TW201710501A - 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法 - Google Patents

類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其用途方法 Download PDF

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Abstract

本發明涉及靶向ANGPTL3基因的雙股核糖核酸(dsRNA)組成物，以及使用此種dsRNA組成物而抑制ANGPTL3表現的方法及治療具有脂肪代謝障礙，諸如高血脂症或高三酸甘油酯血症之個體的方法。

Description

類血管生成素3(ANGPTL3)iRNA組成物及其用途方法 相關申請案
本申請主張2015年4月13日提交的美國臨時申請案號62/146,604及2015年12月1日提交的美國臨時申請案號62/261,361的優先權之利益。藉由引用將上述各申請案的全部內容併入本文中。
序列表
目前的申請案含有序列表，該序列表已經以ASCII格式電子提交，藉由引用將全部內容併入本文中。所述ASCII複本創建於2016年4月12日，命名為121301-03363_SL.txt及大小為213,246位元組。
類血管生成素3(ANGPTL3)為分泌調控脂質代謝之因子的類血管生成素家族之成員及主要在肝臟中表現(Koishi,R.et al.,(2002)Nat.Genet.30(2)：151-157)。ANGPTL3雙重抑制催化三酸甘油酯水解的脂蛋白脂肪酶(LPL)，及水解高密度脂蛋白(HDL)磷脂類的內皮脂肪酶(EL)的催化活性。在降血脂但肥胖的KK/Snk小鼠中，降低 ANGPTL3表現經由促進清除三酸甘油酯而對高血脂症及動脈粥樣硬化具有保護效應(Ando et al.,(2003)J.Lipid Res.,44：1216-1223)。人類ANGPTL3血漿濃度與血漿HDL膽固醇及HDL磷脂的位準正相關(Shimamura et al.,(2007)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.,27：366-372)。
脂肪代謝障礙可導致血清脂質的位準升高，諸如三酸甘油酯及/或膽固醇。血清脂質升高與高血壓、心血管疾病、糖尿病及其他病理狀況強烈相關。高三酸甘油酯血症為脂肪代謝障礙的實例其特徵為三酸甘油酯的高血液位準。其係與動脈粥樣硬化有關，即使在沒有高膽固醇位準(高膽固醇血症)的情況。當三酸甘油酯濃度過量時(即，大於1000mg/dl或12mmol/l)，高三酸甘油酯血症亦可導致胰臟炎。高血脂症為脂肪代謝障礙的另一個實例其特徵為血液中任一種或全部脂質及/或脂蛋白的位準升高。脂肪代謝障礙的現有治療，包含節食、運動及用他汀類(statins)及其他藥物治療，並不總是有效的。據此，在所屬領域中需要有針對具有脂肪代謝障礙之個體的替代治療。
本發明提供iRNA組成物，該iRNA組成物有效應於ANGPL3基因的RNA轉錄本的RNA誘導沉默複合體(RISC)介導的裂解。ANGPL3基因可在細胞中，如，個體諸如人類中的細胞。本發明亦提供方法使用本發明iRNA組成物用於抑制ANGPL3基因表現及/或用於治療可從 ANGPL3基因表現的抑制或減低而受益的個體，如，患有或易患有脂肪代謝障礙的個體，諸如患有或易患有高血脂症或高三酸甘油酯血症的個體。
據此，一方面，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNAs)用於抑制ANGPTL3表現。dsRNAs包含有義股及反義股，其中有義股包括與SEQ ID NO：1序列的差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸及反義股包括與SEQ ID NO：5序列的差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。在某些具體例中，dsRNAs包含有義股及反義股，其中有義股包括與表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任何一個表中所列的任何一個反義股的差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸。
另一方面，本發明提供雙股核糖核酸(dsRNAs)用於抑制ANGPTL3表現。dsRNAs包含有義股及反義股，反義股包括互補區，而該互補區包括與選自下列所成群組的任何一個核苷酸序列的差異不超過3個核苷酸的至少15個連續核苷酸：5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：14)5'-UTGAGUUCAAGTGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：15)；5'-GAAUATGUGACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：16)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：17)；5'-AUUAAGCUGCUUCUUUTUAUU-3'(SEQ ID NO：18)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：19)； 5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3'(SEQ ID NO：20)5'-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3'(SEQ ID NO：21)；5'-UGUCACUUGAACUCAACUCAA-3'(SEQ ID NO：22)5'-UUGAGUUGAGUUCAAGUGACAUA-3'(SEQ ID NO：23)；5'-AACUAACUAACUUAAUUCAAA-3'(SEQ ID NO：24)5'-UUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGC-3'(SEQ ID NO：25)；5'-UCACAAUUAAGCUCCUUCUUU-3'(SEQ ID NO：26)5'-AAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAAC-3'(SEQ ID NO：27)；5'-GAGCAACUAACUAACUUAAUU-3'(SEQ ID NO：28)5'-AAUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO：29)；5'-UUAUUGUUCCUCUAGUUAUUU-3'(SEQ ID NO：30)5'-AAAUAACUAGAGGAACAAUAAAA-3'(SEQ ID NO：31)；5'-AUUAAGCUCCUUCUUUUUAUU-3'(SEQ ID NO：32)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：33)；5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：34)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：35)；5'-CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3'(SEQ ID NO：36)5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3'(SEQ ID NO：37)；及5'-CUCCAUAGUGAAGCAAUCUAA-3'(SEQ ID NO：38)5'-UUAGAUUGCUUCACUAUGGAGUA-3'(SEQ ID NO：39)。
在某些具體例中，有義及反義股包括選自下列所成群組的核苷酸序列：5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：14) 5'-UTGAGUUCAAGTGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：15)；5'-GAAUATGUGACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：16)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：17)；5'-AUUAAGCUGCUUCUUUTUAUU-3'(SEQ ID NO：18)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：19)；5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3'(SEQ ID NO：20)5'-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3'(SEQ ID NO：21)；5'-UGUCACUUGAACUCAACUCAA-3'(SEQ ID NO：22)5'-UUGAGUUGAGUUCAAGUGACAUA-3'(SEQ ID NO：23)；5'-AACUAACUAACUUAAUUCAAA-3'(SEQ ID NO：24)5'-UUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGC-3'(SEQ ID NO：25)；5'-UCACAAUUAAGCUCCUUCUUU-3'(SEQ ID NO：26)5'-AAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAAC-3'(SEQ ID NO：27)；5'-GAGCAACUAACUAACUUAAUU-3'(SEQ ID NO：28)5'-AAUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO：29)；5'-UUAUUGUUCCUCUAGUUAUUU-3'(SEQ ID NO：30)5'-AAAUAACUAGAGGAACAAUAAAA-3'(SEQ ID NO：31)；5'-AUUAAGCUCCUUCUUUUUAUU-3'(SEQ ID NO：32)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：33)；5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：34)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：35)；5'-CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3'(SEQ ID NO：36)5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3'(SEQ ID NO：37)；及 5'-CUCCAUAGUGAAGCAAUCUAA-3'(SEQ ID NO：38)5'-UUAGAUUGCUUCACUAUGGAGUA-3'(SEQ ID NO：39)。
在某些具體例中，dsRNA包括至少一個修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA在有義股中包括不超過4個(即，4、3、2、1或0)未修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA在反義股中包括不超過4個(即，4、3、2、1或0)未修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA在有義股及反義股兩者中包括不超過4個(即，4、3、2、1或0)未修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA之所有有義股中的核苷酸均為修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA之所有反義股中的核苷酸均為修飾核苷酸。在某些具體例中，dsRNA之有義股中的所有核苷酸及反義股中所有的核苷酸均為修飾核苷酸。
在某些具體例中，修飾核苷酸獨立選自由2'-O-甲基修飾核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸及與膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺基團相連接的末端核苷酸所成群組。在某些具體例中，修飾核苷酸選自由2'-去氧-2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、鎖核苷酸、無鹼基核苷酸(abasic核苷酸)、2'-胺基-修飾核苷酸、2'-烷基-修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯及含非天然鹼基的核苷酸所成群組。
在某些具體例中，dsRNA包括至少17個核苷酸長度的互補區。在某些具體例中，dsRNA包括19及23個核苷酸長度的互補區。在某些具體例中，dsRNA包括 19個核苷酸長度的互補區。
在某些具體例中，dsRNA的各股不超過30個核苷酸長度。在某些具體例中，dsRNA為至少15個核苷酸長度。
在其他具體例中，本發明雙股RNAi藥劑的一股或兩股多達66個核苷酸長度，如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸長度，有至少19個連續核苷酸的區域，而該區域實質上與ISNR基因之mRNA轉錄本的至少一部份互補。在一些具體例中，有義及反義股形成18至30個連續核苷酸的雙鏈體(duplex)。
在一具體例中，RNAi藥劑的至少一股包括至少1個核苷酸的3'突出。在某些具體例中，至少一股包括至少2個核苷酸的3'突出，如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在其他具體例中，RNAi藥劑的至少一股包括至少1個核苷酸的5'突出。在某些具體例中，至少一股包括至少2個核苷酸的5'突出，如，2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個核苷酸。在又其他的具體例中，RNAi藥劑之一股的3'及5'皆包括至少1個核苷酸的突出。
在某些具體例中，雙股RNAi藥劑進一步包括配體。在某些具體例中，配體為N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)。配體可以是經由單價、二價或三價分支連接子而附接於RNAi藥劑的一個或多個GalNAc。配體可接合至 雙股RNAi藥劑之有義股的3'端、雙股RNAi藥劑之有義股的5'端、雙股RNAi藥劑之反義股的3'端或雙股RNAi藥劑之反義股的5'端。
在一些具體例中，本發明之雙股RNAi藥劑包括複數個GalNAc，如，2、3、4、5或6個，各獨立經由複數個單價連接子而附接於雙股RNAi藥劑的複數個核苷酸。
在某些具體例中，配體為
在某些具體例中，雙股RNAi藥劑如下列示意圖所示與配體接合 及，其中X為O或S。在一具體例中，該X為O。
在某些具體例中，dsRNA包括選自下列所成群組的雙鏈體：AD-57927.6、AD-63133.1、AD-63136.1、AD-63137.1、AD-63139.1、AD-63142.1、AD-63143.1、AD-63144.1、AD-63145.1、AD-63148.1、AD-63149.1、AD-63150.1、AD-63151.1、AD-63153.1、AD-63154.1、AD-63156.1、AD-63157.1、AD-63160.1、AD-63162.1、AD-63163.1、AD-63167.1、AD-63168.1、AD-63170.1、AD-63173.1、AD-63174.1、AD-63175.1、AD-63176.1、AD-63177.1、AD-63179.1、AD-63181.1、AD-66916、AD-66920、AD-66921、AD-66923、AD-66922、AD-66917、AD-66918、AD-66919、AD-66924、AD66925及AD-63185.1。在某些具體例中，dsRNA包括選自下列所成群組的雙鏈體：AD-57927.6、AD-63136.1、AD-63137.1、AD-63142.1、D-63148.1、AD-63151.1、AD-63156.1、AD-63157.1、AD-63160.1、AD-63163.1、AD-63167.1、AD-63170.1、AD-63173.1、AD-63174.1、AD-63176.1、AD-66916、AD-66920、AD-66921、AD-66923、AD-66922、AD-66917、AD-66918、AD-66919、AD-66924、AD66925、AD-67173、AD-67174、AD-67007、及AD-63179.1。在一具體例中，dsRNA的有義及反義股包括選自下列所成群組的核苷酸序列：5'-ascsauauUfuGfAfUfcagucuuuuu-3'(SEQ ID NO：40)5'-asAfsaaaGfacugaucAfaAfuaugususg-3'(SEQ ID NO：41)；5'-usgsucacUfuGfAfAfcucaacucaaL96-3'(SEQ ID NO：42) 5'-usUfsgagUfuGfAfguucAfaGfugacasusa-3'(SEQ ID NO：43)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：44)5'-usdTsgaguucaagdTgdAcauauucsusu-3'(SEQ ID NO：45)；5'-gsasauadTgudGacuugaa(Cgn)ucaa-3'(SEQ ID NO：46)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：47)；5'-asusuaadGcudGcuucuuu(Tgn)uauu-3'(SEQ ID NO：48)5'-asAfsuaaAfaagaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：49)；5'-AfscsAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3'(SEQ ID NO：50)5'-asAfsaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfususg-3'(SEQ ID NO：51)；5'-UfsgsUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAf-3'(SEQ ID NO：52)5'-usUfsgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasusa-3'(SEQ ID NO：53)；5'-asascuaaCfuAfAfCfuuaauucaaa-3'(SEQ ID NO：54)5'-usUfsugaAfuUfAfaguuAfgUfuaguusgsc-3'(SEQ ID NO：55)；5'-uscsacaaUfuAfAfGfcuccuucuuu-3'(SEQ ID NO：56)5'-asAfsagaAfgGfAfgcuuAfaUfugugasasc-3'(SEQ ID NO：57)；5'-gsasgcaaCfuAfAfCfuaacuuaauu-3'(SEQ ID NO：58)5'-asAfsuuaAfgUfUfaguuaGfuUfgcucsusu-3'(SEQ ID NO：59)；5'-ususauugUfuCfCfUfcuaguuauuu-3'(SEQ ID NO：60)5'-asAfsauaAfcUfAfgaggAfaCfaauaasasa-3'(SEQ ID NO：61)；5'-asusuaagCfuCfCfUfucuuuuuauu-3'(SEQ ID NO：62)5'-asAfsuaaAfaAfGfaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：63)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：64)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：65)；5'-csasacauAfuUfUfGfaucagucuuu-3'(SEQ ID NO：66) 5'-asAfsagaCfuGfAfucaaAfuAfuguugsasg-3'(SEQ ID NO：67)；及5'-csusccauAfgUfGfAfagcaaucuaa-3'(SEQ ID NO：68)5'-usUfsagaUfuGfCfuucaCfuAfuggagsusa-3'(SEQ ID NO：69)。
另一方面，本發明提供含有本文所提供之dsRNAs的細胞。
在又另一方面，本發明提供抑制ANGPTL3基因表現用的醫藥組成物。組成物包含本文所提供之dsRNA藥劑。在某些具體例中，醫藥組成物進一步包括液體製劑。
本發明亦提供抑制細胞中ANGPTL3表現的方法。該方法包含使細胞與如本文所述dsRNA接觸；及維持細胞一段時間而使充分得到ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的降解，從而抑制細胞中ANGPTL3基因的表現。
在某些具體例中，細胞在個體中。在某些具體例中，個體為人類。在某些具體例中，人類個體患有脂肪代謝障礙。在某些具體例中，脂肪代謝障礙為高血脂症或高三酸甘油酯血症。在某些具體例中，抑制至少約30%的ANGPTL3表現。
另一方面，本發明提供治療個體的方法，該個體具有可經由降低ANGPTL3表現而受益的障礙。該方法包含對個體給藥治療有效量的任何本文提供之dsRNAs，從而治療個體。在某些具體例中，障礙為脂肪代謝障礙。在某些具體例中，脂肪代謝障礙為高血脂症或高 三酸甘油酯血症。在某些具體例中，對個體給藥dsRNA造成一種或多種血清脂質的減少及/或ANGPTL3蛋白累積的減少。
在進一步的方面，本發明亦提供抑制個體中ANGPTL3表現的方法。該方法包含對個體給藥治療有效量的任何本文提供之dsRNAs，從而抑制個體中ANGPTL3表現。
在又另一方面，本發明提供試劑盒用於進行本發明的方法。一具體例中，本發明提供試劑盒經由使細胞與有效於抑制細胞中ANGPTL3表現的量之本發明雙股RNAi藥劑接觸而進行抑制細胞中ANGPTL3基因表現的方法。試劑盒包括RNAi試劑及使用說明，及視需要地，對個體給藥RNAi藥劑的方式。
第1圖為顯示在指明的iRNA藥劑以單次30mg/kg、10mg/kg或3mg/kg的皮下劑量給藥後第3天，ob/ob雌性小鼠血清中殘留的ANGPTL3 mRNA量的圖。以相對於對照組樣本(PBS)的ANGPTL3 mRNA量對GAPDH mRNA量的比率之樣本中的ANGPTL3 mRNA量對GAPDH mRNA量的比率表示ANGPTL3 mRNA的量。
第2圖為顯示多劑量給藥AD-57927(第1星期期間每天3mg/kg經5天，隨後在第2至4星期以3mg/kg每星期2次(3.0mg/kg qd x 5；qw x 6))對ob/ob雌性小鼠的血清 ANGPTL3蛋白位準之效應圖。以相對於給藥AD-57927前血清樣本中存在的ANGPTL3蛋白量表示該ANGPTL3蛋白的量。
第3圖為顯示多劑量給藥AD-57927(第1星期期間每天3mg/kg經5天，隨後在第2至4星期以3mg/kg每星期2次(3.0mg/kg qd x 5；qw x 6))對ob/ob雌性小鼠的三酸甘油酯(TG)位準之效應圖。以相對於給藥AD-57927前血清樣本中存在的TG量表示TG的量。
第4圖為顯示多劑量給藥AD-57927(第1星期期間每天3mg/kg經5天，隨後在第2至4星期以3mg/kg每星期2次(3.0mg/kg qd x 5；qw x 6))對ob/ob雌性小鼠的LDL膽固醇(LDLc)位準之效應圖。以相對於給藥AD-57927前血清樣本中存在的LDLc量表示LDLc的量。
第5圖為顯示多劑量給藥AD-57927(第1星期期間每天3mg/kg經5天，隨後在第2至4星期以3mg/kg每星期2次(3.0mg/kg qd x 5；qw x 6))對ob/ob雌性小鼠的總膽固醇(Tc)位準之效應圖。以相對於給藥AD-57927前血清樣本中存在的Tc量表示Tc的量。
第6A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續期間圖，其係以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在野生型小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第6B圖為顯示以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的 iRNA藥劑後第10天殘留在野生型小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第7A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續期間的圖，其係以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在野生型小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第7B圖為顯示以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第5天殘留在野生型小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第8A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續期間的圖，其係以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在ob/ob小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第8B圖為顯示以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第5天在ob/ob小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白沉默百分率的圖。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白位準表示該小鼠ANGPTL3蛋白的沉默百分率。
第9圖為顯示以單次0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9 mg/kg皮下劑量給藥AD-65695後第5天在ob/ob小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白沉默百分率的圖。以相對於給藥前血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白位準表示該小鼠ANGPTL3蛋白的沉默百分率。
第10A圖為顯示以單次0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg皮下劑量給藥AD-65695(ALN-ANG)對ob/ob小鼠的三酸甘油酯(TG)位準之效應的圖。以給予AD-65695的小鼠血清樣本中的TG量對給予PBS的小鼠血清樣本中的TG量的比率表示TG的量。
第10B圖為顯示以單次0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg皮下劑量給藥AD-65695(ALN-ANG)對ob/ob小鼠的總膽固醇(TC)位準之效應的圖。以給予AD-65695的小鼠血清樣本中的TC量對給予PBS的小鼠血清樣本中的TC量的比率表示TC的量。
第10C圖為顯示以單次0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg皮下劑量給藥AD-65695(ALN-ANG)對ob/ob小鼠的低密度脂蛋白膽固醇(LDLc)位準之效應的圖。以給予AD-65695的小鼠血清樣本中的LDLc量對給予PBS的小鼠血清樣本中的LDLc量的比率表示LDLc的量。
第10D圖為顯示以單次0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg皮下劑量給藥AD-65695(ALN-ANG)對ob/ob小鼠中高密度脂蛋白膽固醇(HDL)位準對總膽固醇(TC)值之比率的效應圖。
第11圖描述測定指明的iRNA藥劑在野生型小鼠 (C57BL/6)中的持久性之劑量方案及研究設計，該小鼠經靜脈給藥1x1011病毒顆粒(AAV8-TBG-ANGPTL3)的腺相關病毒載體8(AAV8)而受感染，該載體編碼受肝臟特異性甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子驅動的人類ANGPTL3基因(編碼區)。
第12A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之人類ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第12B圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第13圖描述劑量滴定及測定指明的iRNA藥劑在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠中的持久性之劑量方案及研究設計。
第14A圖為顯示以單次3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第11天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的 人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第14B圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第11天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第15A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之人類ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第15B圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之小鼠ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的小鼠ANGPTL3蛋白量表示該小鼠ANGPTL3蛋白的量。
第16圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次1mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中之人類ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該 人類ANGPTL3蛋白的量。
第17A圖為描述以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第14天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第17B圖為描述以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第28天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第18A圖為描述以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第14天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第18B圖為描述以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第28天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第19A圖為顯示對指明的iRNA藥劑之反應持續時間的圖，其係以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在瘦石蟹獼猴血清中之石蟹 獼猴ANGPTL3蛋白的量表示。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該石蟹獼猴ANGPTL3蛋白的量。
第19B圖為顯示以單次1mg/kg或3mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑經一段時間後殘留在石蟹獼猴血清中的三酸甘油酯百分比。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的石蟹獼猴三酸甘油酯量表示該三酸甘油酯的量。
第20圖為描述以單次1mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第28天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第21A圖為描述以單次1mg/kg皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第28天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的人類ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
第21B圖為描述以單次1mg/k皮下劑量給藥指明的iRNA藥劑後第21天殘留在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠血清中的小鼠ANGPTL3蛋白量的圖。以相對於給藥前(pre-dose)血清樣本中存在的人類ANGPTL3蛋白量表示該人類ANGPTL3蛋白的量。
本發明提供iRNA組成物，該iRNA組成物 有效應於ANGPL3基因RNA轉錄本的RNA誘導的沉默複合體(RISC)介導的裂解。ANGPTL3基因可在細胞內，如，個體諸如人類中的細胞。本發明亦提供方法使用本發明iRNA組成物用於抑制ANGPL3基因表現及/或用於治療個體而該個體具有可從ANGPL3基因表現的抑制或降低而受益之疾病，如，脂肪代謝障礙，諸如高血脂症或高三酸甘油酯血症。
本發明iRNAs可包含具有區域的RNA股(反義股)，而該區域約為30個或較少的核苷酸長度，如，15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度，該區域實質上與ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的至少一部份互補。
在其他具體例中，本發明雙股RNAi藥劑的一股或兩股達到66個核苷酸長度，如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸長度，有至少19個連續核苷酸的區域而該區域實質上與ANGPTL3 基因之mRNA轉錄本的至少一部分互補。在一些具體例中，有義及反義股形成18至30個連續核苷酸的雙鏈體。
本文所說明使用這些iRNA藥劑能夠使哺乳動物中ANGPTL3基因的mRNAs靶向降解。很低劑量的ANGPTL3 iRNAs，特別地，能特定地及有效地介導RNA干擾(RNAi)，而導致ANGPTL3基因表現的顯著抑制。使用基於細胞及體內之檢測，本發明者等人證實靶向ANGPTL3的iRNAs可介導RNAi，而導致ANGPTL3基因表現的顯著抑制。因此，包含這些iRNAs的方法及組成物適用於治療可從ANGPL3蛋白的位準及/或活性的降低而受益的個體，諸如具有脂肪代謝障礙，諸如高血脂症或高三酸甘油酯血症的個體。
在一些具體例中，本發明iRNA藥劑包含RNA股(反義股)該RNA股可達到66個核苷酸長度，如，36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個核苷酸長度，有至少19個連續核苷酸的區域，而該區域實質上與ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的至少一部份互補。在一些具體例中，具有較長長度之反義股的此種iRNA藥劑可包含20至60個核苷酸長度的第二RNA股(有義股)其中有義及反義股形成18至30個連續核苷酸的雙鏈體。
下列之詳細說明揭露如何製作及使用含有iRNAs的組成物來抑制ANGPTL3基因表現，以及用於治療具有從抑制及/或降低此基因之表現而受益的疾病或障礙的個體之組成物或方法。
I.定義
為了更容易瞭解本發明，首先定義某些術語。此外，應指出的是每當列舉參數的數值或數值範圍時，意指所列舉數值的數值及範圍的中間值亦為本發明的一部分。
本文所使用的冠詞"一(a)"及"一(an)"意指一個或多個(即，至少一個)物品的語法對象。經由舉例，"元件"意指一個元件或多個元件，如，複數個元件。
本文所使用的"包含"意指可與短語"包含但不限於"相互替代使用。本文所使用的術語"或"，除非上下文另有明白指明，意指可與術語"及/或"相互替代使用。
術語"ANGPTL3"意指具有自任何脊椎動物或哺乳動物來源之胺基酸序列的類血管生成素蛋白3，除非另有說明，包含，但不限於，人類、牛、雞、囓齒類、小鼠、大鼠、豬、綿羊、靈長類、猴及天竺鼠。該術語亦指天然ANGPTL3的片段或變異體，其保持天然ANGPTL3的至少一種體內或體外活性。該術語包含ANGPTL3全長未加工的前驅物形式以及由信號肽之轉譯後裂解造成的成熟形式及由類血纖維蛋白原結構域之蛋白水解加工而造成的形式。可在，例如，GenBank Accession No.GI：452408443(NM_014495.3；SEQ ID NO：1)找到人類ANGPTL3 mRNA轉錄本的序列。可在，例如，GenBank Accession No.GI：297278846(XM_001086114.2；SEQ ID NO：2)找到恆河猴ANGPTL3 mRNA的預測序列。可在，例如，GenBank Accession No.GI：142388354(NM_013913.3；SEQ ID NO：3)找到小鼠ANGPTL3 mRNA的序列。可在，例如，GenBank Accession No.GI：68163568(NM_001025065.1；SEQ ID NO：4)找到大鼠ANGPTL3 mRNA的序列。使用公共可用的數據庫，如，GenBank、UniProt及OMIM，方便取得ANGPTL3 mRNA序列的另外實例。
本文所使用的"ANGPTL3"亦指經由自然發生之ANGPTL3基因的DNA序列變異而在細胞中表現的特別多肽，諸如ANGPTL3基因中的單核苷酸多型性。已辨識出ANGPTL3基因中的許多SNP及可在，例如，NCBI dbSNP(參見，如，www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)找到。ANGPTL3基因中的SNP之非限制性實例可在，NCBI dbSNP Accession Nos.rs193064039；rs192778191；rs192764027；rs192528948；rs191931953；rs191293319；rs191171206；rs191145608；rs191086880；rs191012841或rs190255403找到。
如本文所使用，"目標序列"意指在ANGPTL3基因轉錄期間形成的mRNA分子之核苷酸序列連續部分，包含mRNA其為初級轉錄產物的RNA加工產物。一具體例中，序列之目標部分至少足夠長以作為裂解在或靠近ANGPTL3基因轉錄期間形成的mRNA分子之核苷酸序列部分的iRNA介導的裂解之基質。
目標序列可以是約9至36個核苷酸長度，如，約15至30個核苷酸長度。例如，目標序列可以是約15至30個核苷酸、15至29、15至28、15至27、15至26、 15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度。上文列舉的範圍及長度之範圍及長度中間值亦涵蓋為本發明的一部分。
如本文所使用，術語"包括序列的股"意指包括經由使用標準核苷酸命名的序列所描述的核苷酸鏈的寡核苷酸。
"G"、"C"、"A"、"T"及"U"一般各分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶作為鹼基的核苷酸。然而，應瞭解的是術語"核糖核苷酸"或"核苷酸"亦可意指修飾的核苷酸，進一步詳細如下，或替代置換部分(參見，如，表1)。熟練的技術人員熟知可用其他部分替換鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤及尿嘧啶而實質上不會改變寡核苷酸的鹼基配對特性，而該寡核苷酸包括具有此種置換部分的核苷酸。例如，沒有限制地，包括肌苷作為其鹼基的核苷酸可與含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對。因此，可用含有，例如，肌苷的核苷酸置換在本發明特定的dsRNA之核苷酸序列中含有尿嘧啶、鳥嘌呤或腺 嘌呤的核苷酸。另一個實例中，可分別用鳥嘌呤及尿嘧啶置換寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤及胞嘧啶而與目標mRNA形成G-U搖擺鹼基配對。含有此種置換部分的序列適合於本發明特定的組成物及方法。
如本文中相互替代使用的術語"iRNA"、"RNAi藥劑"、"iRNA藥劑"、"RNA干擾劑"意指含有如本文所定義術語之RNA的藥劑，其透過RNA誘導的沉默複合體(RISC)路徑介導RNA轉錄本的靶向裂解。經由已知為RNA干擾(RNAi)的過程，iRNA引導mRNA的序列特異性降解。iRNA調變，如，抑制，細胞中ANGPTL3表現，如，個體，諸如哺乳動物個體中的細胞。
在一具體例中，本發明RNAi藥劑包含與目標RNA序列，如，ANGPTL3目標mRNA序列，相互作用的單股RNA而引導目標RNA的裂解。不希望受到理論的束縛而咸信經引導入細胞的長雙股RNA由已知為Dicer的第III型核酸內切酶斷裂為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer，一種類核酸內切酶III的酶，處理dsRNA成為19至23個鹼基對之有特徵性2個鹼基3'突出的短干擾RNAs(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。然後siRNAs併入RNA誘導的沉默複合體(RISC)其中一種或多種解旋酶解旋siRNA雙鏈體，而使得互補反義股能引導目標識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。與合適的目標mRNA一結合後，RISC中的一種或多種核酸內切酶裂解目標而誘導沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev. 15：188)。因此，在一方面本發明涉及細胞內產生的單股RNA(sssiRNA)及其促進RISC複合體形成而引起目標基因，即，ANGPTL3基因的沉默。據此，本文使用的術語"siRNA"亦指如上述的RNAi。
另一具體例中，RNAi藥劑可以是經引導入細胞或生物體而抑制目標mRNA的單股RNAi藥劑。單股RNAi藥劑(ssRNAi)結合RISC核酸內切酶，Argonaute 2，然後裂解目標mRNA。單股siRNAs一般為15至30個核苷酸且經化學修飾。美國專利案號8,101,348及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894說明單股RNAi藥劑的設計及試驗，於此經由引用將各自的全部內容併入本文中。可如本文所述或經由Lima et al.,(2012)Cell 150；：883-894說明的方法化學修飾而使用本文所述的任一反義核苷酸序列作為單股siRNA。
另一具體例中，本發明使用之組成物及方法中的"iRNA"為雙股RNA且在本文中稱為"雙股RNAi藥劑"、"雙股RNA(dsRNA)分子"、"dsRNA藥劑"或"dsRNA"。術語"dsRNA"，意指核糖核酸分子複合體，其具有包括2條反向平行及實質上互補的核苷酸股的雙鏈體結構，稱為具有關於目標RNA，即，ANGPTL3基因，的"有義"及"反義"方向。本發明的一些具體例中，雙股RNA(dsRNA)經由本文中稱為RNA干擾或RNAi的轉錄後基因沉默機制而引發目標RNA，如，mRNA的降解。
通常，dsRNA分子各股的多數核苷酸為核糖 核苷酸，但是如本文的詳細說明，各股或雙股亦可包含一種或多種非核糖核苷酸，如，去氧核糖核苷酸及/或修飾的核苷酸。此外，如本說明書所使用，"RNAi藥劑"可包含具有化學修飾的核糖核苷酸；RNAi藥劑可包含多個核苷酸的實質修飾。如本文所使用，術語"修飾的核苷酸"意指獨立具有修飾的糖部分、修飾的核苷酸間連接及/或修飾的核鹼基的核苷酸。因此，術語修飾的核苷酸包含在核苷酸間連接、糖部分或核鹼基之取代、添加或移除，如，官能基或原子。適用於本發明藥劑的修飾包含本文所揭露或所屬領域習知的所有類型。為了本說明書及申請專利範圍的目的，"RNAi藥劑"包含任何一種如使用於siRNA類型分子的此種修飾。
雙鏈體區域可以是容許經由RISC路徑而特異性降解所要目標RNA的任何長度，可在約9至36個鹼基對長度的範圍，如，約15至30個鹼基對長度，例如，約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個鹼基對長度，諸如約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、 20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對長度。上文列舉的範圍及長度之範圍及長度中間值亦涵蓋為本發明的一部分。
形成雙鏈體結構的雙股可以是較大RNA分子的不同部分，或可以是分開的RNA分子。在雙股為較大分子之部分，及因此在一股的3'端及各自的另一股的5'端間經由不中斷核苷酸鏈連接而形成雙鏈體結構的情況，該連接RNA鏈稱為"髮夾環"。髮夾環可包括至少一個未配對核苷酸。在一些具體例中，髮夾環可包括至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個或更多個未配對核苷酸。
在分開的RNA分子包括dsRNA實質上互補兩股的情況，該等分子不需要，但可共價連接。在兩股經由不同於在一股的3'端及各自的另一股的5'端之間的不中斷核苷酸鏈連接而共價連接形成雙鏈體結構的情況，該連接結構稱為"連接子"。RNA股可具有相同或不同數目的核苷酸。鹼基對的最大數目為dsRNA最短股中的核苷酸數目減去雙鏈體中存在的任何突出。除雙鏈體結構之外，RNAi可包括一個或多個核苷酸突出。
在一具體例中，本發明RNAi藥劑為dsRNA，其各股包括19至23個核苷酸，與目標RNA序列 相互作用，如，ANGPTL3目標mRNA序列，而介導目標RNA的裂解。不希望受到理論的束縛，經引導入細胞的長雙股RNA經由已知為Dicer的第III型核酸內切酶斷裂為siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer，一種類核酸內切酶III的酶，處理dsRNA成為19至23個鹼基對之具有2個鹼基3'突出特徵的短干擾RNAs(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。然後siRNAs併入RNA誘導的沉默複合體(RISC)其中一種或多種解旋酶解旋siRNA雙鏈體，而使得互補反義股能引導目標識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。與合適的目標mRNA一結合後，RISC中的一種或多種核酸內切酶裂解目標而誘導沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。
如本文所使用，術語"核苷酸突出"意指至少一個未配對核苷酸從iRNA，如，dsRNA，的雙鏈體結構突出。例如，當dsRNA之一股的3'端延伸至超出另一股之5'端時有核苷酸突出，或反之亦然。dsRNA可包括至少1個核苷酸的突出；或者突出可包括至少2個核苷酸，至少3個核苷酸，至少4個核苷酸，至少5個核苷酸或更多。核苷酸突出可包括或由核苷酸/核苷類似物所組成，包含去氧核苷酸/核苷。突出(等)可在有義股、反義股或其任何組合。再者，突出的核苷酸可存在於dsRNA的反義或有義股的5'端、3'端或兩端。
在一具體例中，dsRNA之反義股具有1至10個核苷酸，如，1、2、3、4、5、6、7、9或10個核苷 酸，突出在3'端及/或5'端。在一具體例中，dsRNA之有義股具有1至10個核苷酸，如，1、2、3、4、5、6、7、9或10個核苷酸，突出在3'端及/或5'端。另一個具體例中，突出中的一個或多個核苷酸經核苷硫代磷酸酯置換。
在某些具體例中，在有義股或反義股或兩者的突出可包含比10個核苷酸為較長的延長長度，如，10至30個核苷酸、10至25個核苷酸、10至20個核苷酸或10至15個核苷酸長度。某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體的有義股。在某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體有義股的3'端。在某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體有義股的5'端。在某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體的反義股。在某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體反義股的3'端。在某些具體例中，延長的突出係在雙鏈體反義股的5'端。在某些具體例中，延伸的突出中的一個或多個核苷酸經核苷硫代磷酸酯置換。
如本文所使用關於dsRNA的術語"鈍"或"平端"意指在dsRNA的指定末端沒有未配對的核苷酸或核苷酸類似物，即，沒有核苷酸突出。dsRNA的一端或兩端可以是鈍的。在dsRNA兩端皆為鈍的情況，則說dsRNA為平端。明確地說，"平端"dsRNA為兩端皆為鈍的dsRNA，即，在分子的任何一端均沒有核苷酸突出。常常這樣的分子在其整個長度上均為雙股。
術語"反義股"或"引導股"意指iRNA之股，如dsRNA，其包含實質上與目標序列，如，ANGPTL3 mRNA，互補的區域。如本文所使用，術語"互補區"如本文所定義，意指在反義股之實質上與序列，例如目標序列，如，ANGPTL3核苷酸序列，互補的區域。在互補區非完全與目標序列互補的情況，可在分子的內部或末端區域有誤配。通常，最耐受的誤配在末端區域，如，在iRNA之5'及/或3'末端的5、4、3或2個核苷酸內。
如本文所使用的術語"有義股"或"過客股"，意指iRNA之股，其包含與本文所定義的反義股之區域實質上互補的區域。
如本文所使用，術語"裂解區"意指位於直接鄰近裂解位點的區域。該裂解位點為目標上裂解發生的位點。在一些具體例中，裂解區包括在裂解位點任一端，且直接鄰近裂解位點的3個鹼基。在一些具體例中，裂解區包括裂解位點任一端，且直接鄰近裂解位點的2個鹼基。在一些具體例中，裂解位點具體地發生在與反義的核苷酸10及11結合的位點，裂解區包括核苷酸11、12及13。
如本文所使用，除非另有指明，當使用術語"互補"說明與第二核苷酸序列有關的第一核苷酸序列時，如熟練技術人員所瞭解，意指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下雜合而形成雙鏈體結構的能力。此種條件，例如，可以是嚴格條件，而該嚴格條件可包含：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃經12至16小時，隨後洗滌(參見，如，"Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可採用其他條件，諸如在生物體內可碰到的生理學相關條件。熟練的技術人員能夠依照雜合核苷酸的最終應用而測定最適合於兩序列互補試驗的條件組。
iRNA中，如，本文所述之dsRNA，的互補序列，在一個或兩個核苷酸序列的整個長度包含鹼基配對，該鹼基配對為包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸之鹼基配對。此種序列在本文中可稱為相對於彼此"完全互補"。然而，本文中當第一序列稱為相對於第二序列"實質上互補"時，兩序列可完全互補，或一經雜合為多達30個鹼基對的雙鏈體時，可形成一個或多個，但是通常不超過5、4、3或2個誤配鹼基對，而同時保持在與其最終應用，如經由RISC路徑抑制基因表現，為最相關的條件下之雜合能力。然而，當兩種寡核苷酸經設計一經雜合而形成一個或多個單股突出時，此種突出在確定互補性上將不被認為是誤配。例如，包括一個長度為21個核苷酸的寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸的寡核苷酸之dsRNA，其中較長寡核苷酸包括與較短寡核苷酸完全互補的21個核苷酸，於本文所述之目的，該dsRNA仍可稱為"完全互補"。
"互補"序列，如本文所使用，亦可包含非Watson-Crick鹼基對及/或從非天然及修飾的核苷酸形成的鹼基對，或完全由非Watson-Crick鹼基對及/或從非天然及 修飾的核苷酸形成的鹼基對形成，只要能達到相對於其雜合能力之上述要求。這種非Watson-Crick鹼基對包含，但不限於，G：U搖擺或Hoogstein鹼基配對。
本文術語"互補"、"完全互補"及"實質上互補"可相對於dsRNA的有義股及反義股間或iRNA藥劑之反義股及目標序列間之鹼基配對而使用，如將從其用途的上下文中瞭解。
如本文所使用，與傳訊RNA(mRNA)"至少部分實質上互補"的多核苷酸意指與感興趣的mRNA(如，編碼ANGPTL3的mRNA)之連續部分實質上互補的多核苷酸。例如，如果序列與編碼ANGPTL3之mRNA的非中斷部分實質上互補則多核苷酸與ANGPTL3 mRNA的至少一部份互補。
據此，在一些具體例中，本文所揭露之反義股多核苷酸與目標ANGPTL3序列完全互補。在其他具體例中，本文所揭露之反義股多核苷酸與目標ANGPTL3序列實質上互補及包括在整個長度上與核苷酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的片段之等效區域至少約80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補的連續核苷酸序列。
在一具體例中，本發明RNAi藥劑包含與反義多核苷酸實質上互補的有義股，而該反義多核苷酸依序與目標ANGPTL3序列互補，及其中有義股多核苷酸包括 在整個長度上與核苷酸序列SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：5的片段之等效區域至少約80%互補，諸如約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%互補的連續核苷酸序列。如本文所使用的術語"抑制"，與"降低"、"沉默"、"下調"、"抑止"及其他相似術語相互替代使用，及包含任何級別的抑制。
如本文所使用的短語"抑制ANGPTL3表現"，包含抑制任何ANGPTL3基因表現(諸如，如小鼠ANGPTL3基因、大鼠ANGPTL3基因、猴ANGPTL3基因或人類ANGPTL3基因)以及編碼ANGPTL3蛋白之ANGPTL3基因的變異體或突變體。
"抑制ANGPTL3基因表現"包含任何級別的ANGPTL3基因抑制，如，至少部分抑止ANGPTL3基因表現，諸如至少約20%抑制。在某些具體例中，抑制為至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約825%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約935%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。
可基於與ANGPTL3基因表現有關的任何變數值而評估ANGPTL3基因表現，如，ANGPTL3 mRNA值或ANGPTL3蛋白值。亦可間接基於血清脂質、三酸甘油 酯、膽固醇(包含LDL-C、HDL-C、VLDL-C、IDL-C及總膽固醇)或游離脂肪酸的位準而評估ANGPTL3基因表現。可由與對照位準比較之一種或多種這些變數的絕對或相對位準的減低而評估抑制。對照位準可以是所屬領域使用的任何類型對照位準，如，給藥前基線位準，或從未治療或經對照物(諸如，如，只有緩衝劑的對照物或非活性藥劑對照物)治療之相似個體、細胞或樣本測定之對照位準。
在一具體例中，ANGPTL3基因表現的至少部分抑止，係由ANGPTL3 mRNA量的降低而評估，可從其中ANGPTL3基因經轉錄而已接受治療以使得ANGPTL3基因表現受抑制的第一細胞或細胞群組中分離或檢測出ANGPTL3 mRNA量，而與實質上與第一細胞或細胞群組相同而未曾接受如此之治療(對照細胞)的第二細胞或細胞群組比較。抑制程度可以表示為：
如本文所使用的短語"使細胞與RNAi藥劑接觸"諸如dsRNA，包含用任何可能方式接觸細胞。使細胞與RNAi藥劑接觸包含使細胞與RNAi藥劑在體外接觸或使細胞與RNAi藥劑在體內接觸。可直接或間接進行接觸。因此，例如，可由個別進行的方法使RNAi藥劑與細胞作物理接觸，或者，可將RNAi藥劑投入允許或造成隨後與細胞接觸的情況。
在體外進行接觸，例如，可將細胞與RNAi 藥劑一起培養。在體內進行接觸，例如，注射RNAi藥劑進入或接近細胞所在地方的組織，或注射RNAi藥劑進入另一個區域，如，血流中或皮下空間，而使得藥劑將隨後到達所要接觸細胞之所在地方的組織。例如，RNAi藥劑可含有配體及/或與配體偶合，如，GalNAc3，該配體引導RNAi藥劑至感興趣的位點，如肝臟。也可以組合體外及體內的接觸方法。例如，亦可使細胞與RNAi藥劑在體外接觸隨後移植入個體。
在一具體例中，使細胞與RNAi接觸包含經由助長或有效攝取或吸收進入細胞而"導入"或"遞送iRNA進入細胞"。吸收或攝取iRNA可經由獨立的擴散性或主動的細胞過程或經由輔助藥劑或裝置而發生。可在體外及/或體內將iRNA導入細胞中。例如，體內導入時，可將iRNA注射入組織位點或全身性給藥。亦可經由β-葡聚糖遞送系統完成體內遞送，諸如美國專利案號5,032,401及5,607,677，及美國專利公開案號2005/0281781中所說明的，特此經由引用將全部內容併入本文中。體外導入細胞包含所屬領域習知的方法諸如電穿孔及脂質體轉染。進一步的探討說明於以下本文中及/或為所屬領域所習知。
術語"脂質奈米顆粒"或"LNP"為囊泡，該囊泡包括脂質層而該脂質層包封藥學活性分子，諸如核酸分子，如，iRNA或iRNA從其轉錄的質體。LNPs說明於，例如，美國專利案號6,858,225、6,815,432、8,158,601及8,058,069中，特此經由引用將全部內容併入本文中。
如本文所使用，"個體"為動物、諸如哺乳動物，包含靈長類(諸如人類、非人類靈長類，如，猴及黑猩猩)、非靈長類(諸如牛、豬、駱駝、美洲駝羊、馬、山羊、兔、綿羊、倉鼠、天竺鼠、貓、狗、大鼠、小鼠、馬及鯨魚)或鳥(如，鴨或鵝)。具體例中，個體為人類，諸如正在接受治療或評定為可從ANGPL3表現的降低而受益之疾病、障礙或病狀的人類；可從ANGPL3表現的降低而受益之疾病、障礙或病狀之風險的人類；患有可從ANGPL3表現的降低而受益之疾病、障礙或病狀的人類；及/或正在接受治療可從ANGPL3表現的降低而受益之疾病、障礙或病狀的人類，如本文所說明。
如本文所使用，術語"治療(treating)"或"處理(treatment)"意指有利或想得到的結果包含，諸如減低個體之三酸甘油酯位準。術語"治療"或"處理"亦包含，但不限於，脂肪代謝障礙之一種或多種症狀的緩解或改善，諸如，如疹黃瘤尺寸的減小。"處理"亦指與沒有處理之預期存活期相比的延長存活期。
上下文中疾病標記或症狀的"減低"意指此位準在統計學上的顯著減少。減少可以是，例如，至少10%、至少20%、至少30%、至少40%或更多，及較佳下降到公認為沒有此種疾病之個體的正常範圍內之程度。
如本文所使用，"預防"或"防止"，當使用在關於可從ANGPL3基因表現的降低而受益的疾病、障礙或其病狀時，意指降低個體將發展出與此種疾病、障礙或病 狀有關之症狀的可能性，如，高三酸甘油酯位準或疹黃瘤。發展出高三酸甘油酯位準或疹黃瘤之可能性的降低為，例如，當個體具有一種或多種高三酸甘油酯位準或疹黃瘤的風險因素時不是無法發展成高三酸甘油酯位準或疹黃瘤就是發展成相對於具有相同風險因素但未接受如本文所說明的處理之群體之較低嚴重性的高三酸甘油酯位準或疹黃瘤。無法發展成疾病、障礙或病狀，或降低發展出與此種疾病、障礙或病狀有關之症狀的可能性(如，至少約10%對於該疾病或障礙之臨床上的級別)，或展現延遲的症狀(如，以天、星期、月或年計)均被認為是有效預防。
如本文所使用，術語"血清脂質"意指任何存在於血液中的主要脂質。血清脂質可以游離形式或以蛋白複合體，如脂蛋白複合體的一部分，存在於血液中。血清脂質的非限制性實例可包含三酸甘油酯及膽固醇，諸如總膽固醇(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、極低密度脂蛋白膽固醇(VLDL-C)及中間密度脂蛋白膽固醇(IDL-C)。
如本文所使用，"脂肪代謝障礙"意指與脂質代謝之干擾有關或由其所造成的障礙。例如，此術語包含導致高血脂症的任何障礙、疾病或病狀，或以血中任何或所有脂質及/或脂蛋白位準的不正常提升為特徵的病狀。此術語意指遺傳性障礙，諸如家族性高三酸甘油酯血症、家族性部分脂質營養不良第1型(FPLD1)，或誘發或獲得性障礙，諸如因為疾病、障礙或病狀(如，腎衰竭)、節食或攝 取某些藥物(如，因為使用於治療，如AIDS或HIV之高效抗反轉錄病毒療法的結果)之結果而誘發或獲得的障礙。示例之脂質代謝障礙包含，但不限於，動脈粥樣硬化、血脂異常、高三酸甘油酯血症(包含藥物誘發高三酸甘油酯血症、利尿劑誘發高三酸甘油酯血症、酒精誘發高三酸甘油酯血症、β-腎上腺素阻斷劑誘發高三酸甘油酯血症、雌激素誘發高三酸甘油酯血症、糖皮質素誘發高三酸甘油酯血症、類視色素誘發高三酸甘油酯血症、希美替定(cimetidine)誘發高三酸甘油酯血症及家族性高三酸甘油酯血症)、高三酸甘油酯血症相關的急性胰臟炎、乳糜微粒症候群、家族性乳糜微粒血症、Apo-E剔除或抗性、LPL缺陷或活性減退、高血脂症(包含家族性混合型高脂血症)、高膽固醇血症、高膽固醇血症相關的痛風、黃瘤症(皮下膽固醇沉積)、異質性LPL缺乏之高血脂症及高LDL及異質性LPL缺乏之高血脂症。
如本文所定義，脂質代謝障礙相關的心血管疾病亦被認為是"脂質代謝障礙"。這些疾病可包含冠狀動脈疾病(亦稱為缺血性心臟疾病)、冠狀動脈疾病相關的炎症、再狹窄、周邊血管疾病及中風。
如本文所定義，與體重相關的障礙亦被認為是"脂質代謝障礙"。此種障礙可包含肥胖症、代謝症候群包含代謝症候群的獨立成分(如，中心性肥胖症、FBG/糖尿病前期/糖尿病、高膽固醇血症、高三酸甘油酯血症及高血壓)、甲狀腺功能減退症、尿毒症，及其他與體重增加 相關的病狀(包含快速體重增加)、體重減輕、體重減輕的維持或體重減輕後之體重再增加的風險。
如本文所定義，進一步認為血糖障礙為"脂質代謝障礙"。此種障礙可包含胰島素抗性相關的糖尿病、高血壓及多囊性卵巢症候群。其他示例之脂質代謝障礙亦可包含腎臟移植、腎病症候群、庫欣氏症候群、肢端肥大症、全身性紅斑性狼瘡、球蛋白異常血症、脂質營養不良、肝醣病第一型及愛迪生氏病。
如本文所使用，"治療上有效量"，意指包含RNAi藥劑的量，當給予具有脂肪代謝障礙的個體時，足夠有效治療疾病(如，經由減少、改善或維持現有疾病或一種或多種疾病的症狀)的量。"治療上有效量"可取決於RNAi藥劑、藥劑如何給藥、疾病及其嚴重性及個體之病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前或伴隨治療(如果有的話)及其他待治療之個別特徵而變化。
如本文所使用，"預防上有效量"，意指包含RNAi的量，當給予具有脂肪代謝障礙的個體時，足夠防止或改善疾病或疾病的一種或多種症狀。改善疾病包含緩慢疾病病程或降低疾病後期發展的嚴重性。"預防上有效量"可取決於iRNA、藥劑如何給藥、疾病的風險程度及患者之病史、年齡、體重、家族病史、基因組成、先前或伴隨治療(如果有的話)及其他待治療之個別特徵而變化。
"治療上有效量"或"預防上有效量"亦包含RNAi藥劑的量，該量以合理的益處/風險比率產生一些所 需之局部或全身效用而應用於任何治療。本發明方法使用的iRNA可以足夠的量給藥而產生合理的益處/風險比率而應用於此種治療。
本文所使用的短語"藥學上可接受的"意指那些化合物、材料、組成物及/或劑型，在合理的醫學範圍內，適合用於與人類個體及動物個體的組織接觸而不出現過度的毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，而與合理的益處/風險比率相稱。
如本文所使用的短語"藥學上可接受的載劑"意指藥學上可接受的材料、組成物或載劑，諸如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、製造輔助劑(如，潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅、或硬脂酸)或溶劑封裝材料，其涉及從一個器官或身體的一部分載運或輸送主題化合物至另一個器官或身體的一部分。在與製劑的其他成分相容的意義上，各載劑必須是"可接受的"且對待治療的個體是無害的。一些可充當藥學上可接受的載劑之材料的實例包含：(1)糖類，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉類，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素，及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；(4)黃蓍粉末；(5)麥芽糖；(6)明膠；(7)潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉及及滑石；(8)賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；(9)油類，諸如花生油、棉仔油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；(10)二醇類，諸如丙二醇；(11)多元醇類，諸如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇，(12)酯 類，諸如油酸乙酯及十二酸乙酯；(13)洋菜；(14)緩衝劑類，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等張鹽水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液類；(21)聚酯、聚碳酸酯及/或聚酸酐；(22)膨脹劑，諸如多肽及胺基酸(23)血清成分，諸如血清白蛋白、HDL及LDL；及(24)藥物製劑中使用的其他無毒可相容物質。
如本文所使用，術語"樣本"包含分離自個體之相似流體、細胞或組織，以及存在於個體體內的流體、細胞或組織的收集。生物流體的實例包含血液、血清及漿膜液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包含來自組織、器官或局部區域的樣本。例如，樣本可衍生自特別的器官、器官的一部分或這些器官中的流體或細胞。在某些具體例中，樣本可衍生自肝臟(如，整個肝臟或肝臟中的某些區段或肝臟中某些類型的細胞，諸如，如肝細胞)。在一些具體例中，"衍生自個體的樣本"意指來自個體的血液或血漿。
II.本發明iRNAs
本文所說明的是抑制ANGPTL3基因表現的iRNAs。在具體例中，iRNA藥劑包含抑制細胞中ANGPTL3基因表現的雙股核糖核酸(dsRNA)分子，該細胞諸如於個體，如哺乳動物，諸如具有脂肪代謝障礙，如家族性高血脂症之人類中的細胞。dsRNA包含具有與ANGPTL3基因表現中形成 之mRNA之至少一部分互補之互補區的反義股，互補區為約30個或較少的核苷酸長度(如，約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18個或較少的核苷酸長度)。與表現ANGPTL3基因的細胞接觸時，iRNA抑制ANGPTL3基因表現(如，人類、靈長類、非靈長類或鳥類的ANGPTL3基因)至少約10%，其係經由，例如，PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法，或基於蛋白質的方法，諸如經由使用，例如，西方墨點或流式細胞技術之免疫螢光分析而檢測。
在要使用dsRNA的條件下，dsRNA包含兩股RNA互補及雜合而形成雙鏈體。dsRNA之一股(反義股)包含與目標序列實質上互補，及通常完全互補的互補區。目標序列可衍生自ANGPTL3基因表現期間形成之mRNA序列。另一股(有義股)包含與反義股互補的區域，如此使得該兩股在合適條件下組合時雜合而形成雙鏈體結構。如本文中他處所述及如所屬領域所習知，亦可包含dsRNA之互補序列作為單核酸分子的自身互補區，相對於在分開的寡核苷酸。
通常，雙鏈體結構在15及30個鹼基對長度之間，如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、 19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對長度之間。上文列舉的範圍及長度之範圍及長度中間值亦涵蓋為本發明的一部分。
同樣地，目標序列的互補區在15及30個核苷酸長度之間，如，15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度之間。上文列舉的範圍及長度之範圍及長度中間值亦涵蓋為本發明的一部分。
在一些具體例中，dsRNA在約15及約23個核苷酸長度之間，或在約25及約30個核苷酸長度之間。通常，dsRNA足夠長而充當Dicer酶之受質。例如，所屬領域熟知比約21至23個核苷酸長的dsRNA可充當Dicer之受質。一般熟練技術人員亦認知，用以靶向裂解的RNA區域常常為較大RNA分子的部分，往往是mRNA分子。其 中相關的，mRNA目標的"部分"為使其能成為RNAi介導的裂解受質(即，透過RISC路徑的裂解)之足夠長度mRNA目標的連續序列。
所屬領域熟練技術人員亦認知雙鏈體區域為dsRNA的主要功能部分，如，約9至36個鹼基對的雙鏈體區域，如，約10至36、11至36、12至36、13至36、14至36、15至36、9至35、10至35、11至35、12至35、13至35、14至35、15至35、9至34、10至34、11至34、12至34、13至34、14至34、15至34、9至33、10至33、11至33、12至33、13至33、14至33、15至33、9至32、10至32、11至32、12至32、13至32、14至32、15至32、9至31、10至31、11至31、12至31、13至32、14至31、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對。因此，在一具體例中，到變成加工至功能性雙鏈體的程度，如，15至30個鹼基對，其靶向用於裂解的期望RNA，具有多於30個鹼基對的雙 鏈體區域的RNA分子或RNA分子複合體為dsRNA。因此，一般熟練技術人員將認知在一具體例中，miRNA為dsRNA。另一個具體例中，dsRNA不是天然發生的miRNA。另一個具體例中，適用於靶向ANGPTL3表現的iRNA藥劑不是經由裂解較大的dsRNA而在目標細胞中產生。
如本文所說明dsRNA可進一步包含一個或多個單股核苷酸突出，如，1、2、3或4個核苷酸。具有至少一個核苷酸突出的dsRNAs可具有相對於彼等之平端對應物之超乎意料的優異抑制性能。核苷酸突出可包括核苷酸/核苷類似物，包含去氧核苷酸/核苷，或由其所組成。突出可在有義股、反義股或其任何組合。再者，突出的核苷酸可存在於dsRNA的反義股或有義股的5'端、3'端或兩端。
可用所屬領域習知如以下將進一步討論的的標準方法合成dsRNA，如使用自動DNA合成器，諸如購自市售，例如，Biosearch,Applied Biosystems,Inc.。
可使用兩步驟製程製備本發明iRNA化合物。首先，分別製備雙股RNA分子之個別股。然後，將成分股降溫黏合。可使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備siRNA化合物的個別股。有機合成提供可容易地製備包括非天然或修飾的核苷酸之寡核苷酸股的優勢。可使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備本發明單股寡核苷酸。
在一方面，本發明dsRNA包含至少2個核苷酸序列，有義序列及反義序列。有義股序列選自表2A、 2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任一者中所提供的序列群組及有義股之反義股的相應核苷酸序列選自表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任一者的序列群組。在這方面，兩序列之一者與兩序列之另一者互補，序列之一者與ANGPTL3基因表現所產生的mRNA序列實質上互補。因此，在這方面，dsRNA將包含2個寡核苷酸，其中一個寡核苷酸為表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任一者中所述的有義股(過客股)及第二個寡核苷酸為表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任一者中所述的有義股的相應反義股(引導股)。在一具體例中，分開的寡核苷酸含有dsRNA的實質上互補序列。另一個具體例中，單寡核苷酸含有dsRNA的實質上互補序列。
應瞭解的是，雖然說明表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B中的序列為修飾的、未修飾的、未接合的及/或接合的，但是本發明iRNA的RNA，如本發明dsRNA，可包括列於表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任一者中的任何一個序列，其為與其中所述不同的未修飾的、未接合的，及/或修飾的及/或接合的。
另一方面，本發明用於抑制ANGPTL3表現 的雙股核糖核酸(dsRNA)包括、主要由或由有義股及反義股所組成，其中有義股包括核苷酸序列5'-usgsucacUfuGfAfAfcucaacucaaL96-3'，及反義股包括核苷酸序列5'-asusUfsgagUfuGfAfguucAfaGfugacasusa-3'；或有義股包括核苷酸序列5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaaL96-3'，及反義股包括核苷酸序列usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu。
熟練技術人員很清楚知道具有約20及23個鹼基對之間，如21個鹼基對的雙鏈體結構之dsRNAs被譽為對誘發RNA干擾特別有效(Elbashir et al.,(2001)EMBO J.,20：6877-6888)。然而，其他人發現較短或較長的RNA雙鏈體結構亦為有效(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。上述具體例中，憑藉本文提供之寡核苷酸序列的性質，本文所說明的dsRNAs可包含至少長度最低限度為21個核苷酸的一股。可合理預期相較於上述dsRNAs，只在一端或兩端減掉少數個核苷酸的較短雙鏈體可同樣地有效。因此，具有衍生自本文提供之序列之一之含至少15、16、17、18、19、20或更多連續核苷酸的序列，且抑制ANGPTL3基因表現的能力不同於包括全序列的dsRNAs不超過約5、10、15、20、25或30%抑制之dsRNAs，係涵蓋於本發明之範圍內。
此外，本文所說明的RNAs識別在ANGPTL3轉錄本中對RISC-介導的裂解敏感的位點。因此，本發明進一步特徵為靶向此位點內部的iRNAs。如本文所使用， 如果iRNA促進特別位點內任何地方的轉錄本裂解，則稱該iRNA靶向於RNA轉錄本的特別位點內。此種iRNA通常將包含來自本文提供之序列之一的至少約15個連續核苷酸，該連續核苷酸連接從與ANGPTL3基因選擇序列連續的區域取得的額外核苷酸序列。
雖然目標序列通常為約15至30個核苷酸長度，但是在這範圍內用於介導任何指定目標RNA的裂解之特定序列的適用性有廣泛的變異。本文提出的各種不同套裝軟體及指南提供識別任何指定基因目標之最佳目標序列的識別，但是亦可採用實證方法，其中指定尺寸的"視窗"或"遮罩"(如非限制性實例，21個核苷酸)按字面地或象徵性地(包含，如矽片中)被放置在目標RNA序列而識別在尺寸範圍內可充當目標序列的序列。經由漸進地移動序列"視窗"沿初始目標序列位置向上游或下游一個核苷酸，可識別下一個潛在目標序列，直到針對任何選擇的指定目標尺寸而識別整套的可能序列。該過程與識別那些最佳執行序列的識別序列之系統合成及測試(使用本文所說明或所屬領域習知的檢測)相連結，可識別那些RNA序列，而用iRNA藥劑靶向時，介導目標基因表現的最佳抑制。因此，當本文識別的序列表示有效的目標序列時，預期可漸進地經由"拖曳視窗"沿指定序列向上游或下游一個核苷酸而得到抑制效率的進一步優化而識別有相等的或更好的抑制特徵的序列。
此外，預期對本文識別的任何序列，可由 系統地添加或移出核苷酸而產生較長或較短序列並測試經由將較長或較短尺寸之視窗從該點沿目標RNA向上或向下拖曳而產生的那些序列，而達成進一步優化。再次地，使產生新候選物的目標的此方案，與基於那些目標序列在所屬領域習知及/或本文所說明的抑制檢測中測試iRNAs的有效性聯合，可導致進一步抑制效率的改進。更進一步，如可以引入如本文所述或所屬領域習知的修飾核苷酸，添加或改變突出或如所屬領域習知及/或本文討論的其他修飾而調節這種優化序列以進一步優化該分子(如，增加血清穩定性或循環半衰期、增加熱穩定性、加強跨膜遞送、靶向特別位置或細胞類型、增加與沉默路徑酶的相互作用、增加從胞內體的釋放)作為表現抑制劑。
如本文所說明的iRNA藥劑可含有對目標序列的一個或多個誤配。在一具體例中，如本文所說明的iRNA含有不超過3個誤配。如果iRNA的反義股含有對目標序列的誤配，則該誤配的區域較佳不位於互補區的中心。如果iRNA的反義股含有對目標序列的誤配，則該誤配較佳應侷限於距互補區的5'或3'端之最後5個核苷酸內。例如，對股與ANGPTL3基因之區域互補的23個核苷酸iRNA藥劑而言，通常在中央的13個核苷酸內不含有任何誤配。可使用本文所述方法或所屬領域習知的方法測定含有對目標序列誤配的iRNA是否有效於抑制ANGPTL3基因表現。考慮帶有誤配之iRNAs在抑制ANGPTL3基因表現的效能是重要的，特別是如果已知ANGPTL3基因中的 特別互補區在群體內具有多型性序列變異時。
III.本發明之修飾iRNAs
在一具體例中，本發明iRNA的RNA，如，dsRNA，為未修飾的，及不包括，如所屬領域習知及本文所述之化學修飾及/或接合。另一個具體例中，本發明iRNA的RNA，如，dsRNA，經化學修飾而加強穩定性或其他有益特徵。在本發明某些具體例中，本發明iRNA的實質上所有核苷酸均為修飾的核苷酸。本發明其他具體例中，本發明iRNA的所有核苷酸均為修飾的核苷酸。本發明iRNAs其中"實質上所有核苷酸均為修飾的核苷酸"為在很大程度但不是全部經修飾及可包含不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸。
本發明表徵的核酸可經由所屬領域良好建立的方法合成及/或修飾，諸如"Current protocols in nucleic acid chemistry,"Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA中所述者，其係特此以引用方式併入本文。修飾包含，例如，端修飾，如，5'端修飾(磷酸化、接合、倒置鍵結)或3'端修飾(接合、DNA核苷酸、倒置鍵結等)；鹼基修飾，如置換為穩定的鹼基、去穩定的鹼基或與擴充的配偶體組庫的鹼基對的鹼基、鹼基移除(無鹼基核苷酸)或接合鹼基；糖修飾(如，在2'位置或4'位置)或糖的置換；及/或骨架修飾，包含磷酸二酯鍵結的修飾或置換。適用於本文所述具體例的iRNA化合物的具體實例 包含但不限於含有修飾骨架或無天然核苷間鍵結的RNAs。含有修飾骨架的RNAs包含，其中在骨架中不具有磷原子的那些RNAs。出於本說明書之目的，及有時所屬領域談及，不具有磷原子在其核苷間骨架中的修飾RNAs亦可被認為是寡核苷。在一些具體例中，修飾的iRNA將在其核苷間骨架中具有磷原子。
修飾的RNA骨架包含，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基膦酸酯及包含3'-伸烷基膦酸酯及手性膦酸酯的其他烷基膦酸酯、次膦酸酯、包含3'-胺基磷醯胺酯及胺基烷基磷醯胺酯的磷醯胺酯、硫代磷醯胺酯、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯及具有正常3'-5'鍵結的硼烷磷酸酯、這些酯的2'-5'連接類似物，及具有反轉極性的那些酯，其中相鄰對的核苷單位為3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。亦包含各種不同鹽、混合鹽及游離酸形式。
教導製備以上含磷鍵結的代表性美國專利包含，但不限於，美國專利案號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639； 6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029及美國專利RE39464特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
修飾的RNA骨架其中不包含磷原子者具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵結或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵結形成的骨架。這些包含具有下列者：N-嗎啉基鍵結(從核苷的糖部分所部分形成)；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸及碸骨架；甲乙醯基(formacetyl)及硫代甲乙醯基骨架；亞甲基甲乙醯基及硫代甲乙醯基骨架；含烯的骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨架；磺酸酯及磺醯胺骨架；醯胺骨架；及其他具有混合N、O、S及CH2成分部分的骨架。
教導製備以上寡核苷的代表性美國專利包含，但不限於，美國專利案號5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437及5,677,439，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
在其他具體例中，考量iRNAs使用的適當RNA模擬物，其中糖及核苷間鍵結兩者，即，核苷酸單位的骨架，經新穎基團置換。維持鹼基單位並與適當的核酸目標化合物雜合。一種此類寡聚化合物，已顯示具有優異 雜合特性的RNA模擬物，稱為肽核酸(PNA)。PNA化合物中，RNA的糖骨架經含醯胺的骨架置換，特別是胺基乙基甘胺酸骨架。保留核鹼基並與骨架醯胺部分的氮雜氮原子直接或間接結合。教導製備PNA化合物的代表性美國專利包含，但不限於，美國專利案號5,539,082；5,714,331及5,719,262，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。適用於本發明iRNAs的額外的PNA化合物說明於，例如，Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500。
本發明表徵的一些具體例包含有硫代磷酸酯骨架的RNAs及有雜原子骨架的寡核苷，特別是上文引用的美國專利案號5,489,677的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及--N(CH3)--CH2--CH2--[其中天然磷酸二酯骨架表示為--O--P--O--CH2--]，及上文引用的美國專利案號5,602,240的醯胺骨架。在一些具體例中，本文表徵的RNAs具有上文引用的美國專利案號5,034,506的N-嗎啉基骨架結構。
修飾的RNAs亦可含有一個或多個取代的糖部分。本文表徵的iRNAs，如，dsRNAs，可在2'位置包含下列者之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可以是經取代或未經取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例之適合修飾包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為1至約10。在其他具體例中，dsRNAs在2'位置包含下列者之一：C1至C10低碳數烷基、經取代低碳數烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷胺基、聚烷胺基、取代的矽基、RNA裂解基團、報導子基團、嵌入子、用於改善iRNA之藥物動力學特性的基團，或用於改善iRNA之藥效動力學特性的基團，及其他具有相似特性的取代基。在一些具體例中，修飾包含2'-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即，烷氧基-烷氧基基團。另一個示例之修飾為2'-二甲基胺基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基團，如本文以下所說明，亦稱為2'-DMAOE，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(在所屬領域中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。進一步示例之修飾包含：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-去氧核苷酸，(這3種均有R及S異構物)；2'-烷氧基烷基；及2'-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包含2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)及2'-氟(2'-F)。亦可在iRNA之RNA的其他位置做相似的修飾，尤其是，在3'末端核苷酸或在2'-5'連接的dsRNAs中的糖的3'位置及在5'末端核苷 酸的5'位置。iRNAs亦可具有糖模擬物諸如置換呋喃戊糖的環丁基部分。教導製備這種修飾的糖結構的代表性美國專利包含，但不限於，美國專利案號4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；及5,700,920，所述專利的某些由本申請共同持有。特此藉由引用將各自上述的全部內容併入本文中。
本發明iRNA亦可包含核鹼基(在所屬領域中常簡稱為"鹼基")修飾或取代。如本文所使用，"未修飾"或"天然"核鹼基包含嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。修飾的核鹼基包含其他合成及天然核鹼基諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、腺嘌呤及鳥嘌呤的6-甲基及其他烷基衍生物、腺嘌呤及鳥嘌呤的2-丙基及其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫代胞嘧啶、5-鹵基尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-鹵基、8-胺基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵基尤其是5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-去氮雜鳥嘌呤及7-去氮雜腺嘌呤及3-去氮 雜鳥嘌呤及3-去氮雜腺嘌呤。另外的核鹼基包含在美國專利案號3,687,808中揭露者、在Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中揭露者；在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中揭露者、在Englisch et al.,(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30：613中揭露者及在Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中揭露者。這些核鹼基的某些特別地適用於增加本發明表徵的寡聚化合物的結合親和力。這些包含5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代的嘌呤，包含2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代顯示增加核酸雙鏈體穩定性0.6至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)及為示例之鹼基取代，與2'-O-甲氧基乙基糖修飾組合時更加特別。
教導製備某些上述的修飾核鹼基以及其他修飾的核鹼基的代表性美國專利包含，但不限於，上述美國專利案號3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692； 6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672及7,495,088，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
本發明iRNA亦可經修飾而包含一種或多種鎖核酸(LNA)。鎖核酸為具有修飾的核糖部分的核苷酸其中該核糖部分包括連接2'及4'碳之額外的橋。這個結構有效地將核糖"鎖"在3'-內型結構構形。將鎖核酸添加到siRNAs顯示增加siRNA在血清中的穩定性，且降低偏離目標效應(Elmen,J.et al.,(2005)核酸s Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)核酸s Research 31(12)：3185-3193)。
本發明iRNA亦可經修飾而包含一個或多個雙環糖部分。"雙環糖"為經由兩個原子橋接而修飾的呋喃糖基環。"雙環核苷"("BNA")為具有糖部分的核苷，糖部分包括連接糖環中兩個碳原子的橋，因而形成雙環環系。在某些具體例中，該橋連接糖環的4'碳及2'碳。因此，一些具體例中本發明藥劑可包含一種或多種鎖核酸(LNA)。鎖核酸為具有修飾的核糖部分的核苷酸其中該核糖部分包括連接2'及4'碳之額外的橋。換言之，LNA為包括雙環糖部分的核苷酸而雙環糖部分包括4'-CH2-O-2'的橋。這個結構有效地將核糖"鎖"在3'-內型結構構形中。將鎖核酸添加到siRNAs顯示增加siRNA在血清中的穩定性，且降低偏離目 標效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843；Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。本發明多核苷酸使用的雙環核苷的實例包含而不限於核苷，該核苷包括在4'及2'核糖基環原子間的橋。在某些具體例中，本發明反義多核苷酸藥劑包含一個或多個雙環核苷，該雙環核苷包括4'至2'的橋。這種4'至2'橋接雙環核苷的實例，包含但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(亦稱為"拘束性乙基"或"cEt")及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見，如，美國專利案號7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見，如，美國專利案號8,278,283)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見，如，美國專利案號8,278,425)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(參見，如，美國專利公開號2004/0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R為H，C1-C12烷基或保護基(參見，如，美國專利案號7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見，如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(-CH2)-2'(及其類似物；參見，如，美國專利案號8,278,426)。特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
教導製備鎖核酸核苷酸的另外代表性美國專利及美國專利公開包含但不限於下列者：美國專利案號6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845； 7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US 2008/0039618；及US 2009/0012281，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
可將上述任一種雙環核苷製備成具有一種或多種包含例如α-L-核呋喃糖及β-D-核呋喃糖的立體化學糖構形(參見WO 99/14226)。
亦可將本發明iRNA修飾成包含一個或多個拘束性乙基核苷酸。如本文所使用，"拘束性乙基核苷酸"或"cEt"為包括雙環糖部分的鎖核酸，而雙環糖部分包括4'-CH(CH3)-0-2'的橋。在具體例中，拘束性乙基核苷酸為S構形，在本文中稱為"S-cEt"。
本發明iRNA亦可包含一個或多個"構形限制的核苷酸"("CRN")。CRN為有連接子連接核糖的C2'及C4'碳或核糖的C3'及C5'碳的核苷酸類似物。CRN將核糖環鎖在適當的構形而增加對mRNA的雜合親和力。該連接子有足夠長度將氧放置於最佳穩定性及親和性的位置而致使較少核糖環起摺。
教導製備某些上述CRN的代表性公開號包含，但不限於，美國專利公開號2013/0190383；及PCT公開號WO 2013/036868，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
在一些具體例中，本發明iRNA包括其為UNA(解鎖核酸)核苷酸的一個或多個單體。UNA為解鎖非 環核酸，其中糖的任何鍵結都被移除，而形成解鎖的"糖"殘基。在實例中，UNA亦包含在C1'-C4'間的鍵結已被移除的單體(即，C1'及C4'碳間的共價碳-氧-碳鍵結)。另一個實例中，糖的C2'-C3'鍵結(即，C2'及C3'碳間的共價碳-碳鍵結)已被移除(參見Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)and Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039特此藉由引用併入)。
教導製備UNA的代表性美國公開案包含，但不限於，美國專利案號8,314,227；及美國專利公開號2013/0096289；2013/0011922；及2011/0313020，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
對RNA分子端的有力穩定修飾可包含N-(乙醯基胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺醇(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-0-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥基脯胺醇(Hyp-C6-胺基)、2-二十二醯基-尿苷-3"-磷酸鹽、反向鹼基dT(idT)及其他。可在PCT公開號WO 2011/005861找到這種修飾的揭露。
本發明iRNA的其他修飾包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物，如，在RNAi藥劑之反義股上的5'端磷酸酯或磷酸酯模擬物。適合的磷酸酯模擬物揭露於，例如美國專利公開號2012/0157511中，特此藉由引用將全部內容併入本文中。
IV.與配體接合之iRNAs
本發明iRNA的RNA之另一種修飾涉及化學連接RNA以加強iRNA活性、細胞分布或細胞攝取之一個或多個配體、部分或接合物。這種部分包含但不限於脂質部分諸如膽固醇部分(Letsinger et al.,(1989)Proc.Natl.Acid.Sci.USA,86：6553-6556)，膽酸(Manoharan et al.,(1994)Biorg.Med.Chem.Let.,4：1053-1060)，硫醚，如，己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.,660：306-309；Manoharan et al.,(1993)Biorg.Med.Chem.Let.,3：2765-2770)，硫代膽固醇(Oberhauser et al.,(1992)Nucl.Acids Res.,20：533-538)，脂族鏈，如，十二烷基二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,(1991)EMBO J,10：1111-1118；Kabanov et al.,(1990)FEBS Lett.,259：327-330；Svinarchuk et al.,(1993)Biochimie,75：49-54)，磷脂，如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(Manoharan et al.,(1995)Tetrahedron Lett.,36：3651-3654；Shea et al.,(1990)Nucl.Acids Res.,18：3777-3783)，聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,(1995)Nucleosides & Nucleotides,14：969-973)，或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,(1995)Tetrahedron Lett.,36：3651-3654)，十六烷基部分(Mishra et al.,(1995)Biochim.Biophys.Acta,1264：229-237)，或十八胺或己胺基-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277：923- 937)。
在一具體例中，配體改變向其中併入的iRNA藥劑之分布、靶向或壽命。較佳的具體例中相較於沒有這種配體的物種，該配體針對選擇的目標提供加強的親和力，選擇的目標如，分子、細胞或細胞類型、區室，如，細胞的或器官的區室、組織、器官或身體的部位。較佳的配體不參與雙鏈體核酸中的雙鏈體配對。
配體可包含天然存在的物質，諸如蛋白質(如，人類血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(如，葡聚糖、普魯藍多醣、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙醯葡萄糖胺、N-乙醯半乳胺糖或玻尿酸)；或脂質。配體亦可以是重組或合成分子，諸如合成聚合物，如合成的聚胺基酸。聚胺基酸的實例包含聚胺基酸為聚離胺酸(PLL)、聚L-天門冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-乳交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺的實例包含：聚乙烯亞胺、聚離胺酸(PLL)、精胺、亞精胺、聚胺、假肽聚胺、模擬肽聚胺、樹狀聚合物聚胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、聚胺的四級鹽或α螺旋肽。
配體亦可包含與指定的細胞類型諸如腎細胞結合的靶向基團，如細胞或組織靶向劑，如凝集素、糖 蛋白、脂質或蛋白，如抗體。靶向基團可以是促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、黏液素碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺多價甘露糖、多價海藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸酯、聚麩胺酸酯、聚天門冬胺酸酯、脂質、膽固醇、類固醇、膽酸、葉酸、維生素B12、維生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模擬物。
其他配體的實例包含染料、嵌入劑(如，吖啶)、交聯劑(如，補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉類(TPPC4、德克薩卟啉、噻啉)、多環芳香族烴(如，啡嗪、二氫啡嗪)、人工核酸內切酶(如，EDTA)、親脂性分子(如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睪固酮、1,3-雙-O(十六基)甘油、香葉基氧己基、鯨蠟基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪(phenoxazine))，以及肽接合物(如，觸角足肽、Tat肽)、烷化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG(如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、取代的烷基、放射標示的標記、酶、半抗原(如，生物素)、轉運/吸收促進劑(如，阿斯匹靈、維生素E、葉酸)、合成的核糖核酸酶(如，咪唑、雙咪唑、組織胺、咪唑團簇、吖啶-咪唑接合物、四氮雜大環類的Eu3+複合體)、二硝基苯基、HRP或AP。
配體可以是蛋白，如糖蛋白，或肽，如對輔助配體具有特異親和力的分子，或抗體，如，與指定細 胞類型諸如肝細胞結合的抗體。配體亦可包含激素或激素受體。亦可包含非肽種類，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡萄糖胺多價甘露糖或多價海藻糖。配體可以是，例如，脂多醣、p38 MAP激酶的活化物或NF-κ B的活化物。
配體可以是，例如，可經由擾亂細胞的細胞骨架(如，經由擾亂細胞的微管、微絲及/或中間絲)而增加iRNA藥劑攝入細胞中的物質，如藥物。藥物可以是，例如，泰素(taxon)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、細胞鬆弛素(cytochalasin)、諾考達唑(nocodazole)、促微絲聚合劑(japlakinolide)、紅海海綿素A(latrunculin A)、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔藓素A(swinholide A)、茚達諾辛(indanocine)或肌基質蛋白(myoservin)。
在一些具體例中，附接於如本文所述的iRNA之配體充當藥物動力學調變劑(PK調變劑)。PK調變劑包含親脂物、膽酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白結合劑、PEG、維生素等。示例之PK調變劑包含，但不限於，膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、維生素E、生物素等。包括多個硫代磷酸酯鍵結的寡核苷酸亦已知與血清蛋白結合，因此骨架中包括多個硫代磷酸酯鍵結的短寡核苷酸，如，約5個鹼基、10個鹼基、15 個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸，亦適用於本發明作為配體(如，作為PK調變配體)。此外，與血清成分(如，血清蛋白)結合的適配體亦適合使用作為本文所述具體例中的PK調變配體。
本發明之配體接合寡核苷酸可經由使用具有懸垂反應功能性的寡核苷酸，諸如衍生自連接分子附接在該寡核苷酸(敘述於下)，而合成。這種反應寡核苷酸可與市售配體、合成的且有多種保護基團的任一種的配體或具有連接部分附接至其的配體直接反應。
可方便地及常規地經由眾所周知的固相合成技術製造本發明使用在接合物的寡核苷酸。這種合成的設備經由若干銷售商包含，例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)銷售。可另外地或替換地採用所屬領域習知的任何一種這種合成的其他方式。亦瞭解使用相似技術製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯類及烷化衍生物。
在本發明之具有序列特異性連接核苷的配體接合寡核苷酸及配體分子中，可在適當的DNA合成儀上利用標準核苷酸或核苷前驅物，或已具有連接部分的核苷酸或核苷接合物前驅物，已具有配體分子的配體核苷酸或核苷接合物前驅物，或具有結構塊的非核苷配體，來組裝寡核苷酸及寡核苷。
使用已具有連接部分的核苷酸接合物前驅物時，典型地完成序列特異性連接核苷的合成，然後配體分子與連接部分反應而形成配體接合寡核苷酸。在一些具 體例中，除了市售及常規地使用於寡核苷酸合成的標準亞磷醯胺及非標準亞磷醯胺外，經由自動化合成儀使用衍生自配體核苷接合物的亞磷醯胺合成本發明寡核苷酸或連接核苷。
A.脂質接合物
在一具體例中，配體或接合物為脂質或脂質基分子。這種脂質或脂質基分子較佳與血清蛋白結合，如，人類血清白蛋白(HSA)。結合HAS的配體允許接合物分布至目標組織，如，身體的非腎目標組織。例如，目標組織可以是肝臟，包含肝臟的實質細胞。亦可使用可結合HAS的其他分子作為配體。例如，可使用萘普生(neproxin)或阿斯匹靈。脂質或脂質基配體可(a)增加接合物對降解的抗性、(b)增加靶向或轉運至目標細胞或細胞膜中，及/或(c)可使用於調整與血清蛋白的結合，如HSA。
可使用脂質系配體來抑制，如，控制接合物與目標組織的結合。例如，更強烈地結合HAS的脂質或脂質系配體將不太可能被靶向腎及因此不太可能從身體清除。可用較不強烈結合HAS的脂質或脂質系配體使接合物靶向至腎。
較佳的具體例中，脂質系配體結合HSA。較佳地，其係以足夠的親和力結合HAS而使得接合物將較佳地分布至非腎組織。然而，較佳為該親和力不是如此強烈而使得HSA-配體結合不能逆轉。
另一個較佳的具體例中，脂質系配體微弱或根本不結合HSA，如此使得接合物將較佳分布至腎。亦可使用靶向腎細胞的其他部分置換脂質系配體或除脂質系配體之外還使用靶向腎細胞的其他部分。
另一方面，配體為經由目標細胞，如，正在增殖的細胞，所攝取的部分，如，維生素。這些特別地適用於治療其特徵為不想要的細胞增殖之障礙，如，惡性或非惡性型，如，癌細胞。示例之維生素包含維生素A、E及K。其他示例之維生素包含B維生素，如，葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或經由目標細胞諸如肝細胞攝取的其他維生素或養分。還包含HAS及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
另一方面，配體為細胞滲透劑，較佳為螺旋形細胞滲透劑。較佳地，該藥劑為兩性。示例性藥劑為肽諸如tat或觸角足蛋白。如果該藥劑為肽，可經修飾，包含肽醯基模擬物、反演物、非肽或假肽鍵結及D-胺基酸的使用。螺旋形劑較佳為α-螺旋劑，該α-螺旋劑較佳具有親脂性及疏脂性的相。
配體可以是肽或模擬肽。模擬肽(本文中亦稱為寡肽模擬物)為能夠摺疊成與天然肽相似之限定三維結構的分子。肽及模擬肽附接至iRNA藥劑可影響iRNA的藥物動力學分布，諸如經由加強細胞識別及吸收。肽或模擬肽部分可以是約5至50個胺基酸長，如，約5、10、15、 20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
肽或模擬肽可以是，例如細胞滲透肽、陽離子肽、兩性肽或疏水性肽(如，主要由Tyr、Trp或Phe所組成)。肽部分可以是樹狀肽、拘束肽或交聯肽。另一個替代方案中，肽部分可包含疏水性膜轉運序列(MTS)。示例之含疏水性MTS的肽為具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：13)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF類似物(如，胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：10))亦可以是靶向部分。肽部分可以是"遞送"肽，該遞送肽可轉載包含肽、寡核苷酸及蛋白的大極性分子越過細胞膜。例如，已發現來自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：11))及果蠅觸角足蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：12))的序列能發揮如遞送肽的功能。肽或模擬肽可由隨機DNA序列編碼，諸如從噬菌體展示庫或一珠一化合物(OBOC)組合庫鑑定的肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。用於細胞靶向目的，經由併入的單體單元而繫至dsRNA藥劑的肽或模擬肽之實例為精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(RGD)肽或RGD模擬物。肽部分的長度範圍可從約5個胺基酸至約40個胺基酸。肽部分可具有結構修飾，諸如使得增加穩定性或引導構形特性。可使用以下說明之任何結構修飾。
本發明組成物及方法所使用的RGD肽可以是線性或環狀，及可以是修飾的，如，糖基化或甲基化，而促進靶向至特定組織。含RGD的肽及模擬肽可包含D- 胺基酸，以及合成RGD模擬物。除RGD之外，可使用靶向整聯蛋白配體的其他部分。該配體的較佳接合物靶向PECAM-1或VEGF。
"細胞滲透肽"能夠滲透細胞，如，微生物細胞，諸如細菌或真菌細胞，或哺乳類細胞，諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可以是，例如，α-螺旋線性肽(如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鍵的肽(如，α-防禦素、β-防禦素或牛白血球抗菌肽)或只含有一種或兩種主要胺基酸的肽(如，PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。細胞滲透肽亦可包含核定位信號(NLS)。例如，細胞滲透肽可以是二重兩性肽，諸如MPG，其係衍生自HIV-1 gp41的融合肽結構域及SV40大T抗原的NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳水化合物接合物
本發明組成物及方法的一些具體例中，iRNA寡核苷酸另外包括碳水化合物。與碳水化合物接合的iRNA對體內核酸的遞送以及適合於體內治療用途的組成物是有利的，如本文所述。如本文所使用，"碳水化合物"意指一種化合物，該化合物為本身由具有至少6個碳原子的一個或多個單糖單位構成的碳水化合物(可以是線性、支鏈或環狀的)，有氧、氮或硫原子與各碳原子結合；抑或是具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，而該碳水化合物由具有至少6個碳原子的一個或多個單糖單位構成(可以是線 性、支鏈或環狀的)，有氧、氮或硫原子與各碳原子結合。代表性的碳水化合物包含糖類(單糖、二糖、三糖及含有約4、5、6、7、8或9個單糖單位的低聚糖)，及多糖諸如澱粉、肝醣、纖維素及多糖膠。特定的單糖包含C5及以上的糖(如，C5、C6、C7或C8)；二糖及三糖包含具有2個或3個單糖單位的糖(如，C5、C6、C7或C8)。
在一具體例中，本發明組成物及方法中使用的碳水化合物接合物為單糖。在具體例中，該單糖為N-乙醯半乳胺糖，諸如
另一個具體例中，本發明組成物及方法中使用的碳水化合物接合物選自下列所成群組：
本文所述具體例中使用的另一個代表性碳水化合物接合物包含，但不限於， 當X或Y之一為寡核苷酸時，另一個為氫。
在某些本發明具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由單價連接子附接至本發明iRNA藥劑。在一些具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由二價連接子附接至本發明iRNA藥劑。在本發明又其他具體例中，GalNAc或GalNAc衍生物經由三價連接子附接至本發明iRNA藥劑。
在具體例中，本發明之雙股RNAi藥劑包括一個附接至iRNA藥劑的GalNAc或GalNAc衍生物。另一個具體例中，本發明之雙股RNAi藥劑包括複數個(如，2、3、4、5或6)GalNAc或GalNAc衍生物，各透過複數個單價連接子獨立附接至雙股RNAi藥劑的複數個核苷酸。在一些具體例中，例如，當本發明iRNA藥劑的兩股為較大分子的部分且經由一股的3'端及各自其他股的5'端間的核 苷酸不間斷鏈連接而形成包括複數個未配對核苷酸的髮夾環時，髮夾環內的各未配對核苷酸可獨立包括經由單價連接子附接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些具體例中，碳水化合物接合物另外包括一個或多個如上述的額外配體，諸如，但不限於，PK調變劑及/或細胞滲透肽。
適用於本發明的額外碳水化合物接合物(及連接子)包含PCT公開號2014/179620及WO 2014/179627中所述者，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
D.連接子
在一些具體例中，本文所述接合物或配體可用各種不同連接子附接至iRNA寡核苷酸，而連接子可為可裂解或不可裂解。
術語"連接子"或"連接基團"意指連接化合物之兩個部分的有機部分，如，共價地附接化合物的兩個部分。連接子一般包括直接的鍵或原子諸如氧或硫，單位諸如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈，諸如，但不限於，經取代或未經取代烷基、經取代或未經取代烯基、經取代或未經取代炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔 基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個或多個亞甲基可被下列者中斷或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、經取代或未經取代芳基、經取代或未經取代雜芳基、經取代或未經取代雜環基；其中R8為氫、醯基、脂族或經取代脂族。在具體例中，連接子在約1至24個原子、2至24、3至24、4至24、5至24、6至24、6至18、7至18、8至18個原子、7至17、8至17、6至16、7至17或8至16個原子之間。
可裂解連接基團為在細胞外充分穩定的基團，但是一進入目標細胞中則被裂解而釋放由連接子固定在一起的兩個部分。較佳的具體例中，可裂解連接基團在目標細胞或在第一參考條件下(其可，如，選擇為模擬或代表細胞內條件)比在個體血液中或在第二參考條件下(其可，如，選擇為模擬或代表在血液或血清中發現的條件)的裂解快至少約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少100倍。
可裂解連接基團對裂解劑敏感，如，pH、 氧化還原電位或降解分子的存在。通常，裂解劑在細胞內部比在血清或血液中更普遍或經發現有更高水平或活性。這種裂解劑的實例包含：被選擇用於特別基質或不具基質特異性的氧化還原劑，包含，如，氧化或還原酶或存在細胞中的還原劑諸如硫醇，其可經由還原作用而降解氧化還原可裂解連接基團；酯酶；胞內體或可創造酸性環境的藥劑，如，導致pH為5或較低者；可經由充當廣泛性酸而水解或降解酸可裂解連接基團的酶、肽酶(其可以是基質特異性)及磷酸酶。
可裂解連接基團，諸如二硫鍵，可對pH敏感。人類血清的pH為7.4，而平均細胞內pH為稍低，約在7.1至7.3範圍。胞內體具有更酸性的pH，在5.5至6.0範圍，而溶酶體具有甚至更酸性的pH約5.0。一些連接子可具有在較佳pH被裂解的可裂解連接基團，由此將陽離子脂質從配體釋放至細胞內，或進入希望的細胞區室中。
連接子可包含可由特別的酶裂解的連接基團。併入連接子的可裂解連接基團之類型可取決於有待靶向的細胞。例如，肝靶向配體可經由包含酯基團的連接子而連接至陽離子脂質。肝細胞富含酯酶，因此該連接子在肝細胞中比在不富含酯酶的細胞類型中更有效的被裂解。其他富含酯酶的細胞類型包含肺、腎皮質及睪丸的細胞。
當靶向富含肽酶的細胞類型諸如肝細胞或滑膜細胞時，可使用含有肽鍵的連接子。
通常，可由測試降解劑(或條件)對裂解候選 連接基團的能力來評估候選可裂解連接基團的適合性。也希望也測試候選可裂解連接基團在血液中或與其他非目標組織接觸時抵抗裂解的能力。因此，可測定在第一及第二條件之間裂解的相對敏感度，其中選擇第一條件為指示在目標細胞中的裂解及選擇第二條件為指示在其他組織或生物流體中的裂解，如，血液或血清。可在無細胞系統中、細胞中、細胞培養中、器官或組織培養中，或整個動物中進行該評估。有用的是在無細胞中或細胞條件中進行初始評估及在整個動物中進一步評估而確認。較佳的具體例中，相較於在血液或血清中(或在選擇為模擬細胞外條件的體外條件下)，適用的候選化合物在細胞中(或在選擇為模擬細胞內條件的體外條件下)的裂解至少快約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍。
i.氧化還原可裂解連接基團
一具體例中，可裂解連接基團為在氧化或還原時被裂解的氧化還原可裂解連接基團。還原可裂解連接基團的實例為二硫鍵連接基團(-S-S-)。為了確定候選的可裂解連接基團是否為適合的"還原可裂解連接基團"，或例如是否適合與特別的iRNA部分及特別的靶向劑一起使用，可參考本文所述的方法。例如，可經由與二硫蘇糖醇(DTT)或使用所屬領域習知試劑之其他還原劑進行培養而評估候選物，其係模擬會在細胞中，如，目標細胞，觀察到的裂解速率。亦可在選擇為模擬血液或血清的條件下評估候選物。在具 體例中，候選化合物在血液中被裂解最多約10%。在其他具體例中，相較於在血液中(或在選擇為模擬細胞外條件的體外條件下)，適用的候選化合物在細胞中(或在選擇為模擬細胞內條件的體外條件下)被降解至少快約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍。可使用標準酶動力學檢測在選擇為模擬細胞內介質的條件下並與選擇為模擬細胞外介質的條件下比較而測定候選化合物的裂解速率。
ii.磷酸酯系可裂解連接基團
另一個具體例中，可裂解連接子包括磷酸酯系可裂解連接基團。降解或水解磷酸酯系團的藥劑裂解可裂解連接基團。在細胞中裂解磷酸酯系團的藥劑之實例為酶類諸如細胞中的磷酸酶。磷酸酯系連接基團的實例為-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。較佳的具體例為-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。較佳的具體例為-O-P(O)(OH)-O-。可使用與上述者類似的方法測評這 些候選物。
iii.酸可裂解連接基團
另一個具體例中，可裂解連接子包括酸可裂解連接基團。酸可裂解連接基團為在酸性條件下被裂解的連接基團。較佳的具體例中酸可裂解連接基團在pH為約6.5或較低(如，約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或較低)的酸性環境中被裂解，或被充當廣泛性酸的藥劑諸如酶裂解。在細胞中，特定低pH胞器，諸如胞內體及溶酶體可提供酸可裂解連接基團的裂解環境。酸可裂解連接基團的實例包含但不限於腙、酯及胺基酸的酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。較佳的具體例為附接在酯(烷氧基)的氧原子上的碳為芳基、經取代烷基或第三烷基諸如二甲基戊基或第三丁基。可使用與上述者類似的方法測評這些候選物。
iv.酯系連接基團
另一個具體例中，可裂解連接子包括酯系可裂解連接基團。酯系可裂解連接基團被細胞中的酶諸如酯酶及醯胺酶裂解。酯可裂解連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可使用與上述者類似的方法測評這些候選物。
v.肽系裂解基團
在又另一個具體例中，可裂解連接子包括肽系可裂解 連接基團。肽系可裂解連接基團被細胞中的酶諸如肽酶及蛋白酶裂解。肽系可裂解連接基團是在胺基酸之間形成肽鍵而產生寡肽(如，二肽、三肽等)及多肽。肽系可裂解基團不包含醯胺基(-C(O)NH-)。可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成醯胺基。肽鍵為在胺基酸之間形成而產生肽及蛋白的特殊類型醯胺鍵。肽系裂解基團通常限制於在胺基酸之間形成而產生肽及蛋白的肽鍵(即，醯胺基)及不包含整個醯胺官能基。肽系可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB為兩相鄰胺基酸的R基團。可使用與上述者類似的方法測評這些候選物。
在一具體例中，本發明iRNA經由連接子與碳水化合物接合。有本發明組成物及方法之連接子的iRNA碳水化合物接合物的非限制性實例包含，但不限於， (式XXXI)，當X或Y之一為寡核苷酸時，另一個為氫。
本發明組成物及方法的某些具體例中，配體為經由二價或三價分支連接子而附接的一個或多個GalNAc(N-乙醯半乳胺糖)衍生物。
在一具體例中，本發明dsRNA與選自任何式(XXXII)至(XXXV)顯示之結構之群組的二價或三價分支連接子接合： 其中：q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C每次出現時獨立表示0至20及其中該重複單位可以是相同或不同；P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C在每次出現時各獨立地為不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C在每次出現時獨立地為不存在、伸烷基、經取代伸烷基其中一個 或多個亞甲基可被一個或多個下列者中斷或封端：O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R")、C≡C或C(O)；R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C在每次出現時各獨立地為不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、 NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、、 雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C表示配體；即，各在每次出現時獨立地為單糖(諸如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、低聚糖或多糖；及Ra為H或胺基酸側鏈。三價接合GalNAc衍生物特別適用於與RNAi藥劑一起使用於抑制目標基因表現，諸如式(XXXVI)者： 其中L5A、L5B及L5C表示單糖，諸如GalNAc衍生物。
適合的二價或三價分支連接子基團接合GalNAc衍生物的實例包含，但不限於，以上引用的結構如式II、VII、XI、X及XIII。
教導製備RNA接合物的代表性美國專利包 含，但不限於，美國專利案號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，特此藉由引用將各自的全部內容併入本文中。
不需要指定化合物的所有位置均經一致的修飾，並且事實上可在單個化合物或甚至iRNA內的單個核苷中併入多於一個的上述修飾。本發明亦包含為嵌合化合物的iRNA化合物。
"嵌合"iRNA化合物或"嵌合體"，在本發明的上下文中為iRNA化合物，較佳地為dsRNAs，含有兩個或更多個化學上不同的區域，各由至少一個單體單位所構成，即，在dsRNA化合物情況下的核苷酸。這些iRNAs通常含有至少一個區域其中RNA經修飾而因此賦予iRNA 對核酸酶降解的抗性、增加細胞攝取及/或增加目標核酸結合親和力。iRNA的額外區域可充當能裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體的酶之基質。藉由舉例，RNase H為裂解RNA：DNA雙鏈體的RNA股的細胞核酸內切酶。因此RNase H的活化，導致RNA目標的裂解，因而大大加強iRNA的基因表現抑制效率。因此，相較於雜合至相同目標區域的硫代磷酸酯去氧dsRNAs，使用嵌合dsRNAs時，用較短iRNAs往往可得到可比較的結果。可常規地經由凝膠電泳檢測RNA目標的裂解及，如需要，聯合所屬領域習知的核酸雜合技術。
在某些實例中，iRNA的RNA可經由非配體基團修飾。為了加強iRNA活性、細胞分布或細胞攝取，已使許多非配體分子與iRNAs接合，而進行這種接合的程序可在科學文獻中找到。這種非配體部分包含脂質部分，諸如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4：1053)、硫醚(如，己基-S-三苯甲基硫醇)(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂族鏈(如，十二烷基二醇或十一烷基殘基)(Saison-Behmoaras etal.,EMBO J.,1991,10：111；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；Svinarchuk et al.,Biochimie, 1993,75：49)、磷脂(如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯)(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides &核苷酸s,1995,14：969)、金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、十六烷基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)或十八胺或己胺基-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。教導製備這種RNA接合物的代表性美國專利已列於上文。典型的接合方案涉及在序列的一個或多個位置具有胺基酸連接子的RNAs之合成。然後使用適當的偶合或活化試劑使胺基與分子反應而接合。可用仍與固體支持物結合或在RNA裂解後處於溶液相的RNA進行接合反應。用HPLC純化RNA接合物通常提供純的接合物。
IV.本發明iRNA的遞送
可有多種不同方法達成遞送本發明iRNA至細胞如，個體，諸如人類個體(如，對有需要之個體，諸如具有脂肪代謝障礙的個體)體內細胞。例如，可經由在體外或體內使細胞接觸本發明iRNA而進行遞送。亦可經由給予個體包括iRNA，如dsRNA，的組成物而直接進行體內遞送。替代地，可經由給予一個或多個編碼及引導iRNA表現的載體而間接進行體內遞送。以下進一步討論這些替代方案。
通常，任何遞送核酸分子(體外或體內)的方法適用於本發明iRNA的使用(參見如，Akhtar S.and Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144 and WO94/02595，其藉由引用全部併入本文中。)。於體內遞送，為了遞送iRNA分子而考慮的因素包含，例如，遞送分子的生物穩定性、防止非特異性效用及遞送分子在目標組織中的累積。可經由局部給藥而最小化iRNA的非特異性效用，例如，經由直接注射或植入組織或局部給予製劑。局部給藥至治療部位最大化藥劑的局部濃度，限制藥劑向全身組織的暴露否則全身組織可受藥劑傷害或可降解藥劑，及允許給予較低總劑量的iRNA分子。若干研究已顯示局部給予iRNA時成功減弱基因產物。例如，經由石蟹獼猴中的水晶體內注射(Tolentino,MJ.et al.,(2004)Retina 24：132-138)及小鼠的視網膜下注射(Reich,SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9：210-216)而眼內遞送VEGF dsRNA，均顯示防止年齡相關的黃斑病變之實驗模型中的血管新生。此外，小鼠的直接腫瘤內注射dsRNA減小腫瘤體積(Pille,J.et al.(2005)Mol.Ther.11：267-274)且可延長荷瘤小鼠的存活(Kim,WJ.et al.,(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.et al.,(2007)Mol.Ther.15：515-523)。亦已經由直接注射而成功地局部遞送RNA干擾至CNS(Dorn,G.et al.,(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.et al.(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al.(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al.(2004)Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al.(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)及經由鼻腔給藥而成功遞送至肺部(Howard,KA.et al.,(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.et al.,(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.et al.,(2005)Nat.Med.11：50-55)。對於全身給藥iRNA用於治療疾病，可將RNA修飾或替代地使用藥物遞送系統來遞送；兩種方法都可以有防止dsRNA被體內核酸內切酶或外切酶快速降解的作用。RNA或藥物載體的修飾亦可允許iRNA組成物靶向目標組織且避免不想要的偏離目標效應。可經由與親脂性基團諸如膽固醇化學接合而修飾iRNA分子以加強細胞攝取及防止降解。例如，將針對ApoB與親脂性膽固醇部分接合的iRNA全身性注射至小鼠中而導致在肝臟及空腸兩者中apoB mRNA的減弱(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。iRNA與適體的接合已顯示抑制前列腺癌小鼠模型的腫瘤生長及介導腫瘤消退(McNamara,JO.etal.,(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。另一個替代具體例中，可使用藥物遞送系統諸如奈米顆粒、樹狀物、聚合物、脂質體或陽離子遞送系統來遞送iRNA。帶正電荷的陽離子遞送系統促進iRNA分子(帶負電荷)的結合且亦加強在帶負電荷細胞膜的相互作用而允許iRNA被細胞有效攝取。陽離子脂質、樹狀物或聚合物可與iRNA結合，或經誘導而形成包裝iRNA的囊泡或微胞(參見如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。囊泡或微胞的形成進一 步防止全身性給藥時的iRNA降解。製造及給予陽離子-iRNA複合體的方法完全在所屬領域熟練技術人員之能力範圍內(參見如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold,AS et al.,(2007)J.Hypertens.25：197-205，其通過引用全部併入本文中。)。適用於全身性遞送iRNAs的一些藥物遞送系統的非限制性實例包含DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003),supra；Verma,UN.et al.,(2003),supra)、Oligofectamine,"固體核酸脂質顆粒"(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚伸乙基亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)及聚醯胺基胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。一些具體例中，iRNA與環糊精形成複合體而用於全身性給藥。可在美國專利案號7,427,605中找到給藥的方法及iRNAs及環糊精的醫藥組成物，該美國專利藉由引用全部併入本文中。
A.編碼本發明iRNAs的載體
靶向ANGPTL3基因的iRNA可從插入DNA或RNA載體的轉錄單位表現(參見，如，Couture,A,et al.,TIG.(1996), 12：5-10；Skillern,A.,et al.,國際PCT公開號WO 00/22113,Conrad，國際PCT公開號WO 00/22114，及Conrad，美國專利案號6,054,299)。表現可以是短暫的(數小時至數星期內)或持續的(數星期至數個月或更久)，取決於所使用的特定建構及目標組織或細胞類型。這些轉基因可作為線性建構、環狀質體或可以是整合或非整合載體的病毒載體而引入。亦可建構該轉基因以允許它作為染色體外的質體而進行遺傳(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
iRNA的個別股或股可從表現載體的啟動子轉錄。在兩個分離的股待表現以產生，例如，dsRNA，的情況下，可將兩個分離的表現載體共引入(如，經由轉染或感染)目標細胞中。替代地可經由兩個位在相同表現質體的啟動子轉錄各dsRNA的個別股。在具體例中，dsRNA經表現為經由連接子多核苷酸序列連結的反向重複多核苷酸而使得該dsRNA具有莖及環結構。
iRNA表現載體通常為DNA質體或病毒載體。與真核細胞相容的表現載體，較佳地是那些與脊椎動物細胞相容的，可用來產生如本文所述表現iRNA的重組建構。真核細胞表現載體為所屬領域所熟知且可從多種商業來源獲得。通常，提供含有用於插入所需核酸區段的便利限制位點的這種載體。iRNA表現載體的遞送可以是全身性，諸如經靜脈或肌肉內給藥、經由給藥至從患者移植出的目標細胞隨後再引入患者中，或經由允許引入所需目標 細胞的任何其他方法。
可與本文所述方法及組成物一起使用的病毒載體包含，但不限於，(a)腺病毒載體；(b)逆轉錄病毒載體，包含但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40載體；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體諸如正痘病毒，如，牛痘病毒載體或禽痘，如，金絲雀痘或雞痘；及(j)輔助-依賴性或無腸腺病毒。複製缺陷病毒亦可以是有利的。不同載體將併入或將不併入細胞的基因組中。如需要，該建構可包含病毒序列用於轉染。替代地，可將該建構併入能附加型複製的載體中，如，EPV及EBV載體。iRNA重組表現的建構通常需要調節元素，如，啟動子、加強子等而確保iRNA在目標細胞中的表現。針對載體及建構的其他方面考量為所屬領域所習知。
V.本發明之醫藥組成物
本發明亦包含醫藥組成物及製劑，該醫藥組成物及製劑包含本發明iRNAs。在具體例中，本文提供含有如本文所述iRNA及藥學上可接受的載體之醫藥組成物。含有iRNA的醫藥組成物適用於治療與ANGPTL3基因的表現或活性相關的疾病或障礙，如，脂肪代謝障礙，如，遺傳性障礙，諸如家族性高三酸甘油酯血症、家族性部分脂肪營養不良第1型(FPLD1)或誘發性或獲得性障礙，諸如因為疾 病、障礙或病狀(如，腎衰竭)、節食或攝取某些藥物(如，因為使用於治療，如，AIDS或HIV之高效抗逆轉濾病毒療法的結果)之結果而誘發或獲得的障礙。
基於遞送模式而配製這種醫藥組成物。實例為配製成經由腸外遞送，如，靜脈(IV)或皮下遞送而用於全身性給藥的組成物。另一個實例為配製成直接遞送至肝臟的組成物，如，經由輸注至肝臟，諸如經由連續幫浦輸注。
本發明醫藥組成物可按足以抑制ANGPTL3基因表現的劑量給予。通常，本發明iRNA的適當劑量為每日每公斤接受者體重約0.001至約200.0毫克範圍內，通常每日每公斤體重約1至50mg範圍內。一般，本發明iRNA的適當劑量為約0.1mg/kg至約5.0mg/kg範圍內，較佳為約0.3mg/kg及約3.0mg/kg。
重複給藥方案可包含在常規基礎上給藥治療量的iRNA，諸如從每隔1天到1年1次。在某些具體例中，給藥iRNA約1個月1次至約1季1次(即，約每3個月1次)。
初始治療方案之後，可在較不頻繁的基礎上給藥而治療。
熟練技術人員應了解某些因素可影響有效治療個體所需之劑量及時間，包含但不限於疾病或障礙的嚴重性、先前的疾病、個體的一般健康情形及/或年齡及其他存在的疾病。再者，用治療有效量的組成物治療個體可 包含單次治療或一系列治療。可使用傳統方法或在使用適當動物模型之體內測試的基礎上評估包含於本發明之個別iRNAs之有效劑量及體內半衰期，如本文中他處所述。
小鼠遺傳學上的進展已產生多種小鼠模型用於研究各種人類疾病，諸如可從ANGPL3表現的減低而受益的脂肪代謝障礙。這種模型可用於iRNA的體內試驗，以及用於測定治療上有效的劑量。所屬領域習知適合的小鼠模型及包含，例如，在肥胖(ob)基因中含有突變的肥胖(ob/ob)小鼠(Wiegman et al.,(2003)Diabetes,52：1081-1089)；含有LDL受體同型結合剔除的小鼠(LDLR-/-小鼠；Ishibashi et al.,(1993)J Clin Invest 92(2)：883-893)；飲食誘導的動脈粥樣硬化小鼠模型(Ishida et al.,(1991)J.Lipid.Res.,32：559-568)；及異型接合脂蛋白脂肪酶剔除的小鼠模型(Weistock et al.,(1995)J.Clin.Invest.96(6)：2555-2568)。
取決於所需的是局部還是全身治療及取決於待治療的區域而按多種方法給予本發明醫藥組成物。給藥可以是局部的(如，經皮貼片)，肺的，如，經由粉末或噴霧劑的吸入或吹入，包含經由霧化器；氣管內、鼻腔、表皮的及經皮的、口服或腸外。腸外給藥包含靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；表皮下，如，經由移植裝置；或顱內，如，經由腦實質內、鞘內或心室內的給藥。
可按方法遞送iRNA而靶向特定組織，諸如肝臟(如，肝臟的肝細胞)。
用於局部給藥的醫藥組成物及製劑可包含經皮貼片、軟膏、乳液、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。傳統藥物載劑、水、粉末或油基劑、增稠劑等可以是必要的或可合宜的。塗層的保險套、手套等亦可以是適用的。適合的局部製劑包含其中本文表徵的iRNAs與局部遞送劑諸如脂肪、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、鉗合劑及表面活性劑掺合者。適合的脂肪及脂質體包含中性(如，二油醯基磷脂醯乙醇胺DOPE、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼DMPC、二硬脂醯磷脂醯膽鹼)、陰性(如，二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油DMPG)及陽離子(如，二油醯基四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯基磷脂醯乙醇胺DOTMA)。本發明表徵的iRNAs可包封於脂質體中或可與脂質體特別是陽離子脂質體形成複合體。替代地，iRNAs可與脂質特別是陽離子脂質複合。適合的脂肪酸及酯類包含但不限於花生四烯酸、油酸、二十酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉毒鹼、醯基膽鹼或C1-20烷基酯(如，異丙基肉豆蔻酸酯IPM)、單甘油酯、二甘油酯或其藥學上可接受的鹽。在美國專利案號6,747,014中詳細說明局部製劑，其藉由引用併入本文中。
用於口服給藥的組成物及製劑包含粉末或顆粒、微粒、奈米顆粒、水或非水介質的懸浮液或溶液、 膠囊、明膠膠囊、袋裝粉劑、錠劑或迷你錠劑。可以是合宜的為增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。在一些具體例中，口服製劑為其中本發明表徵的dsRNAs與一種或多種滲透加強劑、表面活性劑及鉗合劑聯合給藥的製劑。適合的表面活性劑包含脂肪酸及/或其酯或鹽、膽酸及/或其鹽。適合的膽酸/鹽包含鵝去氧膽酸(CDCA)及熊去氧膽酸(ursodeoxychenodeoxycholic acid)(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、葡糖膽酸(glucholic acid)、甘膽酸(glycholic acid)、甘胺去氧膽酸(glycodeoxycholic acid)、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉及甘胺二氫褐黴酸鈉。適合的脂肪酸包含花生四烯酸、十一酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉毒鹼、醯基膽鹼，或單甘油酯、二甘油酯或其藥學上可接受的鹽(如，鈉鹽)。在一些具體例中，可使用滲透加強劑的組合，例如，脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。示例之組合為月桂酸、辛酸及UDCA之鈉鹽的組合。另外的滲透加強劑包含聚氧伸乙基-9-月桂基醚、聚氧伸乙基-20-十六基醚。本發明表徵的DsRNAs可用包含噴霧乾燥顆粒的顆粒形式或複合而形成微粒或奈米顆粒而口服遞送。DsRNA複合劑包含聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷酯、聚環氧丙烷、聚氰基丙烯酸烷酯；陽離子化明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇類(PEG)及澱 粉；聚氰基丙烯酸烷酯；DEAE-衍生的聚亞胺、普魯蘭多醣、纖維素及澱粉。適合的複合劑包含幾丁聚醣、N-三甲基幾丁聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(如，對胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(氰基丙烯酸異己酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己基酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸乙醇酸共聚物(PLGA))、海藻酸鹽及聚乙二醇(PEG)。美國專利案號6,887,906、美國專利公開號20030027780及美國專利案號6,747,014中詳細說明dsRNAs的口服製劑及彼等之製備，其各自通過引用併入本文中。
用於腸外、腦實質內(進入大腦)、鞘內、心室內或肝內給藥的組成物及製劑可包含無菌水溶液，該無菌水溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適當的添加物諸如，但不限於，滲透加強劑、載劑化合物及其他藥學上可接受的載劑或賦形劑。
本發明醫藥組成物包含，但不限於，溶液、乳狀劑及含脂質體的製劑。這些組成物可從多種成分生成，所述成分包含，但不限於，預製的液體、自乳化固體及自乳化半固體。治療肝臟疾病諸如肝癌時，特別佳的是靶向肝臟的製劑。
可根據製藥業中熟知的傳統技術製備可便利提出單位劑型的本發明藥物製劑。這種技術包含使活性成分與藥物載劑或賦形劑相結合的步驟。通常，經由均勻地且緊密地使活性成分與液體載劑或精細分割的固體載劑或兩者結合而製備製劑，然後，如需要，將產品製成型。
可將本發明組成物配製成各種可能的劑型諸如，但不限於，錠劑、膠囊、凝膠膠囊、液體漿劑、軟膠囊、栓劑及灌腸劑。亦可將本發明組成物配製成水、非水或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可進一步含有增加懸浮液之黏稠度的物質，包含，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或葡聚糖。懸浮液亦可含有穩定劑。
A.另外的製劑 i.乳狀劑
可將本發明組成物製備及配製成乳狀劑。乳狀劑一般為一種液體以通常直徑超過0.1μm的微滴形式分散在另一種液體中的異源系(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y., Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳狀劑經常為包括兩種互不相溶彼此緊密地混合及分散的液相之雙相系。通常，乳狀劑可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)種類。當水相經細碎且成為微小液滴而分散至本體油相中時，產生的組成物稱為油包水(w/o)乳狀劑。替代地，當油相經細碎且成為微小液滴而分散至本體水相中時，產生的組成物稱為水包油(o/w)乳狀劑。乳狀劑除分散相及可以水相、油相或其本身作為獨立相的溶液存在的活性藥物之外，可含有另外的成分。如需要乳狀劑中可存在藥物賦形劑諸如乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑。醫藥乳狀劑亦可以是包括多於兩相的多重乳狀劑，諸如，例如，油包水包油(o/w/o)及水包油包水(w/o/w)乳狀劑之情況。這種複合製劑往往提供某些單純二相乳狀劑所沒有的優勢。多重乳狀劑其中o/w乳狀劑的各個油滴包有小水滴時則構成w/o/w乳狀劑。同樣地，在油連續相中的穩定化水滴中包封油滴的系統則提供o/w/o乳狀劑。
乳狀劑的特徵為較小或沒有熱力學穩定性。通常，乳狀劑的分散相或不連續相良好地分散到外相或連續相並且透過乳化劑方式或製劑的黏性而維持這種形式。在乳狀軟膏基料及乳膏的情況，乳狀劑的相可以是半 固體或固體。穩定乳狀劑的其他方式需要使用可引入乳狀劑任一相中的乳化劑。乳化劑可廣泛地分成四種類型：合成的表面活性劑、天然存在的乳化劑、吸收基料及細分散的固體(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成表面活性劑，亦稱為表面活性試劑，已發現被廣泛應用於乳狀劑製劑且已在文獻中評論過(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。表面活性劑一般為兩性及包括親水性及疏水性部分。表面活性劑的親水性對疏水性比值的性質稱為親水性/親脂性平衡值(HLB)且為製備製劑上分類及選擇表面活性劑的重要工具。可基於親水性基團的性質而將表面活性劑分類成不同類型：非離子型、陰離子型、陽離子型及兩性型(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
使用於乳狀劑製劑之天然存在的乳化劑包含羊毛脂、蜜蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收基料具有親水性特性因此使得他們可以吸收水而形成w/o乳狀劑而仍然保持其半固體稠度，諸如無水羊毛脂及親水性凡士林。亦使用細碎的固體作為良好的乳化劑尤其是與表面活性劑組合而在黏稠製劑中使用。這些包含極性無機固體，諸如重金屬氫氧化物、非膨脹黏土諸如皂土、綠坡縷土、水輝石、高嶺土、蒙脫土、膠狀矽酸鋁及膠狀矽酸鎂鋁、色素及無極性固體諸如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳狀劑製劑亦包含多種非乳化材料並且有助於乳狀劑的特性。這些包含脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水性膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水性膠體或水膠體包含天然存在的膠及 合成的聚合物諸如多醣(例如，阿拉伯膠、洋菜、海藻酸、卡拉膠、瓜爾膠、加拉亞膠及黃蓍膠)、纖維素衍生物類(例如，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)及合成的聚合物(例如，卡波姆膠(carbomers)、纖維素醚及羰基乙烯基聚合物)。這些在水中分散或膨脹而形成膠狀溶液而經由在分散相的小滴周圍形成強力界面膜及經由增加外相的黏稠度而穩定乳狀劑。
因為乳狀劑往往含有許多可容易地支持微生物生長的成分諸如碳水化合物、蛋白質、類固醇及磷脂，這些製劑往往含有防腐劑。乳狀劑製劑所包含的普通用防腐劑包含對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、四級銨鹽、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、對羥基苯甲酸酯及硼酸。普通乳狀劑製劑亦添加抗氧化劑而防止製劑變質。使用的抗氧化劑可以是自由基清除劑諸如生育酚、沒食子酸烷酯、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯，或還原劑諸如抗壞血酸及偏亞硫酸氫鈉，及抗氧化劑增效劑諸如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂。
透過皮膚、口服及腸外途徑的乳狀劑應用及其製造方法已在文獻中評論(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。因 為容易配製以及在吸收及生物可利用率方面之效能的觀點，很廣泛地使用口服遞送的乳狀劑製劑(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker (Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y., volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油基緩瀉劑、油溶性維生素及高脂肪營養製劑為普遍作為o/w乳狀劑而經口服給藥的物質。
ii.微滴乳狀劑
本發明的具體例中，將iRNAs及核酸組成物配製成微滴乳狀劑。微滴乳狀劑可定義為水、油及兩性物的體系，其為單一光學等向性及熱力學穩定的液體溶液(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。一般微滴乳狀劑為經由下列方法而製備的體系：首先將由分散至水性表面活性劑溶液，然後添加 足量的第四成分，通常為中等鏈長的醇，而形成透明體系。因此，微滴乳狀劑亦被描述為經由表面活性分子的界面膜穩定化之二不混溶液體的熱力學穩定、等向性地澄清的分散液(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。普通經由組合3至5種包含油、水、表面活性劑、輔物表面活性劑及電解液的成分而製備微滴乳狀劑。微滴乳狀劑是否為油包水(w/o)或水包油(o/w)類型取決於所使用的油及表面活性劑的性質及取決於表面活性劑分子的極性頭及烴類尾的結構及幾何包裝(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
已廣泛地研究利用相圖的現象學方法，而產生給予所屬領域熟練技術人員如何配置微滴乳狀劑的全面知識(參見如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳狀劑比較，微滴乳狀劑提供將不溶於水的藥物溶解於自發形成熱力學穩定小滴的製劑中之優點。
製備微滴乳狀劑所使用的表面活性劑包含，但不限於，單獨或與輔表面活性劑組合的離子性表面活性劑、非離子性表面活性劑、Brij 96、聚氧伸乙基油基醚、聚脂肪酸甘油酯、單月桂酸四甘油酯(ML310)、單油酸四甘油酯(MO310)、單油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、單癸酸十甘油酯(MCA750)、單油酸十甘油酯(MO750)、一倍半油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)。輔表面活性劑，經常為短鏈醇諸如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，其作用為經由滲透入表面活性劑膜層，因為在表面活性劑分子間產生的空隙空間從而產生無序膜，而增加界面流動性。然而，可不使用輔物表面活性劑而製備微滴乳狀劑且所屬領域習知無醇自乳化微滴乳狀劑體系。水相通常可以是，但不限於，水、藥物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇，及乙二醇的衍生物。油相包含，但不限於，物質諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中等鏈(C8-C12)的單、二及三甘油酯、聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、飽和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
從藥物溶解及藥物的加強吸收觀點來看，微滴乳狀劑特別令人感興趣。已提出脂肪系微滴乳狀劑(o/w及w/o兩者)用於加強包含肽之藥物的口服生物可利用性(參見如，美國專利案號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin. Pharmacol.,1993,13,205)。微滴乳狀劑提供下列優點：改善藥物溶解性、保護藥物不受酶水解、由於表面活性劑誘發的膜流動性及滲透性的改變而加強藥物吸收、容易製備、容易以固體劑型口服給藥、改善臨床效能及減低毒性(參見如，美國專利案號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常在環境溫度下當微滴乳狀劑的成分混在一起時就可自然形成微滴乳狀劑。在配製熱不穩定藥物、肽或iRNAs時，這個特別有益。在化妝品及藥物應用上微滴乳狀劑也有效地用於經皮遞送活性成分。預期本發明微滴乳狀劑組成物及製劑將助長增加iRNAs及核酸從胃腸道的全身吸收，以及改善iRNAs及核酸的局部細胞攝取。
本發明微滴乳狀劑亦可含有另外的成分及添加物諸如去水山梨醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol及滲透加強劑，而改善製劑的性質及加強本發明iRNAs及核酸的吸收。本發明微滴乳狀劑使用的滲透加強劑可歸類為五大類之一：表面活性劑、脂肪酸、膽鹽、鉗合劑及非鉗合非表面活性劑(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。已在上文討論過這些各類型。
iii.微粒
本發明RNAi藥劑可納入顆粒中，如，微粒。可經由 噴霧乾燥製造微粒，但亦可經由其他方法包含冷凍乾燥、蒸發、流體床乾燥、真空乾燥或這些技術的組合而製造。
iv.滲透加強劑
在具體例中，本發明採用各種滲透加強劑使產生核酸，特別是iRNAs，至動物皮膚的有效遞送。大多數藥物以離子化及非離子化的形態存在於溶液中。然而，經常只有脂溶性或親脂性藥物容易通過細胞膜。已發現如果用滲透加強劑處理欲通過的膜，甚至非親脂性藥物也可通過細胞膜。除了幫助非親脂性藥物擴散通過細胞膜外，滲透加強劑亦加強親脂性藥物的可滲透性。
滲透加強劑可歸類為五大類之一，即，表面活性劑、脂肪酸、膽鹽、鉗合劑及非鉗合非表面活性劑(參見如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。以下更詳細說明各上述類型的滲透加強劑。
表面活性劑(或"表面活性試劑")為化學實體，當溶於水溶液時，降低溶液的表面張力或水溶液與另一液體間的界面張力，結果加強iRNAs透過黏膜的吸收。除了膽鹽及脂肪酸外，這些滲透加強劑包含，例如，十二烷基硫酸鈉、聚氧伸乙基-9-月桂基醚及聚氧伸乙基-20-十六基醚(參見如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；及全氟化合物乳狀劑，諸如FC-43(Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
各種充當滲透加強劑的脂肪酸及其衍生物包含，例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油酸甘油酯(1-單油基-外消旋-甘油)、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉毒鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(如，甲基、異丙基及第三丁基)及其單-及二甘油酯(即，油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞麻油酸酯等)(參見如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁的生理作用包含助長脂肪及脂溶性維生素的分散及吸收(參見如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各種天然膽鹽，及其合成的衍生物充當為滲透加強劑。因此術語" 膽鹽"包含任何天然存在的膽汁成分以及任何其合成的衍生物。適合的膽鹽包含，例如，膽酸(或藥學上可接受的鈉鹽、膽酸鈉)、去氫膽酸(去氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸鈉)、葡糖膽酸(葡糖膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸鈉)、甘胺去氧膽酸(甘胺去氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氫-褐黴酸鈉(STDHF)、甘胺二氫褐黴酸鈉及聚氧伸乙基-9-月桂基醚(POE)(參見如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee etal.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Chapter 39 In：Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
所使用與本發明有關的鉗合劑可定義為與金屬離子形成複合體而將金屬離子從溶液移除的化合物，結果是加強iRNAs透過黏膜的吸收。關於在本發明中使用作為滲透加強劑，鉗合劑具有也充當DNase抑制劑的附加優點，因為多數DNA核酸酶的特徵為需要二價金屬離子用於催化及因此被鉗合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。適合的鉗合劑包含但不限於乙二胺四乙酸 二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(如，水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸酯及高香草酸酯)、膠原蛋白的N-醯基衍生物、月桂醇聚醚-9及β-二酮的N-胺基醯基衍生物(烯胺)(參見如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文所使用，非鉗合非表面活性劑滲透加強化合物可定義為雖然展示不顯著的鉗合劑或表面活性劑的活性但仍可加強iRNAs經由消化道黏膜之吸收的化合物(參見如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這類的滲透加強劑包含，例如，不飽和環脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；及非類固醇消炎藥劑諸如雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、吲哚美辛(indomethacin)及苯丁唑酮(phenylbutazone)(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
加強iRNAs在細胞級別上的細胞攝取之試劑亦可添加到本發明醫藥及其他組成物中。例如，已知陽離子脂質諸如轉化脂(lipofectin)(Junichi et al,U.S.Pat.No.5,705,188)、陽離子甘油衍生物及聚陽離子分子諸如聚離胺 酸(Lollo et al.,PCT Application WO 97/30731)，亦加強dsRNAs的細胞攝取。市售轉染試劑的實例包含，例如LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、Lipofectamine 2000TM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、293fectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、CellfectinTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、DMRIE-CTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、FreeStyleTM MAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM 2000 CD(Invitrogen；Carlsbad,CA)、LipofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OligofectamineTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、OptifectTM(Invitrogen；Carlsbad,CA)、X-tremeGENE Q2轉染試劑(Roche；Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOTAP脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)、DOSPER脂質體轉染試劑(Grenzacherstrasse,Switzerland)或Fugene(Grenzacherstrasse,Switzerland)、Transfectam®試劑(Promega；Madison,WI)、TransFastTM轉染試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-20試劑(Promega；Madison,WI)、TfxTM-50試劑(Promega；Madison,WI)、DreamFectTM(OZ Biosciences；Marseille,France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille,France)、TransPass a D1轉染試劑(New England Biolabs；Ipswich,MA,USA)、LyoVecTM/LipoGenTM(Invitrogen；San Diego,CA,USA)、PerFectin轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、NeuroPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、GenePORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA, USA)、GenePORTER 2轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、Cytofectin轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、BaculoPORTER轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、TroganPORTERTM轉染試劑(Genlantis；San Diego,CA,USA)、RiboFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、PlasFect(Bioline；Taunton,MA,USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)、SureFECTOR(B-Bridge International；Mountain View,CA,USA)或HiFectTM(B-Bridge International,Mountain View,CA,USA)等。
可利用於加強核酸給藥之滲透性的藥劑，包含甘油類諸如乙二醇及丙二醇、吡咯類諸如2-吡咯、月桂氮酮類及萜類諸如苧烯及薄荷酮。
v.載劑
本發明某些組成物亦在製劑中併入載劑化合物。如本文所使用，"載劑化合物"或"載劑"可意指核酸或其類似物，其為惰性(即，本身不具有生物活性)但是在體內過程中被識別為核酸，而例如，經由降解生物活性核酸或促進其從循環中移除，而降低具有生物活性之核酸的生物可利用性。核酸及載劑化合物的共同給藥，通常過量的後者可導致肝、腎或其他外循環器官(extracirculatory reservoirs)中回收的核酸量大量降低，可能是由於載劑化合物與核酸之間對於普通受體的競爭。例如，與聚肌苷酸、葡聚糖硫酸酯、聚胞苷酸或4-乙醯胺基-4'異硫氰基-芪-2,2'-二磺酸 共同給藥時，可降低肝組織中部分硫代磷酸酯dsRNA之回收(Miyao et al.,DsRNA Res.Dev.,1995,5,115-121；Takakura et al.,DsRNA & Nucl.Acid Drug Dev.,1996,6,177-183)。
vi.賦形劑
與載劑化合物相反的，"藥物載劑"或"賦形劑"為用於遞送一個或多個核酸給動物之藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任何藥理學上惰性的載劑。賦形劑可以是液體或固體，在與核酸或其他指定醫藥組成物的成分組合時，根據計畫的給藥方式而選擇，以使提供所需容積及稠度。通常藥物載劑包含，但不限於，黏合劑(如，預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填料(如，乳糖及其他糖類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)；潤滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石、二氧化矽、膠態二氧化矽、硬脂酸、硬脂酸金屬鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇類、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(如，澱粉、澱粉羥乙酸鈉等)；及潤濕劑(如，十二烷基硫酸鈉等)。
亦可使用適合於非腸外給藥，與核酸無有害反應之藥學上可接受的有機或無機賦形劑來配製本發明組成物。適合的藥學上可接受的載劑包含，但不限於，水、鹽溶液、醇類、聚乙二醇類、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
核酸的局部給藥製劑可包含無菌的或非無菌的水溶液、常用溶劑諸如醇類中的非水溶液或核酸在液體或固體油基中的溶液。溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他適合的添加物。可使用適合於非腸外給藥，與核酸無有害反應之藥學上可接受的有機或無機賦形劑。
適合的藥學上可接受的賦形劑包含，但不限於，水、鹽溶液、醇、聚乙二醇類、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他成分
本發明組成物可另外含有以在所屬領域建立的使用量之其他在醫藥組成物中常見的輔助成分。因此，例如，組成物可含有另外的、相容的藥學活性物質諸如，例如，止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可含有適用於物理配製本發明組成物之各種劑型的另外物質，諸如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、乳白劑、增稠劑及穩定劑。然而，添加此類物質時，不應該過度干擾本發明組成物成分的生物活性。可將製劑滅菌及，如需要，與製劑之核酸無有害反應的輔助劑，如，潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳香物質等混合。
水懸浮液可含有增加懸浮液黏稠度的物質包含，例如，羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或葡聚糖。懸浮 液亦可含有穩定劑。
在一些具體例中，本文表徵的醫藥組成物包含(a)一種或多種iRNA化合物及(b)一種或多種功能為非RNAi代謝且適用於治療脂肪代謝障礙的藥劑。此類藥劑的實例包含，但不限於消炎劑、抗脂肪變性劑、抗病毒劑及/或抗纖維化劑。此外，常見使用於保護肝臟的其他物質，諸如水飛薊素(silymarin)，亦可與本文所述iRNAs聯合使用。其他適用於治療肝疾病的藥劑包含替比夫定(telbivudine)、恩替卡韋(entecavir)及蛋白酶抑制劑諸如替拉瑞韋(telaprevir)及其他，例如，在Tung et al.,美國專利公開號2005/0148548、2004/0167116及2003/0144217中；及在Hale et al.,美國專利公開號2004/0127488中揭露者。
可經由標準藥學程序在細胞中或實驗動物中測定這類化合物的毒性及治療效能，如，測定LD50(群體中50%致死的劑量)及ED50(群體中有效治療50%的劑量)。毒性及治療效能間的劑量比值為治療指數及可表示為LD50/ED50比。展現高治療指數的化合物為較佳。
可使用從細胞培養檢測及動物研究得到的數據來配製用在人類的劑量範圍。本發明在本文中表徵的組成物之劑量通常在包含小量或無毒性ED50之循環濃度範圍內。劑量可取決於採用的劑型及使用的給藥途徑而在此範圍內變化。對於本發明表徵的方法所使用的任何化合物，可從細胞培養檢測初步估計治療有效劑量。可在動物模型中配製劑量而得到該化合物的循環血漿濃度範圍或， 適當時，目標序列之多肽產物的循環血漿濃度範圍(如，達到多肽濃度降低)，包含在細胞培養中測定IC50(即，達到半最大症狀抑制之化合物濃度)。可使用這類資訊更精確地測定適用於人類的劑量。例如，可用高效液相層析法測量血漿中的值。
除了上述討論的給藥外，本發明表徵的iRNAs可與其他對治療ANGPTL3表現所介導的病理過程有效的習知藥劑組合給藥。在任何情況下，給藥的醫師可基於使用所屬領域習知或本文所述的效能標準測量所觀察到的結果而調整iRNA給藥的量及時間。
VI.本發明的方法
本發明亦提供使用本發明iRNA及/或含有本發明iRNA的組成物來降低及/或抑制細胞中ANGPTL3表現的方法。該方法包含使細胞與dsRNA接觸並維持細胞一段充分時間而得到ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的降解，因此抑制細胞中ANGPTL3基因表現。可經由所屬領域習知的任何方法評估基因表現的降低。例如，可使用下列方法測定ANGPTL3表現的降低：使用對於一般所屬領域熟練技術人員而言常規的方法，如，北方墨點法、qRT-PCR，來測定ANGPTL3之mRNA表現程度；使用對於一般所屬領域熟練技術人員而言常規的方法，諸如西方墨點法、免疫技術，來測定ANGPTL3的蛋白值。亦可間接測量ANGPTL3的生物活性的減低，如，血清脂質、三酸甘油酯、膽固醇 及/或游離脂肪酸值的減低，而評估ANGPTL3表現的降低。
本發明的方法中可在體外或體內與細胞接觸，即，細胞可以是在個體體內。
適合於使用本發明的方法治療的細胞可以是任何表現ANGPTL3基因的細胞。適合在本發明的方法中使用的細胞可以是哺乳動物細胞，如，靈長類細胞(諸如人類細胞或非人類靈長類細胞，如，猴細胞或黑猩猩細胞)、非靈長類細胞(諸如牛細胞、豬細胞、駱駝細胞、美洲駝羊細胞、馬細胞、山羊細胞、兔細胞、綿羊細胞、倉鼠細胞、天竺鼠細胞、貓細胞、狗細胞、大鼠細胞、小鼠細胞、獅細胞、虎細胞、熊細胞、或水牛細胞)、鳥細胞(如，鴨細胞或鵝細胞)或鯨細胞。在具體例中，該細胞為人類細胞，如，人類肝細胞。
在細胞中ANGPTL3表現被抑制至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或約100%。較佳的具體例中，至少抑制20%的ANGPTL3表現。
本發明的體內方法可包含將含有iRNA的組 成物給予個體，其中該iRNA包含與有待治療的哺乳動物ANGPTL3基因之RNA轉錄本的至少一部分互補的核苷酸序列。有待治療的生物體為哺乳動物諸如人類時，可經由所屬領域習知的任何方式給予組成物，這些方式包含，但不限於口服、腹膜內，或腸外途徑，包含顱內(如，心室內、腦實質內及鞘內)、靜脈、肌肉內、皮下、經皮、氣道(噴霧劑)、鼻、直腸及局部(包含口腔及舌下)給藥。在某些具體例中，經由靜脈輸注或注射給予組成物。在某些具體例中，經由皮下注射給予組成物。
在一些具體例中，經由長效注射而給藥。長效注射可以持續方式在一段延長的時間期間釋放iRNA。因此，長效注射可降低得到所需效果而需要的給藥頻率，所需效果如，所需的ANGPTL3抑制或治療或預防的效果。長效注射亦可提供更連續的血清濃度。長效注射可包含皮下注射或肌肉內注射。較佳的具體例中，長效注射為皮下注射。
在一些具體例中，經由幫浦給藥。幫浦可以是外部幫浦或手術植入的幫浦。在某些具體例中，幫浦為皮下植入的滲透幫浦。在其他具體例中，幫浦為輸注幫浦。輸注幫浦可用於靜脈、皮下、動脈或硬膜外輸注。較佳的具體例中，輸注幫浦為皮下輸注幫浦。在其他具體例中，幫浦為遞送iRNA到肝臟的手術植入幫浦。
給藥的模式取決於所需要的是局部還是全身治療及取決於有待治療的區域。可選擇給藥的途徑及部 位而加強靶向。
在一方面，本發明亦提供抑制哺乳動物ANGPTL3基因表現的方法。該方法包含給予哺乳動物包括靶向哺乳動物細胞中ANGPTL3基因之dsRNA的組成物且維持哺乳動物細胞一段充分時間而得到ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的降解，因此抑制細胞中ANGPTL3基因表現。可經由所屬領域習知的任何方法及經由，如，本文所述qRT-PCR，而評估基因表現的降低。可經由所屬領域習知的任何方法及經由，如，本文所述ELISA，而評估蛋白質生產的降低。在具體例中，穿刺肝臟生檢充當組織物質用於監測ANGPTL3基因及/或蛋白質表現的降低。
本發明進一步提供治療的方法給需要的個體。本發明的治療方法包含以治療上有效量的靶向ANGPTL3基因的iRNA或包括靶向ANGPTL3基因之iRNA的醫藥組成物而將本發明iRNA給予個體，如，可從ANGPL3表現的降低及/或抑制而受益的個體。
本發明iRNA可以"游離iRNA"而給藥。游離iRNA在醫藥組成物不存在下給藥。裸iRNA可在適合的緩衝溶液中。緩衝溶液可包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽，或其任何組合。具體例中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。可以調整含有iRNA的緩衝溶液的pH及滲透濃度以使其適合給予個體。
替代地，本發明iRNA可作為醫藥組成物而給予，諸如dsRNA脂質體製劑。
可從ANGPL3基因表現的降低及/或抑制而受益的個體為具有脂肪代謝障礙者，如，遺傳性脂肪代謝障礙或後天性或脂肪代謝障礙。在具體例中，具有脂肪代謝障礙的個體具有高血脂症。另一個具體例中，具有脂肪代謝障礙的個體具有高三酸甘油酯血症。治療可從ANGPL3基因表現的降低及/或抑制而受益的個體包含治療性處理(如，具有疹黃瘤的個體)及預防性處理(如，不具疹黃瘤的個體或可能發展成疹黃瘤風險的個體)。
本發明進一步提供使用iRNA或其醫藥組成物的方法，如，用於治療可從ANGPL3表現的降低及/或抑制而受益的個體，如，具有脂肪代謝障礙的個體，將此方法與其他藥物及/或其他治療方法，如，已知藥物及/或已知治療方法，諸如，例如，目前採用於治療這些疾病的藥物及/或治療方法組合。例如，在某些具體例中，將靶向ANGPTL3的iRNA與，如，適用於治療脂肪代謝障礙的藥劑組合而給藥，如本文中他處所述。例如，適用於治療可從ANGPL3表現的降低而受益的個體，如，具有脂肪代謝障礙的個體，的另外藥劑可包含降低一種或多種血清脂質的藥劑。此種藥劑的非限制性實例包含膽固醇合成的抑制劑，諸如HMG-CoA還原酶抑制劑，如，他汀類。他汀類可包含阿托伐他汀(atrovastatin)(Lipitor)、氟伐地汀(fluvastatin)(Lescol)、洛伐他汀(lovastatin)(Mevacor)、洛伐他汀緩釋劑(Altoprev)、匹伐他汀(pitavastatin)(Livalo)、普伐他汀(pravastatin)(Pravachol)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin) (Crestor)及辛伐他汀(simvastatin)(Zocor)。其他適用於治療脂肪代謝障礙的藥劑可包含膽汁多價鉗合劑，諸如銷膽胺及其他樹脂；VLDL分泌抑制劑，諸如菸鹼酸；親脂性抗氧化劑，諸如普羅布考(Probucol)；醯基輔酶A膽固醇醯基轉移酶抑制劑；類法尼醇X受體拮抗劑；固醇調節結合蛋白裂解活化蛋白(SCAP)活化劑；微粒體三酸甘油酯轉移蛋白(MTP)抑制劑；ApoE-相關肽；及抗ANGPTL3治療抗體。另外的治療藥劑亦可包含提升高密度脂蛋白(HDL)的藥劑，諸如膽固醇酯轉移蛋白(CETP)抑制劑。再者，另外的治療藥劑亦可包含膳食補充劑，如，魚油。可在相同時間及/或在相同組合中給予iRNA及另外的治療藥劑，如，腸外地，或另外的治療藥劑可作為單獨組成物的部分或在單獨的時間及/或經由所屬領域習知或本文所述的另一種方法而給予。
在具體例中，該方法包含給予本文表徵的組成物以致減少目標ANGPTL3基因表現持續約，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24小時、28、32或約36小時。具體例中，降低目標AGPTL3基因的表現達一段持續時間，如，至少約兩、三、四天或更久，如，約1星期、2星期、3星期或4星期或更久。
較佳地，適用於本文表徵的方法及組成物的iRNAs特定地靶向目標ANGPTL3基因的RNAs(初級的或加工的)。可如本文所述製備及進行使用iRNAs而抑制這些基因表現的組成物及方法。
根據本發明方法的dsRNA給藥可導致有脂肪代謝障礙的患者之此類疾病或障礙的嚴重性、徵象、症狀及/或標記的降低。在上下文中“降低”意指此類之值在統計學上的顯著減少。該降低可以是，例如，至少約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或約100%。
疾病的治療或預防的效果是可以評估的，例如經由測量疾病進展、病情緩解、症狀的嚴重性、疼痛減少、生活的品質、持續治療效果所需藥物的劑量、疾病標記的級別或適合於正在治療或靶向預防的指定疾病的任何其他可測量的參數。經由測量任何此類參數之一或參數的任何組合而監測治療及或預防的效能，這是在所屬領域熟練技術人員的能力範圍內。例如，可經由，例如，週期性監測一種或多種血清脂質值，而評估治療脂肪代謝障礙的效能。後來讀數與初始讀數的比較提供醫師治療是否有效的指示。經由測量任何此類參數之一或參數的任何組合而監測治療及或預防的效能，這是在所屬領域熟練技術人員的能力範圍內。與給藥靶向ANGPTL3的iRNA或其醫藥組成物有關，"有效抵抗"脂肪代謝障礙指明以臨床上適當的方式給藥致使對至少統計學上顯著部分的患者產生有益效果，諸如改善症狀、治癒、減少疾病、延長壽命、改善生活品質或經由熟悉治療脂肪代謝障礙及相關原因的醫師通常認可為積極的效果。
在疾病狀態的一個或多個參數中有統計學 上顯著的改善，或經由不能惡化或發展症狀否則該症狀可被預期時，則治療或預防效果是明顯的。作為實例，在可測量的疾病參數中至少10%為有利改變，及較佳為至少20%、30%、40%、50%或更多，則可指明為有效治療。可使用所屬領域習知用於指定疾病的動物模型來評斷指定iRNA藥物或該藥物之製劑的效能。使用實驗動物模型時，觀察到在統計學上顯著的標記或症狀降低，則治療效能是明顯的。
替代地，可基於臨床上接受的疾病嚴重性分級量表，如實例Child-Pugh評分(有時稱為Child-Turcotte-Pugh評分)，經由診斷領域熟練技術人員測定的疾病嚴重性的降低而測量該效能。任何積極的改變導致如，使用適當的量表而測量到的疾病嚴重性的降低，則表示使用如本文所述的iRNA或iRNA製劑的足夠治療。
可給予個體治療量的dsRNA，諸如約0.01mg/kg至約50mg/kg。通常，本發明iRNA的適合劑量將在約0.1mg/kg至約5.0mg/kg的範圍內，較佳約0.3mg/kg及約3.0mg/kg。
可在常規基礎上，經由靜脈輸注一段時間來給予iRNA。在某些具體例中，於初始治療方案後，該治療可按較低頻率的基礎而給藥。給藥iRNA可降低ANGPTL3值，如，患者的細胞、組織、血液、尿或其他區室中的ANGPTL3值至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或至少約99或更多。較佳的具體例中，給藥iRNA可降低ANGPTL3值，如，患者的細胞、組織、血液、尿或其他區室中的ANGPTL3值至少20%。
在給藥全劑量的iRNA前，可先給予患者較小劑量，諸如5%輸注反應，並監測不良作用，諸如過敏反應。另一個實例中，可監測患者的不想要的免疫刺激作用，諸如增加的細胞介素(如，TNF-α或INF-α)值。
替代地，可皮下地給予iRNA，即，經由皮下注射。可使用一次或多次注射來遞送所需每日劑量的iRNA給個體。可在一段時間內重複注射。可在常規基礎上重複給藥。在某些具體例中，於初始治療方案後，該治療可按較低頻率的基礎而給藥。重複劑量方案可包含在常規基礎上給藥治療量的iRNA，諸如每隔一天或1年1次。在某些具體例中，約每月1次至約每季1次(即，約每3個月1次)給藥iRNA。
除非另有說明，本文使用的所有技術的及科學的術語具有與本發明所屬領域一般熟練技術人員所瞭解的有相同的意義。雖然可將與本文所述的相似或等同的方法或材料使用於本發明表徵的iRNAs及方法的實踐及試 驗中，在下文仍說明適合的方法及材料。本文提及的所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻均藉由引用全部併入本文中。在有衝突的情況，本說明書，包含定義，將為主導。此外，材料、方法及實例僅為說明性而非旨在限制。
[實施例] 實施例1. iRNA的設計、合成、選擇及體外評估
此實施例說明設計、合成、選擇及體外評估ANGPTL3 iRNA藥劑的方法(亦參見，PCT出版物，WO 2012/177784，其全部內容均藉由引用併入本文中)。
試劑的來源
當本文沒有具體給出試劑來源時，可從任何分子生物學試劑供應商獲得符合分子生物學應用之質量及純度標準的此類試劑。
使用定制的R及Python方案設計靶向人類ANGPTL3，"類血管生成素3"(人類：NCBI refseqID NM_014995；NCBI GeneID：27329)，以及毒理學物種ANGPTL3異種同源物(石蟹獼猴：XM_005543185；小鼠：NM_013913；大鼠：NM_001025065)的一組siRNAs。人類ANGPTL3 REFSEQ mRNA具有2951鹼基長度。該組siRNA設計的理論基礎及方法如下：用線性模型來測定從位置81到位置2951(編碼區域及3'UTR)每個潛在19mer siRNA的預測效能，該線性 模型從超過20,000靶向大量脊椎動物基因的區別siRNA設計衍生mRNA減弱的直接測量。以人類、石蟹獼猴及恒河猴之間的完美或近乎完美的匹配設計ANGPTL3 siRNAs的子集。以對小鼠及大鼠ANGPTL3異種同源物的完美或近乎完美的匹配設計另一個子集。對於siRNA的各股，以蠻力搜索使用定制Python方案而測量目標物種轉錄組中在siRNA及所有潛在比對之間誤配的數目及位置。將額外的加權給予種子區域中的誤配，此處定義為反義寡核苷酸的位置2-9，還有siRNA的裂解位點，此處定義為反義寡核苷酸的位置10-11。種子誤配、裂解位點及通過反義位置19的其他位置的誤配相對加權為2.8：1.2：1。忽略第一位置的誤配。經由總計各加權誤配值而計算各股的特異性評分。優先權是給在人類及石蟹獼猴中其反義評分為>=3.0及預測效能為>=70%ANPTL3轉錄本之敲滅的siRNAs。
ANGPTL3序列的合成合成 ANGPTL3單股及雙鏈體的合成
在Mermade 192合成儀上(BioAutomation)使用固體支持物介導的亞磷醯胺化學以1umol的規模合成ANGPTL3 siRNA序列。固體支持物為裝載定制GalNAc配體或通用固體支持物的可控多孔玻璃(500°A)(AM biochemical)。從Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)及Hongene(China)獲得輔助合成試劑、2'-F及2'-O-甲基RNA及去氧亞磷醯胺。使用相應亞磷醯胺將2'F、2'-O-甲基、RNA、 DNA及其他修飾核苷引入序列中。在GalNAc修飾的CPG支持物上進行3'GalNAc接合單股的合成。使用定制CPG通用固體支持物合成反義單股。採用5-乙硫基-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)的所有亞磷醯胺(100mM乙腈溶液)的偶合時間為5分鐘。使用3-((二甲基胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，得自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))的50mM無水乙腈/吡啶(1：1 v/v)溶液而產生硫代磷酸酯鍵結。氧化時間為3分鐘。經由最後的DMT基團("DMT off")的移除而合成所有序列。
固相合成一完成時，在密封的96深孔盤中使用200μL甲胺水溶液試劑於60℃經20分鐘而將單股從固體支持物裂解及去保護。對於含有2'ribo殘基(2'-OH)，用第三丁基二甲基矽基(TBDMS)保護的序列，在第二步驟使用TEA.3HF試劑進行去保護。在甲胺去保護溶液中添加200uL二甲基亞碸(DMSO)及300ul TEA.3HF試劑並將該溶液在60℃追加培養20分鐘。裂解及去保護步驟終止後，使合成盤回到室溫並經由添加1mL的乙腈：乙醇混合物(9：1)而沉澱。將孔盤在-80℃冷卻2hrs並借助多通道吸量管而小心地倒出上清液。將寡核苷酸團塊再懸浮於20mM NaOAc緩衝液並在裝備有A905自動進樣器及Frac 950分液收集器的AKTA Purifier System上使用5mL HiTrap粒徑篩析管柱(GE Healthcare)而進行脫鹽。在96孔盤中收集脫鹽樣本。來自各序列的樣本經由LC-MS分析而確認一致性，用UV(260nm)定量且選擇的樣本集經由IEX層析法而 測定純度。
在Tecan液體處理自動機器上進行ANGPTL3單股的低溫黏合(annealing)。組合有義及反義單股的等莫耳混合物並在96孔盤中低溫黏合。組合互補的單股後，密封96孔盤並在100℃烘箱中加熱10分鐘並以2至3小時的時間使其緩慢降至室溫。各雙鏈體濃度在1X PBS中標準化至10uM，然後進行體外篩選檢測。
實施例2. 導聯選擇與評估
基於各種體外及體內分析的結果(參見，PCT公開案，WO 2012/177784，其全部內容均藉由引用併入本文中)，而選擇AD-52981母序列(有義序列：ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU(SEQ ID NO：20)；反義序列：AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG(SEQ ID NO：21))進行修飾及進一步的體內評估。
因此，使用AD-52981母序列，如上述而合成AD-57927(有義序列：AfscsAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96(SEQ ID NO：70)；反義序列：asAfsaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfususg(SEQ ID NO：71))。
經由皮下給予C57BL/6雌性小鼠單次30、10或3mg/kg劑量的AD-52981(有義序列：AfcAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUfL96(SEQ ID NO：72)；反義序列：aAfaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfusUfsg(SEQ ID NO：73))、AD-57927或PBS對照組而評估AD-57927的體內效果。給藥後72小時，處死動物並測定肝中的ANGPTL3 mRNA值。意外地，如第1圖所示，AD-57927("優化ANG-GalNAc")減低ANGPTL3 mRNA值比母iRNA藥劑，AD-52981("ANG-GalNAc")，超過約10倍。
亦使用多劑量方案評估AD-57927在體內抑止ANGPTL3蛋白表現及減低三酸甘油酯、LDL膽固醇及總膽固醇值的能力。在第一星期每天皮下給藥ob/ob雌性小鼠3mg/kg的AD-57927經5天，隨後在第2至4星期(qd x 5；qw x 6)以3mg/kg劑量每星期兩次給藥。動物在第0、4、8、11、15、18、22及25天時採血，並於第29天處死。經由ELISA測量ANPTL3蛋白質位準。使用Olympus血清分析儀測量三酸甘油酯、LDL膽固醇及總膽固醇。如第2圖所示，經由AD-57927的ANGPTL3蛋白最大減弱為99%。經由AD-57927而降低的最大三酸甘油酯位準為98%(第3圖)，經由AD-57927而降低的最大LDL為88%(第4圖)，及經由AD-57927而降低的最大總膽固醇為64%(第5圖)。所有第2至第5圖展示的為相對於給藥前數值的數據。
總結來說，證明AD-57927降低ANGPTL3 mRNA值超過母序列約10倍。亦證明AD-57927以劑量反應方式降低ANGPTL3(參見第1圖)，並且AD-57927的效能在多劑量給藥時進一步改善而導致在混合高血脂症的ob/ob小鼠模型中降低血清ANPTL3蛋白質大於95%。再者，以3mg/kg多劑量給藥AD-57927，經由ANGPLT3特定ELISA檢測，消除循環的血清ANGPLT3蛋白質，其導致高血脂症的ob/ob小鼠模型中>95%的TGs降低、>85%的LDL 膽固醇降低及>60%的總膽固醇降低。
實施例3. iRNA的設計、合成、選擇及體外評估
此實施例說明另外的ANGPTL3 iRNA藥劑之設計、合成、選擇及體外評估的方法。
體外篩選： 細胞培養及轉染：
經由胰蛋白酶消化而從盤中釋放前，使Hep3b細胞(ATCC,Manassas,VA)在37℃、5% CO2的氛圍下，在補充10% FBS(ATCC)的Eagle's Minimum Essential Medium(Gibco)中生長至接近融合。將每孔4.9μl的Opti-MEM加0.1μl的Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen,Carlsbad CA.cat # 13778-150)添加至384孔盤中個別孔的5μl各siRNA雙鏈體中。然後將混合物在室溫培養20分鐘。將40μl含5,000Hep3b細胞的完全生長培養基添加至siRNA混合物中。在RNA純化前將細胞培養24hrs。以10nM及0.1nM最終雙鏈體濃度進行單次劑量實驗。
使用DYNABEADS mRNA分離試劑盒分離總RNA(Invitrogen,part #：610-12)：
在每孔含有3μL磁珠的75μl溶解/結合緩衝液中溶解細胞並在靜電振盪機上混合10分鐘。使用磁性盤支持物在Biotek EL406上進行自動洗滌步驟。在緩衝液A中1次、 緩衝液B中1次及緩衝液E中2次洗滌磁珠(90μL)，其間有抽吸步驟。最終抽吸之後，如以下所述，將完整的10μL RT混合物添加至各孔。
使用ABI High capacity cDNA reverse transcription試劑盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)合成cDNA：
將每一反應1μl 10X緩衝液、0.4μl 25X dNTPs、1μl隨機引子、0.5μl逆轉錄酶、0.5μl的RNase抑制劑及6.6μl H2O的主混合物添加至各孔中。密封孔盤，在靜電振盪機搖動10分鐘，然後在37℃培養2小時。隨後，將孔盤在80℃搖動8分鐘。
實時PCR：
在384孔盤(Roche cat # 04887301001)的每孔中將2μl cDNA添加至含有0.5μl人類GAPDH TaqMan探針(4326317E)、0.5μl人類AngPTL3(Hs00205581_m1)、2μl無核酸酶的水及5μl Lightcycler 480探針主混合物(Roche Cat # 04887301001)的主混和物中。使用△△Ct(RQ)檢測法，在LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行實時PCR。除非總結表中另有指示，各雙鏈體至少以兩次獨立轉染測試。
為了計算相對倍數變化，使用△△Ct方法分析實時數據並針對用10nM非特異性siRN轉染的細胞或 模擬轉染的細胞進行的檢測而標準化。
測試含有基於有義序列5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3'(SEQ ID NO：20)及反義序列5'-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3'(SEQ ID NO：21)之各種不同化學修飾的一系列ANGPLT3 iRNAs。表2A及2B顯示序列的化學修飾示。表3顯示檢測的結果。
如上述合成靶向ANGPTL3基因的另外iRNA藥劑。表4A、4B、7A及7B顯示另外的修飾ANGPTL3有義及反義股序列的詳細列表，及表5及7C顯示未修飾ANGPTL3有義及反義股序列的詳細列表。
實施例4. 野生型小鼠的體內ANGPTL3沉默
在野生型(C57BL/6)小鼠中評估上述另外藥劑之子集的體內效能及持續時間。皮下給予6至8週齡雌性小鼠單次3mg/kg劑量的該藥劑並測定給藥前、第0天及給藥後第4、10、17、27、38及52天的動物血清中的小鼠ANGPTL3位準。這些檢測使用每組3隻小鼠。使用ELISA檢測，R&D系統小鼠類血管生成素3 Quantikine ELISA試劑盒(目錄號碼MANL30)化驗ANGPTL3位準。
第6A及第6B圖提供這些檢測的結果。如第6A圖所示，所有藥劑有效且持久地抑制ANGPTL3表現並在給藥後約第4天達到最低點。如第6B圖所示，在給藥後第10天，與其他檢測的藥劑比較，給予AD-63174及AD-63175之動物的ANGPTL3位準最低。
亦在野生型(C57BL/6)小鼠中評估上述另外藥劑的第二子集。皮下給予6至8週齡雌性小鼠單次1mg/kg劑量或單次3mg/kg劑量的該藥劑並測定給藥前、第0天及給藥後第5、14、21、28及42天的動物血清中的小鼠ANGPTL3位準。(對於給予AD-65695的動物組，由於相較於其他測試藥劑的反應，此藥劑增加反應的持續時間，亦測定給予AD-65695在給藥後第55天的動物血清中的小鼠ANGPTL3位準)。這些檢測使用每組3隻小鼠。如上述，使用ELISA檢測化驗ANGPTL3位準。
第7A及第7B圖提供這些檢測的結果並證明所有藥劑有效且持久地抑制ANGPTL3表現並在給藥後 約第5天達到最低點(第7A圖)及，相對於其他測試藥劑，給予AD-65695的動物在1mg/kg及3mg/kg劑量具有最低ANGPTL3位準(第7B圖)。
實施例5. Ob/Ob小鼠的體內ANGPTL3沉默
在ob/ob小鼠中評估上述另外藥劑之子集的體內效能及持續時間。皮下給予6至8週齡雌性ob/ob小鼠單次3mg/kg劑量的該藥劑並測定給藥前、第0天及給藥後第5、13、24、及38天的動物血清中的小鼠ANGPTL3位準。這些檢測使用每組4隻小鼠。如上述，使用ELISA檢測化驗ANGPTL3位準。
第8A及第8B圖提供這些檢測的結果並證明所有藥劑有效且持久地抑制ANGPTL3表現並在給藥後約第5天達到最低點(第8A圖)及，相對於其他檢測的藥劑，給予AD-63175或AD65695的動物在3mg/kg劑量具有最高ANGPTL3位準沉默(第8B圖)。
經由皮下給予動物0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg或9mg/kg的單次劑量而檢測ob/ob小鼠中AD-65695的劑量反應，並測定給藥前及給藥後第5及13天的動物血清中的小鼠ANGPTL3位準。如上述，使用ELISA檢測化驗ANGPTL3位準，亦使用Olympus分析儀測量血清中三酸甘油酯(TGs)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLc)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLc)及總膽固醇(TC)的位準。
第9圖證明第5天時，在給予0.3mg/kg劑 量的AD-65695之動物的血清中有58%的ANGPTL3蛋白質沉默，在給予1mg/kg劑量的AD-65695之動物的血清中有82%的ANGPTL3蛋白質沉默，在給予3mg/kg劑量的AD-65695之動物的血清中有98%的ANGPTL3蛋白質沉默，及在給予9mg/kg劑量的AD-65695之動物的血清中有99%的ANGPTL3蛋白質沉默。
第10A圖顯示給藥PBS對照組或AD-65695之後ob/ob小鼠中的TGs位準；第10B圖顯示給藥PBS對照組或AD-65695之後ob/ob小鼠中量得的TC位準；第10C圖顯示給藥PBS對照組或AD-65695之後ob/ob小鼠中的LDLc位準；及第10D圖顯示給藥PBS對照組或AD-65695之後ob/ob小鼠中HDLc對TC的比率。該數據證明與對照組比較，以所有評估的劑量給藥AD-65695均降低ob/ob小鼠中的TGs、LDLc及TC(在使用單次劑量3mg/kg的AD-65695上發現降低80%的血清LDLc及TGs)。
實施例6. AAV-TBG-ANGPTL3小鼠中的體內ANGPTL3沉默
為了測定另外藥劑之子集的單次劑量降低人類ANGPTL3蛋白位準的持久性，在給藥前14天野生型小鼠(C57BL/6)經由靜脈給予200μl的1 x 1011腺相關病毒載體8(AAV8)的病毒顆粒而受感染，該載體編碼受肝臟特異性甲狀腺素結合球蛋白(TBG)啟動子驅動的人類ANGPTL3基因(編碼區)(AAV8-TBG-ANGPTL3)。第0天時，經皮下給 予小鼠單次3mg/kg的藥劑並測定給藥前及給藥後第5、14、28及42天的動物血清中的ANGPTL3位準(參見第11圖)。如上述，使用ELISA檢測測定血清樣本中的小鼠ANGPTL3位準，並經由使用檢測人類及石蟹獼猴ANGPTL3而不與小鼠ANGPTL3交叉反應的抗體之ELISA檢測測定血清樣本中的人類ANGPTL3位準(R&D系統小鼠類血管生成素3 Quantikine ELISA試劑盒)。這些檢測使用未試驗過的小鼠(未暴露於AAV的小鼠)的血清充作負對照。兩種給予的藥劑，AD-57927及AD-65695，與小鼠、大鼠、石蟹獼猴及人類(m/r/cy/h)ANGPTL3 mRNA交叉反應。另外兩種給予的藥劑，AD-62865及AD-62866，只與石蟹獼猴及人類(cy/h)ANGPTL3 mRNA交叉反應。
第12A圖顯示給予該藥劑或PBS對照組之後的人類ANGPTL3蛋白質位準及第12B圖顯示給予該藥劑或PBS對照組之後的小鼠ANGPTL3位準，如預期，給予cy/h藥劑AD-62865及AD-62866之後，沒有小鼠ANGPTL3沉默。結果證明給予該藥劑後獲得達80%之人類ANGPTL3的減弱而有~60%的ANGPTL3減弱持續至少4星期。數據亦證明給予交叉反應的m/r/cy/h藥劑AD-65695之後，有>90%的小鼠ANGPTL3減弱，而在單次3mg/kg劑量的AD-65695之後，~75%ANGPTL3的減弱持續至少4星期。再者，數據證明給藥m/r/cy/h藥劑AD-65695及cy/h藥劑AD-62865之後有可比較的ANGPTL3減弱的效能及持續時間。
亦進行AD-65695、AD-62865及AD-62866的單次劑量持久性分析。如第13圖所示，給予受AAV8-TBG-ANGPTL3感染小鼠單次0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg劑量的AD-65695，或給予受AAV8-TBG-ANGPTL3感染小鼠單次1mg/kg或3mg/kg劑量的AD-62865，或給予受AAV8-TBG-ANGPTL3感染小鼠單次0.3mg/kg劑量的AD-62866。在給藥前及給藥後第11、25及39天收集動物血清，並如上述，使用ELISA檢測測定小鼠及人類的ANGPTL3位準。
第14A、14B、15A及15B圖展現這些分析的數據。第14A及14B圖分別提供給予該藥劑後第11天的人類及小鼠ANGPTL3值。第15A及第15B圖分別提供給予單次0.3mg/kg、1mg/kg或3mg/kg劑量的AD-65695的給藥前及給藥後第11、25及39天的人類及小鼠ANGPTL3位準。數據證明AD-65695(m/r/cy/h藥劑)具有對80%動物有效的劑量(ED80)之3mg/kg及對人類ANGPTL3的ED40之1mg/kg。數據亦證明AD-65695具有對小鼠ANGPTL3的ED90之3mg/kg、ED70之1mg/kg及ED50之0.3mg/kg。此外，數據證明AD-62865(cy/h藥劑)具有對人類ANGPTL3的ED80之3mg/kg。
經由給予受AAV8-TBG-ANGPTL3感染小鼠單次1mg/kg劑量之另外藥劑而檢測該藥劑之效能，而該另外藥劑相較於其所從而衍生的母序列具有較少2'-氟修飾的核苷酸(說明於以上表4A及4B)。在給藥前及給藥後 第9天收集動物血清，如上述，使用ELISA檢測測定小鼠及人類ANGPTL3位準。以下表6提供這些檢測的結果，及第16圖證明相較於母序列具有較少2'-氟修飾核苷酸的3種藥劑，AD-66920、AD-66921及AD-66922，較cy/h特定藥劑AD-62865具有改善的人類ANGPTL3敲滅的持續時間。
實施例7. AAV-TBG-ANGPTL3小鼠中的體內ANGPTL3沉默
在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠中檢測列於表7A、7B及7C中的另外藥物之第二子集。表8A及8B提供這些序列之有義及反義股的修飾核苷酸序列。簡要地，及 如上述，在給藥前第14天，經由靜脈給予1x1011病毒顆粒而感染野生型小鼠(C57BL/6)。於第0天，給予小鼠單次1mg/kg或3mg/kg劑量的該藥劑。在給藥前及給藥後第14及28天收集動物血清，並如上述，使用ELISA檢測測定小鼠及人類ANGPTL3位準。
以下表9及第17A及第17B圖提供這些檢測的結果。該結果證明藥劑AD-67173、AD-67174、AD-66922、AD-67007及AD-66920具有人類ANGPTL3減弱的改善持續時間。
另一個實驗中，在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠中檢測列於表7A、7B及7C中的另外藥劑的另一子集。表10A及10B提供這些序列的有義及反義股的修飾核苷酸序列。簡要地，及如上述，在給藥前第14天，經由靜脈給予1x1011病毒顆粒而感染野生型小鼠(C57BL/6)。於第0天，給予小鼠單次1mg/kg或3mg/kg劑量的該藥 劑。在給藥前及給藥後第14及28天收集動物血清，並如上述，使用ELISA檢測測定小鼠及人類ANGPTL3位準。
以下表11及第18A圖提供這些給藥後第14天的檢測結果，及以下表12及第18B圖提供這些給藥後第28天的檢測結果。該結果證明藥劑AD-66921、AD-66916及AD-67042具有人類ANGPTL3減弱的改善持續時間。
實施例8. 非人類靈長類中的體內ANGPTL3沉默
在第1天，皮下給予雄性石蟹獼猴(n=3/組)單次1mg/kg劑量的AD-65695或AD-66920，或單次3mg/kg劑量 的AD-66920。給藥後第4、8、11、15及22天收集禁食血清並測量Angplt3的蛋白質位準及血清脂質位準。
第19A及第19B圖提供這些檢測的結果並證明單次3mg/kg劑量的AD-66920(h/cy)給藥後有達80%之血清ANGPTL3蛋白質的減弱及約50%的血清中三酸甘油酯位準的降低。單次1mg/kg劑量的AD-66920對血清中三酸甘油酯值具有適中的效果。意外地，雖然給藥單次1mg/kg劑量的AD-65695將ANGPTL3蛋白質位準降低到與單次1mg/kg劑量的AD-66920相似的位準，但是單次1mg/kg劑量的AD-65695在AAV8-TBG-ANGPTL3小鼠模型中的效果比單次1mg/kg劑量的AD-66920差3倍且對血清中三酸甘油酯沒有效用。
實施例9. AAV-TBG-ANGPTL3小鼠中的體內ANGPTL3沉默
在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠中檢測一組靶向ANGPTL3的另外藥物之體內效能。表13A及13B提供這些序列的有義及反義股的修飾核苷酸序列。簡要地，及如上述，在給藥前第21天，經由靜脈給予1x1011病毒顆粒而感染野生型小鼠(C57BL/6；n=3)。於第0天，給予小鼠單次1mg/kg劑量的該藥劑。在給藥前及給藥後第28天收集動物血清，並如上述，使用ELISA檢測測定人類ANGPTL3位準。
第20圖提供這些檢測的結果及證明這些藥 劑有效地敲滅人類ANGPTL3蛋白質的位準。
在受AAV8-TBG-ANGPTL3感染的小鼠中檢測另一組列於表13A及13B之靶向ANGPTL3藥物之體內效能。如上述，在給藥前第21天，經由靜脈給予1x1011病毒顆粒而感染野生型小鼠(C57BL/6；n=3)。於第0天，給予小鼠單次1mg/kg劑量的該藥劑。在給藥前及給藥後第28天收集動物血清，並如上述，經由ELISA檢測測定人類及小鼠ANGPTL3位準。
第21A及第21B圖提供這些檢測的結果及證明這些藥劑有效地敲滅小鼠及人類ANGPTL3蛋白質的位準。
實施例10. AAV-TBG-ANGPTL3小鼠中的體外ANGPTL3沉默
如上述，合成靶向ANGPTL3基因的進一步iRNA藥劑。表14顯示另外未修飾ANGPTL3有義及反義股序列的詳細列表及表13A、13B、15A及15B顯示這些另外藥劑的修飾有義及反義股序列的詳細列表。
經由藥劑以10nM及0.1nM最終雙鏈體濃度的單次劑量轉染而在Hep3b及初代石蟹獼猴肝細胞的體內檢測中評估這些另外的藥劑。(參見表16)。
如上述培養及轉染Hep3b細胞。與ANGPTL3藥劑一起培養24小時之後，評估初代石蟹獼猴肝細胞中的自由攝取沉默。除了用5μL完全生長培養基取代含有 Lipofectamine RNAiMax及Optimem的5μL外，該方法與上述者相似。這些檢測的結果(表16所提供)說明許多雙鏈體有效地抑制ANGPTL3 mRNA表現。
<110> 阿尼拉製藥公司(ALNYLAM PHARMACEUTICALS,INC.)
<120> 類血管生成素3(ANGPTL3)iRNA組成物及其用途方法 (ANGIOPOIETIN-LIKE 3(ANGPTL3)iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OE USE THEREOF)
<130> 121301-03363
<140>
<141>
<150> 62/146,604
<151> 2015-04-13
<150> 62/261,361
<151> 2015-12-01
<160> 670
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2951
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 2149
<212> DNA
<213> 恆河獼猴
<400> 2
<210> 3
<211> 1598
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<400> 3
<210> 4
<211> 1785
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 4
<210> 5
<211> 2951
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
<210> 6
<211> 2149
<212> DNA
<213> 恆河獼猴
<400> 6
<210> 7
<211> 1598
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<400> 7
<210> 8
<211> 1785
<212> DNA
<213> 溝鼠
<400> 8
<210> 9
<211> 2201
<212> DNA
<213> 食蟹獼猴
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的敘述： RFGF類似序列
<400> 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人類免疫缺乏病毒
<400> 11
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蠅
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 未知的敘述：
RFGF序列
<400> 13
<210> 14
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 14
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 15
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 16
<210> 17
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 17
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 18
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 19
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 30
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 31
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 32
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 33
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 34
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 35
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 36
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 37
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 38
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 39
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 40
<210> 41
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 41
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 42
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 43
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 44
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 45
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 46
<210> 47
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 47
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 48
<210> 49
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 49
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 50
<210> 51
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 51
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 52
<210> 53
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 53
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 54
<210> 55
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 55
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 56
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
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<400> 57
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<220>
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<400> 58
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<400> 66
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 68
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 70
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 71
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<212> RNA
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<220>
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<400> 72
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 73
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 74
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 75
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 76
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 77
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 78
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 倒轉無鹼基DNA(2-羥基甲基-四氫呋喃-5-硫酸酯)
<400> 79
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 80
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 81
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 82
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 83
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 84
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 85
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 86
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 87
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 88
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<221> 修飾鹼基
<222> (1)..(1)
<223> 倒轉無鹼基DNA(2-羥基甲基-四氫呋喃-5-硫酸酯)
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 91
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 92
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<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 93
<210> 94
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 94
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 95
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
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<400> 99
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 100
<210> 101
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 101
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 102
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 103
<210> 104
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 104
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 105
<210> 106
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 106
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 107
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 108
<210> 109
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 109
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 110
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 111
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 112
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 113
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 114
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 115
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 116
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 117
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 118
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 119
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 120
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 121
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 122
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 123
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 124
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 125
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 126
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 127
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 128
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 129
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 130
<210> 131
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 131
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 132
<210> 133
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 133
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 134
<210> 135
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 135
<210> 136
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 136
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 137
<210> 138
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 138
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 139
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 140
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 141
<210> 142
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 142
<210> 143
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 143
<210> 144
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 144
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 145
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 146
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 147
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 148
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 228
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 229
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
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<212> RNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 232
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 233
<210> 234
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 234
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 235
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<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
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<400> 236
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 237
<210> 238
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 238
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 239
<210> 240
<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 240
<210> 241
<211> 23
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 241
<210> 242
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
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<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<220>
<223> 組合的DNA/RNA分子的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 337
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> RNA
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<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 523
<210> 524
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 524
<210> 525
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 525
<210> 526
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 526
<210> 527
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 527
<210> 528
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 528
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 529
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
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<400> 531
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 533
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 543
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 548
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 550
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<400> 551
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 552
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 553
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 554
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 555
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
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<400> 557
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 558
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 560
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<220>
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<220>
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<400> 562
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 565
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<212> RNA
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<220>
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<220>
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<400> 567
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 568
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<400> 570
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<212> RNA
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<220>
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 572
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 573
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 574
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 575
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 576
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 577
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 578
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 579
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 580
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 581
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<400> 582
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 584
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 585
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 586
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<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 587
<210> 588
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 588
<210> 589
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 589
<210> 590
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 590
<210> 591
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 591
<210> 592
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 592
<210> 593
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 593
<210> 594
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 594
<210> 595
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 595
<210> 596
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 596
<210> 597
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 597
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 598
<210> 599
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 599
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 600
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 601
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 602
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 603
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 604
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 605
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 606
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 609
<210> 610
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 610
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 611
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<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 612
<210> 613
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 613
<210> 614
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 614
<210> 615
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 615
<210> 616
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 616
<210> 617
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 617
<210> 618
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 618
<210> 619
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 619
<210> 620
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 620
<210> 621
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 621
<210> 622
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 622
<210> 623
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 623
<210> 624
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 624
<210> 625
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 625
<210> 626
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 626
<210> 627
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 627
<210> 628
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 628
<210> 629
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 629
<210> 630
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 630
<210> 631
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 631
<210> 632
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 632
<210> 633
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 633
<210> 634
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 634
<210> 635
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 635
<210> 636
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 636
<210> 637
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 637
<210> 638
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 638
<210> 639
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 639
<210> 640
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 640
<210> 641
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 641
<210> 642
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 642
<210> 643
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 643
<210> 644
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 644
<210> 645
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 645
<210> 646
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 646
<210> 647
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 647
<210> 648
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 648
<210> 649
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 649
<210> 650
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 650
<210> 651
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 651
<210> 652
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 652
<210> 653
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 653
<210> 654
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 654
<210> 655
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 655
<210> 656
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 656
<210> 657
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 657
<210> 658
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 658
<210> 659
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 659
<210> 660
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 660
<210> 661
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 661
<210> 662
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 662
<210> 663
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 663
<210> 664
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 664
<210> 665
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 665
<210> 666
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 666
<210> 667
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 667
<210> 668
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 668
<210> 669
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 669
<210> 670
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成的寡核苷酸
<400> 670

Claims (65)

  1. 一種抑制類血管生成素3(ANGPTL3)表現的雙股核糖核酸(dsRNA)，其中該dsRNA包括有義股及反義股，該反義股包括互補區，該互補區包括至少15個連續核苷酸，而該15個連續核苷酸與表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任何一個表中所列的任何一個反義核苷酸序列差異不超過3個核苷酸。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之dsRNA，其中該有義及反義股包括選自下列所成群組的核苷酸序列：5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：14)5'-UTGAGUUCAAGTGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：15)、5'-GAAUATGUGACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：16)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：17)、5'-AUUAAGCUGCUUCUUUTUAUU-3'(SEQ ID NO：18)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：19)、5'-ACAUAUUUGAUCAGUCUUUUU-3'(SEQ ID NO：20)5'-AAAAAGACUGAUCAAAUAUGUUG-3'(SEQ ID NO：21)、5'-UGUCACUUGAACUCAACUCAA-3'(SEQ ID NO：22)5'-UUGAGUUGAGUUCAAGUGACAUA-3'(SEQ ID NO： 23)、5'-AACUAACUAACUUAAUUCAAA-3'(SEQ ID NO：24)5'-UUUGAAUUAAGUUAGUUAGUUGC-3'(SEQ ID NO：25)；5'-UCACAAUUAAGCUCCUUCUUU-3'(SEQ ID NO：26)5'-AAAGAAGGAGCUUAAUUGUGAAC-3'(SEQ ID NO：27)、5'-GAGCAACUAACUAACUUAAUU-3'(SEQ ID NO：28)5'-AAUUAAGUUAGUUAGUUGCUCUU-3'(SEQ ID NO：29)、5'-UUAUUGUUCCUCUAGUUAUUU-3'(SEQ ID NO：30)5'-AAAUAACUAGAGGAACAAUAAAA-3'(SEQ ID NO：31)、5'-AUUAAGCUCCUUCUUUUUAUU-3'(SEQ ID NO：32)5'-AAUAAAAAGAAGGAGCUUAAUUG-3'(SEQ ID NO：33)、5'-GAAUAUGUCACUUGAACUCAA-3'(SEQ ID NO：34)5'-UUGAGUUCAAGUGACAUAUUCUU-3'(SEQ ID NO：35)、5'-CAACAUAUUUGAUCAGUCUUU-3'(SEQ ID NO：36)5'-AAAGACUGAUCAAAUAUGUUGAG-3'(SEQ ID NO：37)及5'-CUCCAUAGUGAAGCAAUCUAA-3'(SEQ ID NO：38)5'-UUAGAUUGCUUCACUAUGGAGUA-3'(SEQ ID NO： 39)。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之dsRNA，其中該dsRNA包括至少一個修飾的核苷酸。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項之任一項所述之dsRNA，其中有義股的核苷酸不超過4個為未修飾的核苷酸。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項之任一項所述之dsRNA，其中反義股的核苷酸不超過6個為未修飾的核苷酸。
  6. 如申請專利範圍第1項至第3項及第5項之任一項所述之dsRNA，其中所有有義股的核苷酸均為修飾的核苷酸。
  7. 如申請專利範圍第1項至第3項及第6項之任一項所述之dsRNA，其中所有反義股的核苷酸均為修飾的核苷酸。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之dsRNA，其中該有義及反義股包括選自下列所成群組的核苷酸序列：5'-ascsauauUfuGfAfUfcagucuuuuu-3'(SEQ ID NO：40)5'-asAfsaaaGfacugaucAfaAfuaugususg-3'(SEQ ID NO：41)；5'-usgsucacUfuGfAfAfcucaacucaaL96-3'(SEQ ID NO：42)5'-usUfsgagUfuGfAfguucAfaGfugacasusa-3'(SEQ ID NO：43)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：44) 5'-usdTsgaguucaagdTgdAcauauucsusu-3'(SEQ ID NO：45)；5'-gsasauadTgudGacuugaa(Cgn)ucaa-3'(SEQ ID NO：46)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：47)；5'-asusuaadGcudGcuucuuu(Tgn)uauu-3'(SEQ ID NO：48)5'-asAfsuaaAfaagaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：49)；5'-AfscsAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3'(SEQ ID NO：50)5'-asAfsaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfususg-3'(SEQ ID NO：51)；5'-UfsgsUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAf-3'(SEQ ID NO：52)5'-usUfsgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasusa-3'(SEQ ID NO：53)；5'-asascuaaCfuAfAfCfuuaauucaaa-3'(SEQ ID NO：54)5'-usUfsugaAfuUfAfaguuAfgUfuaguusgsc-3'(SEQ ID NO：55)；5'-uscsacaaUfuAfAfGfcuccuucuuu-3'(SEQ ID NO：56)5'-asAfsagaAfgGfAfgcuuAfaUfugugasasc-3'(SEQ ID NO：57)；5'-gsasgcaaCfuAfAfCfuaacuuaauu-3'(SEQ ID NO：58)5'-asAfsuuaAfgUfUfaguuaGfuUfgcucsusu-3'(SEQ ID NO：59)； 5'-ususauugUfuCfCfUfcuaguuauuu-3'(SEQ ID NO：60)5'-asAfsauaAfcUfAfgaggAfaCfaauaasasa-3'(SEQ ID NO：61)；5'-asusuaagCfuCfCfUfucuuuuuauu-3'(SEQ ID NO：62)5'-asAfsuaaAfaAfGfaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：63)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：64)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：65)；5'-csasacauAfuUfUfGfaucagucuuu-3'(SEQ ID NO：66)5'-asAfsagaCfuGfAfucaaAfuAfuguugsasg-3'(SEQ ID NO：67)；及5'-csusccauAfgUfGfAfagcaaucuaa-3'(SEQ ID NO：68)5'-usUfsagaUfuGfCfuucaCfuAfuggagsusa-3'(SEQ ID NO：69)。
  9. 如申請專利範圍第3項至第7項之任一項所述之dsRNA，其中至少一種所述修飾的核苷酸選自下列所成群組：去氧-核苷酸、3'端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-去氧-修飾的核苷酸、鎖核苷酸、解鎖核苷酸、構形限制的核苷酸、拘束乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基-修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基-修飾的核苷酸、2'-C-烷基-修飾的核苷酸、2'-羥基-修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烷基-修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基 磷酸酯、含非天然鹼基的核苷酸、四氫呋喃修飾的核苷酸、1,5-無水己醣醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包括5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、包括5'-甲基膦酸酯基團的核苷酸、包括5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物的核苷酸、包括乙烯基磷酸酯的核苷酸、包括腺苷-乙二醇核酸(GNA)的核苷酸、包括胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-異構物的核苷酸、包括2-羥基甲基-四氫呋喃-5-磷酸酯的核苷酸、包括2'-去氧胸苷-3'磷酸酯的核苷酸、包括2'-去氧鳥苷-3'-磷酸酯的核苷酸及與膽固醇基衍生物或十二酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之dsRNA，其中核苷酸的修飾為2'-O-甲基及2'氟修飾。
  11. 如申請專利範圍第8項或第9項所述之dsRNA，其進一步包括至少一個硫代磷酸酯核苷酸間連接。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之dsRNA，其中該dsRNA包括6至8個硫代磷酸酯核苷酸間連接。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之dsRNA，其中該互補區至少為17個核苷酸長度。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之dsRNA，其中該互補區為19至23個核苷酸長度。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之dsRNA，其中該互補區為19個核苷酸長度。
  16. 如申請專利範圍第1項至第15項之任一項所述之dsRNA，其中各股不超過30個核苷酸長度。
  17. 如申請專利範圍第1項至第16項之任一項所述之dsRNA，其中至少一股包括至少一個核苷酸的3'突出。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之dsRNA，其中至少一股包括至少2個核苷酸的3'突出。
  19. 如申請專利範圍第1項至第18項之任一項所述之dsRNA，其進一步包括配體。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之dsRNA，其中該配體與dsRNA之有義股的3'端接合。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之dsRNA，其中該配體為N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)衍生物。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之dsRNA，其中該配體為
  23. 如申請專利範圍第20項所述之dsRNA，其中該dsRNA如下列方案所示與該配體接合
  24. 一種抑制細胞中類血管生成素3(ANGPTL3)表現的雙股核糖核酸(RNAi)藥劑，其中該RNAi藥劑包括與反義股互補的有義股，其中該反義股包括與SEQ ID NO：2互補的區域，其中各股約為14至約30個核苷酸長度，及其中該雙股RNAi藥劑由式(IIIe)表示：有義：5'-Na-Y Y Y-Nb-3'反義：3'-np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-5' (IIIe)其中：np'為2個核苷酸突出及np'內的各核苷酸經由硫代磷酸酯鍵結與鄰近核苷酸連接；各Na、Nb、Na'及Nb'獨立表示包括0至25個修飾的或未修飾的或其組合的核苷酸之寡核苷酸序列，各序列包括至少兩個經不同修飾的核苷酸；YYY及Y'Y'Y'各獨立表示在三個連續核苷酸上有三個相同修飾的模體(motif)；其中該有義股包括不超過4個的2'-氟修飾；其中該反義股包括不超過6個的2'-氟修飾；其中該有義股及該反義股獨立包括在5'端的2個硫代磷酸酯鍵結；及其中該有義股與至少1個配體接合。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該YYY模體發生在或臨近有義股的裂解位點。
  26. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該Y'Y'Y'模體發生在從5'端之反義股的11、12及13 位置。
  27. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該Y核苷酸含有2'-氟修飾。
  28. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該Y'核苷酸含有2'-O-甲基修飾。
  29. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為15至30個核苷酸對長度。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為17至23個核苷酸對長度。
  31. 如申請專利範圍第29項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為17至25個核苷酸對長度。
  32. 如申請專利範圍第29項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為23至27個核苷酸對長度。
  33. 如申請專利範圍第29項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為19至21個核苷酸對長度。
  34. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該雙股區域為21至23個核苷酸對長度。
  35. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中各股具有15至30個核苷酸。
  36. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中各股具有19至30個核苷酸。
  37. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中核苷酸上的修飾選自下列所成群組：去氧-核苷酸、3'端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾的核苷酸、 2'-氟修飾的核苷酸、2'-去氧-修飾的核苷酸、鎖核苷酸、解鎖核苷酸、構形限制的核苷酸、拘束乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基-修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基-修飾的核苷酸、2'-C-烷基-修飾的核苷酸、2'-羥基-修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烷基-修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、含非天然鹼基的核苷酸、四氫哌喃修飾的核苷酸、1,5-無水己醣醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包括硫代磷酸酯基團的核苷酸、包括甲基膦酸酯基團的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸及包括5'-磷酸酯模擬物的核苷酸，及其組合。
  38. 如申請專利範圍第37項所述之雙股RNAi藥劑，其中該核苷酸上的修飾為2'-O-甲基或2'-氟修飾。
  39. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該有義股包括不超過3個的2'-氟修飾。
  40. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該有義股包括不超過2個的2'-氟修飾。
  41. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該反義股包括不超過5個的2'-氟修飾。
  42. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該反義股包括不超過4個的2'-氟修飾。
  43. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該反義股包括不超過3個的2'-氟修飾。
  44. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中 該反義股包括不超過2個的2'-氟修飾。
  45. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該配體為經由單價、二價或三價分支連接子而附接的一個或多個GalNAc衍生物。
  46. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該配體為
  47. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該配體附接於有義股的3'端。
  48. 如申請專利範圍第47項所述之雙股RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑如下列方案所示與該配體接合 其中X為O或S。
  49. 如申請專利範圍第25項所述之雙股RNAi藥劑，其中 該反義股包括選自下列所成群組的核苷酸序列：5'-ascsauauUfuGfAfUfcagucuuuuu-3'(SEQ ID NO：40)5'-asAfsaaaGfacugaucAfaAfuaugususg-3'(SEQ ID NO：41)；5'-usgsucacUfuGfAfAfcucaacucaaL96-3'(SEQ ID NO：42)5'-usUfsgagUfuGfAfguucAfaGfugacasusa-3'(SEQ ID NO：43)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：44)5'-usdTsgaguucaagdTgdAcauauucsusu-3'(SEQ ID NO：45)；5'-gsasauadTgudGacuugaa(Cgn)ucaa-3'(SEQ ID NO：46)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：47)；5'-asusuaadGcudGcuucuuu(Tgn)uauu-3'(SEQ ID NO：48)5'-asAfsuaaAfaagaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：49)；5'-AfscsAfuAfuUfuGfAfUfcAfgUfcUfuUfuUf-3'(SEQ ID NO：50)5'-asAfsaAfaGfaCfuGfaucAfaAfuAfuGfususg-3'(SEQ ID NO：51)；5'-UfsgsUfcAfcUfuGfAfAfcUfcAfaCfuCfaAf-3'(SEQ ID NO：52)5'-usUfsgAfgUfuGfaGfuucAfaGfuGfaCfasusa-3'(SEQ ID NO：53)；5'-asascuaaCfuAfAfCfuuaauucaaa-3'(SEQ ID NO：54) 5'-usUfsugaAfuUfAfaguuAfgUfuaguusgsc-3'(SEQ ID NO：55)；5'-uscsacaaUfuAfAfGfcuccuucuuu-3'(SEQ ID NO：56)5'-asAfsagaAfgGfAfgcuuAfaUfugugasasc-3'(SEQ ID NO：57)；5'-gsasgcaaCfuAfAfCfuaacuuaauu-3'(SEQ ID NO：58)5'-asAfsuuaAfgUfUfaguuaGfuUfgcucsusu-3'(SEQ ID NO：59)；5'-ususauugUfuCfCfUfcuaguuauuu-3'(SEQ ID NO：60)5'-asAfsauaAfcUfAfgaggAfaCfaauaasasa-3'(SEQ ID NO：61)；5'-asusuaagCfuCfCfUfucuuuuuauu-3'(SEQ ID NO：62)5'-asAfsuaaAfaAfGfaaggAfgCfuuaaususg-3'(SEQ ID NO：63)；5'-gsasauauGfuCfAfCfuugaacucaa-3'(SEQ ID NO：64)5'-usUfsgagUfuCfAfagugAfcAfuauucsusu-3'(SEQ ID NO：65)；5'-csasacauAfuUfUfGfaucagucuuu-3'(SEQ ID NO：66)5'-asAfsagaCfuGfAfucaaAfuAfuguugsasg-3'(SEQ ID NO：67)；及5'-csusccauAfgUfGfAfagcaaucuaa-3'(SEQ ID NO：68)5'-usUfsagaUfuGfCfuucaCfuAfuggagsusa-3'(SEQ ID NO：69)，其中A、C、G及U為核糖A、C、G或U；a、c、g及u為2'-O-甲基(2'-OMe)A、C、G或U；Af、Cf、Gf 及Uf為2'-氟A、C、G或U；及s為硫代磷酸酯鍵結。
  50. 如申請專利範圍第24項所述之雙股RNAi藥劑，其中該RNAi藥劑選自表2A、2B、4A、4B、5、7A、7B、7C、8A、8B、10A、10B、13A、13B、14、15A及15B之任何一個表中所列之RNAi藥劑群組。
  51. 一種細胞，該細胞含有申請專利範圍第1項至第50項之任一項所述之dsRNA。
  52. 一種抑制ANGPTL3基因表現的醫藥組成物，該醫藥組成物包括申請專利範圍第1項至第50項之任一項所述之dsRNA。
  53. 如申請專利範圍第52項所述之醫藥組成物，該醫藥組成物進一步包括脂質製劑。
  54. 一種抑制細胞中ANGPTL3表現的方法，該方法包括：(a)使細胞與申請專利範圍第1項至第50項之任一項所述之dsRNA接觸；及(b)維持步驟(a)產生的細胞經一段時間而充分得到ANGPTL3基因之mRNA轉錄本的降解，從而抑制至細胞中的ANGPTL3基因表現。
  55. 如申請專利範圍第54項所述之方法，其中該細胞在個體中。
  56. 如申請專利範圍第55項所述之方法，其中該個體為人類。
  57. 如申請專利範圍第55項所述之方法，其中該個體選自恆河猴、石蟹獼猴、小鼠及大鼠所構成的群組。
  58. 如申請專利範圍第56項所述之方法，其中該人類個體患有脂肪代謝障礙。
  59. 如申請專利範圍第58項所述之方法，其中該脂肪代謝障礙為高血脂症或高三酸甘油酯血症。
  60. 如申請專利範圍第54項至第59項之任一項所述之方法，其中至少抑制約30%的ANGPTL3表現。
  61. 一種方法，該方法用於治療具有從降低ANGPTL3表現而受益之障礙的個體，包括給予個體治療上有效量的申請專利範圍第1項至第50項之任一項所述之dsRNAs，因而治療該個體。
  62. 如申請專利範圍第61項所述之方法，其中該障礙為脂肪代謝障礙。
  63. 如申請專利範圍第62項所述之方法，其中該脂肪代謝障礙為高血脂症或高三酸甘油酯血症。
  64. 如申請專利範圍第63項所述之方法，其中給予個體dsRNA造成一種或多種血清脂質的減少及ANGPTL3蛋白質累積的減低。
  65. 一種抑制個體中ANGPTL3表現的方法，該方法包括給予該個體治療上有效量的申請專利範圍第1項至第50項之任一項所述之dsRNAs，因而抑制該個體之ANGPTL3表現。
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Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX345095B (es) 2011-06-21 2017-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
WO2016168286A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
JOP20200050A1 (ar) * 2017-09-14 2020-03-05 Arrowhead Pharmaceuticals Inc عوامل RNAi وتركيبات لتثبيط التعبير عن شبيه آنجيوبويتين 3 (ANGPTL3)، وطرق استخدام
EP3719126A4 (en) * 2017-12-01 2021-10-20 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID, ASSOCIATED PREPARATION PROCESS AND USE
JP2021504415A (ja) * 2017-12-01 2021-02-15 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッドＳｕｚｈｏｕ Ｒｉｂｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． 二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用
CN110944675B9 (zh) 2017-12-01 2024-08-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
KR20200095483A (ko) 2017-12-01 2020-08-10 쑤저우 리보 라이프 사이언스 컴퍼니, 리미티드 핵산, 이를 포함하는 조성물과 컨쥬게이트, 및 그의 제조 방법과 용도
JP7365052B2 (ja) 2017-12-01 2023-10-19 スーチョウ リボ ライフ サイエンス カンパニー、リミテッド 核酸、当該核酸を含む組成物及び複合体ならびに調製方法と使用
US11633482B2 (en) 2017-12-29 2023-04-25 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
CN112313335B (zh) * 2018-05-14 2024-07-09 阿尔尼拉姆医药品有限公司 血管紧张素原(AGT)iRNA组合物及其使用方法
EP3842534A4 (en) 2018-08-21 2022-07-06 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. NUCLEIC ACID, COMPOSITION AND CONJUGATE CONTAINING NUCLEIC ACID AND METHOD OF USE THEREOF
WO2020063198A1 (zh) 2018-09-30 2020-04-02 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
US20210388356A1 (en) * 2018-11-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified double stranded oligonucleotide
WO2020099482A2 (en) * 2018-11-13 2020-05-22 Lipigon Pharmaceuticals Ab Angptl 3 oligonucleotides influencing the regulation of the fatty acid metabolism
KR20230011913A (ko) * 2020-03-04 2023-01-25 버브 테라퓨틱스, 인크. 표적화된 rna 전달을 위한 조성물 및 방법
CA3174872A1 (en) * 2020-04-07 2021-10-14 Sander Jan Hendrik Van Deventer Gene constructs for silencing angiopoietin-like 3 (angptl3) and uses thereof
JP2023536685A (ja) * 2020-09-30 2023-08-29 納▲タイ▼得（青島）生物医薬有限公司 アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）のｓｉＲＮＡ及びその用途
WO2022079222A1 (en) * 2020-10-16 2022-04-21 Sanofi Novel rna compositions and methods for inhibiting angptl3
CN114685585B (zh) * 2020-12-31 2024-06-04 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核苷酸序列、双链寡核苷酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
TW202302849A (zh) * 2021-03-04 2023-01-16 美商艾拉倫製藥股份有限公司 類血管生成素３（ＡＮＧＰＴＬ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2023044458A1 (en) * 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing angptl4
EP4405476A1 (en) * 2021-09-23 2024-07-31 Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for inhibiting expression of angiopoietin-like 3 (angptl3) protein
WO2023092102A1 (en) * 2021-11-19 2023-05-25 Sanegene Bio Usa Inc. Double stranded rna targeting angiopoietin-like 3 (angptl-3) and methods of use thereof
KR20240119084A (ko) 2021-12-22 2024-08-06 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 안지오포이에틴 유사 3(angptl3) 억제제를 이용한 신장 질환 치료
WO2023134705A1 (zh) * 2022-01-11 2023-07-20 上海金中锘美生物医药科技有限公司 抑制angptl3表达的rna干扰剂及其用途
CN116987696A (zh) * 2022-08-04 2023-11-03 北京福元医药股份有限公司 用于抑制angptl3基因表达的双链核糖核酸及其修饰物、缀合物和用途
WO2024032608A1 (zh) * 2022-08-08 2024-02-15 大睿生物医药科技(上海)有限公司 调控ANGPTL3基因活性的siRNA分子
US20240158795A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment Of Kidney Diseases With A Combination of Angiopoietin Like 3 (ANGPTL3) Inhibitors And Solute Carrier Family 5 Member 2 (SLC5A2) Inhibitors

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5783701A (en) 1992-09-08 1998-07-21 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Sulfonamide inhibitors of aspartyl protease
RU2123492C1 (ru) 1993-02-19 1998-12-20 Ниппон Синяку Ко., Лтд Производные глицерина, средство для доставки физиологически активного вещества и фармацевтическая композиция
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
WO2000022114A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
US6436989B1 (en) 1997-12-24 2002-08-20 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Prodrugs of aspartyl protease inhibitors
CN1110492C (zh) 1997-12-24 2003-06-04 沃泰克斯药物股份有限公司 天冬氨酰蛋白酶抑制剂的前药
JP2002527061A (ja) 1998-10-09 2002-08-27 インジーン・インコーポレイテッド ｓｓＤＮＡの酵素的合成
TWI260322B (en) 1999-02-12 2006-08-21 Vertex Pharma Inhibitors of aspartyl protease
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
EP1560931B1 (en) 2002-11-14 2011-07-27 Dharmacon, Inc. Functional and hyperfunctional sirna
PL1866414T3 (pl) 2005-03-31 2012-10-31 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitory podjednostki 2 reduktazy rybonukleotydowej i ich zastosowania
JP5484063B2 (ja) 2006-12-08 2014-05-07 レキシコン ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド Ａｎｇｐｔｌ３に対するモノクローナル抗体
CA2708173C (en) 2007-12-04 2016-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Targeting lipids
MX2010008394A (es) 2008-01-31 2010-11-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9.
US8546554B2 (en) 2008-09-25 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of Serum Amyloid A gene
KR102578331B1 (ko) 2008-10-20 2023-09-15 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
NZ593618A (en) 2008-12-10 2013-02-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
US20120017784A1 (en) * 2009-01-20 2012-01-26 James Butcher Method of providing a printed date
PL2440183T3 (pl) 2009-06-10 2019-01-31 Arbutus Biopharma Corporation Ulepszona formulacja lipidowa
BRPI1010689A2 (pt) 2009-06-15 2016-03-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc "dsrna formulado por lipídios direcionados para o gene pcsk9"
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8653047B2 (en) * 2010-01-08 2014-02-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of angiopoietin-like 3 expression
EP3115468B1 (en) * 2010-09-21 2018-07-25 Agilent Technologies, Inc. Increasing confidence of allele calls with molecular counting
MX345095B (es) 2011-06-21 2017-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de arni similares a angiopoyetina 3 (angptl3) y metodos para su uso.
EP3366775B1 (en) * 2011-11-18 2022-04-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified rnai agents
EP3358013B1 (en) * 2012-05-02 2020-06-24 Sirna Therapeutics, Inc. Short interfering nucleic acid (sina) compositions
US9708607B2 (en) 2012-08-03 2017-07-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified RNAi agents
ES2947520T3 (es) * 2012-08-06 2023-08-10 Alnylam Pharmaceuticals Inc Proceso para la preparación de agentes de ARN conjugados con carbohidratos
WO2014182661A2 (en) * 2013-05-06 2014-11-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc Dosages and methods for delivering lipid formulated nucleic acid molecules
ES2844593T3 (es) * 2014-05-01 2021-07-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y procedimientos para modular la expresión de la angiopoyetina de tipo 3
MX2017002144A (es) 2014-08-20 2017-08-15 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ácido ribonucleico (arn) de cadena doble modificados.
CA2979998A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016168286A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof

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