАЇї за п. 1, де сенсова нитка містить не більше б 2'-фтор- модифікацій.
18. Двонитковий засіб для КМАЇї за п. 1, де сенсова нитка містить не більше 5 2'-фтор- модифікацій.
19. Двонитковий засіб для КМАЇї за п. 1, де сенсова нитка містить не більше 4 2'-фтор- бо модифікацій.
20. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де антисенсова нитка містить не більше 5 2'-фтор- модифікацій.
21. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де антисенсова нитка містить не більше 4 2'-фтор- модифікацій.
22. Двонитковий засіб для КМАЇї за п. 1, де антисенсова нитка містить не більше 3 2'-фтор- модифікацій.
23. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де антисенсова нитка містить не більше 2 2'-фтор- модифікацій.
24. Двонитковий засіб для КЕМАЇї за п. 1, який додатково містить 5'-фосфат або міметик 5'- фосфату на 5'-кінцевому нуклеотиді антисенсової нитки.
25. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, який додатково містить міметик 5'-фосфату на 5- кінцевому нуклеотиді антисенсової нитки.
26. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 25, де міметик 5'-фосфату являє собою 5'-вінілфосфат (5'-
МР).
27. Двонитковий засіб для ЕМАЇї за п. 1, де лігандом є одна або декілька похідних саїЇМАс, приєднаних за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера.
28. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 1, де ліганд являє собою о Н Н но кити нити о АснМ о і он но о З ге) М М а но -еятК жити "а АснНМ о о о о); о) ема на о АСНМ во Н
29. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де ліганд приєднаний до 3'-кінця сенсової нитки.
30. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 29, де засіб для ЕМАЇ кон'югований з лігандом, як показано на наступній схемі: з я- -0 у ро НИ И - " оси он (о) гу Же М но юн НО ь ДМ ту мини ів но юн Од ма чини у о її ку швове поем ме: Мо де Х являє собою О або 5.
31. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де антисенсові нитки містять нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: 5-ивСівцддицасайдАтаайсссазивсо-3 (ЗЕО ІО МО: б), 5-изСтвидстицАїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7), 5-Ш8СтвицастииАїсайдАтайтисссазивс-3 (ЗЕО ІЮ МО: 8) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалйтисссавзивс-3" (ЗЕО ІО МО: 9), де а, с, д і и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СТ, С і ОГ являють собою 2'"-фтор-модифіковані А, С, С або І; 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
32. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 1, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з: Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та
5-ивСівцддицасайдАтаайсссазивсо-3 (ЗЕО ІО МО: 6); Б-ивдзадашлистАттдиаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5Б-изСтвидс ти АїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7); Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-Ш5СівцдсетишАтсацдАтТалтисссазивсо-3" (5ЕО ІЮ МО: 8); та Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалйтисссазивсо-3" (ЗЕО ІО МО: 9), де а, с, д і и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СТ, С і ОГ являють собою 2'"-фтор-модифіковані А, С, С або М; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
33. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 32, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-изСтвидстицАїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, с або Ш; АГ, СІ, сі г являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, с або Ш; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
34. Двонитковий засіб для ЕМАЇ за п. 1, де вказаний засіб для КМАЇ вибраний із групи засобів для КМАЇ, наведених в будь-якій із таблиць 1, 3, 5, 6 або 7.
35. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ВМАЇ) для інгібування експресії транстирену (ТТ) у клітині, де вказаний засіб для КМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, повністю комплементарну до 569 ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом, де лігандом є одна або декілька похідних заіМАс, приєднаних за допомогою двовалентного або тривалентного розгалуженого лінкера.
36. Двонитковий засіб для КЕМАї за п. 35, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇ представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'-Ма- Ум м-Мь-3", антисенсова нитка: 3'-пр'-Ма- У "-Мь'-5', (Ше) де Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр' зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотіоатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Ма і Ме" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 8- 10 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їхніми комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із Ум і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів, і де модифікації є 2'-О-метил- або 2'-фтор-модифікаціями.
37. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇї) для інгібування експресії транстиретину (ТТ) у клітині, де вказаний засіб для ЕМАЇї містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з будь-яких із нуклеотидних послідовностей, наведених у таблиці 5.
38. Засіб на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇї) для інгібування експресії транстиретину (ТТК) у клітині, де вказаний засіб для КМАї міститьсенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, при цьому антисенсова нитка містить ділянку комплементарності, яка містить щонайменше 15 суміжних нуклеотидів, що відрізняються не більше ніж З нуклеотидами від будь-якої з антисенсових послідовностей, наведених у таблиці 6, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
39. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 38, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з будь-яких із нуклеотидних послідовностей, наведених у таблиці 6.
40. Двонитковий засіб для КМАЇ за п. 38, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з будь-яких із нуклеотидних послідовностей, наведених у таблиці 7.
41. Клітина, що містить двонитковий засіб для КМАЇ за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38.
42. Вектор, що містить двонитковий засіб для КМАЇ за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38.
43. Клітина, що містить вектор за п. 42.
44. Фармацевтична композиція, що містить двонитковий засіб для КМАЇї за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38 або вектор за п. 42.
45. Фармацевтична композиція за п. 44, де двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять в небуферному розчині.
46. Фармацевтична композиція за п. 45, де вказаний небуферний розчин являє собою сольовий розчин або воду.
47. Фармацевтична композиція за п. 44, де вказаний двонитковий засіб для КМАЇ вводиться з буферним розчином.
48. Фармацевтична композиція за п. 47, де вказаний буферний розчин передбачає ацетат, цитрат, проламін, карбонат або фосфат або будь-яку їхню комбінацію.
49. Фармацевтична композиція за п. 47, де вказаний буферний розчин являє собою фосфатно- сольовий буферний розчин (РВ5).
50. Спосіб інгібування експресії транстиретину (ТТЕ) у клітині, при цьому спосіб передбачає приведення клітини в контакт із двонитковим засобом для ЕМАЇї за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38 або вектором за п. 42.
51. Спосіб за п. 50, де вказана клітина знаходиться в організмі суб'єкта.
52. Спосіб за п. 51, де суб'єктом є людина.
53. Спосіб за п. 52, де суб'єкт страждає на ТТК-асоційоване захворювання.
54. Спосіб за будь-яким із пп. 50-53, де експресія ТТК інгібується щонайменше на приблизно 10 Фо, на приблизно 15 95, на приблизно 20 95, на приблизно 25 95, на приблизно 30 95, на приблизно 40 95, на приблизно 50 95, на приблизно 60 95, на приблизно 70 95, на приблизно 80 удо, на приблизно 90 95, на приблизно 95 95, на приблизно 98 95 або на приблизно 100 95.
55. Спосіб лікування суб'єкта, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання або має ризик Зо розвитку ТТК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості двониткового засобу для КМАЇ за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38 або вектора за п. 42.
56. Спосіб лікування суб'єкта, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості двониткового засобу для ЕМАЇ, де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
57. Спосіб зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІЗ (тМіІб-7) у суб'єкта, який страждає на ТТВ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТЕК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично БО ефективної кількості двониткового засобу для КЕМАЇїі за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38 або вектора за п. 42.
58. Спосіб зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІЗ (тМіІб-7) у суб'єкта, який страждає на ТТВ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТЕК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості двониткового засобу для ЕМАЇ, де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів,
де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
59. Спосіб підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6МУМТ) у суб'єкта, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТЕ-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості двониткового засобу для ЕМАЇ за будь-яким із пп. 1, 35, 37 і п. 38 або вектора за п. 42.
60. Спосіб підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6МУМУТ) у суб'єкта, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТЕ-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості або профілактично ефективної кількості двониткового засобу для КМАЇ, де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до 5ЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
61. Спосіб за будь-яким із пп. 56, 58 і п. 60, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇ представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'-Ма- Ум м-Мь-3", антисенсова нитка: 3'-пр'-Ма- У "-Мь'-5', (Ше) де Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр' зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Ма і Ме" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0- 25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їхніми комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із Ум і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів.
62. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де суб'єктом є людина.
63. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаним суб'єктом є суб'єкт, який страждає на ТТК- асоційоване захворювання.
64. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаним суб'єктом є суб'єкт з ризиком розвитку ТТЕ- асоційованого захворювання.
65. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаний суб'єкт має мутацію в гені ТТЕК, асоційовану з розвитком ТТК-асоційованого захворювання.
66. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказане ТТК-асоційоване захворювання вибране з групи, що складається з сенільного системного амілоїдозу (55А), системного сімейного амілоїдозу, сімейної амілоїдної полінейропатії (БАР), сімейної амілоїдної кардіоміопатії (АС), лептоменінгеального амілоїдозу/"амілоїдозу центральної нервової системи (СМ5) і гіпертироксинемії.
67. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де у вказаного суб'єкта спостерігається ТТК-асоційований амілоїдоз, і при цьому вказаний спосіб забезпечує зниження відкладання ТТК-амілоїду у вказаного суб'єкта.
68. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаний двонитковий засіб для КМАЇї вводять вказаному суб'єкту за допомогою шляху введення, вибраного з групи, що складається з підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньобронхіального, внутрішньоплеврального, внутрішньочеревного, внутрішньоартеріального, лімфатичного, спинномозкового і будь-яких їхніх комбінацій.
69. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаний двонитковий засіб для КМАЇї вводять вказаному бо суб'єкту шляхом підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення.
70. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, де вказаний двонитковий засіб для КМАЇї вводять вказаному суб'єкту шляхом підшкірного введення.
71. Спосіб за п. 70, де підшкірне введення являє собою самостійне введення.
72. Спосіб за п. 71, де самостійне введення здійснюють за допомогою попередньо заповненого шприца або автоматичного медичного шприца.
73. Спосіб за будь-яким із пп. 56-60, який додатково передбачає оцінювання рівня експресії МРНК ТТК або експресії білка ТТК у зразку, одержаному від суб'єкта.
74. Спосіб за будь-яким із пп. 56, 58 і п. 60, де антисенсові нитки містять нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: 5-ивСівиадинасацдАгТаайсссавзивс-3 (ЗЕО ІО МО: 6), 5-изСтвидстицАїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7), 5-Ш8СтвицастииАїсайдАтайтисссазивс-3 (ЗЕО ІЮ МО: 8) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалйтисссазивсо-3" (ЗЕО ІО МО: 9), де а, с, д і и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СТ, С і ОГ являють собою 2'"-фтор-модифіковані А, С, б або О; 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
75. Спосіб за будь-яким із пп. 56, 58 і п. 60, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається з: Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-ивСівцддицасайдАтаайсссазивсо-3 (ЗЕО ІО МО: 6); Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5Б-изСтвидс ти АїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7); Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-Ш8СтвицастииАїсайдАтайтисссазивсо-3 (ЗЕО ІЮ МО: 8); та Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалйтисссазивсо-3" (ЗЕО ІО МО: 9), де а, с, д і и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СТ, С і ОГ являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, С або М; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
176. Спосіб за п. 75, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та З0 00 5-ивСівидсамшиАїсайдАталіисссазивсо-3 (5ЕО ІО МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, с або Ш; АГ, СІ, сі г являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, с або Ш; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
77. Спосіб за п. 70, де двонитковий засіб для КМАЇї вводять суб'єкту протягом тривалого часу кожні 4 тижні, кожні 5 тижнів або кожні шість тижнів.
78. Спосіб лікування суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 50 мг до приблизно 250 мг засобу на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ЕМАЇ), де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіоатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
79. Спосіб зменшення, уповільнення або припинення підвищення бала за шкалою оцінки нейропатичних порушень (МІ5) або модифікованою МІЗ (тМіІЗ-7) у суб'єкта, який страждає на ТТВ-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 50 мг до приблизно 250 мг засобу на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (ЕМАЇ), де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; бо де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій;
де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіосатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
80. Спосіб підвищення показника тесту з б-хвилинною ходьбою (6МУУТ) у суб'єкта, який страждає на ТТК-асоційоване захворювання або має ризик розвитку ТТК-асоційованого захворювання, що передбачає введення суб'єкту фіксованої дози, що становить від приблизно 50 мг до приблизно 250 мг засобу на основі двониткової рибонуклеїнової кислоти (КМАЇ), де двонитковий засіб для ЕМАЇ містить сенсову нитку, комплементарну до антисенсової нитки, де вказана антисенсова нитка містить ділянку, комплементарну до ЗЕО ІЮ МО: 2, де довжина кожної нитки становить від приблизно 14 до приблизно 30 нуклеотидів, де практично всі нуклеотиди сенсової нитки і практично всі нуклеотиди антисенсової нитки являють собою модифіковані нуклеотиди, де сенсова нитка містить не більше 8 2'-фтор-модифікацій; де антисенсова нитка містить не більше 6 2'-фтор-модифікацій; де кожна із сенсової нитки та антисенсової нитки незалежно містить два фосфотіосатні зв'язки на 5'-кінці; і де сенсова нитка кон'югована щонайменше з одним лігандом.
81. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇї представлений формулою (Ше): сенсова нитка: 5'-Ма- Ум м-Мь-3", антисенсова нитка: 3'-пр'-Ма- У 7 -Мь'-5", (Ше) де Пр являє собою виступаючий кінець з 2 нуклеотидів, і кожний нуклеотид у пр' зв'язаний із сусіднім нуклеотидом за допомогою фосфотісатного зв'язку; кожний із Ма, Мь, Мь і Му" незалежно являє собою олігонуклеотидну послідовність, що містить 0- 25 нуклеотидів, які є або модифікованими, або немодифікованими, або їхніми комбінаціями, при цьому кожна послідовність містить щонайменше два неоднаково модифіковані нуклеотиди; кожний із УМ і У" незалежно являє собою один мотив з трьома ідентичними модифікаціями трьох послідовних нуклеотидів.
82. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де антисенсова нитка містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: 5-ивСівцддицасайдАтаайсссазивсо-3 (ЗЕО ІО МО: б), 5-изСтвицдстиАїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7), 5-Ш8СтвицастииАїсайдАтайтисссазивс-3 (ЗЕО ІЮ МО: 8) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалйтисссазивсо-3" (ЗЕО ІО МО: 9), де а, с, д і и являють собою 27-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, СТ, С і ОГ являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, С або І; 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
83. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності, вибрані з групи, що складається 3: Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-ивСівцддицасайдАтаайсссазивсо-3 (ЗЕО ІО МО: 6); Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-изСівицдса ти АїсайдАталйтисссавивс-3'Є5ЕО ІЮ МО: 7); Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-З3 (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-Ш8СівидетишАтсаийдАтТалтисссазивсо-3'(5ЕО ІО МО: 8); та Б-ивдзадашлистАтОгдоаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-МРизСізидатицАїсацдАтТалтисссазивс-3'5ЕО ІЮ МО: 9), де а, с, д і м являють собою 2'-0- метил-модифіковані (2-ОМе) А, С, с або Ш; Ат, Ст, Сг і Ої являють собою 2'"-фтор-модифіковані А, С, С або М; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок; і МР являє собою міметик 5'-фосфату.
84. Спосіб за п. 83, де сенсова та антисенсова нитки містять нуклеотидні послідовності: Б-ивдзадашлистАт Ота цаассаада-3" (ЗЕО ІЮ МО: 10) та 5-изСтвидстицАїсайдАталйтисссавивс-3 (ЗЕО ІО МО: 7), де а, с, д і и являють собою 2'-О-метил-модифіковані (2'-ОМе) А, С, с або Ш; АГ, СІ, сі г являють собою 2'-фтор-модифіковані А, С, с або Ш; і 5 являє собою фосфотіоатний зв'язок.
85. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 50 мг.
86. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 75 мг.
87. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у бо фіксованій дозі, що становить приблизно 100 мг.
88. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 125 мг.
89. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 150 мг.
90. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 175 мг.
91. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 200 мг.
92. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 225 мг.
93. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для КМАї вводять суб'єкту у фіксованій дозі, що становить приблизно 250 мг.
94. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де фіксовану дозу двониткового засобу для ЕМАЇ вводять суб'єкту один раз на приблизно кожні 4 тижні, кожні 5 тижнів, кожні б тижнів, кожні 8 тижнів або один раз на три місяці.
95. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де фіксовану дозу двониткового засобу для ЕМАЇ вводять суб'єкту один раз на приблизно кожні три місяці.
96. Спосіб за будь-яким із пп. 78-80, де двонитковий засіб для ЕМАЇ вводять суб'єкту протягом тривалого часу.
97. Спосіб за будь-яким із пп. 78-96, де суб'єктом є людина.
98. Спосіб за п. 97, де вказаним суб'єктом є суб'єкт, який страждає на ТТЕ-асоційоване захворювання.
99. Спосіб за п. 97, де вказаним суб'єктом є суб'єкт з ризиком розвитку ТТЕ-асоційованого захворювання.
100. Спосіб за будь-яким із пп. 78-99, де вказаний суб'єкт має мутацію в гені ТТЕ, асоційовану з розвитком ТТК-асоційованого захворювання.
101. Спосіб за будь-яким із пп. 78-100, де вказане ТТК-асоційоване захворювання вибране з групи, що складається з сенільного системного амілоїдозу (55А), системного сімейного амілоїдозу, сімейної амілоїдної полінейропатії (ЕАР), сімейної амілоїдної кардіоміопатії (БАС), Зо лептоменінгеального амілоїдозу/амілоїдозу центральної нервової системи (СМ5) і гіпертироксинемії.
102. Спосіб за будь-яким із пп. 78-100, де у вказаного суб'єкта спостерігається ТТК- асоційований амілоїдоз, і при цьому вказаний спосіб забезпечує зниження відкладання ТТЕ- амілоїду у вказаного суб'єкта.
103. Спосіб за будь-яким із пп. 78-102, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять вказаному суб'єкту за допомогою шляху введення, вибраного з групи, що складається з підшкірного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, внутрішньобронхіального, внутрішньоплеврального, внутрішньочеревного, внутрішньоартеріального, лімфатичного, спинномозкового і будь-яких їхніх комбінацій.
104. Спосіб за будь-яким із пп. 78-102, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять вказаному суб'єкту шляхом підшкірного, внутрішньом'язового або внутрішньовенного введення.
105. Спосіб за будь-яким із пп. 78-102, де вказаний двонитковий засіб для ЕМАЇї вводять вказаному суб'єкту шляхом підшкірного введення.
106. Спосіб за п. 105, де підшкірне введення являє собою самостійне введення.
107. Спосіб за п. 106, де самостійне введення здійснюють за допомогою попередньо заповненого шприца або автоматичного медичного шприца.
108. Спосіб за будь-яким із пп. 78-102, який додатково передбачає оцінювання рівня експресії МРНК ТТК або експресії білка ТТК у зразку, одержаному від суб'єкта.
і р ш Й ке Й я ж.
НА НІЙ х 6 се . НИПИНиИННИ ши"шиєиєиєи и и и и и , НЕШШШШИММ Фігура 1 й ЦПитозоль самиць пашеків те Й жов нях Щ г ш-к--ке в-во Ї в шШшиш ст й я ПОН -о Ж 1 ши в я 0 ь й ше: кодек они чи в пи чи ЩШ ц а що оон С он З З " кА. | : ше кі ше. : і ї піт й сей сей Ш о Ж т : шк ие й Е - й м. її - - з у йо. Я С ІН ї Ши ще пс пи іа г і її шк: ШІ не : й : ж В їх ке Ши. ши шк пиши їх бе Ка. і т перен г аз 1 СН я Н КЗ Ї пня шк -5 5 КК Кай ї В | Моз» де ї З нене я авеавнйЙт й шини о а 24 28 35 495 45 БВ 63 78. 42 49 5 в зов ост Й зу і 34 Часідні) й ння АПОБІВЖЕ: АІь-вх т едумх АД 5 інакнкЕечне ямісу Де чекюкюю КАЕМАХ що в ДОМОМ) ов МІНИ ПИ Й | МЕТА КМ я я фігура 3 зевее ОЕЕЮТЕІУНЮХ ура: ї : : доня пічне Е й нн І що ' пиннннинниниинини : К. СЕЗ Ї,0 рення Н Пн йо ж п Б - ї Др евннея ч й ! Я | : Й | еднкккккккккккккккккя Й : ко | М доня : ей : щей ЕВ 1 Ж т ин НІ т ше па - ня ї Ей пенні ; Е щ Я У еше о. ї ах Ще -Е еосптнннтня : ур дп ее І нини с Й й А вк -Б М: Н : Й о ней й : ни ши з шо К. - 00 ЗК о і па ЕН в Ба нс ну Ж о ши В --. щи д я | Щ У, - й ях Й щі З ї о ту ва о дно | й они дум слхд ЗАТ ІЯЖУ Кі кін ок яміст УК мюбйню КІР ДІ сеяксе АІКЕФКУХ ПК ех | З ПЕВ Фігура 4 ЦЖКЬ сюдюю МОНЕЩОТЯ ЗМІ що шле К Ех плей "- » ма 7 і и й: - да Я що У з х в я мч тб» в М мае ж з сш -ч -о й ко щохей я ВО і ЕХ й Шо без ве ва 7 : Ше щи Н ї : В в ши ; х ш в; ще пн ЕН КК КО що З у їй М ж г Час дні) а КУ КУ КУ Її фігура 5 СМІХ у кількості 0,3 мук СМІХ у кількості І мг суто но или ДВ М хо елек ВЕК ЛІК хору ееннкеВ З вики ВІК У СВ ех В Я міке АТ ВИ жхкддх | Мк МЛН Й НІ ке А крани ВИДЬЯКМК й й вояк в за 00: ваз. що І ож ще МОЖ с турне ЕЛ А НИМ З НЕ НБК КЕ зі ЩЕ - БЕЗ КЗ т з Жеще Же ОКО БАШТ КЗ ко х з МЕМ СТ ОПН Я г КОХ К М КО кот аж й ж и я НН Ва Ї В о В ОК Кок ОТЖ о ї ж щ ВЗ М х - ї ої и щоОфш ДИ ОН з НВ КЗ У : Ж се 5 В Ж лю ен ше ШЕ ще Же ре а и нин в ОО ТБ ва іа о ЧЕЙ Ше: й : во у 55 ЦК що п ве : я я 5 5 55 са ЯКО Яр Ж Е МОБ дрон їй яко я ж дк хх же що ж У «ах що й и шо Ж ни нн І НН сш ше ше Ма бл Часідцй ї ХЕ КЗ ї Фігура А згура 6.
Сміх Я у кількості З виТЖг те З моз ВІЗІКМН ТИ се хек АТМ г КО доня Б х їх Б ще ов 3 їхе ма Фігура ОС ту Груп З та в між нн ншшшш и ши Я Як вішлення Ден: Я я Со 5 ВЕ З З з Х Х нд тя ши ши ши ши ши ША шин ши зе: х 3 х ї Е ОЗ З Фігура 7
Одноразова доза 0,3 мі/ке тд У В хюїки АМС Ме М Я кар ЗІКИ ТЕТ В В ї : - Ж ї :
- х. ї щі по й. х ши : шк ся ї з-о ев п : : в я т 5 і -о ТЕЖ ; ! : : що ех У НЕ : ! реження і В шШ ОА ОХ 1 1 і і Тов : «В ї ХНН Яя Н 1 ї і ї он Ку Кока ве Не в М ни и НН п
- х. рН НН; ЧИ НКУ 4 Н : ї СОМ Н ку У ник ше МВ З і Я ЕІ Н СК і; о ПОЛА еВ : Н Н Де т ї як В ж. Ж свахи КАК, оп М каш ДИ ШИ НЕ : Ж Ко ще Б тд св З о ни З ще Н Н З Б ме в ин шов якої ОКО А НК й; ва ве ; : : а : ї
3. : х : і : СХ : ї Н Я ї 7 : й кл ФС: Е ї Сі ї ІЗ Н х й : Н "й ПН о м В ї БУ І : Н З -ї що ; щ- : | | | пиши -к М : Е : Н Х їй Н ! ш щ БУ т Щ т- : ї : Кох ФО ях х ІЗ х І ЗИ: ЗЕ З ра ка Я ; ; Ж У й. Е І т Й я х Х У Ка Я Зх ЗІ ЗКУ Її Часідні Вік 0. Фігура ВА усе сте : - : ж «кі стей т МОХ ща р 7 Бо Їй еВ вх Й і: т : Н Н шо ж й 3 Ї Я : ж | і щ У ШЕ ї : : ! І і - Ерозія :ї : І Н Н ОО Ес ї КОХ ОК Ох ї : : Н доня і ; З х І СЗЕ Е Н : : Н ІМ Н шо я о ЕН : х : І ВМ в. - да ще з г ай : Н Н Н ва ви З ВД : т : І з Х - гі У шов Н : З : ! дик а - : ОК Н : : Ж дви й - лота В: ї : т ї : І КУ Н З шк» Ж ши Е Н ! і | й ' н ОНИ: х і Н : ТЯ: ; ї Н да з Уч СЕ й : і : у ШЕ ї ' і кошея ЩО 115 Н ії ї : с: Н Н : вед : ШИ ї : Н і : НИ і х З їнод ши і ШЕ нин ши ши ДЕН Що шин - : я ЧЕ : Е Е А Я вве ще м і - : ще г Н Н с З шої т : Кен Н Н їв "і ща: щ їі їх т с ни ії Н ї «ВЕ ' а МАО ТЕО І ї ЕЙ р ї о : ву то ія Н Как : Еш ще ро Е і ї ц ! НИ і І ї- : КУ туї і Е І Е Н і КО і й й п : у НЕ з: В : і ! шик А х ЩЕ КО ї І х : і і че ВИ ом. ше ше ши шк СИ Е ж : б ї ї - 3 ще ї Н З оохам : З В Н Ї ЧИ : і ш | шин : ШЕ я : х Во к : Н і Х ча Не т ї ї й Кк нащиєх ШЕ Ох - . Ж х Б т г ІЗ У Не: Не з ИН У НН З ЗВ ПН З НН В Є ЗНЗ Я: пох й Ж не й же хо З Чх ЗЕ ЩЕ 1 ща Ки Й х с. ї Час ле Жуттчжттчк М фігура 5
UAA201802022A 2015-07-31 2016-07-28 КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ UA126276C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562199563P 2015-07-31 2015-07-31
US201662287518P 2016-01-27 2016-01-27
PCT/US2016/044359 WO2017023660A1 (en) 2015-07-31 2016-07-28 TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA126276C2 true UA126276C2 (uk) 2022-09-14

Family

ID=56682264

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201802022A UA126276C2 (uk) 2015-07-31 2016-07-28 КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ

Country Status (33)

Country Link
US (4) US10208307B2 (uk)
EP (1) EP3329002B1 (uk)
JP (3) JP6896703B2 (uk)
KR (2) KR20240074895A (uk)
CN (2) CN116064515A (uk)
BR (1) BR112018000542B1 (uk)
CA (1) CA2994285A1 (uk)
CL (1) CL2018000198A1 (uk)
CY (1) CY1124545T1 (uk)
DK (1) DK3329002T3 (uk)
EA (1) EA201890394A1 (uk)
ES (1) ES2842300T3 (uk)
FI (1) FIC20230006I1 (uk)
FR (1) FR23C1008I2 (uk)
HK (2) HK1256494A1 (uk)
HR (1) HRP20202082T1 (uk)
HU (2) HUE051998T2 (uk)
IL (2) IL296476B1 (uk)
LT (2) LT3329002T (uk)
MA (1) MA43335B1 (uk)
MX (2) MX2018000981A (uk)
MY (1) MY195720A (uk)
NL (1) NL301216I2 (uk)
NO (1) NO2023007I1 (uk)
PL (1) PL3329002T3 (uk)
PT (1) PT3329002T (uk)
RS (1) RS61297B1 (uk)
SG (1) SG10201912341SA (uk)
SI (1) SI3329002T1 (uk)
TW (3) TWI727963B (uk)
UA (1) UA126276C2 (uk)
WO (1) WO2017023660A1 (uk)
ZA (2) ZA201800571B (uk)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
BR112012000828A8 (pt) 2009-07-06 2017-10-10 Ontorii Inc Novas pró-drogas de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
US9605019B2 (en) 2011-07-19 2017-03-28 Wave Life Sciences Ltd. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
KR102095699B1 (ko) 2011-11-18 2020-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
CN104105790A (zh) 2011-11-18 2014-10-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 修饰的RNAi试剂
AU2013288048A1 (en) 2012-07-13 2015-01-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
KR20220139425A (ko) 2012-07-13 2022-10-14 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
WO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP3095461A4 (en) 2014-01-15 2017-08-23 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
PT3094728T (pt) 2014-01-16 2022-05-19 Wave Life Sciences Ltd Desenho quiral
SG10201912341SA (en) * 2015-07-31 2020-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES
JOP20210043A1 (ar) * 2015-10-01 2017-06-16 Arrowhead Pharmaceuticals Inc تراكيب وأساليب لتثبيط تعبير جيني للـ lpa
WO2018112320A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing ttr-associated diseases using transthyretin (ttr) irna compositions
BR112020005230A2 (pt) 2017-09-19 2020-09-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. composições e métodos para o tratamento da amiloidose mediada por transtiretina (ttr)
CA3083968C (en) * 2017-12-01 2024-04-23 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Double-stranded oligonucleotide, composition and conjugate comprising double-stranded oligonucleotide, preparation method thereof and use thereof
JP7470107B2 (ja) * 2018-09-28 2024-04-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及びＴＴＲ関連眼疾患を治療又は予防するためのその使用方法
EP4022062A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Neurofilament light chain (nfl) as a biomarker for transthyretin amyloidosis polyneuropathy
CN115461460A (zh) 2020-03-06 2022-12-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 用于抑制转甲状腺素蛋白(ttr)的表达的组合物和方法
EP4237005A1 (en) * 2020-10-28 2023-09-06 Novo Nordisk A/S Anti-transthyretin antibodies and methods of use thereof
WO2022260939A2 (en) 2021-06-08 2022-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating or preventing stargardt's disease and/or retinal binding protein 4 (rbp4)-associated disorders
CN117795074A (zh) 2021-08-03 2024-03-29 阿尔尼拉姆医药品有限公司 转甲状腺素蛋白（TTR）iRNA组合物和其使用方法

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030027216A1 (en) 2001-07-02 2003-02-06 Kiernan Urban A. Analysis of proteins from biological fluids using mass spectrometric immunoassay
US20030229037A1 (en) 2000-02-07 2003-12-11 Ulrich Massing Novel cationic amphiphiles
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
US20030072794A1 (en) 2000-06-09 2003-04-17 Teni Boulikas Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes
HU230458B1 (hu) 2000-12-01 2016-07-28 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák
US20020160394A1 (en) 2001-01-24 2002-10-31 Bayer Corporation Regulation of transthyretin to treat obesity
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2002318396A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 The Cleveland Clinic Foundation Homocysteinylated transthyretin
US20030191056A1 (en) 2002-04-04 2003-10-09 Kenneth Walker Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins
AU2003260370B2 (en) 2002-08-05 2008-05-22 Silence Therapeutics Gmbh Further novel forms of interfering RNA molecules
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004042072A2 (en) 2002-11-01 2004-05-21 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Quantitative analysis of protein isoforms using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry
JP2006507841A (ja) 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
US7250496B2 (en) 2002-11-14 2007-07-31 Rosetta Genomics Ltd. Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
DK2216407T3 (en) 2003-03-07 2016-03-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc therapeutic compositions
AU2004227414A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals iRNA conjugates
EP1648519B1 (en) 2003-07-16 2014-10-08 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US20050244869A1 (en) 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
EP1765415A4 (en) 2004-06-03 2010-03-24 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS FACILITATING THE "RISC" LOAD
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
US7838561B2 (en) 2004-06-14 2010-11-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for preventing or treating cardiac hypertrophy
BRPI0520207A2 (pt) 2004-12-08 2012-09-25 Revision Therapeutics Inc uso de uma quantidade eficaz de um primeiro composto, e, medicamento sistemicamente formulado
WO2007086883A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
ES2381201T3 (es) 2005-03-31 2012-05-24 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibidores de la subunidad 2 de la ribonucleótido-reductasa y utilizaciones de los mismos
US7915230B2 (en) 2005-05-17 2011-03-29 Molecular Transfer, Inc. Reagents for transfection of eukaryotic cells
AU2006274413B2 (en) 2005-07-27 2013-01-10 Arbutus Biopharma Corporation Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2007051303A1 (en) 2005-11-02 2007-05-10 Protiva Biotherapeutics, Inc. MODIFIED siRNA MOLECULES AND USES THEREOF
US7718629B2 (en) 2006-03-31 2010-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
GB0704764D0 (en) 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
US20110046206A1 (en) 2007-06-22 2011-02-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double strand compositions comprising differentially modified strands for use in gene modulation
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
CA2710713C (en) 2007-12-27 2017-09-19 Protiva Biotherapeutics, Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP2011511004A (ja) 2008-01-31 2011-04-07 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド ＰＣＳＫ９遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを送達するための最適化された方法
WO2009100390A2 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Classifying amyloidosis
CN102119217B (zh) 2008-04-15 2015-06-03 普洛体维生物治疗公司 用于核酸递送的新型制剂
TWI455944B (zh) 2008-07-01 2014-10-11 Daiichi Sankyo Co Ltd 雙股多核苷酸
EP2323667A4 (en) 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
ES2475065T3 (es) 2008-10-09 2014-07-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Aminol�pidos mejorados y métodos para la administración de ácidos nucleicos
EA020312B1 (ru) 2008-10-20 2014-10-30 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы для ингибирования экспрессии транстиретина
CN104910025B (zh) 2008-11-07 2019-07-16 麻省理工学院 氨基醇类脂质和其用途
KR20220150995A (ko) 2008-11-10 2022-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
WO2010078536A1 (en) 2009-01-05 2010-07-08 Rxi Pharmaceuticals Corporation Inhibition of pcsk9 through rnai
EP3243504A1 (en) 2009-01-29 2017-11-15 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
SG10201402054UA (en) 2009-05-05 2014-09-26 Muthiah Manoharan Lipid compositions
TR201811076T4 (tr) 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
NZ597504A (en) 2009-06-15 2013-10-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated dsrna targeting the pcsk9 gene
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
EP2496238A4 (en) 2009-11-03 2013-10-02 Alnylam Pharmaceuticals Inc FORMULATED LIPID COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING TRANSTHYRETIN EXPRESSION (TTR)
WO2011123468A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sirna therapy for transthyretin (ttr) related ocular amyloidosis
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
US9290760B2 (en) 2010-09-15 2016-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
US9260471B2 (en) 2010-10-29 2016-02-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using short interfering nucleic acids (siNA)
US20140275211A1 (en) 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
CN104105790A (zh) 2011-11-18 2014-10-15 阿尔尼拉姆医药品有限公司 修饰的RNAi试剂
KR102095699B1 (ko) 2011-11-18 2020-04-02 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴（ＴＴＲ） 관련 질병을 치료하기 위한 ＲＮＡｉ 제제, 조성 및 그의 사용방법
CA2879683C (en) 2012-08-03 2023-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
WO2015042564A1 (en) * 2013-09-23 2015-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing transthyretin (ttr) associated diseases
AU2014360314B2 (en) 2013-12-06 2018-04-26 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the specific inhibition of transthyretin (TTR) by double-stranded RNA
WO2015089368A2 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component irna compositions and methods of use thereof
SG10201913791QA (en) 2014-08-20 2020-03-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Modified double-stranded rna agents
KR102631505B1 (ko) 2014-08-29 2024-02-01 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스타이레틴(ttr) 매개 아밀로이드증의 치료 방법
SG10201912341SA (en) 2015-07-31 2020-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc TRANSTHYRETIN (TTR) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR PREVENTING TTR-ASSOCIATED DISEASES
JP7470107B2 (ja) 2018-09-28 2024-04-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物及びＴＴＲ関連眼疾患を治療又は予防するためのその使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
LTPA2023505I1 (uk) 2023-02-27
KR102667020B1 (ko) 2024-05-21
WO2017023660A1 (en) 2017-02-09
US20230022185A1 (en) 2023-01-26
TW201718855A (zh) 2017-06-01
NO2023007I1 (no) 2023-02-07
BR112018000542A2 (pt) 2018-09-18
CN108138182A (zh) 2018-06-08
MA43335A (fr) 2018-06-06
US20200377889A1 (en) 2020-12-03
PT3329002T (pt) 2021-01-12
ES2842300T3 (es) 2021-07-13
HUS2300007I1 (hu) 2023-02-28
FIC20230006I1 (fi) 2023-02-06
IL256614B2 (en) 2023-02-01
HK1256494A1 (zh) 2019-09-27
JP6896703B2 (ja) 2021-06-30
CA2994285A1 (en) 2017-02-09
NL301216I2 (nl) 2023-05-24
US11286486B2 (en) 2022-03-29
KR20240074895A (ko) 2024-05-28
MY195720A (en) 2023-02-07
BR112018000542B1 (pt) 2023-01-24
TWI727963B (zh) 2021-05-21
MX2018000981A (es) 2018-06-11
PL3329002T3 (pl) 2021-04-19
JP2024028749A (ja) 2024-03-05
CL2018000198A1 (es) 2018-07-20
DK3329002T3 (da) 2021-01-11
ZA201800571B (en) 2019-07-31
US20190345492A1 (en) 2019-11-14
HRP20202082T1 (hr) 2021-02-19
FR23C1008I2 (fr) 2024-04-05
US10683501B2 (en) 2020-06-16
EP3329002A1 (en) 2018-06-06
IL296476B1 (en) 2024-06-01
LT3329002T (lt) 2021-01-11
MA43335B1 (fr) 2021-01-29
TW202130810A (zh) 2021-08-16
CN108138182B (zh) 2022-08-19
JP2021167313A (ja) 2021-10-21
HK1256683A1 (zh) 2019-10-04
MX2023012080A (es) 2023-10-25
SG10201912341SA (en) 2020-02-27
JP7417559B2 (ja) 2024-01-18
JP2018523655A (ja) 2018-08-23
CN116064515A (zh) 2023-05-05
HUE051998T2 (hu) 2021-04-28
US10208307B2 (en) 2019-02-19
EA201890394A1 (ru) 2018-08-31
SI3329002T1 (sl) 2021-02-26
CY1124545T1 (el) 2022-07-22
TW202344688A (zh) 2023-11-16
FR23C1008I1 (fr) 2023-03-24
IL256614B (en) 2022-10-01
EP3329002B1 (en) 2020-10-07
NL301216I1 (uk) 2023-02-08
IL296476A (en) 2022-11-01
IL256614A (en) 2018-02-28
TWI807302B (zh) 2023-07-01
RS61297B1 (sr) 2021-02-26
KR20180028537A (ko) 2018-03-16
ZA201902447B (en) 2021-10-27
US20170029817A1 (en) 2017-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA126276C2 (uk) КОМПОЗИЦІЯ НА ОСНОВІ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНУ (TTR) І СПОСІБ ЇЇ ЗАСТОСУВАННЯ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АБО ПОПЕРЕДЖЕННЯ TTR-АСОЦІЙОВАНОГО ЗАХВОРЮВАННЯ
JP6933670B2 (ja) Ｓｅｒｐｉｎｃ１ ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
JP7062623B2 (ja) ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物及びその使用方法
JP7058656B2 (ja) トランスサイレチン（ＴＴＲ）ｉＲＮＡ組成物を用いてＴＴＲ関連疾患を治療または予防するための方法
JP2021073290A (ja) パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
ES2640260T3 (es) Composiciones y métodos para inhibir la expresión del Gen alas1
JP2020141685A (ja) アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
CN105408481B (zh) SERPINA1 iRNA组合物及其使用方法
ES2656516T3 (es) Composiciones y métodos para inhibir la expresión de transtiretina
CN103890000B (zh) 血管生成素样3(ANGPTL3)iRNA组合物及其使用方法
RU2702501C2 (ru) Композиции и способы ингибирования экспрессии гена tmprss6
TW201710501A (zh) 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法
TWI669393B (zh) 抑制ｌｅｃｔ２基因表現之組合物及方法
CN105452463A (zh) Tmprss6 irna组合物及其使用方法
TWI694080B (zh) 抑制ａｌａｓ１基因表現的組合物及方法
CN116234585A (zh) 微管相关蛋白TAU(MAPT)iRNA剂组合物及其使用方法
TW201718857A (zh) 用於抑制alas1基因表現之組合物及方法
CN117561334A (zh) 人染色体9开放阅读框72（C9ORF72）iRNA药剂组合物和其使用方法
EA043935B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA ДЛЯ ТРАНСТИРЕТИНА (TTR) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ АССОЦИИРОВАННЫХ С TTR ЗАБОЛЕВАНИЙ
NZ714530B2 (en) SERPINA1 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
NZ620151B2 (en) Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compostions and methods of use thereof
EA042137B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ iRNA TMPRSS6 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ