ES2844593T3 - Composiciones y procedimientos para modular la expresión de la angiopoyetina de tipo 3 - Google Patents

Composiciones y procedimientos para modular la expresión de la angiopoyetina de tipo 3 Download PDF

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Abstract

Compuesto de la fórmula siguiente **(Ver fórmula)** o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para modular la expresión de la angiopoyetina de tipo 3
Sector de la invención
En la presente memoria descriptiva, se dan a conocer procedimientos, compuestos y composiciones para reducir la expresión de ARNm y proteína de tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) en un animal. Además, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer procedimientos, compuestos y composiciones que tienen un inhibidor de la ANGPTL3 para reducir enfermedades o afecciones relacionadas con ANGPTL3 en un animal. Dichos procedimientos, compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir, retrasar o mejorar una o más enfermedades cardiovasculares o síndromes metabólicos, o uno de sus síntomas, en un animal.
Estado de la técnica anterior
La diabetes y la obesidad (denominadas a veces colectivamente “diabesidad”) están interrelacionadas porque se sabe que la obesidad exacerba la patología de la diabetes y más del 60 % de los diabéticos son obesos. La mayor parte de la obesidad humana se asocia con resistencia a la insulina y resistencia a la leptina. De hecho, se ha sugerido que la obesidad puede tener un impacto aún mayor en la acción de la insulina que la propia diabetes (Sindelka et al., Physiol Res., 2002, 51, 85-91). Además, se sabe que varios compuestos en el mercado para el tratamiento de la diabetes inducen aumento de peso, un efecto secundario muy indeseable para el tratamiento de esta enfermedad.
La enfermedad cardiovascular también está interrelacionada con la obesidad y la diabetes. La enfermedad cardiovascular abarca una amplia variedad de etiologías y tiene una variedad igualmente amplia de agentes causales y actores interrelacionados. Muchos agentes causales contribuyen a síntomas, tales como niveles elevados de colesterol en plasma, entre los que se incluyen el colesterol no de lipoproteínas de densidad elevada (no HDL-C, de non-high density lipoprotein cholesterol), así como otros trastornos relacionados con los lípidos. Dichos trastornos relacionados con los lípidos, denominados generalmente dislipidemia, incluyen hiperlipidemia, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia, entre otras indicaciones. El colesterol no HDL elevado se asocia con la aterogénesis y sus secuelas, incluidas enfermedades cardiovasculares tales como arteriosclerosis, arteriopatía coronaria, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular isquémico y otras formas de cardiopatía. Estos se clasifican como los tipos de enfermedades más prevalentes en los países industrializados. De hecho, se estima que 12 millones de personas en los Estados Unidos padecen arteriopatía coronaria y, aproximadamente, 36 millones requieren tratamiento para los niveles elevados de colesterol.
La evidencia epidemiológica y experimental ha demostrado que los niveles elevados de triglicéridos circulantes (TG) pueden contribuir a la enfermedad cardiovascular y una miríada de trastornos metabólicos (Valdivielso et al., 2009, Atherosclerosis Zhang et al., 2008, Circ Res. 1; 102 (2): 250-6). Los TG derivados de fuentes exógenas o endógenas se incorporan y secretan en quilomicrones desde el intestino o en lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL, de very low density lipoproteins) desde el hígado. Una vez en circulación, los TG son hidrolizados por la lipoproteína lipasa (LpL) y los ácidos grasos libres resultantes pueden ser absorbidos por los tejidos locales y utilizados como fuente de energía. Debido al profundo efecto que tiene la LpL sobre los TG plasmáticos y el metabolismo en general, es de gran interés descubrir y desarrollar compuestos que afecten a la actividad de LpL.
El síndrome metabólico es una combinación de trastornos médicos que aumentan el riesgo de enfermedad cardiovascular y diabetes. Los síntomas, que incluyen presión arterial elevada, triglicéridos elevados, disminución de HDL y obesidad, tienden a aparecer conjuntamente en algunas personas. Afecta a un gran número de personas de forma agrupada. En algunos estudios, se calcula una prevalencia en los EE. UU. de hasta el 25 % de la población. El síndrome metabólico se conoce con otros nombres, tales como síndrome X (metabólico), síndrome de resistencia a la insulina, síndrome de Reaven o CHAOS. Con la prevalencia elevada de trastornos cardiovasculares y trastornos metabólicos, sigue siendo necesario mejorar los enfoques para tratar estas afecciones.
Las angiopoyetinas son una familia de factores de crecimiento secretados. Conjuntamente con sus respectivos receptores específicos de endotelio, las angiopoyetinas desempeñan un papel importante en la angiogénesis. Un miembro de la familia, la de tipo angiopoyetina 3 (también conocida como proteína de tipo angiopoyetina 3, ANGPT5, ANGPTL3 o angiopoyetina 5), se expresa predominantemente en el hígado y se cree que desempeña un papel en la regulación del metabolismo de los lípidos (Kaplan et al., J. Lipid Res., 2003, 44, 136-143). Las exploraciones de asociación de todo el genoma (GWAS, de Genome-wide association scans) que analizan el genoma en busca de variantes comunes asociadas con las concentraciones plasmáticas de HDL, LDL y triglicéridos descubrieron una asociación entre los triglicéridos y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, de single-nucleotide polymorphisms) cerca de la ANGPTL3 (Willer et al., Nature Genetics, 2008, 40 (2): 161-169). Los individuos con mutaciones homocigotas de la ANGPTL3 con pérdida de función presentan niveles bajos de todos los lípidos y lipoproteínas plasmáticos aterogénicos, tales como el colesterol total (CT) y los TG, colesterol enlazado a lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), apoliproteína B (apoB), no HDL-C, así como HDL-C (Romeo et al. 2009, J Clin Invest, 119 (1): 70-79; Musunuru et al. 2010 N Engl J Med, 363: 2220-2227; Martin-Campos et al. 2012, Clin Chim Acta, 413: 552-555; Minicocci et al. 2012, J Clin Endocrinol Metab, 97: e1266-1275; Noto et al. 2012, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32: 805-809; Pisciotta et al. 2012, Circulation Cardiovasc Genet, 5: 42-50). Este fenotipo clínico se ha denominado hipolipidemia combinada familiar (FHBL2, de familia! combined hypolipidemia). A pesar de la secreción reducida de VLDL, los individuos con FHBL2 no tienen un mayor contenido de grasa hepática. También parecen tener niveles más bajos de glucosa e insulina en plasma y, lo que es más importante, tanto la diabetes como las enfermedades cardiovasculares parecen estar ausentes en estos individuos. Hasta la fecha, no se han informado fenotipos clínicos adversos (Minicocci et al. 2013, J of Lipid Research, 54: 3481-3490). Se ha demostrado que la reducción de la ANGPTL3 conduce a una disminución de los niveles de TG, colesterol y LDL en modelos animales (Patente US13/520,997; Patente WO2011/085271). Los ratones deficientes en ANGPTL3 tienen niveles muy bajos de triglicéridos (TG) y colesterol en plasma, mientras que la sobreexpresión produce los efectos opuestos (Koishi et al. 2002; Koster 2005; Fujimoto 2006). En consecuencia, el papel potencial de la ANGPTL3 en el metabolismo de los lípidos lo convierte en una diana atractiva para la intervención terapéutica.
Hasta la fecha, las estrategias terapéuticas para tratar la enfermedad cardiometabólica dirigidas directamente a los niveles de la ANGPTL3 han sido limitadas. Se han sugerido o desarrollado anteriormente fragmentos de polipéptido ANGPTL3 (Patente US12/128,545), anticuerpos anti-ANGPTL3 (Patente US12/001,012) e inhibidores de ácido nucleico de la ANGPTL3, incluidos los oligonucleótidos antisentido (Patente US13/520,997; Patente WO2011/085271), pero ninguno de los compuestos que están dirigidos directamente a ANGPTL3 ha sido aprobado para el tratamiento de enfermedades cardiometabólicas. En consecuencia, existe una necesidad insatisfecha de compuestos para inhibir la ANGPTL3 altamente potentes y tolerables. La divulgación de la presente memoria descriptiva se refiere al descubrimiento de nuevos y muy potentes inhibidores de la expresión de la ANGPTL3 y su utilización en tratamiento.
La Patente WO 2012/177784 analiza ARNbc modificados con GalNAc3 dirigidos a la ANGPTL3, mientras que la Patente WO 2004/072046 analiza los oligonucleótidos antisentido dirigidos a ANGPTL3. Kallanthottathil Rajeev (8th Anual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society (2012)) analiza la administración dirigida de ARNip utilizando GlcNAc3.
Características de la invención
En la presente memoria descriptiva, se da a conocer un compuesto de la fórmula siguiente:
Figure imgf000004_0001
También se da a conocer en la presente memoria descriptiva una composición que comprende el compuesto de la presente invención. También se da a conocer en la presente memoria descriptiva un compuesto o composición de la presente invención para su utilización en terapia.
Características de la presente divulgación
Se ha descrito anteriormente el receptor de asialoglucoproteína (ASGP-R). Véase, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, núm. 47, págs. 17125-17129 (2005). Dichos receptores se expresan en células hepáticas, particularmente en hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden agrupaciones de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, lo que da como resultado la captación del compuesto en la célula. Véase, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, págs.
5216-5231 (mayo de 2008). Por consiguiente, se han utilizado conjugados que comprenden estas agrupaciones de GalNAc para facilitar la captación de determinados compuestos en las células hepáticas, específicamente en los hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que determinados conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En estos casos, el conjugado que contiene GalNAc se une normalmente a la cadena sentido del dúplex de ARNip. Dado que la cadena sentido se descarta antes de que la cadena antisentido se hibride finalmente con el ácido nucleico diana, existe poca preocupación por que el conjugado interfiera en la actividad. Normalmente, el conjugado se une al extremo 3’ de la cadena sentido del ARNip. Véase, por ejemplo, la Patente US8,106,022. Determinados grupos conjugados descritos en la presente memoria descriptiva son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos anteriormente.
En determinados casos, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células) pero posteriormente debe escindirse o no interferir en las etapas posteriores necesarias para la actividad, tales como la hibridación con un ácido nucleico diana y la interacción con la RNasa H o las enzimas asociadas con el corte y empalme o la modulación del corte y empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido monocatenarios que en compuestos de ARNip, en los que el conjugado puede simplemente unirse a la cadena sentido. En la presente memoria descriptiva, se dan a conocer compuestos antisentido monocatenarios conjugados que tienen una potencia mejorada en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio requerido de propiedades para estos compuestos, esta potencia mejorada es sorprendente.
Los grupos conjugados dados a conocer en la presente memoria descriptiva pueden comprender un resto escindible. Tal como se ha indicado, sin desear quedar ligado por un mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente para proporcionar una mejora en la captación, pero después de esto, es deseable que una parte o, idealmente, todo el conjugado se escinda, liberando el compuesto original (por ejemplo, el compuesto antisentido) en su forma más activa. En determinados casos de la presente divulgación, el resto escindible es un nucleósido escindible. Estos casos aprovechan las nucleasas endógenas en la célula al unir el resto del conjugado (la agrupación) al oligonucleótido antisentido mediante un nucleósido a través de uno o más enlaces escindibles, tales como los de un enlace fosfodiéster. En determinados casos de la presente divulgación, la agrupación se une al nucleósido escindible a través de un enlace fosfodiéster. En determinados casos de la presente divulgación, el nucleósido escindible se une al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace fosfodiéster. En determinados casos de la presente divulgación, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En estos casos, dichos nucleósidos escindibles se enlazan entre sí, al compuesto antisentido y/o al grupo mediante enlaces escindibles (tales como los de un enlace fosfodiéster). Determinados conjugados de la presente memoria descriptiva no comprenden un nucleósido escindible y, en su lugar, comprenden un enlace escindible. Se demuestra que la escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido está proporcionada por, como mínimo, un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Estos profármacos se administran a un animal y se metabolizan finalmente a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para eliminar todo o parte del conjugado dando como resultado la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido, que carece de todo o parte del conjugado.
En la presente invención reivindicada, el conjugado se une al extremo 5’ del oligonucleótido. Determinados conjugados 5’ de este tipo se escinden de manera más eficaz que sus homólogos que tienen un grupo conjugado similar unido en el extremo 3’. En determinadas realizaciones, se puede correlacionar la actividad mejorada con una mejor escisión. En determinadas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5’ tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3’ (véanse, por ejemplo, los ejemplos 56, 81, 83 y 84). Además, la unión 5’ permite una síntesis de oligonucleótidos más sencilla. Normalmente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección de 3’ a 5’. Para producir un oligonucleótido conjugado en 3’, se une normalmente un nucleósido 3’ conjugado anteriormente al soporte sólido y, posteriormente, se construye el oligonucleótido de la manera habitual. Sin embargo, la unión de ese nucleósido conjugado al soporte sólido complica la síntesis. Además, utilizando ese enfoque, el conjugado está presente a lo largo de toda la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante las etapas posteriores o puede limitar los tipos de reacciones y reactivos que se pueden utilizar. Utilizando las estructuras y técnicas descritas en la presente memoria descriptiva para oligonucleótidos conjugados en 5’, se puede sintetizar el oligonucleótido utilizando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (más 5’) o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
En vista de la técnica y la presente divulgación, un experto en la materia puede preparar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de la presente memoria descriptiva. Además, la síntesis de determinados de dichos conjugados y oligonucleótidos conjugados dados a conocer en la presente memoria descriptiva es más fácil y/o requiere de pocas etapas y, por lo tanto, es menos costosa que la de los conjugados descritos anteriormente, lo que proporciona ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de determinados grupos conjugados consiste en menos etapas sintéticas, lo que da como resultado un mayor rendimiento, en relación con los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados, tales como GalNAc3-10 en el ejemplo 46 y el GalNAc3-7 en el ejemplo 48 son mucho más simples que los conjugados descritos anteriormente, tales como los descritos en la Patente US8,106,022 o la Patente US7,262,177 que requieren el ensamblaje de más intermedios químicos. Por consiguiente, estos y otros conjugados descritos en la presente memoria descriptiva tienen ventajas sobre los compuestos descritos anteriormente para su utilización con cualquier oligonucleótido, incluidos los oligonucleótidos monocatenarios y cualquiera de las cadenas de oligonucleótidos bicatenarios (por ejemplo, ARNip). De manera similar, se dan a conocer en la presente memoria descriptiva grupos conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Tal como se demuestra, dichos grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Dichos compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc se pueden unir a cualquier compuesto antisentido, incluidos los oligonucleótidos monocatenarios y cualquiera de las cadenas de oligonucleótidos bicatenarios (por ejemplo, ARNip).
En determinadas realizaciones, el conjugado de la presente invención no altera sustancialmente determinadas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, se demuestra en la presente memoria descriptiva que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunógenos que los compuestos originales no conjugados. Dado que se mejora la potencia, las realizaciones en las que la tolerabilidad permanece igual (o, de hecho, incluso si la tolerabilidad empeora sólo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para la terapia.
La conjugación permite alterar los compuestos antisentido de formas que tienen consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, la sustitución de uno o más enlaces fosforotioato de un compuesto antisentido completamente de fosforotioato por enlaces fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, los compuestos antisentido de este tipo que tienen uno o más fosfodiéster son menos inmunógenos que el mismo compuesto en el que cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, tal como se muestra en el ejemplo 26, esa misma sustitución de uno o más enlaces fosforotioato por enlaces fosfodiéster también da como resultado una captación celular reducida y/o pérdida de potencia. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados descritos en la presente memoria descriptiva toleran este cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida de captación y potencia, en comparación con la contraparte completamente de fosforotioato conjugado. De hecho, por ejemplo, en los ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y, como mínimo, un enlace internucleosídico fosfodiéster muestran realmente una potencia aumentada in vivo incluso en relación con una contraparte completamente de fosforotioato que también comprende el mismo conjugado. Además, dado que la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la captación/potencia, una pequeña pérdida en esa ganancia sustancial puede ser aceptable para conseguir una tolerabilidad mejorada.
En determinadas realizaciones, la conjugación del compuesto antisentido de la presente invención da como resultado un aumento de la liberación, captación y actividad en los hepatocitos. De este modo, se administra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en determinadas realizaciones, ese aumento de la liberación por sí solo no explica el aumento total de la actividad. En determinadas de estas realizaciones, entra más compuesto en los hepatocitos. En determinadas realizaciones, incluso ese aumento de la captación de hepatocitos no explica todo el aumento de actividad. En estas realizaciones, aumenta la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 102, determinadas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para los oligonucleótidos que se dirigen a genes que se expresan en hepatocitos.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado de la presente invención da como resultado una exposición renal reducida. Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden determinadas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son menores en el riñón que las de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para indicaciones terapéuticas en las que no se busca actividad en el riñón, la exposición al riñón conlleva el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, una concentración elevada en el riñón da como resultado, normalmente, la pérdida de compuesto en la orina, lo que da como resultado una eliminación más rápida. Por consiguiente, para las dianas no renales, la acumulación renal no es deseable.
La presente invención da a conocer compuestos antisentido conjugados representados por la siguiente estructura.
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Determinadas realizaciones dan a conocer una composición que comprende el compuesto antisentido conjugado de la presente invención, o una sal del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En determinadas realizaciones, la modulación de la expresión de la ANGPTL3 se produce en una célula o tejido. En determinadas realizaciones, las modulaciones se producen en una célula o tejido de un animal. En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de ARNm de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, la modulación es una reducción en el nivel de la proteína ANGPTL3. En determinadas realizaciones, se reducen los niveles de proteína y ARNm de la ANGPTL3. Esta reducción puede tener lugar de una manera dependiente del tiempo o dependiente de la dosis.
Determinadas realizaciones dan a conocer el compuesto de la presente invención o composiciones del compuesto de la presente invención para su utilización en terapia. Determinadas realizaciones dan a conocer el compuesto de la presente invención o composiciones del compuesto de la presente invención para prevenir, tratar, retrasar, ralentizar la progresión y/o mejorar enfermedades, trastornos y afecciones relacionadas con la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, estas enfermedades, trastornos y afecciones son enfermedades, trastornos y afecciones cardiovasculares y/o metabólicas.
Descripción detallada de la invención
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la presente invención, tal como se reivindica. En la presente memoria descriptiva, la utilización del singular incluye el plural, a menos que se indique específicamente lo contrario. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la utilización de “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Además, la utilización de la expresión “entre los o las que se incluyen” así como otras formas, tales como “que incluye” e “incluido”, no es limitante. Además, términos como “elemento” o “componente” abarcan elementos y componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los títulos de las secciones que se utilizan en la presente memoria descriptiva son solo para fines organizativos y no se deben interpretar como una limitación del tema descrito.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con la química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica y los procedimientos y técnicas de las mismas, descritas en la presente memoria descriptiva, son las bien conocidas y utilizadas de manera común en la técnica. Se pueden utilizar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico. Determinadas técnicas y procedimientos de este tipo se pueden encontrar, por ejemplo, en “Carbohydrate Modifications in Antisense Research”, editado por Sangvi y Cook, American Chemical Society, Washington DC, 1994; “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, 21a edición, 2005; y “Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications”, editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido” significa un compuesto que comprende un resto de nucleobase y un resto de azúcar. Entre los nucleósidos se incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos de origen natural (tales como los que se encuentran en el ADN y ARN) y nucleósidos modificados. Los nucleósidos pueden estar enlazados a un resto fosfato.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “modificación química” significa una diferencia química en un compuesto cuando se compara con una contraparte de origen natural. Entre las modificaciones químicas de los oligonucleótidos se incluyen modificaciones de nucleósidos (incluidas modificaciones de restos de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “furanosilo” significa una estructura que comprende un anillo de 5 miembros que comprende cuatro átomos de carbono y un átomo de oxígeno.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar de origen natural” significa un ribofuranosilo tal como se encuentra en el ARN de origen natural o un desoxirribofuranosilo tal como se encuentra en el ADN de origen natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar” significa un resto de azúcar de origen natural o un resto de azúcar modificado de un nucleósido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar modificado” significa un resto de azúcar sustituido o un sustituto de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar sustituido” significa un furanosilo que no es un resto de azúcar de origen natural. Entre los restos de azúcar sustituidos se incluyen, sin constituir limitación, furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2’, la posición 3’, la posición 5’ y/o la posición 4’. Determinados restos de azúcar sustituidos son restos de azúcar bicíclicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar sustituido en 2’” significa un furanosilo que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un resto de azúcar sustituido en 2’ no es un resto de azúcar bicíclico (es decir, el sustituyente 2’ de un resto de azúcar sustituido en 2’ no forma un puente con otro átomo del anillo de furanosilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “MOE” significa -OCH2CH2OCH3.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido 2’-F” se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende flúor en la posición 2’. A menos que se indique lo contrario, el flúor en un nucleósido 2’-F está en la posición ribo (sustituyendo el OH de una ribosa natural).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “sustituto de azúcar” significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de sustituir el resto de azúcar de origen natural de un nucleósido, de modo que las subunidades de nucleósidos resultantes son capaces de enlazarse entre sí y/o enlazarse a otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridar con un compuesto oligomérico complementario. Entre estas estructuras se incluyen anillos que comprenden un número diferente de átomos que el furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); sustitución del oxígeno de un furanosilo por un átomo que no es oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como una sustitución del oxígeno. Dichas estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para los restos de azúcar sustituidos (por ejemplo, sustitutos de azúcar carbocíclicos bicíclicos de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos de azúcar también incluyen sustituciones de azúcar más complejas (por ejemplo, sistemas sin anillo de ácido nucleico peptídico). Entre los sustitutos del azúcar se incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto de azúcar bicíclico” significa un resto de azúcar modificado que comprende un anillo de 4 a 7 miembros (que incluye, sin constituir limitación, un furanosilo) que comprende un puente que conecta dos átomos del anillo de 4 a 7 miembros para formar un segundo anillo, lo que da como resultado una estructura bicíclica. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un anillo de azúcar. En determinadas realizaciones, el anillo de 4 a 7 miembros es un furanosilo. En determinadas de estas realizaciones, el puente conecta el carbono 2’ y el carbono 4’ del furanosilo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleótido” significa un nucleósido que comprende además un grupo de enlace fosfato. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósidos enlazados” pueden estar enlazados o no mediante enlaces fosfato y, de este modo, se incluyen, sin constituir limitación, “nucleótidos enlazados”. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósidos enlazados” son nucleósidos que están conectados en una secuencia continua (es decir, no están presentes nucleósidos adicionales entre los que están enlazados).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleobase” significa un grupo de átomos que se puede enlazar a un resto de azúcar para crear un nucleósido que es capaz de incorporarse en un oligonucleótido, y en el que el grupo de átomos es capaz de unirse con una nucleobase complementaria de origen natural de otro oligonucleótido o ácido nucleico. Las nucleobases pueden ser de origen natural o pueden estar modificadas. “Secuencia de nucleobases” significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace o modificación de nucleobase.
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, los términos “nucleobase no modificada” o “nucleobase de origen natural” significan las nucleobases heterocíclicas de origen natural de ARN o ADN: las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) (incluida la 5-metil C) y uracilo (U).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleobase modificada” significa cualquier nucleobase que no es una nucleobase de origen natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido modificado” significa un nucleósido que comprende, como mínimo, una modificación química en comparación con los nucleósidos de ARN o ADN de origen natural. Los nucleósidos modificados comprenden un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido bicíclico” o “BNA” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido de etilo restringido” o “cEt” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4’-CH(CH3)-O-2’ .
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido de ácido nucleico bloqueado” o “LNA” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4’-CH2-O-2’ .
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleósido sustituido en 2’” significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto de H u OH. A menos que se indique lo contrario, un nucleósido sustituido en 2’ no es un nucleósido bicíclico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “desoxinucleósido” significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar furanosilo 2’-H, tal como los que se encuentran en los desoxirribonucleósidos (ADN) de origen natural. En determinadas realizaciones, un 2’-desoxinucleósido puede comprender una nucleobase modificada o puede comprender una nucleobase de ARN (por ejemplo, uracilo).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “oligonucleótido” significa un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) no modificados y/o desoxirribonucleósidos (ADN) no modificados y/o uno o más nucleósidos modificados.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “oligonucleósido” significa un oligonucleótido en el que ninguno de los enlaces internucleosídicos contiene un átomo de fósforo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, entre los oligonucleótidos se incluyen los oligonucleósidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “oligonucleótido modificado” significa un oligonucleótido que comprende, como mínimo, un nucleósido modificado y/o, como mínimo, un enlace internucleosídico modificado. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace” o “grupo de enlace” significa un grupo de átomos que enlazan entre sí dos o más grupos diferentes de átomos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace internucleosídico” significa un enlace covalente entre nucleósidos adyacentes en un oligonucleótido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace internucleosídico de origen natural” significa un enlace fosfodiéster 3’ a 5’.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace internucleosídico modificado” significa cualquier enlace internucleosídico distinto de un enlace internucleosídico de origen natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace internucleosídico terminal” significa el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o una región definida del mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace de fósforo” significa un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Entre los grupos de enlace de fósforo se incluyen, sin constituir limitación, grupos que tienen la fórmula:
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en la que:
Ra y Rd son cada uno, independientemente, O, S, CH2, NH, o NJ1 en la que Ji es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
Rb es O o S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6 , alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6 , alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
Entre los grupos de enlace de fósforo se incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriéster y boranofosfato.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace de fósforo internucleosídico” significa un grupo de enlace de fósforo que enlaza directamente dos nucleósidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace de fósforo no internucleósido” significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleósido enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace neutro” significa un grupo de enlace que no está cargado. Entre los grupos de enlace neutros se incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(=O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Entre otros grupos de enlace neutros se incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (véase, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi y P. D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (págs. 40-65)). Entre otros grupos de enlace neutros se incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes de componentes mixtos de N, O, S y CH2.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace internucleosídico neutro” significa un grupo de enlace neutro que enlaza directamente dos nucleósidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo de enlace neutro no internucleosídico” significa un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En determinadas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuesto oligomérico” significa una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende uno o más grupos conjugados y/o grupos terminales. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico consiste en un oligonucleótido. Entre los compuestos oligoméricos también se incluyen ácidos nucleicos de origen natural. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico comprende una cadena principal de una o más subunidades monoméricas enlazadas en la que cada subunidad monomérica enlazada está unida directa o indirectamente a un resto de base heterocíclico. En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos también pueden incluir subunidades monoméricas que no están enlazadas a un resto de base heterocíclica, proporcionando de este modo sitios abásicos. En determinadas realizaciones, se pueden modificar independientemente los enlaces que unen las subunidades monoméricas, los restos o sustitutos de azúcar y los restos de bases heterocíclicas. En determinadas realizaciones, la unidad de enlace-azúcar, que puede incluir o no una base heterocíclica, puede estar sustituida con un mimético, tal como los monómeros de los ácidos nucleicos peptídicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo terminal” significa uno o más átomos unidos al extremo 3’ o al extremo 5’ o a ambos, de un oligonucleótido. En determinadas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En determinadas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos de grupo terminal.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “conjugado” o “grupo conjugado” significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidos, entre las que se incluyen, sin constituir limitación, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, de absorción, de distribución celular, de captación celular, de carga y/o de eliminación.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlazador conjugado” o “enlazador” en el contexto de un grupo conjugado significa una porción de un grupo conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1) un oligonucleótido a otra porción del grupo conjugado o (2) dos o más porciones del grupo conjugado.
Los grupos conjugados se muestran en la presente memoria descriptiva como radicales, que proporcionan un enlace para formar una unión covalente a un compuesto oligomérico, tal como un oligonucleótido antisentido. En determinadas realizaciones, el punto de unión del compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3’ del grupo hidroxilo 3’ del nucleósido terminal 3’ del compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, el punto de unión del compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5’ del grupo hidroxilo 5’ del nucleósido terminal 5’ del compuesto oligomérico. En determinadas realizaciones, el enlace para formar la unión al compuesto oligomérico es un enlace escindible. En determinadas de estas realizaciones, dicho enlace escindible constituye todo o parte de un resto escindible.
En determinadas realizaciones, los grupos conjugados comprenden un resto escindible (por ejemplo, un enlace escindible o un nucleósido escindible) y una porción de agrupación de carbohidratos, tal como una porción de agrupación de GalNAc. Esta porción de agrupación de carbohidratos comprende: un resto de dirección y, opcionalmente, un enlazador conjugado. En determinadas realizaciones, la porción de la agrupación de carbohidratos se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la porción de agrupación de carbohidratos comprende 3 grupos GalNAc y se denomina “GalNAc3”. En determinadas realizaciones, la porción de agrupación de carbohidratos comprende 4 grupos GalNAc y se denomina “GalNAc4”. Las porciones de agrupaciones de carbohidratos específicas (que tienen grupos enlazadores de unión, ramificación y conjugados específicos) se describen en la presente memoria descriptiva y se designan con un número romano seguido del subíndice “a”. Por consiguiente, “GalNAc3-1a” se refiere a una porción específica de agrupación de carbohidratos de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNac y grupos de unión, ramificación y enlace identificados específicamente. Este fragmento de agrupación de carbohidratos se une a un compuesto oligomérico mediante un resto escindible, tal como un enlace escindible o nucleósido escindible.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resto escindible” (CM, de “Cleavable Moiety”) significa un enlace o grupo que se puede dividir en condiciones fisiológicas. En determinadas realizaciones, un resto escindible se escinde dentro de una célula o compartimentos subcelulares, tales como un lisosoma. En determinadas realizaciones, un resto escindible se escinde mediante enzimas endógenas, tales como nucleasas. En determinadas realizaciones, un resto escindible comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enlace escindible” significa cualquier enlace químico capaz de dividirse. En determinadas realizaciones, un enlace escindible se selecciona entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster de fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “agrupación de carbohidratos” significa un compuesto que tiene uno o más residuos de carbohidratos unidos a una matriz o grupo enlazador. (véase, por ejemplo, Maier et al., “Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting”, Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, o Rensen et al., “Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor”, J. Med Chem 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de agrupaciones conjugadas de carbohidratos). Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “carbohidrato modificado” significa cualquier carbohidrato que tenga una o más modificaciones químicas con respecto a los carbohidratos de origen natural.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “derivado de carbohidrato” significa cualquier compuesto que se pueda sintetizar utilizando un carbohidrato como material de partida o intermedio.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “carbohidrato” significa un carbohidrato de origen natural, un carbohidrato modificado o un derivado de carbohidrato.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “grupo protector” significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la materia. Pueden encontrarse ejemplos no limitantes de grupos protectores en “Protective Groups in Organic Chemistry”, TW Greene, PGM Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “monocatenario” significa un compuesto oligomérico que no está hibridado con su complemento y que carece de autocomplementariedad suficiente para formar un auto-dúplex estable.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “bicatenario” significa un par de compuestos oligoméricos que hibridan entre sí o un único compuesto oligomérico autocomplementario que forma una estructura de horquilla. En determinadas realizaciones, un compuesto oligomérico bicatenario comprende un primer y un segundo compuesto oligomérico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuesto antisentido” significa un compuesto que comprende o consiste en un oligonucleótido, como mínimo, una porción del cual es complementaria a un ácido nucleico diana con el que es capaz de hibridar, dando como resultado, como mínimo, una actividad antisentido. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “actividad antisentido” significa cualquier cambio detectable y/o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación de la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico diana (por ejemplo, ARNm). En determinadas realizaciones, la actividad antisentido incluye la modulación del corte y empalme de pre-ARNm.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuesto antisentido basado en RNasa H” significa un compuesto antisentido en el que, como mínimo, parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido con un ácido nucleico diana y la posterior escisión del ácido nucleico diana mediante RNasa H.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuesto antisentido basado en RISC” significa un compuesto antisentido en el que, como mínimo, parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al complejo silenciador inducido por ARN (RISC, de RNA Induced Silencing Complex).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “detectar” o “medir” significa que se realiza una prueba o ensayo para detectar o medir. Esta detección y/o medición puede dar como resultado un valor de cero. De este modo, si un ensayo de detección o medición da como resultado un hallazgo de ausencia de actividad (actividad de cero), sin embargo, se ha realizado la etapa de detectar o medir la actividad.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “actividad detectable y/o medible” significa una actividad estadísticamente significativa que no es cero.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “esencialmente sin cambios” significa poco o ningún cambio en un parámetro particular, particularmente en relación con otro parámetro que cambia mucho más. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente cuando cambia menos del 5 %. En determinadas realizaciones, un parámetro no cambia esencialmente si cambia menos del doble mientras que otro parámetro cambia, como mínimo, diez veces. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una actividad antisentido es un cambio en la cantidad de un ácido nucleico diana. En determinadas de estas realizaciones, la cantidad de un ácido nucleico no diana esencialmente no cambia si cambia mucho menos de lo que lo hace el ácido nucleico diana, pero no es necesario que el cambio sea cero.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “expresión” significa el proceso por el cual un gen da como resultado finalmente una proteína. La expresión incluye, sin constituir limitación, transcripción, modificación postranscripcional (por ejemplo, corte y empalme, poliadenización, adición de caperuza 5’) y traducción.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “ácido nucleico diana” significa una molécula de ácido nucleico con la que se pretende que hibride un compuesto antisentido para dar como resultado una actividad antisentido deseada. Los oligonucleótidos antisentido tienen suficiente complementariedad con sus ácidos nucleicos diana para permitir la hibridación en condiciones fisiológicas.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “complementariedad de nucleobase” o “complementariedad”, cuando se hace referencia a nucleobases, significa una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En determinadas realizaciones, nucleobase complementaria significa una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera que es complementario en ese par de nucleobases. Las nucleobases que comprenden determinadas modificaciones pueden mantener la capacidad de emparejarse con una nucleobase homóloga y, de este modo, todavía son capaces de tener complementariedad de nucleobases.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “no complementariedad” en referencia a nucleobases, significa un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “complementariedad” en referencia a compuestos oligoméricos (por ejemplo, nucleósidos, oligonucleótidos o ácidos nucleicos enlazados) significa la capacidad de dichos compuestos oligoméricos o regiones de los mismos para hibridar con otro compuesto oligomérico o región del mismo mediante complementariedad de nucleobases. Los compuestos oligoméricos complementarios no necesitan tener complementariedad de nucleobases en cada nucleósido. Por el contrario, se toleran algunos emparejamientos erróneos. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios tienen complementariedad en el 70 % de las nucleobases (complementariedad del 70 %). En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios tienen una complementariedad del 80 %. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios tienen una complementariedad del 90 %. En determinadas realizaciones, las regiones o compuestos oligoméricos complementarios tienen una complementariedad del 95 %. En determinadas realizaciones, los compuestos o las regiones oligoméricos complementarios tienen una complementariedad del 100 %.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “emparejamiento erróneo” significa una nucleobase de un primer compuesto oligomérico que no es capaz de emparejarse con una nucleobase en una posición correspondiente de un segundo compuesto oligomérico, cuando el primer y el segundo compuesto oligomérico están alineados. El primer o el segundo compuesto oligomérico o ambos pueden ser oligonucleótidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “hibridación” significa el emparejamiento de compuestos oligoméricos complementarios (por ejemplo, un compuesto antisentido y su ácido nucleico diana). Aunque no se limita a un mecanismo particular, el mecanismo más común de emparejamiento implica enlaces de hidrógeno, que pueden ser de enlace de hidrógeno de Watson-Crick, de Hoogsteen o de Hoogsteen invertido, entre nucleobases complementarias.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “que híbrida específicamente” significa la capacidad de un compuesto oligomérico de hibridar con un sitio de ácido nucleico con mayor afinidad de lo que hibrida con otro sitio de ácido nucleico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “complementariedad completa” en referencia a un oligonucleótido o porción del mismo significa que cada nucleobase del oligonucleótido o porción del mismo es capaz de emparejarse con una nucleobase de un ácido nucleico complementario o porción contigua del mismo. De este modo, una región completamente complementaria no comprende emparejamientos erróneos ni nucleobases sin hibridar en ninguna de las cadenas.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “porcentaje de complementariedad” significa el porcentaje de nucleobases de un compuesto oligomérico que son complementarias a una porción de igual longitud de un ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad se calcula dividiendo el número de nucleobases del compuesto oligomérico que son complementarias a las nucleobases en las posiciones correspondientes en el ácido nucleico diana por la longitud total del compuesto oligomérico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “porcentaje de identidad” significa el número de nucleobases en un primer ácido nucleico que son del mismo tipo (independientemente de la modificación química) que las nucleobases en las posiciones correspondientes en un segundo ácido nucleico, dividido por el número total de nucleobases en el primer ácido nucleico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “modulación” significa un cambio de la cantidad o la calidad de una molécula, función o actividad, en comparación con la cantidad o calidad de una molécula, función o actividad antes de la modulación. Por ejemplo, la modulación incluye el cambio, ya sea un aumento (estimulación o inducción) o una disminución (inhibición o reducción) en la expresión génica. Como un ejemplo adicional, la modulación de la expresión puede incluir un cambio en la selección del sitio de empalme del procesamiento del pre-ARNm, dando como resultado un cambio en la cantidad absoluta o relativa de una variante de empalme particular en comparación con la cantidad en ausencia de modulación.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo químico” significa un patrón de modificaciones químicas en un oligonucleótido o una región del mismo. Los motivos se pueden definir mediante modificaciones en determinados nucleósidos y/o en determinados grupos de enlace de un oligonucleótido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo de nucleósido” significa un patrón de modificaciones de nucleósido en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de este oligonucleótido pueden estar modificados o sin modificar. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los motivos de la presente memoria descriptiva que describen solo nucleósidos sean motivos de nucleósidos. De este modo, en estos casos, los enlaces no están limitados.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo de azúcar” significa un patrón de modificaciones de azúcar en un oligonucleótido o una región del mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo de enlace” significa un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o región del mismo. Los nucleósidos de este oligonucleótido pueden estar modificados o sin modificar. A menos que se indique lo contrario, se pretenden que los motivos de la presente memoria descriptiva que describen únicamente enlaces sean motivos de enlace. De este modo, en estos casos, los nucleósidos no están limitados.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo de modificación de nucleobases” significa un patrón de modificaciones en nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de nucleobases.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “motivo de secuencia” significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, de este modo, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo la ausencia de modificaciones químicas.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “tipo de modificación” en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un “tipo” significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un “nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo” puede ser un nucleósido no modificado.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “modificado de manera diferente” significa modificaciones químicas o sustituyentes químicos que son diferentes entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. De este modo, por ejemplo, un nucleósido MOE y un nucleósido de ADN no modificado están “modificados de manera diferente”, aunque el nucleósido de ADN no esté modificado. Asimismo, el ADN y el ARN están “modificados de manera diferente”, aunque ambos sean nucleósidos no modificados de origen natural. Los nucleósidos que son iguales pero que comprenden diferentes nucleobases no están modificados de manera diferente. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2’-OMe y una nucleobase de adenina no modificada y un nucleósido que comprende un azúcar modificado 2’-OMe y una nucleobase de timina no modificada no están modificados de manera diferente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “el mismo tipo de modificaciones” se refiere a modificaciones que son iguales entre sí, incluyendo la ausencia de modificaciones. De este modo, por ejemplo, dos nucleósidos de ADN no modificados tienen “el mismo tipo de modificación”, aunque el nucleósido de a Dn no esté modificado. Dichos nucleósidos que tienen el mismo tipo de modificación pueden comprender diferentes nucleobases.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “regiones separadas” significa porciones de un oligonucleótido en las que las modificaciones químicas o el motivo de modificaciones químicas de cualquier porción vecina incluye, como mínimo, una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan entre sí.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable” significa cualquier sustancia adecuada para su utilización en la administración a un animal. En determinadas realizaciones, un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril. En determinadas realizaciones, dicha solución salina estéril es una solución salina de calidad farmacéutica.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “trastorno metabólico” significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por una desregulación del metabolismo, el complejo conjunto de reacciones químicas asociadas con la descomposición de los alimentos para producir energía.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “enfermedad cardiovascular” o “trastorno cardiovascular” significa una enfermedad o afección caracterizada principalmente por una función alterada del corazón o de los vasos sanguíneos. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos cardiovasculares se incluyen, sin constituir limitación, aneurisma, angina, arritmia, aterosclerosis, enfermedad cerebrovascular (accidente cerebrovascular), cardiopatía coronaria, hipertensión, dislipidemia, hiperlipidemia e hipercolesterolemia.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “sistema de anillo monocíclico o policíclico” pretende incluir todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillo de radicales simples o policíclicos en los que los anillos están condensados o enlazados y pretende incluir sistemas de anillos simples y mixtos seleccionados individualmente entre alifáticos, alicíclicos, arílicos, heteroarílicos, aralquílicos, arilalquílicos, heterocíclicos, heteroarílicos, heteroaromáticos y heteroarilalquílicos. Dichas estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen, cada uno, el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tiene grados variables de saturación, entre los que se incluyen completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos de anillo seleccionados entre C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos, así como anillos que comprenden solo átomos de anillo de C que pueden estar presentes en un motivo mixto tal como, por ejemplo, bencimidazol en el que un anillo solo tiene átomos de anillo de carbono y el anillo condensado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillo mono o policíclico se puede sustituir adicionalmente con grupos sustituyentes tales como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =0 unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillos mono o policíclicos se pueden unir a moléculas originales utilizando diversas estrategias, tales como directamente a través de un átomo del anillo, condensados a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o mediante un resto de enlace bifuncional.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “profármaco” significa una forma inactiva o menos activa de un compuesto que, cuando se administra a un individuo, se metaboliza para formar el compuesto activo o más activo (por ejemplo, un fármaco).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “sustituyente” y “grupo sustituyente” significa un átomo o grupo que sustituye el átomo o grupo de un compuesto original mencionado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiera del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido natural (por ejemplo, un sustituyente modificado en 2’ es cualquier átomo o grupo en la posición 2’ de un nucleósido diferente a H u OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o desprotegidos. En determinadas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una posición del compuesto original o más de una del mismo. Los sustituyentes también pueden estar sustituidos adicionalmente con otros grupos sustituyentes y se pueden unir directamente o mediante un grupo de enlace, tal como un grupo alquilo o hidrocarbilo, a un compuesto original.
Asimismo, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “sustituyente” en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos normalmente presentes en el grupo funcional mencionado. En determinadas realizaciones, un sustituyente sustituye un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en determinadas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que sustituye uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, entre los grupos susceptibles para su utilización como sustituyentes se incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi, oxi sustituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino (=NRbb), amido (-C(O)N-(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2 Rbb) y sulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) 0 -N(Rbb)S(O)2 Rbb). En los que cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferente en la que se incluyen, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en la presente memoria descriptiva están presentes en un grado recurrente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alquilo”, como se utiliza en la presente memoria descriptiva, significa un radical hidrocarburo saturado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Entre los ejemplos de grupos alquilo se incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen normalmente de 1 a, aproximadamente, 24 átomos de carbono, más normalmente, de 1 a, aproximadamente, 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) siendo más preferente de 1 a, aproximadamente, 6 átomos de carbono.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alquenilo” significa un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene, como mínimo, un doble enlace carbono-carbono. Entre los ejemplos de grupos alquenilo se incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1 -metil-2-buten-1 -ilo, dienos, tales como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen, normalmente, de 2 a, aproximadamente, 24 átomos de carbono, más normalmente, de 2 a, aproximadamente, 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 2 a, aproximadamente, 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alquinilo” significa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene, como mínimo, un triple enlace carbono-carbono. Entre los ejemplos de grupos alquinilo se incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen, normalmente, de 2 a, aproximadamente, 24 átomos de carbono, más normalmente, de 2 a, aproximadamente 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 2 a, aproximadamente, 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “acilo” significa un radical formado por eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la fórmula general -C(O)-X en la que X es, normalmente, alifático, alicíclico o aromático. Entre los ejemplos se incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alicíclico” significa un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que, como mínimo, un anillo es alifático. Entre los alicíclicos preferentes se incluyen anillos que tienen de, aproximadamente, 5 a, aproximadamente, 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alifático” significa un radical hidrocarburo lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en el que la saturación entre dos átomos de carbono cualesquiera es un enlace simple, doble o triple. Preferentemente, un grupo alifático contiene de 1 a, aproximadamente, 24 átomos de carbono, más normalmente, de 1 a, aproximadamente, 12 átomos de carbono, siendo más preferente de 1 a, aproximadamente, 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede estar interrumpida con uno o más heteroátomos entre los que se incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Entre dichos grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos se incluyen, sin limitación, polialcoxis, tales como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “alcoxi” significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en el que el átomo de oxígeno se utiliza para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Entre los ejemplos de grupos alcoxi se incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “aminoalquilo” significa un radical alquilo C1-C12 sustituido con amino. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino puede estar situado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, “aralquilo” y “arilalquilo” significan un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción del radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Entre los ejemplos se incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, al arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, “arilo” y “aromático” significan radicales del sistema de anillos carbocíclicos mono o policíclicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Entre los ejemplos de grupos arilo se incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillos de arilo preferentes tienen de, aproximadamente, 5 a, aproximadamente, 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, “halo” y “halógeno” significan un átomo seleccionado entre flúor, cloro, bromo y yodo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “heteroarilo” y “heteroaromático” significan un radical que comprende un anillo aromático mono o policíclico, sistema de anillo o sistema de anillo condensado en el que, como mínimo, uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se pretende que heteroarilo incluya sistemas de anillos condensados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos condensados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen normalmente un átomo de anillo seleccionado entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Entre los ejemplos de grupos heteroarilo se incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo se pueden unir a una molécula original directamente o mediante un resto de enlace, tal como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo, tal como se utilizan en la presente memoria descriptiva, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuesto conjugado” significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados adecuado para utilizar como un grupo conjugado. En determinadas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o proporcionar una o más propiedades, entre las que se incluyen, sin constituir limitación, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o eliminación.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique o modifique de algún otro modo, el término “bicatenario” se refiere a dos compuestos oligoméricos separados que hibridan entre sí. Dichos compuestos bicatenarios pueden tener uno o más nucleósidos que no hibridantes en uno o ambos extremos de una o ambas cadenas (salientes) y/o uno o más nucleósidos internos no hibridantes (emparejamientos erróneos) siempre que haya suficiente complementariedad para mantener la hibridación en condiciones fisiológicamente relevantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “2’-O-metoxietilo” (también 2’-MOE y 2’-O(CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxietilo de la posición 2’ de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado con 2’-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “nucleótido 2’-O-metoxietílico” significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2’-O-metoxietilo.
“Sitio diana 3’ “ o “sitio de parada 3’” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 3’ de un compuesto antisentido particular.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “sitio diana 5’” o “sitio de inicio 5’” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5’ de un compuesto antisentido particular.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “5-metilcitosina” significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5’. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “aproximadamente” significa ±10 % de un valor. Por ejemplo, si se indica, “un marcador se puede aumentar en, aproximadamente, un 50 %”, se implica que el marcador se puede aumentar entre un 45 % y un 55 %.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “agente activo farmacéutico” significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a la ANGPTL3 es un agente activo farmacéutico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “región diana activa” o “región diana” significa una región a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido activos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “compuestos antisentido activos” significan compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “adipogénesis” significa el desarrollo de células grasas a partir de preadipocitos. “Lipogénesis” significa la producción o formación de grasa, ya sea degeneración grasa o infiltración grasa.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “adiposidad” u “obesidad” se refiere al estado de obesidad o una cantidad excesivamente alta de grasa corporal o tejido adiposo en relación con la masa corporal magra. La cantidad de grasa corporal incluye la preocupación tanto por la distribución de la grasa por todo el cuerpo como por el tamaño y la masa de los depósitos de tejido adiposo. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante medidas de pliegues cutáneos, relaciones de circunferencia de cintura a cadera o técnicas como ultrasonidos, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, las personas con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesas. El término “obesidad”, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva incluye estados en los que hay un aumento de grasa corporal más allá del requerimiento físico como resultado de una acumulación excesiva de tejido adiposo en el cuerpo. El término “obesidad” incluye, sin constituir limitación, los siguientes estados: obesidad de inicio en la edad adulta; obesidad alimentaria; obesidad endógena o metabólica; obesidad endocrina; obesidad familiar; obesidad hiperinsulinar; obesidad hiperplásica-hipertrófica; obesidad hipogonadal; obesidad hipotiroidea; obesidad de por vida; obesidad mórbida y obesidad exógena.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “administrado simultáneamente” se refiere a la coadministración de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración simultánea no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “administrar” significa proporcionar un agente a un animal e incluye, sin constituir limitación, administrarlo por un profesional médico y autoadministrarse.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “agente” significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. “Primer agente” significa un compuesto terapéutico de la presente invención. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a la ANGPTL3. “Segundo agente” significa un segundo compuesto terapéutico de la presente invención (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido a ANGPTL3) y/o un compuesto terapéutico que no está relacionado con la ANGPTL3.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “mejoría” se refiere a una disminución de, como mínimo, un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociados. La severidad de los indicadores se puede determinar mediante mediciones subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “ANGPTL3” significa cualquier ácido nucleico o proteína de la ANGPTL3.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “expresión de la ANGPTL3” significa el nivel de ARNm transcrito a partir del gen que codifica la ANGPTL3 o el nivel de proteína traducida a partir del ARNm. La expresión de la ANGPTL3 se puede determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como transferencia Northern o Western.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “ácido nucleico de la ANGPTL3” significa cualquier ácido nucleico que codifica la ANGPTL3. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un ácido nucleico de la ANGPTL3 incluye una secuencia de ADN que codifica la ANGPTL3, una secuencia de ARN transcrita a partir del ADN que codifica la ANGPTL3 (que incluye ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica la ANGPTL3. “ARNm de la ANGPTL3” significa un ARNm que codifica una proteína ANGPTL3.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “animal” se refiere a un animal humano o no humano, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, monos y chimpancés.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “lipoproteína que contiene ApoB” significa cualquier lipoproteína que tiene la apolipoproteína B como su componente proteico, y se entiende que incluye LDL, VLDL, IDL y lipoproteína (a) y generalmente puede ser diana de agentes y terapias reductoras de lípidos. “LDL que contiene ApoB-100” significa LDL que contiene la isoforma de ApoB-100.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “aterosclerosis” significa un endurecimiento de las arterias que afecta a arterias grandes y medianas y se caracteriza por la presencia de depósitos grasos. Los depósitos grasos se denominan “ateromas” o “placas”, que consisten principalmente en colesterol y otras grasas, calcio y tejido cicatricial, y dañan el revestimiento de las arterias.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enfermedad cardiometabólica” o “trastorno cardiometabólico” son enfermedades o trastornos que afectan tanto al sistema cardiovascular como al sistema metabólico. Entre los ejemplos de enfermedades o trastornos cardiometabólicos se incluyen, sin constituir limitación, diabetes y dislipidemias.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “coadministración” significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de la misma o diferentes vías de administración. La coadministración comprende la administración paralela o secuencial. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “colesterol” es una molécula de esterol que se encuentra en las membranas celulares de todos los tejidos animales. El colesterol debe ser transportado en el plasma sanguíneo de un animal mediante lipoproteínas que incluyen lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de densidad elevada (HDL). “Colesterol en plasma” se refiere a la suma de todas las lipoproteínas (VDL, IDL, LDL, HDL) esterificadas y/o el colesterol no esterificado presente en el plasma o suero.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “inhibidor de la absorción de colesterol” significa un agente que inhibe la absorción de colesterol exógeno obtenido de la dieta.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “cardiopatía coronaria (CHD, de Coronary heart disease)” significa un estrechamiento de los pequeños vasos sanguíneos que suministran sangre y oxígeno al corazón, que a menudo es el resultado de la aterosclerosis.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “diabetes mellitus” o “diabetes” es un síndrome caracterizado por un metabolismo desordenado y un nivel de azúcar en sangre anormalmente elevado (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son producción excesiva de orina (poliuria) debido a niveles elevados de glucosa en sangre, sed excesiva y aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) que intenta compensar el aumento de la micción, visión borrosa debido a los efectos de la elevada glucosa en sangre sobre la óptica del ojo, pérdida inexplicable de peso y letargo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “dislipidemia diabética” o “diabetes tipo 2 con dislipidemia” significa una afección caracterizada por diabetes tipo 2, HDL-C reducido, triglicéridos elevados y partículas LDL densas pequeñas elevadas.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “diluyente” significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “dislipidemia” se refiere a un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, que incluye la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias se pueden manifestar por la elevación de lípidos tales como el colesterol y los triglicéridos, así como por las lipoproteínas, tales como el colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “unidad de dosificación” significa una forma en la que se proporciona un agente farmacéutico, por ejemplo, píldora, comprimido u otra unidad de dosificación conocida en la técnica. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido liofilizado. En determinadas realizaciones, una unidad de dosificación es un vial que contiene oligonucleótido antisentido reconstituido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “dosis” significa una cantidad específica de un agente farmacéutico, proporcionada en una sola administración o en un período de tiempo específico. En determinadas realizaciones, se puede administrar una dosis en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden utilizar dos o más inyecciones para conseguir la dosis deseada. En determinadas realizaciones, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes. Las dosis se pueden expresar en mg/kg o g/kg. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “cantidad eficaz” o “cantidad terapéuticamente eficaz” significa la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para producir un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “glucosa” es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermedio metabólico. “Glucosa en plasma” se refiere a la glucosa presente en el plasma. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “lipoproteína C de densidad elevada (HDL-C)” significa colesterol asociado con partículas de lipoproteína de densidad elevada. La concentración de HDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dl o nmol/l. “HDL-C en suero” y “HDL-C en plasma” significan HDL-C en suero y plasma, respectivamente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “inhibidor de la HMG-CoA reductasa” significa un agente que actúa mediante la inhibición de la enzima HMGCoA reductasa, tal como atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina y simvastatina.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “hipercolesterolemia” significa una afección caracterizada por colesterol o colesterol circulante (plasma), colesterol LDL y colesterol VLDL elevados, según las directrices del Informe del Panel de Expertos del Programa Nacional de Educación sobre el Colesterol (NCEP) de Detección. Evaluación del tratamiento del colesterol alto en adultos (véase Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “hiperlipidemia” o “hiperlipemia” es una afección caracterizada por lípidos séricos o lípidos circulantes (plasmáticos) elevados. Esta condición manifiesta una concentración anormalmente elevada de grasas. Las fracciones lipídicas en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad y triglicéridos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “hipertrigliceridemia” significa una condición caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “identificar” o “seleccionar un individuo que tiene una enfermedad metabólica o cardiovascular” significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido diagnosticado con una enfermedad metabólica, una enfermedad cardiovascular o un síndrome metabólico; o, identificar o seleccionar un individuo que tenga cualquier síntoma de una enfermedad metabólica, enfermedad cardiovascular o síndrome metabólico entre los que se incluyen, sin constituir limitación, hipercolesterolemia, hiperglucemia, hiperlipidemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, peso corporal superior al normal y/o contenido de grasa corporal superior al normal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación se puede conseguir mediante cualquier procedimiento, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, ensayos o evaluaciones clínicas estándar, tales como medir el colesterol sérico o circulante (plasma), medir la glucosa en sangre sérica o circulante (plasma), medir los triglicéridos séricos o circulantes (plasma), medir la presión arterial, medir el contenido de grasa corporal, medir el peso corporal y similares.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “identificar” o “seleccionar un individuo diabético” significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido identificado como diabético o identificar o seleccionar un individuo que tiene algún síntoma de diabetes (tipo 1 o tipo 2) tal como, sin constituir limitación, tener una glucosa en ayunas de, como mínimo, 110 mg/dl, glucosuria, poliuria, polidipsia, aumento de la resistencia a la insulina y/o disminución de la sensibilidad a la insulina.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “identificar” o “seleccionar un individuo obeso” significa identificar o seleccionar un individuo que ha sido diagnosticado como obeso o identificar o seleccionar un individuo con un IMC superior a 30 y/o una circunferencia de cintura superior a 102 cm en hombres o superior a 88 cm en mujeres.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “identificar” o “seleccionar un individuo que tiene dislipidemia” significa identificar o seleccionar un individuo diagnosticado con un trastorno del metabolismo de lípidos y/o lipoproteínas, entre los que se incluyen la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias se pueden manifestar por la elevación de lípidos, tales como el colesterol y los triglicéridos, así como por las lipoproteínas, tales como el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “identificar” o “seleccionar un individuo que tiene una mayor adiposidad” significa identificar o seleccionar un individuo que tiene una mayor cantidad de grasa corporal (o adiposidad) que incluye la preocupación por la distribución de la grasa por todo el cuerpo o el tamaño y la masa de los depósitos de tejido adiposo o por ambas. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante mediciones de pliegues cutáneos, relaciones de circunferencia de cintura a cadera o técnicas tales como ultrasonido, tomografía computarizada o resonancia magnética. Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades, las personas con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesos.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resultado cardiovascular mejorado” significa una reducción en la aparición de eventos cardiovasculares adversos, o del riesgo de los mismos. Entre los ejemplos de eventos cardiovasculares adversos se incluyen, sin constituir limitación, muerte, reinfarto, accidente cerebrovascular, shock cardiogénico, edema pulmonar, paro cardíaco y arritmia auricular.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “inmediatamente adyacente” significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “individuo” o “sujeto” o “animal” significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “resistencia a la insulina” se define como la condición en la que las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal de insulina de las células, por ejemplo, células grasas, musculares y/o hepáticas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de los triglicéridos almacenados, lo que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la absorción de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa, y ambos efectos sirven para elevar la glucosa en sangre. Los niveles plasmáticos elevados de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina conducen frecuentemente al síndrome metabólico y diabetes tipo 2.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “sensibilidad a la insulina” es una medida de la eficacia con la que un individuo procesa la glucosa. Un individuo que tiene una alta sensibilidad a la insulina procesa eficazmente la glucosa, mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa eficazmente la glucosa.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “administración intravenosa” significa administración en una vena.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “reducción de lípidos” significa una reducción en uno o más lípidos en un individuo. La reducción de lípidos puede tener lugar con una o más dosis a lo largo del tiempo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “agente reductor de lípidos” significa un agente, por ejemplo, un modulador específico de la ANGPTL3, proporcionado a un individuo para conseguir una disminución de lípidos en el individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se proporciona un agente reductor de lípidos a un individuo para reducir uno o más de apoB, apoC-III, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéridos, partículas LDL pequeñas y densas y Lp (a) en un individuo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “terapia de reducción de lípidos” significa un régimen terapéutico proporcionado a un individuo para reducir uno o más lípidos en un individuo. En determinadas realizaciones, se proporciona una terapia de reducción de lípidos para reducir uno o más de apoB, apoC-III, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no HDL-C, triglicéridos, partículas LDL pequeñas y densas y Lp (a) en un individuo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “lipoproteína”, tal como VLDL, LDL y HDL, se refiere a un grupo de proteínas que se encuentran en el suero, plasma y linfa y son importantes para el transporte de lípidos. La composición química de cada lipoproteína difiere en que la HDL tiene una mayor proporción de proteína que de lípido, mientras que la VLDL tiene una menor proporción de proteína que de lípido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C)” significa colesterol transportado en partículas de lipoproteínas de baja densidad. La concentración de LDL-C en suero (o plasma) generalmente se cuantifica en mg/dl o nmol/l. “LDL-C sérico” y “LDL-C plasmático” significan LDL-C en el suero y el plasma, respectivamente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “principales factores de riesgo” se refiere a factores que contribuyen a un riesgo elevado de una enfermedad o afección particular. En determinadas realizaciones, entre los principales factores de riesgo de cardiopatía coronaria se incluyen, sin constituir limitación, tabaquismo, hipertensión, HDL-C bajo, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria, edad y otros factores dados a conocer en la presente memoria descriptiva.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “trastorno metabólico” o “enfermedad metabólica” se refiere a una afección caracterizada por una alteración o perturbación en la función metabólica. "Metabólico" y "metabolismo" son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que ocurren dentro de un organismo vivo. Entre los trastornos metabólicos se incluyen, sin constituir limitación, hiperglucemia, prediabetes, diabetes (tipo I y tipo 2), obesidad, resistencia a la insulina, síndrome metabólico y dislipidemia debida a diabetes tipo 2.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “síndrome metabólico” significa una afección caracterizada por una agrupación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En determinadas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de 3 cualesquiera de los factores siguientes: circunferencia de la cintura mayor de 102 cm en hombres o mayor de 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de, como mínimo, 150 mg/dl; HDL-C menos de 40 mg/dl en hombres o menos de 50 mg/dl en mujeres; presión arterial de, como mínimo, 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de, como mínimo, 110 mg/dl. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001,285: 2486-2497).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “dislipidemia mixta” significa una afección caracterizada por colesterol elevado y triglicéridos elevados.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “inhibidor de MTP” significa un agente que inhibe la proteína de transferencia de triglicéridos microsómicos enzimática.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “enfermedad de hígado graso no alcohólico” o “NAFLD” significa una afección caracterizada por una inflamación grasa del hígado que no se debe al consumo excesivo de alcohol (por ejemplo, un consumo de alcohol superior a 20 g/día). En determinadas realizaciones, la NAFLD está relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico. La NAFLD abarca un espectro de enfermedades que van desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) hasta la esteatosis hepática con inflamación (esteatohepatitis), fibrosis y cirrosis.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la “esteatohepatitis no alcohólica” (NASH) se produce por la progresión de la NAFLD más allá del depósito de triglicéridos. Se requiere un "segundo impacto" capaz de inducir necrosis, inflamación y fibrosis para el desarrollo de NASH. Los candidatos para el segundo impacto se pueden agrupar en categorías amplias: factores que causan un aumento del estrés oxidativo y factores que promueven la expresión de citocinas proinflamatorias. Se ha sugerido que el aumento de los triglicéridos hepáticos conduce a un aumento del estrés oxidativo en los hepatocitos de animales y humanos, lo que indica una posible relación de causa y efecto entre la acumulación de triglicéridos hepáticos, el estrés oxidativo y la progresión de la esteatosis hepática a EHNA (Browning y Horton, 2005). J Clin Invest, 2004, 114, 147-152). La hipertrigliceridemia y la hiperlipoacidemia pueden causar acumulación de triglicéridos en tejidos periféricos (Shimamura et al., Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322, 1080-1085).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “ácido nucleico” se refiere a moléculas compuestas por nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, pequeños ácidos ribonucleicos de interferencia pequeños (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “administración parenteral” significa la administración de una manera diferente a la del tracto digestivo. La administración parenteral incluye administración tópica, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “agente farmacéutico” significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a la ANGPTL3 es un agente farmacéutico.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “composición farmacéutica” significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender uno o más agentes activos y una solución acuosa estéril.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “vehículo farmacéuticamente aceptable” significa un medio o diluyente que no interfiere con la estructura o función del oligonucleótido. Determinados portadores de este tipo permiten formular composiciones farmacéuticas como, por ejemplo, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y pastillas para la ingestión oral por un individuo. Algunos de estos vehículos permiten formular composiciones farmacéuticas para inyección o infusión. Por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa estéril.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “sales farmacéuticamente aceptables” significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no le proporcionan efectos toxicológicos no deseados.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En determinadas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “prevenir” se refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo, desde minutos hasta indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “efectos secundarios” significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En determinadas realizaciones, entre los efectos secundarios se incluyen reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en los ensayos de función hepática, anomalías de la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central, miopatías y malestar. Por ejemplo, niveles elevados de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática. Por ejemplo, el aumento de bilirrubina puede indicar toxicidad hepática o anomalía de la función hepática.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “estatina” significa un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA reductasa.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “administración subcutánea” significa administración justo debajo de la piel.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “dirigir” o “dirigido” significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “ácido nucleico diana”, “ARN diana” y “transcrito de ARN diana” se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser la diana de compuestos antisentido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “región diana” se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene, como mínimo, una estructura, función o característica identificable.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “segmento diana” significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que están dirigidos uno o más compuestos antisentido. "Sitio diana 5’ " o "sitio de inicio 5’ " se refiere al nucleótido más 5’ de un segmento diana. "Sitio diana 3’" o "sitio de parada 3’" se refiere al nucleótido más 3’ de un segmento diana.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “cambio terapéutico de estilo de vida” significa cambios en la dieta y el estilo de vida destinados a reducir la masa de grasa/tejido adiposo y/o el colesterol. Dicho cambio puede reducir el riesgo de desarrollar cardiopatía y puede incluir recomendaciones para la ingesta dietética de calorías diarias totales, grasas totales, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para la realización de actividad física.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “triglicérido” significa un lípido o grasa neutra que consiste en glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “diabetes tipo 2” (también conocida como "diabetes mellitus tipo 2" o "diabetes mellitus, tipo 2", y anteriormente llamada "diabetes mellitus de tipo 2", "diabetes no insulinodependiente (NIDDM)", "diabetes relacionada con la obesidad", o "diabetes de inicio en el adulto") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “tratar” se refiere a administrar una composición farmacéutica para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
Determinadas realizaciones
En determinados aspectos dados a conocer en la presente memoria descriptiva, la ANGPTL3 tiene la secuencia que se establece en GenBank No. de registro NM_014495.2 (incorporada en la presente memoria descriptiva como la SEQ ID NO: 1). En determinados aspectos, la ANGPTL3 tiene la secuencia que se establece en GenBank No. de registro NT_032977.9 nucleótidos 33032001 a 33046000 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2).
La presente invención da a conocer compuestos antisentido conjugados representados por la siguiente estructura.
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Determinadas realizaciones de la presente invención dan a conocer un profármaco que comprende las composiciones o compuestos dados a conocer en la presente memoria descriptiva. Determinadas realizaciones dan a conocer la utilización del compuesto antisentido conjugado y las composiciones de la presente invención para inhibir la expresión de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado o las composiciones de la presente invención inhiben la ANGPTL3 en, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 50 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 55 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 60 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 65 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 70 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 75 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 80 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 85 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 90 %. En una realización preferente, el compuesto antisentido de la presente invención reduce la ANGPTL3 en, como mínimo, un 95 %.
En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados o composiciones de la presente invención tienen una IC50 de menos de 20 pMI, menos de 10 pMI, menos de 8 pMI, a menos de 5 pMI, a menos de 2 pMI, menos de 1 |j.M, o menos de 0,8 pMI, cuando se ensayan células humanas, por ejemplo, en la línea celular Hep3B tal como se describe en los ejemplos 2-3 y 7-10.
En determinadas realizaciones, el compuesto o las composiciones antisentido conjugadas de la presente invención son eficaces en virtud de que tienen una viscosidad de menos de 40 cP, menos de 35 cP, menos de 30 cP, menos de 25 cP, menos de 20 cP o menos de 15 cP, cuando se miden por los parámetros tal como se describen en el ejemplo 13.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado o las composiciones de la presente invención son altamente tolerables tal como se demuestra por las mediciones de tolerabilidad in vivo descritas en los ejemplos. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido son altamente tolerables, tal como se demuestra al tener un aumento en el valor de ALT y/o AST de no más de 4, 3, 2 o 1,5 veces respecto a los animales tratados con solución salina.
Determinadas realizaciones dan a conocer una sal del compuesto antisentido conjugado de la presente invención. En determinadas realizaciones, el compuesto o las composiciones de la presente invención comprenden una sal del oligonucleótido modificado con el grupo conjugado.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido conjugado o las composiciones de la presente invención comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En determinadas realizaciones, el animal es un ser humano.
Determinados casos dados a conocer en la presente memoria descriptiva dan a conocer procedimientos que comprenden administrar a un animal los compuestos o composiciones antisentido conjugados dados a conocer en la presente memoria descriptiva. En determinados casos de la presente divulgación, la administración del compuesto o composición antisentido conjugado es terapéutica. En determinados casos de la presente divulgación, la administración del compuesto o composición antisentido conjugado trata, previene o ralentiza la progresión de una enfermedad relacionada con la ANGPTL3. En determinados casos de la presente divulgación, la enfermedad está relacionada con ANGPTL3 elevada. En determinados casos de la presente divulgación, la administración del compuesto o composición antisentido conjugado previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad cardiovascular y/o metabólica.
Determinados casos dados a conocer en la presente memoria descriptiva dan a conocer procedimientos para tratar a un ser humano con una enfermedad cardiovascular y/o metabólica que comprenden identificar a un ser humano con una enfermedad cardiovascular y/o metabólica y administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los compuestos o composiciones antisentido conjugados dados a conocer en la presente memoria descriptiva, así como para tratar al ser humano para la enfermedad cardiovascular y/o metabólica.
Determinadas realizaciones dan a conocer el compuesto antisentido conjugado y las composiciones de la presente invención para su utilización en terapia. En determinadas realizaciones, la terapia se utiliza para tratar, prevenir o ralentizar la progresión de una enfermedad relacionada con la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, la terapia se utiliza para tratar, prevenir o ralentizar la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada.
En determinadas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica. En determinadas realizaciones, la enfermedad metabólica y/o cardiovascular incluye, sin constituir limitación, obesidad, diabetes, aterosclerosis, dislipidemia, lipodistrofia, cardiopatía coronaria, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), hiperlipoacidemia o síndrome metabólico o una combinación de los mismos. La dislipidemia puede ser hiperlipidemia. La hiperlipidemia puede ser hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia o tanto hipercolesterolemia como hipertrigliceridemia. La hipercolesterolemia puede ser hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH, de familia! homozygous hypercholesterolemia), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH de familial heterozygous hypercholesterolemia). La hipertrigliceridemia puede ser síndrome de quilomicronemia familiar (FCS, de familial chylomicronemia syndrome) o hiperlipoproteinemia tipo IV. La NAFLD puede ser esteatosis hepática o esteatohepatitis. La diabetes puede ser diabetes tipo 2 o diabetes tipo 2 con dislipidemia.
En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones se designan como un primer agente y los procedimientos o utilizaciones dados a conocer en la presente memoria descriptiva comprenden además la administración de un segundo agente. En determinadas realizaciones, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente. En determinadas realizaciones, el primer agente y el segundo agente se administran conjuntamente de forma secuencial o simultánea.
En determinadas realizaciones, el segundo agente es un agente hipoglucemiante. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio terapéutico de estilo de vida, un agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretágogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de la alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidindiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol.
En determinadas realizaciones, el segundo agente es una terapia hipolipemiante. En determinadas realizaciones, entre las terapias hipolipemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, un inhibidor de la absorción de colesterol, un inhibidor de MTP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a MTP), un inhibidor de ApoB (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a ApoB), un inhibidor de ApoC3 (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a ApoC3), un inhibidor de PCSK9 (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a PCSK9), un inhibidor de CETP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a CETP), fibrato, aceite beneficioso (por ejemplo, krill o aceites de pescado (por ejemplo, VascepaR), aceite de linaza, u otros aceites ricos en ácidos grasos omega-3 tales como ácido a-linolénico (ALA, de), ácido docosahexaenoico (DHA) o ácido eicosapentaenoico (EPA)), o cualquier combinación de los mismos. El inhibidor de la HMG-CoA reductasa puede ser atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina o simvastatina. El inhibidor de la absorción de colesterol puede ser ezetimiba. El fibrato puede ser fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil y similares.
En determinadas realizaciones, la administración comprende la administración parenteral. En determinadas realizaciones, la administración comprende la administración subcutánea.
En determinadas realizaciones, la administración del compuesto antisentido conjugado de la presente invención da como resultado una reducción de los niveles de lípidos, incluidos los niveles de triglicéridos, los niveles de colesterol, la resistencia a la insulina, los niveles de glucosa o una combinación de los mismos. Uno o más de los niveles se pueden reducir independientemente en, como mínimo, un 5 %, como mínimo, un 10 %, como mínimo, un 20 %, como mínimo, un 30 %, como mínimo, un 35 %, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, el 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %. La administración del compuesto antisentido conjugado puede mejorar la sensibilidad a la insulina o la sensibilidad a la insulina hepática. La administración del compuesto antisentido conjugado de la presente invención puede dar como resultado una reducción de las placas ateroscleróticas, obesidad, glucosa, lípidos, resistencia a la glucosa, colesterol o mejora de la sensibilidad a la insulina o cualquier combinación de los mismos.
En la presente memoria descriptiva se da a conocer un kit para tratar, prevenir o mejorar una o más de una enfermedad metabólica o una enfermedad cardiovascular, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, en el que el kit comprende: a) un compuesto antisentido conjugado, tal como los que se describen en la presente memoria descriptiva; y opcionalmente b) un agente o terapia adicional, tal como los que se describen en la presente memoria descriptiva. El kit puede incluir además instrucciones o una etiqueta para utilizar el kit para tratar, prevenir o mejorar una o más enfermedades metabólicas o cardiovasculares.
Compuestos antisentido
Entre los compuestos oligoméricos se incluyen, sin constituir limitación, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser “antisentido” para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.
Un compuesto antisentido puede tener una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. Un oligonucleótido antisentido puede tener una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5’ a 3’, comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
Cuando un único nucleósido adicional está presente en un oligonucleótido alargado, el nucleósido adicional puede ubicarse en el extremo 5’, 3’ o en la porción central del oligonucleótido. Cuando están presentes dos o más nucleósidos adicionales, los nucleósidos añadidos pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene dos nucleósidos añadidos al extremo 5’ (adición 5’), o alternativamente al extremo 3’ (3’ adición) o la porción central, del oligonucleótido. Alternativamente, el nucleósido añadido se puede dispersar por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un oligonucleótido que tiene uno o más nucleósidos añadidos al extremo 5’ , uno o más nucleósidos añadidos al extremo 3’ y/o uno o más nucleósidos añadidos a la porción central. Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992), se ensayó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de emparejamiento erróneo cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor grado que los oligonucleótidos antisentido que no contenían emparejamientos erróneos. De manera similar, la escisión específica de la diana se consiguió utilizando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 emparejamientos erróneos.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el mRNA de bcl-2 y que tiene 3 emparejamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) ensayaron la capacidad para detener la traducción de DHFR humano de serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobase en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Determinados motivos y mecanismos de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada hacia un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo. Los compuestos antisentido quiméricos contienen normalmente, como mínimo, una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación de nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión hacia el ácido nucleico diana y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede conferir otra propiedad deseada, por ejemplo, servir como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex ArN:a Dn .
La actividad antisentido puede resultar de cualquier mecanismo que implique la hibridación del compuesto antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) con un ácido nucleico diana, en el que la hibridación finalmente da como resultado un efecto biológico. En determinadas realizaciones, se modula la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, se reduce la cantidad y/o actividad del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana da como resultado en última instancia la degradación del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, la hibridación del compuesto antisentido con el ácido nucleico diana no da como resultado la degradación del ácido nucleico diana. En determinadas de estas realizaciones, la presencia del compuesto antisentido hibridado con el ácido nucleico diana (ocupación) da como resultado una modulación de la actividad antisentido. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen un motivo químico particular o patrón de modificaciones químicas son particularmente adecuados para explotar uno o más mecanismos. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido funcionan a través de más de un mecanismo y/o mediante mecanismos que no se han aclarado. Por consiguiente, los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva no están limitados por un mecanismo particular.
Entre los mecanismos antisentido se incluyen, sin constituir limitación, antisentido mediado por RNasa H; mecanismos de ARNi, que utilizan la ruta RISC y entre los que se incluyen, sin constituir limitación, mecanismos de ARNip, ARNmc y microARN; y mecanismos basados en la ocupación. Determinados compuestos antisentido pueden actuar a través de más de uno de estos mecanismos y/o mediante mecanismos adicionales.
Antisentido mediado por RNasa H
En determinadas realizaciones, la actividad antisentido resulta, como mínimo, en parte, de la degradación del ARN diana por la RNasa H. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex ARN:ADN. Se sabe en la técnica que los compuestos antisentido monocatenarios que son "de tipo ADN" provocan actividad de RNasa H en células de mamífero. Por consiguiente, los compuestos antisentido que comprenden, como mínimo, una porción de ADN o nucleósidos de tipo ADN pueden activar la RNasa H, dando como resultado la escisión del ácido nucleico diana. En determinadas realizaciones, los compuestos antisentido que utilizan RNasa H comprenden uno o más nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, estos compuestos antisentido comprenden, como mínimo, un bloque de 1-8 nucleósidos modificados. En determinadas de estas realizaciones, los nucleósidos modificados no soportan la actividad de RNasa H. En determinadas realizaciones, dichos compuestos antisentido son gápmeros, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de ADN. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de tipo ADN. En determinadas de estas realizaciones, el espaciador del gápmero comprende nucleósidos de ADN y nucleósidos de tipo ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasa H se sitúa entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento espaciador sirve, generalmente, como sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En determinadas realizaciones, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta.
Ácidos nucleicos diana, regiones y secuencias de nucleótidos diana
Entre las secuencias de nucleótidos que codifican la ANGPTL3 se incluyen, sin constituir limitación, las siguientes: la secuencia humana, tal como se establece en GenBank No. de registro NM_014495.2 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1) o GenBank No. de registro NT_032977.9 nucleótidos 33032001 a 33046000 (incorporada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2). Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO. en los ejemplos contenidos en la presente memoria descriptiva es independiente de cualquier modificación de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO. pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número de Isis (No. Isis) indican una combinación de secuencia y motivo de nucleobase.
Hibridación
La hibridación tiene lugar entre un compuesto antisentido dado a conocer en la presente memoria descriptiva y un ácido nucleico de la ANGPTL3. El mecanismo de hibridación más común implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede tener lugar en diversas condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede enlazarse mediante enlace de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico de la ANGPTL3).
Un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de la ANGPTL3 de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, un emparejamiento erróneo o una estructura de horquilla).
El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando procedimientos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región diana y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes se pueden agrupar o intercalar con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría el 77,8 % de complementariedad global con el ácido nucleico diana. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wisconsin), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482-489).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “completamente complementario” significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejarse de forma precisa con las correspondientes nucleobases de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto de 20 nucleobases antisentido es completamente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. También se puede utilizar completamente complementario en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser “completamente complementaria” a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es totalmente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una 20 porción de nucleobases correspondiente en el que cada nucleobase es complementaria a la porción 20 de nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
Identidad
Los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva también pueden tener un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o la secuencia de un compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia dada a conocer en la presente memoria descriptiva si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN dada a conocer se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, dado que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones abreviadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según el número de bases que tienen un emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base y azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentafuranosilo, el grupo fosfato puede estar enlazado al resto hidroxilo 2’, 3’ o 5’ del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, se hace referencia a los grupos fosfato de manera común como los que forman los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados son preferentes a menudo a las formas nativas, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico diana, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.
También se pueden utilizar nucleósidos químicamente modificados para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen estos nucleósidos químicamente modificados.
Enlaces intemucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3’ a 5’. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, de origen no natural, se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural, debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y aumento de la estabilidad en presencia de nucleasas.
Entre los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados se incluyen enlaces internucleosídicos que conservan un átomo de fósforo, así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Entre los enlaces internucleosídicos representativos que contienen fósforo se incluyen, sin constituir limitación, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
Cada enlace internucleosídico del oligonucleótido del compuesto de la presente invención se selecciona entre fosfodiéster y fosforotioato. Es deseable organizar el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato y enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a las nucleasas. Es deseable organizar el número y la posición de los enlaces internucleosídicos fosforotioato y el número y la posición de los enlaces internucleosídicos fosfodiéster para mantener la resistencia a las nucleasas. Se puede disminuir el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato y se puede aumentar el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster. Se puede disminuir el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato y se puede aumentar el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster a la vez que se mantiene la resistencia a las nucleasas. Es deseable reducir el número de enlaces internucleosídicos fosforotioato a la vez que se conserva la resistencia a las nucleasas. Es deseable aumentar el número de enlaces internucleosídicos fosfodiéster a la vez que se conserva la resistencia a las nucleasas.
Fragmentos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido de la presente invención pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos con azúcar modificado pueden conferir estabilidad mejorada a las nucleasas, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En determinadas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa modificados químicamente. Entre los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente se incluyen, sin constituir limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5’ y 2’, la unión de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(Ri)(R2) (R, Ri y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Entre los ejemplos de azúcares químicamente modificados se incluyen nucleósido sustituido con 2’-F-5’-metilo (véase la Patente WO2008/101157 publicada el 21/8/08 para otros nucleósidos 5’, 2’-bis sustituidos dados a conocer) o sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2’ (véase la Patente US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5’ de un BNA (véase la Patente WO2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que LNA se sustituye, por ejemplo, por un grupo 5’-metilo o 5’-vinilo).
Entre los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados se incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5’-vinilo, 5’-metilo (R o S), 4’-S, 2’-F, 2’-OCH3, 2’-OCH2CH3, 2’-OCH2CH2F y 2’-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2’ también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, OCF3, OCH2 F, O(CH^SCH3 , O(CH2)2-ON(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de ácidos nucleicos bicíclicos (BNA) incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4’ y 2’. En determinadas realizaciones, entre los compuestos antisentido dados a conocer en la presente memoria descriptiva se incluyen uno o más nucleósidos de b Na en los que el puente comprende una de las fórmulas: 4’-(CH2)-O-2’ (LNA); 4’-(CH2)-S-2’; 4’-(CH2)2-O-2’ (ENA); 4’-CH(CH3)-O-2’ y 4’-CH(CH2OCH3)-O-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente US7,399,845, concedida el 15 de julio de 2008); 4’-C(CH3)(CH3)-O-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente PCT/US2008/068922 publicada como Patente WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4’-CH2-N(OCH3)-2’ (y análogos del mismo, véase la Patente PCT/US2008/064591 publicada como Patente WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4’-CH2-ON(CH3)-2’ (véase la Patente US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4’-CH2-N(R)-O-2’, en el que R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (véase la Patente US7,427,672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4’-CH2-C(H)(CH3)-2’ (véase Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4’-CH2-C(=CH2)-2’ (y análogos de los mismos, véase la Patente PCT/US2008/066154 publicada como Patente WO2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008). Se ha informado de más nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (véase, por ejemplo: Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129 (26) 8362-8379; Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. uSa , 2000, 97, 5633-5638; Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Patentes US7,399,845; US7,053,207; US7,034,133; US6,794,499; US6,770,748; US6,670,461; US6,525,191; US6,268,490; Patentes US2008-0039618; US2007-0287831; US2004-0171570; Patentes US12/129,154; US61/099,844; US61/097,787; US61/086,231; US61/056,564; US61/026,998; US61/026,995; US60/989,574; Patentes WO2007/134181; WO2005/021570; WO2004/106356; WO94/14226; y Patentes WO2009/006478; WO2008/154401; y WO2008/150729). Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones estereoquímicas del azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la Patente PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como Patente WO99/14226).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En determinadas realizaciones, el resto de azúcar, o el análogo de resto de azúcar, de un nucleósido se puede modificar o sustituir en cualquier posición.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "nucleósido bicíclico 4’-2’ " o "nucleósido bicíclico 4’ a 2’" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2’ y el átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “azúcar modificado en 2’” significa un azúcar furanosilo modificado en la posición 2’. Los nucleósidos modificados pueden comprender una cadena lateral 2’-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2’-MOE tiene una afinidad de enlace mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2’-0-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2’-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para utilización in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "modificado en 2’" o "sustituido en 2’" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2’ distinto de H u OH. Entre los nucleósidos modificados en 2’ se incluyen, sin constituir limitación, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2’ y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2 no puente, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2’-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-ON(Rm)(Rn), u O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2’ pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "2’-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "2’-OMe" o "2’-OCH3", "2’-O-metil" o "2’-metoxi" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, "MOE" o "2’-MOE" o "2’-OCH2CH2OCH3" o "2’-O-metoxietilo" se refiere cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo-OCH2CH2OCH3 en la posición 2’ del anillo de azúcar.
Los procedimientos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, las Patentes US4,981,957; US5,118,800; US5,319,080; US5,359,044; US5,393,878; US5,446,137; US5,466,786; US5,514,785; US5,519,134; US5,567,811; US5,576,427; US5,591,722; US5,597,909; US5,610,300; US5,627,053; US5,639,873; US5,646,265; US5,670,633; US5,700,920; US5.792.847 y US6,600,032 y la Patente US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como Patente WO2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “oligonucleótido” se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. Tal como se describe en la presente memoria descriptiva, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado.
El compuesto antisentido de la presente invención comprende nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados, en los que el resto de azúcar modificado es 2’-MOE.
Nucleobases modificadas
Las modificaciones o sustituciones de nucleobase (o base) son estructuralmente distinguibles de nucleobases no modificadas de origen natural o sintético, aunque funcionalmente son intercambiables con las mismas. Tanto las nucleobases naturales como las modificadas son capaces de participar en el enlace de hidrógeno. Estas modificaciones de nucleobase pueden proporcionar estabilidad frente a las nucleasas, afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a compuestos antisentido. Entre las nucleobases modificadas se incluyen nucleobases sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Determinadas sustituciones de nucleobase, incluidas las sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, YS, Crooke, ST y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278). Entre las nucleobases modificadas adicionales se incluyen 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases pirimidínicas, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Entre los restos de bases heterocíclicas también se pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se sustituye con otros heterociclos, por ejemplo, 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Entre las nucleobases que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de compuestos antisentido se incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
La nucleobase modificada puede ser 5-metilcitosina. Cada citosina puede ser una 5-metilcitosina.
Composiciones y procedimientos para formular composiciones farmacéuticas
Se pueden mezclar oligonucleótidos antisentido con una sustancia activa o inerte farmacéuticamente aceptable para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de varios criterios, entre los que incluyen, sin constituir limitación, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.
El compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de la ANGPTL3 se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para su utilización en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, una realización es una composición farmacéutica que comprende un compuesto u oligonucleótido modificado según la presente invención y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En determinadas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, sea capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de tales profármacos y otros bioequivalentes. Entre las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas se incluyen, sin constituir limitación, sales de sodio y potasio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que sean escindidos mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido se pueden enlazar covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Entre los grupos conjugados típicos se incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Entre los grupos conjugados adicionales se incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también se pueden modificar para que tengan uno o más grupos estabilizantes que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades, tales como, por ejemplo, estabilidad frente a las nucleasas. Incluidas en los grupos estabilizadores están las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene ácidos nucleicos terminales de la degradación por exonucleasas y pueden ayudar en la administración y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5’ (caperuza 5’) o en el extremo 3’ (caperuza 3’), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas abásicas desoxi invertidas. Entre otros grupos estabilizantes 3’ y 5’ que se pueden utilizar para proteger uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para proporcionar estabilidad frente a las nucleasas se incluyen los dados a conocer en la Patente WO03/004602 publicada el 16 de enero de 2003.
Entre las patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos y publicaciones de solicitudes de patentes internacionales representativas que enseñan la preparación de determinados conjugados, compuestos antisentido conjugados, espaciadores, enlazadores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles, así como otras modificaciones, se incluyen las Patentes US5,994,517, US6,300,319, US6,660,720, US6,906,182, US7,262,177, US7,491,805, US8,106,022, US7,723,509, US2006/0148740, US2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012/037254.
Entre las publicaciones representativas que enseñan la preparación de determinados conjugados, compuestos antisentido conjugados, espaciadores, enlazadores, grupos de ramificación, ligandos, restos escindibles, así como otras modificaciones se incluyen, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38: 1846-1852, BIESSEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38: 1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40): 37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47: 5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42: 609-618, and Valentijn et al., "Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
Tal como se da a conocer en la presente memoria descriptiva, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido basado en RNasa H (tal como un gápmero) o un oligonucleótido modulador de empalme (tal como un oligonucleótido totalmente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprenda, como mínimo, uno, dos o tres grupos GalNAc. Tal como se da a conocer en la presente memoria descriptiva, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado que se encuentre en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8 , 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 2 1 , 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16 (19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2 0 1 1 , 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11, 457-464; Sato et al., J. Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12, 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; Patentes WO1998/013381 WO2011/038356 WO1997/046098 WO2008/098788 WO2004/101619 WO2012/037254 WO2011/120053 WO2011/100131 WO2011/163121 WO2012/177947 WO2013/033230 WO2013/075035 WO2012/083185 WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487 WO2010/144740 WO2010/148013 WO1997/020563 WO2010/088537 WO2002/043771 WO2010/129709 WO2012/068187 WO2009/126933 WO2004/024757 WO2010/054406 WO2012/089352 WO2012/089602 WO2013/166121 WO2013/165816 Patentes US4,751,219; US8,552,163; US6,908,903; US7,262,177; US5,994,517; US6,300,319; US8,106,022 US7,491,805 US7,582,744; US8,137,695; US6,383,812; US6,525,031; US6,660,720; US7,723,509; US8,541,548 US8,344,125 US8,313,772; US8,349,308; US8,450,467; US8,501,930; US8,158,601; US7,262,177; US6,906,182 US6,620,916 US8,435,491; US8,404,862; US7,851,615; Patentes US2011/0097264; US2011/0097265 US2013/0004427 US2005/0164235 US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148 US2012/0128760 US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512 US2013/0236968 US2011/0123520; US2003/0077829; US2008/0108801; y US2009/0203132.
Tratamiento de cultivos celulares y compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de la ANGPTL3 se pueden ensayar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para dichos análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, Virginia; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; Clonetics Corporation, Walkersville, Maryland) y las células se cultivan según las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). Entre los tipos de células ilustrativos se incluyen, sin constituir limitación, células HepG2, células Hep3B, células Huh7 (carcinoma hepatocelular), hepatocitos primarios, células A549, fibroblastos GM04281 y células LLC-MK2.
Ensayos in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente memoria descriptiva se dan a conocer procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan, aproximadamente, un 60-80 % de confluencia en cultivo.
Un reactivo utilizado de manera común para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN® (Invitrogen, Carlsbad, California). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que normalmente varía de 2 a 12 |¿g/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Oligofectamine® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Oligofectamine® en medio de suero reducido Opti-MEM®-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California) para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de Oligofectamine® respecto a oligonucleótido de, aproximadamente, 0,2 a 0,8 |o.l por 100 nM.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianápolis, Indiana). El compuesto oligomérico antisentido se mezcló con FuGENE 6 en 1 ml de RPMI sin suero para conseguir la concentración deseada de oligonucleótido con una proporción de FuGENE 6 respecto a compuesto oligomérico de 1 a 4 |o.l de FuGENE 6 por 100 nM.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001).
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante procedimientos de rutina. Las células se recogen normalmente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos diana se miden mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en la presente memoria descriptiva. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos reptidos.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan normalmente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectin o Cytofectin. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan a concentraciones más elevadas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan utilizando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). El ARN se prepara utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, California) según los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles o expresión diana
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de la ANGPTL3 se puede ensayar de una variedad de formas conocidas en la técnica (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tienipo real se puede realizar de manera conveniente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, California y utilizado según las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de los niveles del ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede realizar mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, California) según las instrucciones del fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que posteriormente se utiliza como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se obtienen de Invitrogen (Carlsbad, California). Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia.
Las cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se pueden normalizar utilizando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como la ciclofilina A o el GADPH o cuantificando el ARN total utilizando RIBOGREEN® (Life Technologies®, Inc. Carlsbad, California). La expresión de la ciclofilina A o el GADPH se puede cuantificar mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se puede cuantificar utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN®. Los procedimientos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L. J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se puede utilizar un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN®.
Los procedimientos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir la utilización de software, tal como el software PRIMER EXPRESS® (Applied Biosystems, Foster City, California). Las sondas y los cebadores utilizados en la PCR en tiempo real se diseñaron para hibridar con secuencias específicas de la ANGPTL3 y se dan a conocer en los ejemplos siguientes. Las sondas de PCR específicas de la diana pueden tener FAM enlazado covalentemente al extremo 5’ y TAMRA o MGB enlazado covalentemente al extremo 3’, donde FAM es el colorante fluorescente y TAMRA o MGB es el colorante de extinción. Análisis de los niveles de proteína
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de la ANGPTL3 se puede evaluar midiendo los niveles de proteína de la ANGPTL3. Los niveles de proteína de la ANGPTL3 se pueden evaluar o cuantificar en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), enzimoinmunoensayo de adsorción (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed., 2001). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse a partir de una variedad de fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, Michigan), o se pueden preparar mediante procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Ensayo in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se ensayan en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de la ANGPTL3 y producir cambios fenotípicos. Los ensayos se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, el ARN se aísla del tejido y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de la ANGPTL3. También se miden los cambios en los niveles de proteína de la ANGPTL3.
Determinadas indicaciones
En la presente memoria descriptiva se dan a conocer composiciones, según la presente invención, para su utilización en terapia. En determinadas realizaciones, en la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos u oligonucleótidos modificados, según la presente invención, para su utilización en el tratamiento, prevención o ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada. En determinadas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad metabólica y/o enfermedad cardiovascular. En determinadas realizaciones, el individuo tiene hipercolesterolemia (por ejemplo, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH)), dislipidemia, hipertrigliceridemia (por ejemplo, deficiencia de LPL heterocigótica, deficiencia de LPL homocigótica), arteriopatía coronaria (CAD) síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipoproteinemia tipo IV), lipodistrofia, hiperlipidemia (por ejemplo, hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia familiar combinada (FCHL)), síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes (por ejemplo., diabetes tipo 2), engrosamiento de la pared vascular, presión arterial elevada (por ejemplo, hipertensión arterial pulmonar), esclerosis (por ejemplo, aterosclerosis, esclerosis sistémica, esclerosis cutánea progresiva y vasculopatía obliterante proliferativa, tal como úlceras digitales y afectación vascular pulmonar).
En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, modulan el metabolismo de lípidos y/o energía en un animal. En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, modulan marcadores fisiológicos o fenotipos de hipercolesterolemia, dislipidemia, hipertrigliceridemia, síndrome metabólico, NAFLD, NASH y/o diabetes. Por ejemplo, la administración de los compuestos a animales puede modular uno o más niveles de VLDL, ácidos grasos no esterificados (NEFA), LDL, colesterol, triglicéridos, glucosa, insulina o ANGPTL3. En determinadas realizaciones, la modulación de los marcadores fisiológicos o fenotipos se puede asociar con la inhibición de la ANGPTL3 por los compuestos.
En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, reducen y/o previenen una o más de la acumulación de TG hepáticos (es decir, esteatosis hepática), aterosclerosis, engrosamiento de la pared vascular (por ejemplo, engrosamiento de la íntima-media arterial), hipercolesterolemia (por ejemplo, hipercolesterolemia homocigótica familiar (HoFH), hipercolesterolemia heterocigótica familiar (HeFH)), dislipidemia, hipertrigliceridemia (por ejemplo, deficiencia de LPL heterocigótica, deficiencia de LPL homocigótica, síndrome de quilomicronemia familiar (FCS), hiperlipoproteinemia tipo IV), lipoidistrofia, hiperlipidemia (por ejemplo, hiperlipidemia combinada, hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), síndrome metabólico, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), esteatohepatitis no alcohólica (NASH), diabetes (por ejemplo, diabetes tipo 2), presión arterial elevada y esclerosis. En determinadas realizaciones, los compuestos, según la presente invención, mejoran la sensibilidad a la insulina.
En determinadas realizaciones, el compuesto antisentido de la presente invención da como resultado una reducción de la expresión de la ANGPTL3 en, aproximadamente, como mínimo, el 15 %, como mínimo, el 20 %, como mínimo, el 25 %, como mínimo, el 30 %, como mínimo, el 35 %, como mínimo, el 40 %, como mínimo, el 45 %, como mínimo, el 50 %, como mínimo, el 55 %, como mínimo, el 60 %, como mínimo, el 65 %, como mínimo, el 70 %, como mínimo, el 75 %, como mínimo, el 80 %, como mínimo, el 85 %, como mínimo, el 90 %, como mínimo, el 95 % o, como mínimo, el 99 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores.
Administración
En determinadas realizaciones, los compuestos y composiciones se administran por vía parenteral.
En determinadas realizaciones, la administración parenteral se realiza mediante infusión. La infusión puede ser crónica o continua o corta o intermitente. En determinadas realizaciones, los agentes farmacéuticos infundidos se administran con una bomba.
En determinadas realizaciones, la administración parenteral se realiza mediante inyección. La inyección se puede administrar con una jeringa o una bomba. En determinadas realizaciones, la inyección es una inyección en bolo. En determinadas realizaciones, la inyección se administra directamente a un tejido u órgano. En determinadas realizaciones, la inyección es subcutánea.
Determinadas terapias combinadas
En determinadas realizaciones, un primer agente que comprende el oligonucleótido modificado se coadministra con uno o más agentes secundarios. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección que el primer agente descrito en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección diferente a la del primer agente descrito en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, dichos segundos agentes están diseñados para tratar un efecto secundario no deseado de una o más composiciones farmacéuticas, tal como las que se describen en la presente memoria descriptiva. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para tratar un efecto no deseado del primer agente. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto de combinación. En determinadas realizaciones, los segundos agentes se coadministran con el primer agente para producir un efecto sinérgico.
En determinadas realizaciones, se administran al mismo tiempo un primer agente y uno o más segundos agentes. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran en diferentes momentos. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En determinadas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.
En determinadas realizaciones, entre los segundos agentes se incluyen, sin constituir limitación, un agente hipoglucemiante o un agente hipolipemiante. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, un agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretágogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de la alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. Entre los agentes hipoglucemiantes se pueden incluir, sin constituir limitación, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidindiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol. En determinadas realizaciones, la terapia hipolipemiante puede incluir, sin constituir limitación, un cambio de estilo de vida terapéutico, niacina, inhibidor de la HMG-CoA reductasa, inhibidor de la absorción de colesterol, inhibidor de MTP (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuesto antisentido dirigido a MTP), fibrato, inhibidor de PCSK9 (por ejemplo, anticuerpos de PCSK9, polipéptidos, compuestos de ácido nucleico de moléculas pequeñas dirigidos a PCSK9), inhibidor de CETP (por ejemplo, moléculas pequeñas tales como torcetrapib y anacetrapib, polipéptidos, anticuerpos o compuestos de ácido nucleico dirigidos a CETP), inhibidor de apoC-III (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuestos de ácido nucleico dirigidos a apoC-III), inhibidor de apoB (por ejemplo, una molécula pequeña, polipéptido, anticuerpo o compuestos de ácido nucleico direccionados a apoB), aceites beneficiosos ricos en ácidos grasos omega-3, ácidos grasos omega-3 o cualquier combinación de los mismos. El inhibidor de la HMG-CoA reductasa puede ser atorvastatina, rosuvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, simvastatina y similares. El inhibidor de la absorción de colesterol puede ser ezetimiba. El fibrato puede ser fenofibrato, bezafibrato, ciprofibrato, clofibrato, gemfibrozil y similares. El aceite beneficioso rico en ácidos grasos omega-3 puede ser krill, aceite de pescado (por ejemplo, VascepaR), aceite de linaza y similares. El ácido graso omega-3 puede ser ALA, DHA, EPA y similares.
Determinados compuestos
Los oligonucleótidos antisentido que están dirigidos a la ANGPTL3 humano se describieron en una publicación anterior (véase la Patente WO2011/085271 publicada el 14 de julio de 2011). Varios oligonucleótidos (233676, 233690, 233710, 233717, 233721, 233722, 337459, 337460, 337474, 337477, 337478, 337479, 337481, 337484, 337487, 337488, 337490, 337491, 337492, 337497, 337498, 337503, 337505, 337506, 337508, 337513, 337514, 337516, 337520, 337521, 337525, 337526 y 337528) descritos en la misma, incluidos los diez compuestos antisentido más potentes in vitro, se utilizaron como referentes en los cribados in vitro seleccionados para nuevos compuestos antisentido descritos a continuación. De los compuestos más potentes descritos en la Patente WO 2011/085271, se descubrió que ISIS 233722 es muy variable en su capacidad para inhibir la ANGPTL3. Por consiguiente, aunque inicialmente se incluyó en algunos estudios in vitro, 233722 no fue seleccionado como referencia para estudios posteriores. De los compuestos de referencia in vitro potentes identificados anteriormente, se seleccionaron cinco (233710, 233717, 337477, 337478, 337479 y 337487) para ensayar in vivo, tal como se describe a continuación, en ratones transgénicos huANGPTL3 para evaluar el más potente en la reducción de la transcripción de ARNm humano y la expresión de proteínas (ejemplo 126). El oligonucleótido antisentido con la potencia in vivo inicial más elevada para reducir los niveles de la ANGPTL3 (233710) se utilizó como referencia para la evaluación in vivo de los nuevos compuestos antisentido descritos a continuación.
Los compuestos antisentido descritos en la presente memoria descriptiva pueden beneficiarse de una o más propiedades mejoradas con respecto a los compuestos antisentido descritos en la Patente WO 2011/085271 y en la Patente US61/920,652. Estas propiedades mejoradas se demuestran en los ejemplos de la presente memoria descriptiva, y a continuación se proporciona un resumen no exhaustivo de los ejemplos para facilitar la referencia. En un primer cribado descrito en la presente memoria descriptiva, se ensayaron, aproximadamente, 3000 compuestos antisentido de gápmero 5-10-5 MOE de nuevo diseño dirigidos a ANGPTL3 humana en células Hep3B para determinar su efecto sobre el ARNm de la ANGPTL3 humana in vitro (ejemplo 1). Los niveles de inhibición del ARNm de los nuevos compuestos antisentido se evaluaron con algunos compuestos antisentido anteriormente diseñados (233717, 337484, 337487, 337492 y 337516) utilizados como referentes en estudios seleccionados. De los, aproximadamente, 3000 compuestos antisentido diseñados recientemente de este primer cribado, se seleccionaron, aproximadamente, 85 compuestos antisentido para estudios de inhibición dependiente de la dosis in vitro para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC50) (ejemplos 117-118). De los, aproximadamente, 85 nuevos compuestos antisentido ensayados para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC50), se seleccionaron, aproximadamente, 38 compuestos antisentido que demostraron una reducción potente dependiente de la dosis de la ANGPTL3 en ensayos de potencia y tolerabilidad in vivo (ALT y AST) en ratones (ejemplos 126-127) con el compuesto antisentido 233710 utilizado como referente.
En un segundo cribado descrito en la presente memoria descriptiva, se ensayaron también, aproximadamente, 2000 compuestos antisentido de nuevo diseño dirigidos a ANGPTL3 humano con un motivo de gápmero MOE o un motivo mixto (desoxi, 5-10-5 MOE y gápmeros cEt) en células Hep3B para determinar su efecto in vitro sobre el ARNm de la ANGPTL3 humana (ejemplos 119-121). Los niveles de inhibición de los nuevos compuestos antisentido se evaluaron con algunos compuestos antisentido diseñados anteriormente (233717, 337487, 337513, 337514 y 337516) utilizados como referentes en estudios seleccionados. De los, aproximadamente, 2000 compuestos antisentido diseñados recientemente de este segundo cribado, se seleccionaron, aproximadamente, 147 compuestos antisentido para estudios de inhibición dependiente de la dosis in vitro para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC50) (ejemplos 122-125). De los, aproximadamente, 147 nuevos compuestos antisentido ensayados para determinar su concentración inhibidora media máxima (IC50), se seleccionaron, aproximadamente, 73 compuestos antisentido que demostraron una reducción potente dependiente de la dosis de la ANGPTL3 en ensayos de potencia y tolerabilidad in vivo (por ejemplo, ALT y AST) en ratones (ejemplos 126-127) con el compuesto antisentido 233710 utilizado como referente.
De los, aproximadamente, 111 compuestos antisentido de los cribados uno y dos que se ensayaron para determinar la potencia y la tolerabilidad en ratones, se seleccionaron 24 para ensayos de tolerabilidad más exhaustivos en ratones mediante la evaluación de marcadores metabólicos hepáticos, tales como alanina transaminasa (ALT), aspartato transaminasa (AST), albúmina y bilirrubina, así como los marcadores metabólicos de riñón BUN (“blood urea nitrogen”, nitrógeno ureico en sangre) y creatinina y peso de órganos (ejemplo 127).
En paralelo con los estudios murinos in vivo, se seleccionaron diecisiete compuestos antisentido para el ensayo de viscosidad (ejemplo 128). Generalmente, los compuestos antisentido que no eran óptimos en viscosidad no se hicieron avanzar a estudios posteriores.
Basándose en los resultados del estudio de tolerabilidad en ratones, se seleccionaron veinte compuestos antisentido para el ensayo de tolerabilidad in vivo en ratas (ejemplo 129). En las ratas, se midieron marcadores metabólicos hepáticos, tales como ALT, AST, albúmina y bilirrubina, pesos corporales y de órganos, así como marcadores metabólicos renales, tales como BUN, creatinina y la relación proteína/creatinina total, para determinar la tolerabilidad de un compuesto in vivo.
También se evaluó la reactividad cruzada de los veinte compuestos antisentido ensayados en las ratas con una secuencia del gen ANGPTL3 de mono rhesus (ejemplo 130). Aunque los compuestos antisentido de este estudio se ensayaron en monos cynomolgus, la secuencia ANGPTL3 del mono cynomolgus no estaba disponible para la comparación con las secuencias de los compuestos de longitud completa, por lo tanto, las secuencias de los compuestos antisentido se compararon con las del mono rhesus, estrechamente relacionado. Se descubrió que las secuencias de ocho compuestos antisentido tenían 0-2 emparejamientos erróneos con la secuencia del gen de la ANGPTL3 de rhesus y se estudiaron adicionalmente en monos cynomolgus (ejemplo 130). Los ocho compuestos antisentido (ISIS 563580, ISIS 560400, ISIS 567320, ISIS 567321, ISIS 544199, ISIS 567233, ISIS 561011 e ISIS 559277) se ensayaron para determinar la inhibición del ARNm de la ANGPTL3 y la expresión de proteínas, así como la tolerabilidad en los monos. En los estudios de tolerabilidad, se midieron los pesos corporales, marcadores metabólicos hepáticos (ALT, AST y bilirrubina), marcadores metabólicos renales (BUN y creatinina), parámetros hematológicos (hemogramas, hemoglobina y hematocrito) y marcadores proinflamatorios (PCR y C3). Además, se midió la concentración de oligonucleótidos de longitud completa presente en el hígado y el riñón y se calculó la proporción de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón/hígado.
La secuencia de un compuesto antisentido potente y tolerable, ISIS 563580, evaluada en monos cynomolgus se modificó adicionalmente con un conjugado de GalNAc y/o cambios en la química de la cadena principal como se muestra en los ejemplos 113-115 y 131 y se evaluó para aumentar la potencia.
Por consiguiente, se dan a conocer en la presente memoria descriptiva compuestos antisentido con una o más características mejoradas, por ejemplo, mejorados con respecto a los compuestos antisentido descritos en la Patente WO 2011/085271 y la Patente US61/920,652. En la presente memoria descriptiva se dan a conocer compuestos antisentido que comprenden un oligonucleótido modificado tal como los que se describen en la presente memoria descriptiva dirigido a una región de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-2, o específicamente hibridable con la misma.
En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de su potencia para inhibir la expresión de la ANGPTL3. En determinadas realizaciones, los compuestos o composiciones inhiben la ANGPTL3 en, como mínimo, un 40 %, como mínimo, un 45 %, como mínimo, un 50 %, como mínimo, un 55 %, como mínimo, un 60 %, como mínimo, un 65 %, como mínimo, un 70 %, como mínimo, un 75 %, como mínimo, un 80 %, como mínimo, un 85 %, como mínimo, un 90 % o, como mínimo, un 95 %.
En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido son eficaces en virtud de una IC50 in vitro de menos de 20 p.M, menos de 10 p.M, menos de 8 p.M, menos de 5 p.M, menos de 2 p.M, menos de 1 p.M, menos de 0,9 |¿M, menos de 0,8 p.M, menos de 0,7 p.M, menos de 0,6 p.M, o menos de 0,5 |¿M cuando se ensayan en células humanas, por ejemplo, en la línea celular Hep3B (tal como se describe en los ejemplos 117-118 y 122-125).
En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido de la presente divulgación son eficaces en virtud de tener una viscosidad de menos de 40 cP, menos de 35 cP, menos de 30 cP, menos de 25 cP, menos de 20 cP, menos de 15 cP, o menos de 10 cP cuando se mide mediante un ensayo (tal como se describe en el ejemplo 128). Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP tendrían una viscosidad inferior a la óptima.
En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido de la presente divulgación son altamente tolerables, tal como lo demuestran las mediciones de tolerabilidad in vivo descritas en los ejemplos. En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido de la presente divulgación son altamente tolerables, como se demuestra al tener un aumento en el valor de ALT y/o AST de no más de 3 veces, 2 veces o 1,5 veces con respecto a los animales tratados con solución salina.
En determinadas realizaciones, determinados compuestos antisentido de la presente divulgación son eficaces en virtud de que tiene una o más de una potencia de inhibición superior al 50 %, un in vitro IC50 de menos de 1 p.M, una viscosidad de menos de 20 cP, y no más de un aumento de 3 veces en ALT y/o AST. Se descubrió que ISIS 563580 (SEQ ID NO: 77) es un potente inhibidor en ratones transgénicos ANGPTL3 y el compuesto antisentido más tolerable. Tenía una viscosidad aceptable de, aproximadamente, 16,83 cP y un valor IC50 de <0,8 m in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST sobre los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más tolerables y potentes para inhibir ANGPTL3 y tenía la mejor proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.
Se descubrió que el ISIS 544199 (SEQ ID NO: 20) era un compuesto antisentido potente y tolerable. Tenía una viscosidad aceptable de 1,7 cP y un valor de IC50 de <0,5 p.M in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST respecto a los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más potentes para inhibir la ANGPTL3 y tenía una buena proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.
Se descubrió que el ISIS 559277 (SEQ ID NO: 110) era un compuesto antisentido potente y tolerable. Tenía un valor de IC50 de <0,8 |oMI in vitro. En ratones, no tuvo más de un aumento de 3 veces en los niveles de ALT y/o AST respecto a los animales tratados con solución salina. Además, en los monos, se encontraba entre los compuestos más potentes para inhibir la ANGPTL3 y tenía una buena proporción de concentración de oligonucleótidos de longitud completa.
El compuesto antisentido conjugado con GalNAc de la presente invención es ISIS 703802 (SEQ ID NO: 77). Se descubrió que este compuesto antisentido era varias veces más potente que su compuesto original ISIS 563580 (SEQ ID nO: 77). ISIS 703802 tenía un valor ID50 de 0,3 mientras que ISIS 563580 tenía un valor ID50 de 6.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran determinadas realizaciones de la presente divulgación. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de las reivindicaciones está destinado únicamente a fines ilustrativos y comparativos y se proporciona como ejemplo de referencia. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores de la presente invención han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tienen el mismo motivo o un motivo similar. Y, por ejemplo, cuando aparece una modificación de alta afinidad particular en una posición particular, se consideran adecuadas otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: procedimiento general para la preparación de fosforamiditas, compuestos 1, 1a y 2
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Bx es una base heterociclica;
Se prepararon los compuestos 1, 1a y 2 según los procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como se describe en la presente memoria descriptiva (véase Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21 (4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75 (5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52 (1), 553-554); y véanse también las Patentes (WO 2011/115818, WO 2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071) y la Patente US7,569,686).
Ejemplo 2: preparación del compuesto 7
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Los compuestos 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-0-acetil-2-desoxi-p-Dgalactopiranosa o pentaacetato de galactosamina) están disponibles en el mercado. El compuesto 5 se preparó según procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991,34, 2692).
Ejemplo 3: preparación del compuesto 11
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Los compuestos 8 y 9 están disponibles en el mercado.
Ejemplo 4: preparación del compuesto 18
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Se preparó el compuesto 11 según los procedimientos ilustrados en el ejemplo 3. El compuesto 14 está disponible en el mercado. Se preparó el compuesto 17 utilizando procedimientos similares notificados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 7: preparación del compuesto 25
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Ejemplo 9: la estructura de Gal-NAc3-1a se muestra a continuación
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Ejemplo 37: la estructura de GalNAc3-2a se muestra a continuación:
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Ejemplo 39: procedimiento general para la preparación del compuesto oligomérico 83h que comprende un conjugado de GalNAc3-3 en el extremo 5’ (GalNAc3-1 modificado para unión del extremo 5’) mediante soporte sólido
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Se preparó el compuesto 18 según los procedimientos ¡lustrados en el ejemplo 4. Los compuestos 83a y 83b están disponibles en el mercado. Se preparó el compuesto oligomérico 83e, que comprende una hexilamina enlazada a fosfodiéster, utilizando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoníaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5’-GalNAc3-3 (83h).
En el que GalNAc3-3 tiene la estructura:
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La porción de la agrupación GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En la que GalNAc3-3a tiene la fórmula:
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Ejemplo 44: efecto de los enlaces PO/PS en la inhibición antisentido de ASO (de A ntisense Oligonucleotide, oligonucleótidos antisentidos) que comprenden GalNAc3-1 conjugado (véase el ejemplo 9) en el extremo 3’, dirigidos a SRB-1
Se ensayaron ISIS 655861 y 655862 que comprendían un conjugado de GalNAc3-1 en el extremo 3’ cada uno de los cuales se dirige a SRB-1 en un estudio de administración única para determinar su capacidad para inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto original no conjugado, ISIS 353382, se incluyó en el estudio a modo de comparación.
Los ASO son gápmeros 5-10-5 MOE, en los que la región espaciadora comprende diez 2’-desoxirribonucleósidos y cada región de ala comprende cinco nucleósidos modificados 2’-MOE. Los ASO se prepararon utilizando procedimientos similares a los ilustrados anteriormente en el ejemplo 19 y se describen en la tabla 36, continuación.
Tabla 36
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Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea una vez la dosis que se muestra a continuación de ISIS 353382, 655861, 655862 o control tratado con PBS a ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado utilizando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon) según protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron en relación con el ARN total (utilizando Ribogreen), antes de la normalización respecto al control tratado con PBS. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio de niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto al control tratado con PBS y se indican como “% de PBS”. Se midieron los ED50 utilizando procedimientos similares a los descritos anteriormente y se presentan a continuación.
Tal como se ilustra en la tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprendían el conjugado GalNAc3-1 en el extremo 3’ (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces PS/PO mixtos mostró una mejora en la potencia en relación con el de totalidad de PS (ISIS 655861).
Tabla 37
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Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero en relación con los ratones inyectados con solución salina utilizando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observaron aumentos en los niveles de transaminasas (tabla 38) o pesos de órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control de PBS. Además, el ASO con enlaces mixtos de PS/PO (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con el de totalidad de PS (ISIS 655861).
Tabla 38
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Ejemplo 45: preparación de Ester PFP, el compuesto 110a
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Se trató el compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmol) con el compuesto 103a o 103b (38 mmol), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml) y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, se filtró la fase orgánica a través de celite, posteriormente se lavó con bicarbonato de sodio, agua y solución saturada de cloruro sódico. Después, la fase orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2 % --> 10 % de metanol/diclorometano) para dar los compuestos 104a y 104b con un rendimiento >80 %. Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura.
Se trataron los compuestos 104a y 104b en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (ejemplo 47), para dar los compuestos 105a y 105b con un rendimiento >90 %. Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura.
Se trataron los compuestos 105a y 105b, individualmente, con el compuesto 90 en las mismas condiciones que para los compuestos 901a-d, para dar los compuestos 106a (80 %) y 106b (20 %). Los análisis por LCMS y Rm N de protón fueron consistentes con la estructura.
Se trataron los compuestos 106a y 106b en las mismas condiciones que para los compuestos 96a-d (ejemplo 47), para dar 107a (60 %) y 107b (20 %). Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura. Se trataron los compuestos 107a y 107b en las mismas condiciones que para los compuestos 97a-d (ejemplo 47), para dar los compuestos 108a y 108b con un rendimiento del 40-60 %. Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura.
Se trataron los compuestos 108a (60 %) y 108b (40 %) en las mismas condiciones que para los compuestos 100a-d (ejemplo 47), para dar los compuestos 109a y 109b con rendimientos >80 %. Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura.
Se trató el compuesto 109a en las mismas condiciones que para los compuestos 101a-d (ejemplo 47), para dar el compuesto 110a con un rendimiento del 30-60 %. Los análisis por LCMS y RMN de protón fueron consistentes con la estructura. Alternativamente, el compuesto 110b se puede preparar de una manera similar comenzando con el compuesto 109b.
Ejemplo 46:
La estructura de GalNAc3-10 (GalNAc3-10a-CM-) se muestra a continuación:
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Ejemplo 47:
La estructura de GalNAc3 -8 (GalNAc3 - 8 a-CM-) se muestra a continuación:
Ejemplo 48: preparación del oligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
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116
Se sintetizó el compuesto 112 siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía (J. Med. Chem. 2004, 47, 5798-5808).
Se disolvió el compuesto 112 (5 g, 8,6 mmol) en metanol/acetato de etilo 1:1 (22 ml/22 ml). Se añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una capa de celite y se lavó la capa con metanol/acetato de etilo 1:1. Se combinaron el filtrado y los lavados y se concentraron a sequedad para producir el compuesto 105a (cuantitativo). La estructura se confirmó mediante LCMS.
Se disolvieron el compuesto 113 (1,25 g, 2,7 mmol), HBTU (3,2 g, 8,4 mmol) y DIEA (2,8 ml, 16,2 mmol) en DMF anhidra (17 ml) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 min. A esta se le añadió una solución del compuesto 105a (3,77 g, 8,4 mmol) en DMF anhidra (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. Se eliminó el disolvente a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en CH2Cl2 (100 ml) y se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 (100 ml) y solución saturada de cloruro sódico (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 10 al 20 % en diclorometano para producir el compuesto 114 (1,45 g, 30 %). La estructura se confirmó mediante análisis por LCMS y RMN de 1H.
Se disolvió el compuesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) en metanol/acetato de etilo 1:1 (4 ml/4 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,14 g). Se hizo pasar hidrógeno abundante a través de la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una capa de celite. La capa de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). Se combinaron el filtrado y los lavados y se evaporaron a presión reducida para producir el compuesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó mediante análisis por LCMS y RMN de 1H.
Se disolvieron el compuesto 83a (0,17 g, 0,75 mmol), HBTU (0,31 g, 0,83 mmol) y DIEA (0,26 ml, 1,5 mmol) en DMF anhidra (5 ml) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 5 min. A esta se le añadió una solución del compuesto 115 (1,22 g, 0,75 mmol) en DMF anhidra y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El disolvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en CH2Cl2. La fase orgánica se lavó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y solución saturada de cloruro sódico, se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La fase orgánica se concentró a sequedad y el residuo obtenido se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 3 al 15 % en diclorometano para producir el compuesto 116 (0,84 g, 61 %). La estructura se confirmó mediante análisis por LCMS y RMN de 1H.
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Se disolvió el compuesto 116 (0,74 g, 0,4 mmol) en metanol/acetato de etilo 1:1 (5 ml/5 ml). Se añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). Se hizo pasar hidrógeno abundante a través de la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La mezcla de reacción se filtró a través de una capa de celite. la capa de celite se lavó con metanol/acetato de etilo (1:1). Se combinaron el filtrado y los lavados y se evaporaron a presión reducida para producir el compuesto 117 (0,73 g, 98 %). La estructura se confirmó mediante análisis por LCMS y RMN de 1H.
Se disolvió el compuesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) en DMF anhidra (3 ml). A esta solución se le añadieron A/,A/-di¡soprop¡let¡lam¡na (70 pl, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 pl, 0,42 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3. La mezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con solución saturada de cloruro sódico y se secó sobre Na2SÜ4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta sequedad y se purificó con cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH del 5 al 10 % en diclorometano para producir el compuesto 118 (0,51 g, 79 %). La estructura se confirmó mediante análisis por LCMS y RMN de 1H y de 1H y 19F.
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Se preparó el compuesto oligomérico 119, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-7, utilizando los procedimientos generales ilustrados en el ejemplo 46. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-7 (GalNAc3-7a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En determinadas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(= O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-7 (GalNAc3-7a-CM-) se muestra a continuación:
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Ejemplo 49:
La estructura de GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 51: preparación de oligonucleótidos 155 que comprenden GalNAc3-6
Figure imgf000054_0002
Se disolvieron el compuesto 4 (15 g, 45,55 mmol) y el compuesto 35b (14,3 gramos, 57 mmol) en CH2CI2 ( 2 00 ml). Se añadieron tamices moleculares activados (4 Á. 2 g, polvo) y se dejó agitar la reacción durante 30 minutos en atmósfera de nitrógeno. Se añadió TMS-OTf (4,1 ml, 22,77 mmol) y se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente durante la noche. Tras completarse, la reacción se interrumpió vertiéndola en solución acuosa saturada de NaHCO3 (500 ml) y hielo triturado (~150 g). La fase orgánica se separó, se lavó con solución saturada de cloruro sódico, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró a presión reducida hasta un aceite naranja. El material en bruto se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con un 2-10 % de MeOH en CH2Cl2 para producir el compuesto 112 (16,53 g, 63 %). Los análisis por LCMS y RMN de 1H fueron consistentes con el compuesto esperado.
Se disolvió el compuesto 112 (4,27 g, 7,35 mmol) en MeOH/EtOAc 1:1 (40 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada la reacción (TLC MeOH al 10 % en CH2Cl2 y LCMS), se eliminó el catalizador mediante filtración a través de una capa de celite. Se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria 1y se secó brevemente a alto vacío para producir el compuesto 105a (3,28 g). Los análisis por LCMS y RMN de TH fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 147 (2,31 g, 11 mmol) en DMF anhidra (100 ml). Se añadió A/,A/-di¡soprop¡let¡lam¡na (DIEA, 3,9 ml, 22 mmol), seguida de HBTU (4 g, 10,5 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción durante ~15 minutos bajo nitrógeno. A esta se le añadió una solución del compuesto 105a (3,3 g, 7,4 mmol) en DMF seca y se agitó durante 2 h en atmósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado y solución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El material en bruto se purificó mediante cromatografía en columna del 2-5 % de MeOH en CH2Cl2 para producir el compuesto 148 (3,44 g, 73 %). Los análisis por LCMS y RMN de 1H fueron consistentes con el producto esperado.
Se disolvió el compuesto 148 (3,3 g, 5,2 mmol) en MeOH/EtOAc 1:1 (75 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10 % en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración a través de una capa de celite. El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el compuesto 149 (2,6 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en DMF seca (10 ml) y se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa.
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150
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Se disolvió el compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) en DMF seca (20 ml). A esto, se le añadieron DIEA (450 |j.l, 2,6 mmol, 1,5 eq.) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). Se dejó agitar la mezcla de reacción durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidra (10 ml). Se ajustó el pH de la reacción a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (en caso necesario). Se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Una vez completada la reacción, ésta se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de una solución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4 , se filtró y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con un 2 - 1 0 % de MeOH en CH2Cl2 para producir el compuesto 150 (0,62 g, 2 0 %). Los análisis por LCMS y RMN de 1H fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 150 (0,62 g) en MeOH/EtOAc 1:1 (5 l). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada la reacción (TLC MeOH al 10 % en DCM y LCMS), se eliminó el catalizador por filtración (filtro de teflón en punta de jeringa, 0,45 |o.m). El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el compuesto 151 (0,57 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seca y se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa.
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154
Se disolvió el compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) en DMF anhidra (5 ml) y se añadieron A/,A/-di¡sopropilet¡lam¡na (75 |o.l, 1 mmol) y PFP-TFA (90 |j.l, 0,76 mmol). La mezcla de reacción se volvió magenta al entrar en contacto y gradualmente se volvió naranja durante los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se controló mediante TLC y LCMS. Una vez completada la reacción (formación del éster de PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de A/,A/-diisopropiletilamina (en caso necesario). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. Al finalizar, la mayor parte del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con NaHCÜ3 acuoso saturado, seguido de solución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (2-10 % de MeOH en CH2Cb) para producir el compuesto 152 (0,35 g, 55 %). Los análisis por LCMS y RMN de 1H fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) en MeOH/EtOAc 1:1 (10 ml). La mezcla de reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada la reacción (TLC MeOH al 10 % en DCM y LCMS), se eliminó el catalizador por filtración (filtro de teflón en punta de jeringa, 0,45 pm). Se concentró el filtrado mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a alto vacío para producir el compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La LCMS fue consistente con el producto deseado.
Se disolvió el compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) en DMF anhidra (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A este se le añadieron A/,A/-di¡soprop¡let¡lam¡na (65 pl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 pl, 0,28 mmol). La mezcla de reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. La mezcla de reacción se volvió magenta al entrar en contacto y gradualmente se volvió de color naranja. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo más A/,A/-diisopropiletilamina. El progreso de la reacción se controló mediante TLC y LCMS. Al finalizar, la mayor parte del disolvente se eliminó a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2Cl2 (50 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de solución saturada de cloruro sódico. La fase orgánica se secó sobre MgSO4 , se filtró, y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna y se eluyó con 2-10 % de MeOH en CH2Cl2 para producir el compuesto 154 (0,29 g, 79 %). Los análisis por LCMS y RMN de 1H fueron consistentes con el producto deseado.
Figure imgf000058_0002
Se preparó el compuesto oligomérico 155, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-6 , utilizando los procedimientos generales ilustrados en el ejemplo 46. La porción de agrupación GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3 - 6 (GalNAc3 - 6 a) se puede combinar con cualquier resto escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En determinadas realizaciones, el resto escindible es -P(=O)(0H)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3 - 6 (GalNAc3 - 6 a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 52:
La estructura de GalNAc3 - 9 (GalNAc3 - 9 a-CM) se muestra a continuación:
Figure imgf000059_0001
Ejemplo 56: estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado 3’ o 5’ (comparación de GalNAc3-1, 2, 3, 5, 6, 7 y 10) dirigidos a SRB-1 in vivo
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados a continuación en un estudio dependiente de la dosis de la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones. Se incluyó ISIS 353382 no conjugado como patrón. Cada uno de los diversos grupos conjugados de GalNAc3 se unió al extremo 5’ del oligonucleótido respectivo mediante un nucleósido de 2’-desoxiadenosina enlazado mediante fosfodiéster (resto escindible), excepto ISIS 655861 que tenía el grupo conjugado de GalNAc3 unido al extremo 3’.
Tabla 42
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La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 9. La estructura de GalNAc3 - 2 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 37. La estructura de GalNAc3 - 3 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 49. La estructura de GalNAc3 - 6 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 51. La estructura de GalNAc3 - 7 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 48. La estructura de GalNAc3 - 10 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 46.
Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea una vez la dosis que se muestra a continuación de ISIS 353382, 655861, 664507, 6 6 1 1 6 1 , 666224, 666961, 666981, 666881, o solución salina, a ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 en el hígado utilizando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon) según protocolos estándar. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto al control con solución salina. Tal como se ilustra en la tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados en 5’ mostraron un ligero aumento de potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido conjugado en 3’.
Tabla 43
Figure imgf000060_0001
(continuación)
Figure imgf000061_0002
Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), en suero en relación con los ratones inyectados con solución salina utilizando protocolos estándar. También se evaluaron la bilirrubina total y el BUN. Se evaluó el cambio en el peso corporal, sin cambios significativos con respecto al grupo de solución salina. Los valores de ALT, AST, bilirrubina total y BUN se muestran en la tabla 44 siguiente.
Tabla 44
Figure imgf000061_0001
(continuación)
Figure imgf000062_0002
Ejemplo 61:
La estructura de GalNAc3 - 12 (GalNAc3 - 12 a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000062_0001
Ejemplo 62:
La estructura de GalNAc3-13 (GalNAc3-13a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000063_0001
Ejemplo 63:
La estructura de GalNAc3-14 (GalNAc3-14a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000063_0002
Ejemplo 64:
La estructura de GalNAc3-15 (GalNAc3-15a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000063_0003
Ejemplo 67:
La estructura de GalNAc3-16 (GalNAc3-16a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000064_0001
Ejemplo 6 8 :
La estructura de GalNAc3-17 (GalNAc3-17a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000064_0002
Ejemplo 69:
La estructura de GalNAc3-18 (GalNAc3-18a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000064_0003
Ejemplo 70:
La estructura de GalNAc3-19 (GalNAc3-19a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000065_0001
Ejemplo 71:
La estructura de GalNAc3- 20 (GalNAc3- 2 0 a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000065_0002
Ejemplo 76:
La estructura de GalNAc3-23 (GalNAc3-23a-CM) se muestra a continuación:
Ejemplo 80: inhibición antisentido in vivo mediante oligonucleótidos dirigidos a la antitripsina alfa-1 (A1AT) que comprenden un conjugado GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 72 siguiente en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis de A1AT en ratones.
Tabla 72
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La estructura de GalNAc3-1 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 9, GalNAc3-3 a se ha mostrado en el ejemplo 39, GalNAc3-7 a se ha mostrado en el ejemplo 48, GalNAc3-10 a se ha mostrado en el ejemplo 46 y GalNAc3-13a se ha mostrado en el ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó un oligonucleótido enumerado en la tabla 72 o PBS a cada uno de los ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) por vía subcutánea una vez por semana a la dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Se determinaron los niveles de ARNm hepático de A1AT utilizando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon) según protocolos estándar. Se determinaron los niveles de proteína plasmática A1AT utilizando el ELISA de antitripsina alfa 1 de ratón (Catálogo # 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, New Hampshire). Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio de ARNm de A1AT hepática y niveles de proteína plasmática para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto al control de PBS.
Tal como se ilustra en la tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de A1AT hepática y de proteína A1AT plasmática de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el original (ISIS 476366).
Tabla 73
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Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas y BUN en plasma en el momento del sacrificio utilizando protocolos estándar. También se midieron los pesos corporales y de órganos. Los resultados se muestran en la tabla 74 siguiente. El peso corporal se muestra como el % con respecto al valor inicial. Los pesos de los órganos se muestran como el % del peso corporal en relación con el grupo de control de PBS.
Tabla 74
Figure imgf000067_0002
(continuación)
Figure imgf000068_0001
Ejemplo 81: duración de la acción in vivo de oligonucleótidos que hibridan A1AT que comprenden una agrupación GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 72 en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea una vez un oligonucleótido enumerado en la tabla 72 o PBS a cada uno de ratones C57BL/6 macho de seis semanas de edad. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Se extrajo sangre el día antes de la dosificación para determinar el valor inicial y a los 5, 12, 19 y 25 días después de la dosis. Los niveles de proteína A1AT en plasma se midieron mediante ELISA (véase el ejemplo 80). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de proteína A1AT en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto a los niveles iniciales. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de GalNAc eran más potentes y tenían una duración de acción más prolongada que el original que carecía de un conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprendían un conjugado 5’-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383 y 678384) eran generalmente aún más potentes con una duración de acción incluso más prolongada que el oligonucleótido que comprendía un conjugado 3’-GalNAc (ISIS 656326).
Tabla 75
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Ejemplo 82: inhibición antisentido in vitro mediante oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden un conjugado de GalNAc3
Se sembraron hepatocitos primarios de hígado de ratón en placas de 96 pocilios a 15.000 células/pocillo 2 horas antes del tratamiento. Se añadieron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 76 a 2, 10, 50, o 250 nM en medio E de Williams y las células se incubaron durante la noche a 37 °C en 5 % de CO2. Las células se lisaron 16 horas después de la adición de oligonucleótidos y se purificó el ARN total utilizando RNease 3000 BioRobot (Qiagen). Se determinaron los niveles de ARNm de SRB-1 utilizando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon) según protocolos estándar. Se determinaron los valores IC50 utilizando software Prism 4 (GraphPad). Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían una variedad de grupos conjugados GalNAc diferentes y una variedad de restos escindibles diferentes son significativamente más potentes en un experimento de captación libre in vitro que los oligonucleótidos originales que carecían de un grupo conjugado GalNAc (ISIS 353382 y 666841).
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 9, GalNAc3 - 3 a se ha mostrado en el ejemplo 39, GalNAc3 - 5 a se ha mostrado en el ejemplo 49, GalNAc3 - 6 a se ha mostrado en el ejemplo 51, GalNAc3 - 7 a se ha mostrado en el ejemplo 48, GalNAc3 - 8 a se ha mostrado en el ejemplo 47, GalNAc3 - 9 a se ha mostrado en el ejemplo 52, GalNAc3 - 10 a se ha mostrado en el ejemplo 46, GalNAc3 - 12 a se ha mostrado en el ejemplo 61, GalNAc3-13a se ha mostrado en el ejemplo 62, GalNAc3-14a se ha mostrado en el ejemplo 63, GalNAc3-15a se ha mostrado en el ejemplo 64, GalNAc3-17a se ha mostrado en el ejemplo 6 8 , GalNAc3-18a se ha mostrado en el ejemplo 69, GalNAc3-19a se ha mostrado en el ejemplo 70, GalNAc3 - 20 a se ha mostrado en el ejemplo 71 y GalNAc3-23a se ha mostrado en el ejemplo 76.
Ejemplo 83: inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprenden una agrupación GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 77 en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis del Factor XI en ratones.
Tabla 77
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La estructura de GalNAc3 - 1 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 9, GalNAc3 - 3 a se ha mostrado en el ejemplo 39, GalNAc3 - 7 a se ha mostrado en el ejemplo 48, GalNAc3 - 10 a se ha mostrado en el ejemplo 46 y GalNAc3-13a se ha mostrado en el ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectó un oligonucleótido enumerado a continuación o PBS a cada uno de los ratones de seis a ocho semanas de edad por vía subcutánea una vez por semana a la dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la dosis final. Se midieron los niveles de ARNm del hígado del Factor XI utilizando PCR en tiempo real y se normalizaron respecto a ciclofilina según protocolos estándar. Se midieron también las transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio para cada grupo de tratamiento, normalizado respecto al control de PBS.
Tal como se ilustra en la tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo el ARNm del Factor XI hepático de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de GalNAc eran más potentes que el original que carecía de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de 5’-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) eran aún más potentes que el oligonucleótido que comprendía un conjugado de 3’-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
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Ejemplo 84: duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos al factor XI que comprenden un conjugado de GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 77 en un estudio de dosis única para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea un oligonucleótido enumerado en la tabla 77 o PBS a cada uno de los ratones de seis a ocho semanas de edad. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Se extrajo sangre mediante sangrados de la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor inicial y el 3°, 10° y 17° día después de la dosis. Se midieron los niveles de proteína del factor XI en plasma mediante ELISA utilizando anticuerpos de captura y detección biotinilados del factor XI de R&D Systems, Minneapolis, Minnesota (Catálogo # AF2460 y No. BAF2460, respectivamente) y OptEIA Reagent Set B (Catálogo # 550534, BD Biosciences, San José, California). Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de proteína del Factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto a los niveles iniciales. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de GalNAc eran más potentes con una duración de acción más prolongada que el original que carecía de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de 5’-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) eran aún más potentes con una duración de acción aún más prolongada que el oligonucleótido que comprendía un conjugado de 3’-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
Figure imgf000075_0001
Ejemplo 93: inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden alas mixtas y un conjugado de 5 ’-GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 100 en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
Figure imgf000075_0002
(continuación)
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Tratamiento
Se inyectó por vía subcutánea un oligonucleótido enumerado en la tabla 100 o solución salina una vez a ratones C57BL/6 de seis a ocho semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) a la dosis que se muestra a continuación. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Se midieron los niveles de ARNm de SRB-1 hepático mediante PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de SRB-1 se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de ciclofilina según protocolos estándar. Los resultados se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Tal como se ilustra en la tabla 101, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos de gápmero que comprendían un conjugado de GalNAc y que tenían alas con modificación completa con cEt o azúcares mixtos fueron significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado y que comprendía alas con modificación completa con cEt.
También se midieron los pesos corporales, las transaminasas hepáticas, la bilirrubina total y el BUN, y se muestran en la tabla 101 los valores promedio para cada grupo de tratamiento. El peso corporal se muestra como el porcentaje de peso corporal promedio en relación con el peso corporal inicial (% v.i.) medido justo antes de la dosis de oligonucleótidos.
Tabla 101
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(continuación)
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Ejemplo 94: inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden modificaciones de 2’-azúcar y un conjugado de 5 ’-GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 102 en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 102
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Tratamiento
El estudio se completó utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 93. Los resultados se muestran en la tabla 103 siguiente y muestran que tanto los oligonucleótidos modificados con 2’-MOE como los con 2’-OMe que comprendían un conjugado GalNAc eran significativamente más potentes que los respectivos oligonucleótidos originales que carecían de un conjugado. Los resultados de las mediciones de peso corporal, transaminasas hepáticas, bilirrubina total y BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 103
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Ejemplo 95: inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden nucleósidos bicíclicos y un conjugado de 5 ’-GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 104 en un estudio dependiente de la dosis para la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 104
Figure imgf000078_0001
Tratamiento
El estudio se completó utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 93. Los resultados se muestran en la tabla 105 siguiente y muestran que los oligonucleótidos que comprendían un conjugado de GalNAc y diversas modificaciones de nucleósidos bicíclicos eran significativamente más potentes que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado y comprendía modificaciones de nucleósidos bicíclicos. Además, el oligonucleótido que comprendía un conjugado de GalNAc y modificaciones de fluoro-HNA fue significativamente más potente que el original que carecía de un conjugado y que comprendía modificaciones de fluoro-HNA. Los resultados de pesos corporales, transaminasas hepáticas, bilirrubina y las mediciones de BUN indicaron que todos los compuestos fueron bien tolerados.
Tabla 105
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Ejemplo 96: unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado GalNAc3
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 70 dirigidos a ApoC-III y los oligonucleótidos de la tabla 106 dirigidos a Apo(a) en un ensayo de ultrafiltración con el fin de evaluar la unión a proteínas plasmáticas.
Tabla 106
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Véase el ejemplo 74 para la leyenda de la tabla. La estructura de GalNAc3-7 a se ha mostrado anteriormente en el ejemplo 48.
Se preacondicionaron unidades de ultrafiltración Ultrafree-MC (membrana de celulosa regenerada de baja unión, 30.000 NMWL, Millipore, Bedford, Massachusetts) con 300 pl de Tween 80 al 0,5 % y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, a continuación, con 300 pl de una solución de 300 pg/ml de un oligonucleótido de control en H2O y se centrifugaron a 2000 g durante 16 minutos. A fin de evaluar la unión no específica a los filtros de cada oligonucleótido de ensayo de las tablas 70 y 106 a utilizarse en los estudios, se colocaron 300 pl de una solución de 250 ng/ml de oligonucleótido en H2O a pH 7,4 en los filtros preacondicionados y se centrifugaron a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron las muestras filtradas y sin filtrar mediante un ensayo ELISA para determinar las concentraciones de oligonucleótidos. Se utilizaron tres réplicas para obtener una concentración promedio para cada muestra. La concentración promedio de la muestra filtrada en relación con la muestra sin filtrar se utiliza para determinar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en ausencia de plasma (% de recuperación).
Se adquirieron muestras de plasma entero congelado recogidas en K3-EDTA de voluntarios humanos normales no medicados, monos cinomolgus y ratones CD-1 de Bioreclamation LLC (Westbury, Nueva York). Se añadieron los oligonucleótidos de ensayo a alícuotas de plasma de 1,2 ml a dos concentraciones (5 y 150 pg/ml). Se colocó una alícuota (300 pl) de cada muestra de plasma enriquecida en una unidad de filtro preacondicionada y se incubó a 37 °C durante 30 minutos, seguido inmediatamente por centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. Se analizaron alícuotas de muestras de plasma enriquecidas filtradas y sin filtrar mediante un ELISA para determinar la concentración de oligonucleótidos en cada muestra. Se utilizaron tres réplicas por concentración para determinar el porcentaje promedio de oligonucleótido unido y no unido en cada muestra. La concentración promedio de la muestra filtrada en relación con la concentración de la muestra sin filtrar se utiliza para determinar el porcentaje de oligonucleótido en el plasma que no está unido a las proteínas plasmáticas (% no unido). Se corrige la unión no específica de los valores finales de oligonucleótidos no unidos dividiendo el % no unido por el % de recuperación para cada oligonucleótido. Los valores finales del % de oligonucleótidos unidos se determinan restando de 100 los valores finales del % no unido. Los resultados se muestran en la tabla 107 para las dos concentraciones de oligonucleótidos ensayadas (5 y 150 pg/ml) en cada especie de plasma. Los resultados muestran que los grupos conjugados de GalNAc no tienen un impacto significativo en la unión a proteínas plasmáticas. Además, los oligonucleótidos con la totalidad de enlaces internucleosídicos PS y enlaces PO/PS mixtos se unían a proteínas plasmáticas, y aquellos con la totalidad de enlaces PS se unían a proteínas plasmáticas en un grado algo mayor que aquellos con enlaces PO/PS mixtos.
Tabla 107
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Ejemplo 98: evaluación de los efectos proinflamatorios de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc en el ensayo de hPMBC
Los oligonucleótidos enumerados en la tabla 109 se analizaron para determinar los efectos proinflamatorios en un ensayo de hPMBC. ISIS 353512 es Tes Ce Ces CdsAdsTdsTdsTds CdsAdsGdsGdsAdsGdsAdsGdsAds Cds CdsTesGesGe y es un respondedor elevado que se utiliza como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las tablas 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la tabla 109 se obtuvieron utilizando sangre de un donante voluntario. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían enlaces internucleosídicos PO/PS mixtos produjeron respuestas proinflamatorias significativamente menores en comparación con los mismos oligonucleótidos que tenían la totalidad de enlaces PS. Además, el grupo conjugado de GalNAc no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
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Ejemplo 99: afinidades de unión de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc para el receptor de asialoglucoproteína
Se ensayaron las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la tabla 110 (véase la tabla 76 para las descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglucoproteína en un ensayo de unión de receptor competitivo. El ligando competidor, glucoproteína ácida a1 (AGP, de Acid Glycoprotein), se incubó en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37 °C, y se confirmó más del 90 % de desialilación con el ensayo de ácido siálico o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC de Size Exclusión Chromatography). Se utilizó monocloruro de yodo para yodar el AGP, según el procedimiento de Atsma et al. (véase J Lipid Res. 1991 Jan; 32 (1): 173-81.) En este procedimiento, se añadió glucoproteína ácida a1 desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na125I y glicina 1 M en NaOH 0,25 M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, la de-AGP marcada con 125I se separó de la sin 125I concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna de centrifugación de 3 KDMWCO. La proteína se ensayó para determinar su eficacia y pureza de marcado en un sistema de HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8 x 300 mm) y un contador de p-RAM. Los experimentos de competición que utilizaban de-AGP etiquetada con 125I y diversos ASO que contenían agrupaciones GalNAc se realizaron tal como se describe a continuación. Se sembraron células HepG2 humanas (106 células/ml) en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiados. Se utilizó medio MEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron 16-20 horas a 37 °C con el 5 % y el 10 % de CO2 respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 min a 37 °C con 1 ml de la mezcla de competencia que contenía el medio de crecimiento apropiado con el 2 % de FBS, 10-8 M de de-AGP etiquetada con 125I y los ASO que contenían agrupaciones GalNAc a concentraciones comprendidas entre 10-11 y 10-5 M. Se determinó la unión no específica en presencia de 10-2 M de azúcar GalNAc. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para eliminar la de-AGP marcada con 125I no unida y el ASO GalNAc competidor. Las células se lisaron utilizando tampón RLT de Qiagen que contenía el 1 % de p-mercaptoetanol. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y se analizaron en un contador y. La unión no específica se restó antes de dividir los recuentos de proteína 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron según una ecuación de unión competitiva de un solo sitio utilizando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd).
Los resultados de la tabla 110 se obtuvieron a partir de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados de los oligonucleótidos marcados con un superíndice “a” son el promedio de los experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían un grupo conjugado GalNAc en el extremo 5’ se unen al receptor de asialoglucoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad de 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprendían un grupo conjugado GalNAc en el extremo 3’.
Tabla 110
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Ejemplo 101: inhibición antisentido de oligonucleótidos que comprenden una agrupación GalNAc enlazada a través de un resto estable
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 112 para determinar la inhibición de la expresión de APOC-III de ratón in vivo. Se inyectó un oligonucleótido enumerado en la tabla 112 o PBS a cada uno de los ratones C57B1/6 por vía subcutánea una vez. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Cada ratón tratado con ISIS 440670 recibió una dosis de 2, 6 , 20 o 60 mg/kg. Cada ratón tratado con ISIS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado de GalNAc de ISIS 696847 está enlazado mediante un resto estable, un enlace fosforotioato en lugar de un enlace fácilmente escindible que contenía fosfodiéster. Los animales se sacrificaron 72 horas después de la dosis. Se midieron los niveles de ARNm de APOC-III hepático mediante PCR en tiempo real. Los niveles de ARNm de APOC-III se normalizaron respecto a los niveles de ARNm de ciclofilina según protocolos estándar. Los resultados se presentan en la tabla 112 como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de APOC-III para cada grupo de tratamiento en relación con el grupo de control de solución salina. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprendían un grupo conjugado de GalNAc eran significativamente más potentes que el oligonucleótido que carecía de un grupo conjugado. Además, el oligonucleótido que comprendía un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido mediante un resto escindible (ISIS 680772) fue aún más potente que el oligonucleótido que comprendía un grupo conjugado de GalNAc enlazado al oligonucleótido mediante un resto estable (ISIS 696847).
Tabla 112
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La estructura de GalNAc3 - 7 a se ha mostrado en el ejemplo 48.
Ejemplo 113: oligonucleótidos antisentido dirigidos a angiopoyetina 3 y que comprenden un grupo conjugado de GalNAc
Se diseñaron los oligonucleótidos de la tabla 121 para dirigirse a la proteína de tipo angiopoyetina 3 humana (ANGPTL3).
Tabla 121
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Ejemplo 114: inhibición antisentido in vivo mediante oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc, dirigidos a la ANGPTL3 humana
Se inyectó un oligonucleótido enumerado en la tabla 122 (y descrito en la tabla 121) o PBS a cada uno de los ratones C57B1/6 transgénicos macho de seis semanas de edad que expresan la ANGPTL3 humana, por vía intraperitoneal una vez por semana a la dosis que se muestra a continuación, para un total de dos dosis. Cada grupo de tratamiento consistía en 4 animales. Los ratones se sacrificaron dos días después de la dosis final. Se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 hepática utilizando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, Oregon) según protocolos estándar. Los resultados siguientes se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de ARNm de la ANGPTL3 hepática para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto al control de PBS.
Tal como se ilustra en la tabla 122, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de ARNm de la ANGPTL3 hepática de una manera dependiente de la dosis, y el oligonucleótido que comprendía un conjugado de GalNAc fue significativamente más potente que el oligonucleótido original que carecía de un conjugado de GalNAc.
Tabla 122
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Se midieron también los niveles de alanina aminotransferasa (ALT) hepática en el momento del sacrificio utilizando protocolos estándar. Los resultados muestran que ninguno de los grupos de tratamiento tenía niveles elevados de ALT, lo que indica que los oligonucleótidos fueron bien tolerados.
Ejemplo 115: inhibición antisentido in vivo mediante oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc, dirigidos a ANGPTL3 de ratón
Se ensayaron los oligonucleótidos enumerados en la tabla 123 siguiente en un estudio dependiente de la dosis en ratones.
Tabla 123
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La estructura de GalNAc3-7 a se ha mostrado en el ejemplo 48.
Se alimentaron ratones con desactivación del receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDLR-/-) con una dieta occidental durante 1 semana antes de inyectarles por vía intraperitoneal una vez por semana la dosis que se muestra a continuación de un oligonucleótido enumerado en la tabla 123 o PBS. Cada grupo de tratamiento consistía en 5 animales. Se extrajo sangre antes de administrar la primera dosis para determinar los niveles iniciales de triglicéridos en plasma y 2 semanas después de la primera dosis. Los resultados de la tabla 124 se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de triglicéridos en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados respecto a los niveles iniciales (% v.i.). Los resultados muestran que los oligonucleótidos antisentido redujeron los triglicéridos de una manera dependiente de la dosis. Además, los oligonucleótidos que comprendían un grupo conjugado de GalNAc mostraron una reducción de triglicéridos incluso más potente que el oligonucleótido que no comprendía un grupo conjugado.
Tabla 124
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Ejemplo 116: inhibición antisentido de la proteína de tipo angiopoyetina 3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de la proteína de tipo angiopoyetina 3 (ANGPTL3) y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con 4.500 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492 MGB (secuencia directa CCGTGGAAGACCAATATAAACAATT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 4; AGTCCTTCTGAGCTGATTTTCTATTTCT; secuencia inversa, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 5; secuencia de sonda AACCAACAGCATAGTCAAATA, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 6) para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia de genes humanos. Cada gápmero enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humana, designado en la presente memoria descriptiva como la SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ iD NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de los nucleótidos 33032001 a 33046000). ’n/a’ indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 125
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(continuación)
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(continuación)
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T a b l a 126
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'obla 127
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Tabla 128
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T a b l a 129
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Tabla 130
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lab!.! 131
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Tabla 133
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TeMe 134
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Tabla 135
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Tabla 136
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Tabla 137
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(continuación)
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(continued)
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Tabla 138
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(continuación)
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(continuación)
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Ejemplo 117: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE
Se seleccionaron los gápmeros 5-10-5 MOE de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in
vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,75 pM, 1,50 pM, 3,00 pM, 6,00 pM y 12,00 pM de oligonucleótido anti especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el
ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real.
Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los
niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de
ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas
con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 139
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Ejemplo 118: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE
Se seleccionaron los gápmeros 5-10-5 MOE de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,813 p.M, 1,625 p.M, 3,25 p.M, 6,50 p.M y 13,00 p.M de oligonucleótido antisentido, tal como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el a Rn de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 140
Figure imgf000174_0001
Tabla 141
Figure imgf000174_0002
(continuación)
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Tabla 142
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Tabla 143
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ral- ! 144
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Tabla 145
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(continuación)
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Tnbin 146
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Ejemplo 119: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros desoxi, MOE y (S)-cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con 4.500 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492 _MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos, en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o un residuo de desoxi azúcar. Las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido antisentido se describen como ’eek-d10-kke’, donde ’k’ indica una modificación de azúcar (S)-cEt; ’d’ indica desoxirribosa; el número indica el número de residuos de azúcares desoxirribosa; y ’e’ indica una modificación de azúcar MOE. Los enlaces internucleosídicos en cada oligonucleótido son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humano, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SeQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 148
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Tabla 149
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Ejemplo 120: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros desoxi, MOE y (S)-cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. ISIS 337487 e ISIS 233717, que son gápmeros de 5-10-5 MOE, se incluyeron también en el ensayo como oligonucleótidos referentes. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño, en las tablas siguientes, se diseñaron como oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt o gápmeros 5-10-5 MOE. Los oligonucleótidos desoxi, MOE y (S)-cEt tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar (S)-cEt o un residuo de desoxi azúcar. Las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido antisentido se describen como ’eek-d10-kke’, donde ’k’ indica una modificación de azúcar (S)-cEt; ’d’ indica desoxirribosa; el número indica el número de residuos de azúcares desoxirribosa; y ’e’ indica una modificación MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de alas en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los enlaces internucleosídicos en cada oligonucleótido son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el oligonucleótido en la secuencia del gen humano. Cada oligonucleótido enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humano, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncado de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.
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:2 8 c O
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Tabla 151
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Tabla 154
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Ejemplo 121: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de la ANGPTL3 y se ensayaron sus efectos sobre el ARNm de la ANGPTL3 in vitro. Se transfectaron células Hep3B cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo utilizando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.500 nM. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos de nuevo diseño en las tablas siguientes se diseñaron como gápmeros 5-10-5 MOE o 3-10-4 MOE. Los gápmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los gápmeros 3-10-4 MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en los que el segmento espaciador central comprende diez 2’-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5’ y la dirección 3’ que comprenden tres y cuatro nucleósidos, respectivamente. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Cada nucleósido en el segmento de ala 5’ y cada nucleósido en el segmento de ala 3’ tiene una modificación 2’-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gápmero son enlaces fosforotioato (P=S). Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de parada" indica el nucleósido más 3’ al que está dirigido el gápmero secuencia de genes humanos. Cada gápmero enumerado en las tablas siguientes está dirigido al ARNm de la ANGPTL3 humana, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 1 (GENBANK No. de registro NM_014495.2) o la secuencia genómica de la ANGPTL3 humana, designada en la presente memoria descriptiva como SeQ ID NO: 2 (GENBANK No. de registro NT_032977.9 truncada de nucleótidos 33032001 a 33046000). "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no está dirigido a esa secuencia genética particular con un 100 % de complementariedad.
Tabla 155
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Ejemplo 122: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. ISIS 233717 e ISIS 337847, ambos gápmeros 5-10-5 MOE, se incluyeron también en los estudios. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación.
Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,813 pMI, 1,625 |¿M, 3,25 pMI, 6,500 |oMI y 13,00 |oMI de oligonucleótido antisentido, tal como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 156
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i abla 157
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Tabla 158
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Tabla 159
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Ejemplo 123: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. ISIS 337847, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también en los estudios. Los oligonucleótidos antisentido se ensayaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados de cada experimento se presentan en tablas separadas a continuación.
Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,160 pM, 0,481 pM, 1,444 pM, 4,333 pM y 13,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 160
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Tabla 161
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Ejemplo 124: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante gápmeros MOE
Se seleccionaron y ensayaron gápmeros MOE de los ejemplos anteriores que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 2 0 . 0 0 0 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,160 pM, 0,481 pM, 1,444 pM, 4,333 pM y 13,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el a Rn de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ArN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
- m : i 163
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Ejemplo 125: inhibición antisentido dependiente de la dosis de la ANGPTL3 humana en células Hep3B mediante oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt
Se seleccionaron y ensayaron oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt de los estudios descritos anteriormente que mostraron una inhibición in vitro significativa del ARNm de la ANGPTL3 y se ensayaron a diversas dosis en células Hep3B. Las células se sembraron en placa a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron utilizando electroporación con concentraciones de 0,111 pM, 0,333 pM, 1,00 pM, 3,00 pM y 9,00 pM de oligonucleótido antisentido, como se especifica en la tabla siguiente. Después de un período de tratamiento de, aproximadamente, 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de la ANGPTL3 mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Se utilizó el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS3492_MGB para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los resultados se presentan como inhibición porcentual de la ANGPTL3, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la concentración inhibidora media máxima (IC50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de la ANGPTL3 se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 164
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Tabla 166
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Tsate 167
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Ejemplo 126: inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en ratones transgénicos huANGPTL3
De los oligonucleótidos antisentido descritos en los estudios anteriores, se evaluó adicionalmente su capacidad para reducir el transcrito de ARNm de la ANGPTL3 humana en ratones C57B1/6 con el transgén de la ANGPTL3 humana (ratones Tg).
Estudio 1
Se mantuvieron ratones Tg hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO, de Antisense oligonucleotides) en solución salina tamponada (PBS, de Phosphate Saline Buffer) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 50 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con los oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS3492_MGB. Los niveles de ARNm también se midieron con el conjunto de sondas de cebadores humanos RTS1984 (secuencia directa CTTCAATGAAACGTGGGAGAACT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 7; secuencia inversa TCTCTAGGCCCAACCAAAATTC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 8 ; secuencia de la sonda AAATATGGTTTTGGGAGGCTTGAT, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 9). Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3, en comparación con el control de PBS.
Tabla 168
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Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo # DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de proteína ANGPTL3.
Wfcta 169
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Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 170
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Estudio 2
Se mantuvieron ratones Tg macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 50 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. Los grupos inyectados con PBS sirvieron como grupos de control con los que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS1984. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 171
Figure imgf000321_0001
Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultados niveles reducidos de la proteína ANGPTL3.
Tabla 172
Figure imgf000322_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8 ° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 173
Figure imgf000323_0001
Estudio 3
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 2,5 mg/kg, 12,5 mg/kg o 25 mg/kg una vez por semana durante 3 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. Los grupos inyectados con PBS sirvieron como grupos de control con los que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022 (secuencia directa AAATTTTAGCCAATGGCCTCC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 10; secuencia inversa TGTCATTAATTTGGCCCTTCG, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 11; secuencia de sonda TCAGTTGGGACATGGTCTTAAAGACTTTGTCC, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 12). Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. Se presenta también la ED50 de cada gápmero en la tabla siguiente. ’n.d.’ indica que no se pudo determinar la ED50.
Tabla 174
Figure imgf000324_0001
Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS dio como resultados niveles reducidos de la proteína ANGPTL3. ’n. d.’ indica que no se pudo determinar la ED50.
Tabla 175
Figure imgf000325_0001
Figure imgf000326_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 17° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 176
Figure imgf000326_0002
Figure imgf000327_0001
Estudio 4
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 177
Figure imgf000328_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 178
Figure imgf000329_0001
Estudio 5
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE o gápmeros desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con RTS1984. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 179
Figure imgf000330_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 180
Figure imgf000330_0002
Figure imgf000331_0002
Estudio 6
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con varios de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 181
Figure imgf000331_0001
Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con varios de los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de proteína ANGPTL3.
Tabla 182
Figure imgf000332_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 10° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 183
Figure imgf000332_0002
Figure imgf000333_0002
Estudio 7
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 184
Figure imgf000333_0001
Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos ISIS dio resultados niveles reducidos de la ANGPTL3. En este caso, el valor’ 0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.
Tabla 185
Figure imgf000334_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 186
Figure imgf000334_0002
Figure imgf000335_0002
Estudio 8
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, también se incluyó como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 187
Figure imgf000335_0001
Figure imgf000336_0001
Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1: 20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de la ANGPTL3.
Tabla 188
Figure imgf000336_0002
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 189
Figure imgf000337_0002
Estudio 9
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. ISIS 233710, un gápmero 5-10-5 MOE, se incluyó también como referente. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. En este caso, el valor ’0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.
Tabla 190
Figure imgf000337_0001
Figure imgf000338_0001
Análisis de proteínas
Los niveles de proteína ANGPTL3 humana se cuantificaron utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo #DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos ISIS dio como resultado niveles reducidos de la ANGPTL3. En este caso, el valor ’0’ implica que el tratamiento con el oligonucleótido ISIS no inhibió la expresión; en algunos casos, se puede haber registrado un aumento de los niveles de expresión.
Tabla 191
Figure imgf000338_0002
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 9° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 192
Figure imgf000339_0001
Estudio 10
Se mantuvieron ratones Tg macho y hembra en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en las instalaciones de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y se esterilizaron mediante filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Grupos de ratones recibieron inyecciones intraperitoneales de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt a una dosis de 5 mg/kg, 12,5 mg/kg o 25 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los grupos tratados con oligonucleótidos correspondientes.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del hígado para un análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3 con hANGPTL3_LTS01022, y también con RTS3492_MGB. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con algunos de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dio como resultado una reducción del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS.
Tabla 193
Figure imgf000340_0001
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 8° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 194
Figure imgf000341_0001
Ejemplo 127: tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ANGPTL3 humano en ratones CD1 Los ratones CD1® (Charles River, Massachussets) son un modelo de ratones multipropósito, que se utiliza con frecuencia para ensayos de seguridad y eficacia. Se trataron ratones con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Estudio 1
Se inyectó por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (un animal por grupo de tratamiento) una dosis única de 200 mg/kg de oligonucleótido desoxi, MOE y cEt. Se inyectó por vía subcutánea a un ratón macho CD1 una dosis única de PBS. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 4° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 195
Figure imgf000342_0002
Pesos corporales
Se midieron los pesos corporales un día después de la dosis única de oligonucleótido ISIS y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
Tabla 196
Figure imgf000342_0001
Figure imgf000343_0001
Estudio 2
Se inyectó por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (un animal por grupo de tratamiento) una dosis única de 200 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Se inyectó por vía subcutánea a un ratón macho CD1 una dosis única de PBS. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en el 5° día, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas (ALT y AST) utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores de función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 197
Figure imgf000343_0002
Figure imgf000344_0002
Pesos corporales
Los pesos corporales se midieron el 5° día después de la dosis única de oligonucleótido ISIS y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido fueron excluidos de estudios adicionales.
Tabla 198
Figure imgf000344_0001
Figure imgf000345_0002
Estudio 3
Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional. Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 45° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 199
Figure imgf000345_0001
Pesos corporales
Los pesos corporales se midieron el 43° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 45° día. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 200
Figure imgf000345_0003
Figure imgf000346_0002
Estudio 4
Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 50 mg/kg o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 46° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 201
Figure imgf000346_0001
Pesos corporales
Los pesos corporales se midieron el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 46° día. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 202
Figure imgf000347_0002
Estudio 5
Se inyectaron por vía intraperitoneal a ratones CD1 macho (cuatro animales por grupo de tratamiento) 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt administrados una vez a la semana durante 6 semanas. A un grupo de 4 ratones CD1 macho se le inyectó por vía intraperitoneal PBS administrado una vez a la semana durante 6 semanas. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis y se recogieron los órganos y el plasma para un análisis adicional.
Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 43° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de estos marcadores fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 203
Figure imgf000347_0001
Pesos corporales
Los pesos corporales se midieron el 41° día y se presentan en la tabla siguiente. Se midieron los pesos de riñón, hígado y bazo al final del estudio el 43° día. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios adicionales.
Tabla 204
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Ejemplo 128: medición de la viscosidad de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a ANGPTL3 humana
Se midió la viscosidad de oligonucleótidos antisentido seleccionados de los estudios descritos anteriormente con el objetivo de cribar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad de más de 40 centipoise (cP). Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP tendrían una viscosidad inferior a la óptima.
Se pesaron oligonucleótidos ISIS (32-35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 |j.l de agua y se disolvió el oligonucleótido antisentido en una solución calentando el vial a 50 °C. Se pipeteó una parte (75 |j.l) de la muestra precalentada a un microviscosímetro (Cambridge). La temperatura del microviscosímetro se fijó en 25 °C y se midió la viscosidad de la muestra. Se pipeteó otra parte (20 |j.l) de la muestra precalentada en 10 ml de agua para lectura UV a 260 nM a 85 °C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, donde la concentración de cada oligonucleótido antisentido fue 350 mg/ml, e indican que la mayoría de las soluciones de oligonucleótidos antisentido son óptimas en su viscosidad bajo el criterio establecido anteriormente.
Tabla 205
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Ejemplo 129: tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos a ANGPTL3 humana en ratas Sprague-Dawley
Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito utilizado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Las ratas se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS de los estudios descritos en los ejemplos anteriores y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Estudio 1
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) el 45° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en UI/l. Se midieron también los niveles plasmáticos de bilirrubina utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 206
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 207
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Tabla 208
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Pesos de órganos
Se midieron los pesos corporales el 42° día y se presentan en la tabla siguiente. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 45° día y se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 209
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Estudio 2
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o con 50 mg/kg o 100 mg/kg de gápmeros 5-10-5 MOE u oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) se midieron el 44° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en Ul/l. Los niveles plasmáticos de bilirrubina también se midieron utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática, fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 210
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina el 44° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 211
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Tabla 212
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Pesos de órganos
Los pesos corporales se midieron el 42° día y se presentan en la tabla siguiente. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido fueron excluidos de estudios adicionales.
Tabla 213
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Estudio 3
Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con comida normal para ratas Purina, dieta 5001. Se inyectaron por vía subcutánea, a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno una vez a la semana durante 6 semanas, PBS o 50 mg/kg de oligonucleótidos desoxi, MOE y cEt. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificaron las ratas y se recogieron los órganos y el plasma para análisis posteriores.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) se midieron el 44° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en Ul/l. Se midieron también los niveles plasmáticos de bilirrubina utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados se presentan también en la tabla siguiente expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 214
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina el 44° día utilizando un analizador de química clínica automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Se midieron los niveles de proteína total en orina y creatinina en orina, y se evaluó la proporción entre proteína total en orina respecto a la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
Tabla 215
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Tabla 216
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Pesos de órganos
Los pesos corporales se midieron el 42° día y se presentan en la siguiente tabla. Los pesos de hígado, bazo y riñón se midieron al final del estudio el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. Se excluyeron de estudios posteriores los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 217
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Ejemplo 130: efecto de oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a ANGPTL3 humana en monos cynomolgus
Se trataron monos cynomolgus con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los ejemplos anteriores. Se evaluaron la eficacia y la tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón.
En el momento en que se llevó a cabo este estudio, la secuencia genómica del mono cynomolgus no estaba disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI); por lo tanto, no se pudo confirmar la reactividad cruzada con la secuencia del gen del mono cynomolgus. En cambio, se comparó la homología de las secuencias de los oligonucleótidos antisentido ISIS utilizados en los monos cynomolgus con una secuencia de mono rhesus. Se espera que los oligonucleótidos ISIS con homología con la secuencia del mono rhesus también presenten una reacción cruzada completa con la secuencia del mono cynomolgus. Los oligonucleótidos antisentido humanos ensayados presentan reactividad cruzada con la secuencia genómica de rhesus (GENBANK No. de registro NW_001108682.1 truncado de los nucleótidos 3049001 a 3062000, designada en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 3). Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, es más probable que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia del mono rhesus. Los sitios de inicio y parada de cada oligonucleótido para SEQ ID NO: 3 se presentan en la tabla siguiente. "Sitio de inicio" indica el nucleótido más 5’ al que está dirigido el gápmero en la secuencia del gen del mono rhesus. "Emparejamiento erróneo" indica el número de nucleobases en el oligonucleótido humano que no coinciden con la secuencia genómica de rhesus.
Tabla 218
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Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante, como mínimo, un período de 30 días, durante el cual se observó a los animales diariamente para verificar su salud general. Los monos tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Se inyectó por vía subcutánea, a nueve grupos de 5 monos cynomolgus macho asignados aleatoriamente cada uno, oligonucleótido ISIS o PBS en cuatro sitios en la espalda en una rotación en el sentido de las agujas del reloj (es decir, izquierda, superior, derecha e inferior), un sitio por dosis. Los monos recibieron dosis de administración de PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS cada dos días durante la primera semana (1°, 3°, 5° y 7° día) y posteriormente se les administró una dosis una vez a la semana durante 12 semanas (14°, 21°, 28°, 35°, 42°, 49°, 56°, 63°, 70°, 77° y 84° día) de PBS o 40 mg/kg de oligonucleótido ISIS.
Durante el período de estudio, se observó a los monos dos veces al día en busca de signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que experimentara un dolor o angustia más que momentáneo o leve debido al tratamiento, lesión o enfermedad fue tratado por el personal veterinario con analgésicos o agentes aprobados para aliviar el dolor después de consultar con el director del estudio. Se identificó cualquier animal con mala salud o en un posible estado moribundo para un mayor seguimiento y posible eutanasia. Por ejemplo, en el 45° día se encontró moribundo un animal en el grupo de tratamiento con ISIS 567321 y se sacrificó. El sacrificio programado de los animales se llevó a cabo el 86° día (aproximadamente 48 horas después de la dosis final) mediante exanguinación después de anestesia inducida mediante ketamina/xilacina y la administración de pentobarbital sódico. Los protocolos descritos en el ejemplo fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Reducción en la diana hepática
Análisis de ARN
El 86° día, se extrajo el ARN del hígado para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión del ARNm de la ANGPTL3. Los resultados se presentan como cambio porcentual de ARNm, respecto al control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Tal como se muestra en la tabla siguiente, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de la ANGPTL3 en comparación con el control de PBS. El análisis de los niveles de ARNm de la ANGPTL3 reveló que ISIS 544199 e ISIS 559277, ambos con reactividad cruzada completa con la secuencia de rhesus, redujeron significativamente los niveles de expresión. Otros oligonucleótidos de ISIS, que staban dirigidos a la secuencia del mono con emparejamientos erróneos, también pudieron reducir los niveles de ARNm de la ANGPTL3.
Tabla 219
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Análisis de proteínas
Se recogió, aproximadamente, 1 ml de sangre de todos los animales disponibles el día 85 y se colocó en tubos que contenían la sal potásica de EDTA. Las muestras de sangre se colocaron en hielo y se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a 4 °C) para obtener plasma.
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo # DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. El análisis de ANGPTL3 plasmática reveló que ISIS 563580, 544199 e ISIS 559277 redujeron los niveles de proteína de manera sostenida. Otros oligonucleótidos de ISIS también pudieron reducir los niveles de la ANGPTL3.
Tabla 220
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Estudios de tolerabilidad
Mediciones de peso corporal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y se presentan en la tabla siguiente. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los pesos corporales estaba dentro del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de los pesos corporales de los monos.
Tabla 221
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Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se extrajeron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la administración de la dosis. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y posteriormente se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Se midieron los niveles de diversos marcadores de función hepática utilizando un analizador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT y AST y los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en UI/l. La bilirrubina, un marcador de la función hepática, se midió de manera similar y se presenta en la tabla siguiente expresada en mg/dl. Los resultados indican que la mayoría de los oligonucleótidos antisentido no tuvo ningún efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de función hepática en monos.
Tabla 222
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Tabla 223
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Tabla 224
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Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se recogieron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se extrajeron de las venas cefálica, safena o femoral, 48 horas después de la dosificación. Los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la extracción de sangre. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y posteriormente se centrifugaron (aproximadamente 3000 rpm durante 10 minutos) para obtener suero. Los niveles de BUN y creatinina se midieron utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados en mg/dl.
Los datos de la química plasmática indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
Tabla 225
Figure imgf000358_0003
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Tabla 226
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Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de, aproximadamente, 0,5 ml de sangre de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Se analizó de las muestras el recuento de glóbulos rojos (RBC, de red blood cell), recuento de glóbulos blancos (WBC, de white blood cell), recuentos individuales de glóbulos blancos, tales como el de monocitos, neutrófilos, linfocitos, así como para el recuento de plaquetas, el contenido de hemoglobina y el hematocrito, utilizando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, EE. UU.). Los datos se presentan en las tablas siguientes.
Los datos indican que los oligonucleótidos no provocaron cambios en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis. Específicamente, el tratamiento con ISIS 563580 fue bien tolerado en términos de parámetros hematológicos de los monos.
Tabla 227
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Tabla 228
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Efecto sobre moléculas proinflamatorias
Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, se tomaron muestras de sangre para el análisis de la proteína C reactiva y los niveles de C3 el 84° día antes de la dosis. Se recogieron, aproximadamente, 1,5 ml de sangre de cada animal y se colocaron en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 min y posteriormente se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente para obtener suero. Se midió la proteína C reactiva (CRP) y el complemento C3, que sirven como marcadores de inflamación, utilizando un analizador químico Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados indican que el tratamiento con ISIS 563580 fue tolerable en monos.
Tabla 229
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Tabla 230
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Medición de la concentración de oligonucleótidos
Se midió la concentración de oligonucleótidos de longitud completa. El procedimiento utilizado es una modificación de los procedimientos publicados anteriormente (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999) que consisten en una extracción con fenol-cloroformo (líquido-líquido) seguida de una extracción en fase sólida. Se añadió un patrón interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 2’-O-metoxietilo 27-mero, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado en la presente memoria descriptiva como SEQ ID NO: 13) antes de la extracción. Las concentraciones de las muestras de tejido se calcularon utilizando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ, de lower limit of quantitation) de, aproximadamente, 1,14 |¿g/g. Los resultados se presentan en la tabla siguiente, expresados como |¿g/g de tejido de hígado o riñón. Se calculó la proporción de concentraciones de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón respecto al hígado. Se descubrió que la proporción de concentraciones de oligonucleótidos de longitud completa en el riñón respecto al hígado después del tratamiento con ISIS 563580 era la óptima, en comparación con otros compuestos evaluados.
Tabla 231
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Ejemplo 131: comparación de la inhibición antisentido de la ANGPTL3 humana en ratones transgénicos huANGPTL3 por oligonucleótidos ISIS que comprenden un grupo conjugado GalNAc y oligonucleótidos ISIS que no comprenden un grupo conjugado GalNAc
Se evaluó la capacidad de oligonucleótidos antisentido que comprendían GalNAc3-7a en comparación con sus contrapartes no conjugadas para reducir el transcrito de ARNm de la ANGPTL3 humana en ratones Tg. Los gápmeros, que se dirigían a la SEQ ID NO: 1, se describen en la tabla siguiente y en la tabla 121. Los símbolos de la columna de Química de la cadena principal son los siguientes: "s" indica éster de tioato y "o" indica éster de fosfato.
Tabla 232
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Se mantuvieron ratones Tg hembra y macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. Los animales se aclimataron durante, como mínimo, 7 días en el centro de investigación antes del inicio del experimento. Se prepararon oligonucleótidos antisentido (ASO) en solución salina tamponada (PBS) y esterilizada por filtración a través de un filtro de 0,2 micrómetros. Los oligonucleótidos se disolvieron en PBS al 0,9 % para inyección.
Un grupo de 4 ratones recibió inyecciones subcutáneas de ISIS 563580 a dosis de 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, o 30 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Grupos de 4 ratones recibieron cada uno inyecciones intraperitoneales de ISIS 703801 o ISIS 703802 a dosis de 0,3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg una vez por semana durante 2 semanas. Un grupo de ratones recibió inyecciones subcutáneas de PBS una vez a la semana durante 2 semanas. El grupo inyectado con PBS sirvió como grupo de control con el que se compararon los correspondientes grupos tratados con oligonucleótidos.
Análisis de ARN
Al final del período de tratamiento, se extrajo ARN del tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de la medición de la expresión de ARNm de la ANGPTL3 con el conjunto de sondas de cebadores humanos hANGPTL3_LTS01022. Los resultados se presentan como porcentaje de cambio de ARNm, en relación con el control de PBS, normalizado con RIBOGREEN®. Un valor cero simplemente indica que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión a un nivel medible.
Los resultados demuestran que los compuestos conjugados son mucho más potentes para reducir la expresión de la ANGPTL3 que su contraparte no conjugada, tal como resulta evidente a partir del porcentaje de inhibición y los valores de ID50. El oligonucleótido conjugado con química de cadena principal mixta (703802) fue más potente para inhibir la expresión que el oligonucleótido conjugado con química de cadena principal con totalidad de fosforotioato (703801).
Tabla 233
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(continuación)
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Análisis de proteínas
Se cuantificaron los niveles de proteína ANGPTL3 humana utilizando un kit ELISA disponible en el mercado (Catálogo # DANL30 por R&D Systems, Minneapolis, Minnesota) con muestras de plasma transgénico diluidas 1:20.000 utilizando el protocolo descrito por el fabricante. Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Un valor cero indica simplemente que el oligonucleótido antisentido no inhibió la expresión a un nivel medible.
Los resultados demuestran que los compuestos conjugados son más potentes para reducir la expresión de la ANGPTL3 que su contraparte no conjugada, tal como resulta evidente a partir de los valores de porcentaje de inhibición. El oligonucleótido conjugado con la química de cadena principal mixta (703802) fue más potente en la inhibición de la expresión que el oligonucleótido conjugado con la química de cadena principal con la totalidad de fosforotioato (703801).
Tabla 234
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Ejemplo 132: tolerabilidad de un oligonucleótido antisentido conjugado con GalNAc, dirigido a la ANGPTL3 humana en ratones CD1
Se inyectaron por vía subcutánea a ratones macho CD1 (cuatro animales por grupo de tratamiento) diversas dosis de ISIS 703802, tal como se describe en la tabla siguiente durante 6 semanas (los días 1, 3, 5, 8, 14, 21, 28, 35 y 42). Se inyectó por vía subcutánea PBS a un grupo de 4 ratones CD1 macho durante 6 semanas. Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la última dosis, y se recogieron los órganos y el plasma para su análisis posterior. Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de ISIS 703802, se midieron los niveles plasmáticos de diversos marcadores de función hepática y renal el 44° día utilizando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Los resultados se presentan en la tabla siguiente. Se demostró que ISIS 703802 es un compuesto tolerable incluso a dosis elevadas.
Tabla 235
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Pesos corporales
Se midieron los pesos corporal, del riñón, del hígado y del bazo al final del estudio en el 44° día. ISIS 703802 no cambió significativamente el peso corporal y de los órganos incluso cuando se administró a dosis elevadas.
Tabla 236
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Ejemplo 133: tolerabilidad de un oligonucleótido antisentido conjugado con GalNAc dirigido a ANGPTL3 humano en ratas Sprague-Dawley
Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito utilizado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Se mantuvieron ratas Sprague-Dawley macho en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron a voluntad con pienso normal para ratas Purina, dieta 5001. Se les inyectaron diversas dosis de ISIS 703802 a grupos de 4 ratas Sprague-Dawley cada uno por vía subcutánea, tal como se describe en la tabla siguiente durante 6 semanas (los días 1, 3, 5, 8, 14, 21, 28, 35 y 42). Se inyectó PBS a un grupo de 4 ratas por vía subcutánea durante 6 semanas. Las ratas se sacrificaron 48 horas después de la última dosis, y se recolectaron los órganos y el plasma para análisis posteriores.
Función hepática y renal
Para evaluar el efecto de ISIS 703802 sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas utilizando un analizador químico clínico automático (Hitachi Olympus AU400e, Melville, Nueva York). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) el 44° día y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en Ul/l.
Para evaluar el efecto de ISIS 703802 sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de albúmina, nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatitina y bilirrubina utilizando el mismo analizador de química clínica y los resultados se presentan en la tabla siguiente expresados en g/dl o mg/dl.
Para evaluar adicionalmente el efecto de ISIS 703802 sobre la función renal, se analizaron los niveles de proteína y creatinina en orina, y se evaluó la proporción de proteína total en orina respecto a creatinina. Los resultados se presentan en la tabla siguiente.
Se demostró que ISIS 703802 es un compuesto tolerable incluso a dosis elevadas.
Tabla 237
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Tabla 238
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Pesos de órganos
Se midieron los pesos corporal, hepático, esplénico y renal al final del estudio el 44° día y se presentan en la tabla siguiente. ISIS 703802 no cambió significativamente el peso corporal, renal y hepático incluso cuando se administró a dosis elevadas.
Tabla 239
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de la fórmula siguiente
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o una sal del mismo.
2. Compuesto, según la reivindicación 1, en el que el compuesto es una sal de sodio.
3. Composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y, como mínimo, uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
4. Composición, según la reivindicación 3, en la que el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
5. Compuesto, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o composición, según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, para su utilización en terapia.
6. Compuesto o composición para su utilización, según la reivindicación 5, para su utilización en el tratamiento, prevención o ralentización de la progresión de una enfermedad relacionada con ANGPTL3 elevada.
7. Compuesto o composición para su utilización, según la reivindicación 6, en el que la enfermedad es una enfermedad, trastorno o afección cardiovascular y/o metabólica.
REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
Esta lista de referencias citada por el solicitante es únicamente para mayor comodidad del lector. No forman parte del documento de la Patente Europea. Incluso teniendo en cuenta que la compilación de las referencias se ha efectuado con gran cuidado, los errores u omisiones no pueden descartarse; la EPO se exime de toda responsabilidad al respecto.
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