JP2017521045A - アンジオポエチン様因子３発現を調節するための組成物及び方法 - Google Patents

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Abstract

動物におけるＡＮＧＰＴＬ３ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、及び組成物を提供する。また、動物における脂質及び／またはグルコースを低下させる方法、化合物、及び組成物も提供する。そのような方法、化合物、及び組成物は、必要とする個体における任意の１つ以上の心血管疾患及び／若しくは代謝性疾患、またはその症状の治療、予防、遅延、または改善に有用である。

Description

配列表
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。この配列表は、２０１５年４月２８日に作成されたサイズ０．９８ＭＢのＢＩＯＬ０２５４ＷＯＳＥＱ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
動物においてアンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させるための方法、化合物、及び組成物が提供される。また、動物においてＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患または状態を軽減するためのＡＮＧＰＴＬ３阻害剤を含む方法、化合物、及び組成物が提供される。そのような方法、化合物、及び組成物は、例えば、動物において心血管疾患またはメタボリック症候群、またはその症状の任意の１つ以上の治療、予防、遅延、または改善に有用である。
糖尿病と肥満（「糖尿肥満」と総称することもある）は相互に関連しており、肥満は糖尿病の病理を悪化させることが知られ、６０%を超える糖尿病患者は肥満である。ほとんどのヒト肥満は、インスリン抵抗性及びレプチン抵抗性に関連する。実際、肥満は、糖尿病それ自体よりもインスリン作用に対する影響がより大きくあり得ることが示唆されている（Ｓｉｎｄｅｌｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｓ．，２００２，５１，８５−９１）。さらに、糖尿病の治療用に市販されている化合物の中には、体重増加を導くことが知られているものがいくつかあり、これはこの疾患の治療に非常に望ましくない副作用である。
心血管疾患もまた肥満及び糖尿病と相互に関連する。心血管疾患は多種多様な病因を包含し、原因物質および相互関連する要因が同じように多岐にわたる。多くの原因物質が、非ＨＤＬコレステロール（非ＨＤＬ−Ｃ）などの血漿コレステロール高値といった症状、並びに他の脂質関連障害の一因となる。こうした脂質関連障害は一般に脂質異常症と呼ばれ、これらには他の適応の中でも高脂血症、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症が含まれる。非ＨＤＬコレステロール高値は、アテローム形成、及び動脈硬化、冠動脈疾患、心筋梗塞、虚血性脳卒中、および他の形態の心臓疾患といった心血管疾患を含む、その続発疾患に関連する。これらは、先進工業国において最もよく見られる病気として位置づけられている。事実、米国では推定１２００万人が冠動脈疾患に罹患しており、約３６００万人がコレステロール高値に対する治療を必要とする。
疫学的証拠および実験的証拠から、血中トリグリセリド（ＴＧ）（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）高値は心血管疾患および無数の代謝障害の一因であることが示されている（Ｖａｌｄｉｖｉｅｌｓｏ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ． １、１０２（２）：２５０−６）。外因性供給源または内因性供給源に由来するＴＧは、腸からのカイロミクロンまたは肝臓からの超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）で取り込まれ分泌される。一旦循環に入ったＴＧはリポタンパク質リパーゼ（ＬｐＬ）により加水分解され、その後、生成された遊離脂肪酸は局所組織に取り込まれ、エネルギー源として使用され得る。血漿ＴＧ及び代謝一般に及ぼすＬｐＬの影響が大きいので、ＬｐＬ活性に影響を与える化合物を発見し開発することは大きな関心の的である。
メタボリック症候群は、心血管疾患及び糖尿病のリスクを高める内科的疾患の組み合わせである。個体によっては、高血圧、高トリグリセリド、低ＨＤＬ、及び肥満などの症状が同時に見られる傾向がある。メタボリック症候群は集団で多数の人々に発生する。いくつかの研究において、米国での有病率は最高で人口の２５%にのぼると算出されている。メタボリック症候群は、（代謝性）症候群Ｘ、インスリン抵抗性症候群、リーブン症候群（Ｒｅａｖｅｎ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、またはＣＨＡＯＳなどさまざまな呼称で知られている。心血管障害及び代謝障害のその高い有病率から、これらの病態を治療するための改善されたアプローチが依然必要とされている。
アンジオポエチンは、分泌される成長因子の一ファミリーである。アンジオポエチンはそれぞれの内皮特異的受容体と共に、血管新生の重要な役割を果たす。ファミリーメンバーの一つであるアンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴ５、ＡＮＧＰＴＬ３、またはアンジオポエチン５としても知られる）は主に肝臓に発現し、脂質代謝を調節する役割を果たすと考えられている（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．，２００３，４４，１３６−１４３）。ＨＤＬ、ＬＤＬ、およびトリグリセリドの血漿濃度に関連する一般的な多様体のゲノムを調査するゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）で、ＡＮＧＰＴＬ３に近接した一塩基多型（ＳＮＰ）とトリグリセリドとの関連が見出された（Ｗｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００８，４０（２）：１６１−１６９）。ホモ接合ＡＮＧＰＴＬ３機能喪失型変異を有する個体は、総コレステロール（ＴＣ）及びＴＧ、低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）、アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）、非ＨＤＬ−Ｃ、並びにＨＤＬ−Ｃなど、アテローム発生性の脂質及びリポタンパク質の血漿レベルがすべて低値を呈する（Ｒｏｍｅｏ ｅｔ ａｌ． ２００９，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，１１９（１）：７０−７９、 Ｍｕｓｕｎｕｒｕ ｅｔ ａｌ． ２０１０ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３６３：２２２０−２２２７、 Ｍａｒｔｉｎ−Ｃａｍｐｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１２，Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，４１３：５５２−５５５、 Ｍｉｎｉｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２０１２，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ，９７：ｅ１２６６−１２７５、 Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ． ２０１２，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，３２：８０５−８０９、 Ｐｉｓｃｉｏｔｔａ ｅｔ ａｌ． ２０１２，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｇｅｎｅｔ，５：４２−５０）。この臨床表現型は家族性複合型低脂血症（ＦＨＢＬ２）と言われている。ＦＨＢＬ２に罹患した被検者は、ＶＬＤＬ分泌量が低いにもかかわらず肝脂肪量は高くない。グルコース及びインスリンの血漿中濃度も低いようであり、重要なことに、これらの被検者には糖尿病及び心血管疾患のいずれも見られないようである。これまで有害な臨床表現型は報告されていない（Ｍｉｎｉｃｏｃｃｉ ｅｔ ａｌ． ２０１３，Ｊ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５４：３４８１−３４９０）．動物モデルにおいて、ＡＮＧＰＴＬ３が低下するとＴＧ、コレステロール及びＬＤＬの各レベルが低下することがわかっている（Ｕ．Ｓ．第１３/５２０，９９７号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８５２７１）。ＡＮＧＰＴＬ３欠損マウスはトリグリセリド（ＴＧ）及びコレステロールの血漿中レベルが非常に低いが、過剰発現では反対の作用がある（Ｋｏｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ２００２、 Ｋｏｓｔｅｒ ２００５、 Ｆｕｊｉｍｏｔｏ ２００６）。したがって、ＡＮＧＰＴＬ３が脂質代謝において果たす潜在的役割から、ＡＮＧＰＴＬ３は治療的介入にとって魅力的な標的である。
これまで、ＡＮＧＰＴＬ３レベルを直接標的にして心血管代謝系疾患を治療するための治療的戦略は限られている。ＡＮＧＰＴＬ３ポリペプチド断片（Ｕ．Ｓ．１２/１２８，５４５）、抗ＡＮＧＰＴＬ３抗体（Ｕ．Ｓ．１２/００１，０１２）及びアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＡＮＧＰＴＬ３核酸阻害剤（Ｕ．Ｓ．１３/５２０，９９７、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０８５２７１、参照によりその全体が本明細書に組み入れられたものとする）が先に示唆または開発されているが、ＡＮＧＰＴＬ３を直接標的にするいずれの化合物も心血管代謝系疾患の治療に承認されていない。したがって、ＡＮＧＰＴＬ３を阻害するための極めて強力で忍容性の高い化合物に対するニーズは満たされていない。本明細書に開示する発明は、新規の、極めて強力なＡＮＧＰＴＬ３発現阻害剤の発見及びそれらの治療における使用に関する。
本明細書ではＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を調節するための組成物及び方法が提供される。ある特定の実施形態において、組成物はＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤である。ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤はＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を低下させる。
ある特定の実施形態において、組成物はＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤である。ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は核酸である。ある特定の実施形態において、核酸はアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は共役基が結合した修飾オリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号７７の核酸塩基配列の核酸塩基の少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個が連続している核酸塩基配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９の長さが等しい部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号２の核酸塩基９７１５〜９７３４の長さが等しい部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号２に対して少なくとも８０％相補的である。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号７７の少なくとも８個が連続した核酸塩基を含む核酸塩基配列を有し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは（ａ）連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含んでおり、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、各ヌクレオシド間の連結はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドであり、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、２０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号７７の少なくとも８個連続した核酸塩基からなる核酸塩基配列を有し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは（ａ）連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、（ｂ）連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、（ｃ）連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントからなり、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、各ヌクレオシド間の連結はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。
ある特定の実施形態において、本開示は、共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞を、核酸転写産物に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させることを含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む共役アンチセンス化合物と接触させること、及び細胞内の核酸転写産物の量または活性を低減させることを含む方法を提供する。
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は以前に記載されている。例えばＰａｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ｖｏｌ．１０２，Ｎｏ．４７，ｐｐ．１７１２５−１７１２９（２００５）を参照されたい。これらの受容体は、肝臓細胞、特に肝細胞上で発現する。さらに、３つのＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドのクラスターを含む化合物は、ＡＳＧＰ−Ｒに結合して細胞内への当該化合物の取り込みをもたらす能力を有することが示されている。例えば、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ.，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６，９，ｐｐ ５２１６−５２３１（２００８年５月）を参照されたい。したがって、そのようなＧａｌＮＡｃクラスターを含む共役体が、肝臓細胞、具体的には肝細胞への特定化合物の取り込みを促進するために使用されている。例えば、特定のＧａｌＮＡｃ含有共役体は、生体内で肝臓細胞における二重鎖ｓｉＲＮＡ化合物の活性を増加させることが示されている。これらの例では、ＧａｌＮＡｃ含有共役体は、典型的には、ｓｉＲＮＡ位二重鎖のセンス鎖に結合させる。センス鎖はアンチセンス鎖が最終的に標的核酸とハイブリダイズする前に処分されてしまうため、共役体が活性を妨害する懸念はほとんどない。典型的には、共役体は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合させる。例えば、米国特許８，１０６，０２２を参照されたい。本明細書に記載する特定の共役基は、今までに記載された共役基よりも活性が高く、かつ／または合成が容易である。
本発明のある特定の実施形態において、共役体は、一本鎖アンチセンス化合物、例えば限定するわけではないが、ＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物や、プレｍＲＮＡ標的核酸のスプライシングを改変するアンチセンス化合物に結合させる。そのような実施形態では、共役体は、利益（細胞内への取り込みの改善）をもたらすのに十分な時間、アンチセンス化合物に結合させた状態にあるべきだが、その後は、切断されるか、または他の何らかの形で、活性に必要な後続ステップ、例えば標的核酸へのハイブリダイゼーション及びＲＮａｓｅ Ｈまたはスプライシング若しくはスプライシング調節に関連する酵素との相互作用などを妨害しないようにすべきである。この性質のバランスは、共役体を単にセンス鎖に結合させるだけでよいｓｉＲＮＡ化合物の場合よりも、一本鎖アンチセンス化合物の場合に、より一層重要である。本明細書には、共役体を欠く同じアンチセンス化合物と比較して、生体内で肝臓細胞における力価が改善されている共役一本鎖アンチセンス化合物を開示する。これらの化合物に要求される性質のバランスを考えると、そのような力価の改善は驚くべきことである。
ある特定の実施形態において、本明細書における共役基は、切断可能部分を含む。機序に束縛されることは望まないが、上述のように、共役体が取り込みの強化をもたらすのに十分な時間、化合物上に残っているべきであることは必然だが、その後は、共役体の何らかの部分、理想的には共役体の全部が切断されて、親化合物（例えばアンチセンス化合物）をその最も活性な形態で放出することが望ましい。ある特定の実施形態では、切断可能部分が切断可能なヌクレオシドである。そのような実施形態では、共役体の残りの部分（クラスター）を、１つ以上の切断可能な結合、例えばホスホジエステル結合のものによって、ヌクレオシドを介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させることにより、細胞中の内在性ヌクレアーゼを利用する。ある特定の実施形態では、クラスターがホスホジエステル結合を介して切断可能なヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態では、切断可能なヌクレオシドが、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンス化合物）に結合している。ある特定の実施形態では、共役基が、２つまたは３つの切断可能なヌクレオシドを含んでよい。そのような実施形態では、上述の切断可能なヌクレオシドが、切断可能な結合（ホスホジエステル結合のもの）によって、互いに、アンチセンス化合物に、かつ／またはクラスターに連結される。本明細書における特定の共役体は、切断可能なヌクレオシドを含まず、代わりに切断可能な結合を含む。オリゴヌクレオチドからの共役体の十分な切断は、細胞内で切断を受けやすい少なくとも１つの結合（切断可能な結合）によってもたらされることを示す。
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物がプロドラッグである。そのようなプロドラッグは、動物に投与され、最終的には、より活性な形態に代謝される。例えば、共役アンチセンス化合物は切断されることで、共役体の全部または一部を除去し、共役体の全部または一部を欠く活性な（またはより活性な）形態のアンチセンス化合物をもたらす。
ある特定の実施形態では、共役体はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合させる。ある特定のそのような５’共役体は、同様の共役基が３’末端に結合している共役体よりも効率よく切断される。ある特定の実施形態では、活性の改善が切断の改善と相関してよい。ある特定の実施形態では、５’末端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性が、３’末端に共役体を含むオリゴヌクレオチドの有効性よりも高い（例えば実施例５６、８１、８３、及び８４を参照のこと）。さらに、５’への結合の方が、簡単なオリゴヌクレオチド合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、典型的には、３’→５’方向に固体支持体上で合成される。３’共役オリゴヌクレオチドを作製するには、典型的には、事前に共役基を結合しておいた３’ヌクレオシドを固体支持体に結合させてから、オリゴヌクレオチドを通常どおりに構築する。しかし、その共役ヌクレオシドを固体支持体に結合させる操作は、合成を複雑にする。さらに、このアプローチを使用した場合、共役体は、オリゴヌクレオチドの合成の間ずっと存在することになり、後続のステップ中に分解される可能性があり、または使用できる反応と試薬の種類が制限される場合がある。５’共役オリゴヌクレオチドについて本明細書に記載する構造及び技法を用いることにより、標準的な自動化された技法を使ってオリゴヌクレオチドを合成し、最後（最も５’側）のヌクレオシドと共に共役体を導入するか、またはオリゴヌクレオチドを固体支持体から切り離してから共役体を導入することができる。
当分野の技術水準及び本開示を考慮すれば、当業者は、本明細書の共役体及び共役オリゴヌクレオチドをどれでも容易に作製することができる。さらに、本明細書に開示するある特定のそのような共役体及び共役オリゴヌクレオチドの合成は、これまでに開示されていた共役体の合成よりも容易であり、かつ／または必要とするステップ数が少なく、それゆえに安価に行うことができるので、それらは製造上の利点になる。例えば、特定の共役基の合成は、これまでに記載された共役基と比較して、より少ない合成ステップからなり、収率の増加をもたらす。実施例４６のＧａｌＮＡｃ３−１０及び実施例４８のＧａｌＮＡｃ３−７などの共役基は、既述の共役体、例えば、より多くの化学中間体の組み立てを必要とするＵ．Ｓ．８，１０６，０２２またはＵ．Ｓ．７，２６２，１７７に記載されているものよりも、はるかに簡単である。したがって、本明細書に記載するこれらの共役体及び他の共役体には、一本鎖オリゴヌクレオチドや二本鎖オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）のどちらかの鎖などといった任意のオリゴヌクレオチドと一緒に使用する際に、既述の化合物に優る利点がある。
同様に、ＧａｌＮＡｃリガンドを１つまたは２つしか持たない共役基も、本明細書に開示する。ここに示すように、そのような共役基は、アンチセンス化合物の活性を改善する。そのような化合物は、ＧａｌＮＡｃリガンドを３つ含む共役体よりも、調製がはるかに容易である。ＧａｌＮＡｃリガンドを１つまたは２つ含む共役基は、任意のアンチセンス化合物に結合させてよく、これには一本鎖オリゴヌクレオチド及び二本鎖オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）の一方が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書の共役体が、忍容性の特定尺度を、実質的に変化させない。例えば、共役アンチセンス化合物の免疫原性は非共役親化合物より高くないことを、本明細書において示す。力価が改善されるので、忍容性が同じままである実施形態は（あるいは実際には力価の増加分と比較して忍容性が少しだけ悪化したとしても）、治療に関して改善された性質を有する。
ある特定の実施形態では、共役により、共役がなければ結果があまり思わしくないような方法で、アンチセンス化合物を改変することが可能になる。例えば、ある特定の実施形態では、全ホスホロチオエートアンチセンス化合物の１つ以上のホスホロチオエート結合を、ホスホジエステル結合で置換することにより、一部の忍容性尺度の改善が起こる。例えば、ある特定の事例では、１つ以上のホスホジエステルを有するそのようなアンチセンス化合物は、各結合がホスホロチオエートである同じ化合物よりも、免疫原性が低い。しかし、ある特定の事例では、実施例２６に示すように、１つ以上のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合で置換すると、細胞取り込みの低減及び／または力価の損失も起こる。ある特定の実施形態において、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物は、共役全ホスホロチオエート化合物と比較して、取り込み及び力価をほとんどまたは全く失うことなく、そのような連結の変化を許容する。事実、ある特定の実施形態では、例えば実施例４４、５７、５９、及び８６では、共役体と少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間結合とを含むオリゴヌクレオチドが、同様に同じ共役体を含む全ホスホロチオエート対応物と比較した場合でさえ、実際に、生体内で力価の増加を呈する。さらに、共役により取り込み／力価の実質的な増加がもたらされるので、その実質的な増加においての小量の損失は、忍容性の改善達成のためには許容されてよい。したがって、ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物が、少なくとも１つのホスホジエステル結合を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書におけるアンチセンス化合物の共役が、肝細胞における送達、取り込み、及び活性の増加をもたらす。したがって、より多くの化合物が肝臓組織に送達される。しかし、ある特定の実施形態では、そのような送達の増加だけでは、活性の増加全体を説明できない。ある特定のそのような実施形態では、より多くの化合物が肝細胞に進入する。ある特定の実施形態では、そのような肝細胞取り込みの増加でも、活性の増加全体を説明することができない。そのような実施形態では、共役化合物の生産的取り込みが増加する。例えば、実施例１０２に示すように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体の特定実施形態は、非実質細胞との対比で肝細胞におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃縮を増加させる。この濃縮は、肝細胞中で発現する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドにとって有益である。
ある特定の実施形態では、本明細書における共役アンチセンス化合物が、腎臓曝露の低減をもたらす。例えば、実施例２０に示すように、ＧａｌＮＡｃ含有共役体の特定実施形態を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、腎臓では、ＧａｌＮＡｃ含有共役体を欠くアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度より低い。このことには、有益な治療的意味が複数ある。腎臓における活性が求められていない治療的適応の場合、腎臓への曝露には、腎毒性のリスクがあり、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、その結果、クリアランスが速くなる。したがって、標的が腎臓でない場合、腎臓内での蓄積は望ましくない。
ある特定の実施形態において、本開示は、式
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］
によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。
本明細書における上記の図及び同様の図において、分岐基「Ｄ」は、「ｑ」で示される数の（Ｅ−Ｆ）基に対応するのに必要な数だけ分岐している。したがって、ｑ＝１の場合、当該の式は、
であり、ｑ＝２の場合、当該の式は、
であり、ｑ＝３の場合、当該の式は、
であり、ｑ＝４の場合、当該の式は、
であり、ｑ＝５の場合、当該の式は、
である。
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される。
特定の変数を２つ以上（例えば２つ以上の「ｍ」または２つ以上の「ｎ」を）有する実施形態では、別段の表示がある場合を除き、そのような特定変数のそれぞれは、独立して選択される。したがって、２つ以上のｎを有する構造の場合、各ｎは独立して選択されるため、それらは互いに同一であっても、または同一でなくてもよい。
ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５６３５８０を含み、ここで、ＸはＧａｌＮＡｃを含む共役基である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５６３５８０からなり、ここで、ＸはＧａｌＮＡｃを含む共役基である。
ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０１を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０１からなる。
ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０２を含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０２からなる。
ある特定の実施形態において、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾（ｓｕｇａｒ ｍｏｄｓ）が多様な５’−ＧａｌＮＡｃを有する、配列番号７７の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾（ｓｕｇａｒ ｍｏｄｓ）が多様な５’−ＧａｌＮＡｃを有する、配列番号７７の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドからなる。
［式中、
Ｒ１は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）であるとともにＲ２はＨであるか、または、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して架橋を形成し、ここで、Ｒ１は−Ｏ−であるとともにＲ２は−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ２−であり、かつ、Ｒ１及びＲ２は、形成される架橋が−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、及び−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−から選択されるよう直接結合され、
また、同一環上のＲ３とＲ４との各対は、環ごとに独立して、Ｒ３はＨ及び−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択されるとともにＲ４はＨであるか、またはＲ３とＲ４が互いに結合して架橋を形成し、ここで、Ｒ３は−Ｏ−であるとともにＲ４は−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ２−であり、かつ、Ｒ３及びＲ４は、形成される架橋が−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、及び−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−から選択されるよう直接結合され、
また、Ｒ５はＨ及び−ＣＨ３から選択され、
また、Ｚは、Ｓ−及びＯ−から選択される］。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の共役アンチセンス化合物またはその塩、及び薬理学的に許容される担体若しくは希釈剤を含む組成物が提供される。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３発現の調節は細胞または組織内で起こる。ある特定の実施形態において、調節は動物の細胞または組織内で起こる。ある特定の実施形態において、動物はヒトである。ある特定の実施形態において、調節はＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルの低下である。ある特定の実施形態において、調節はＡＮＧＰＴＬ３ンパク質レベルの低下である。ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの双方を低下させる。そのような低下は、時間依存的または用量依存的に生じ得る。
ある特定の実施形態では、治療で使用するための組成物及び方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３に関連する疾患、障害、及び状態の進行を予防、治療、遅延、減速及び／または改善するための組成物及び方法が提供される。ある特定の実施形態において、そのような疾患、障害、及び状態は、心血管性及び／または代謝性の疾患、障害、及び状態である。ある特定の実施形態において、治療のための組成物及び方法には、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤を、それを必要とする個体に投与することが含まれる。ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３特異的阻害剤は核酸である。ある特定の実施形態において、核酸はアンチセンス化合物である。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は修飾オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は共役基が結合した修飾オリゴヌクレオチドである。
上述の概要及び以下の詳細な説明はいずれも、例示的及び説明的なものにすぎず、特許請求されている発明を限定するものではないことを理解されるべきである。本明細書において、特に断りのない限り、単数形の使用は複数を含む。本明細書において、特に断らない限り、「または（ｏｒ）」の使用は「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定するものではない。また、「要素」または「成分」などの用語は、特に断りのない限り、１つのユニットを含む要素及び成分並びに２つ以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。
本明細書で使用する項目見出しは構成のみを目的とし、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。本願において引用されるすべての資料または資料の一部、例えば、限定されるものではないが、特許、特許出願、論文、書籍、及び条約は、本明細書で論じられる資料部分およびその資料全体が明言的に参照により本明細書に組み込まれる。
定義
特別に定義しない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、並びに薬化学および製薬化学に関連して用いた専門語、並びにそれらの手順および技術は、当該技術分野で周知の一般に用いられているものである。化学合成および化学的分析には標準技術を用いることができる。それらのある特定の技術及び手順は、例えば、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ” Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｎｇｖｉ ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９９４、 ”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５、及び「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｄｒｕｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ” Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に見出すことができ、これらはいかなる目的においても参照により本明細書に組み込まれるものとする。許される場合には、すべての特許、出願、公開出願、およびその他の刊行物、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）等のデータベースを介して入手可能なＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号および関連する配列情報、並びに本明細書の開示全体で参照されるその他のデータは、本明細書で論じる資料部分およびその資料全体について参照により本明細書に組み込まれる。
特に明記しない限り、以下の用語は以下の意味である。
本明細書において、「ヌクレオシド」は、核酸塩基部分及び糖部分を含む化合物を意味する。ヌクレオシドには、（ＤＮＡ及びＲＮＡにみられる）天然に生じるヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されるものではない。ヌクレオシドをホスフェート部分に連結してよい。
本明細書において、「化学修飾」とは、ある化合物において、天然に生じる化合物と比較した場合の化学的相違を意味する。オリゴヌクレオチドの化学修飾には、ヌクレオシド修飾（糖部分修飾及び核酸塩基修飾を含む）並びにヌクレオシド間結合修飾が含まれる。オリゴヌクレオチドの場合、核酸塩基配列に限られている相違は化学修飾には含まれない。
本明細書において、「フラノシル」は、炭素原子４個及び酸素原子１個を含む５員環を含む構造を意味する。
本明細書において、「天然に生じる糖部分」は、天然に生じるＲＮＡに見られるリボフラノシルまたは天然に生じるＤＮＡに見られるデオキシリボフラノシルを意味する。
本明細書において、「糖部分」は、天然に生じる糖部分またはヌクレオシドの修飾糖部分を意味する。
本明細書において、「修飾糖部分」は置換糖部分または糖代用物を意味する。
本明細書において、「置換糖部分」は、天然に生じる糖部分ではないフラノシルを意味する。置換糖部分には、２’位、３’位、５’位及び／または４’位に置換基を含むフラノシルなどがあるが、これらに限定されない。特定の置換糖部分は二環式糖部分である。
本明細書において、「２’−置換糖部分」は２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含むフラノシルを意味する。特に明記しない限り、２’−置換糖部分は二環式糖部分ではない（すなわち、２’−置換糖部分の２’−置換基は、フラノシル環の別の原子と架橋を形成しない）。
本明細書において、「ＭＯＥ」は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を意味する。
本明細書において、「２’−Ｆ ヌクレオシド」とは、２’位にフッ素を含む糖を含むヌクレオシドを言う。特に明記しない限り、２’−Ｆ ヌクレオシドのフッ素は（天然リボースのＯＨを置換する）リボ位にある。
本明細書において、用語「糖代用物」とは、フラノシルを含まず、ヌクレオシドの天然に生じる糖部分を置換することができる構造であり、結果として生じるヌクレオシドサブユニットを共に連結し、かつ／または他のヌクレオシドに連結して、相補的なオリゴマー化合物にハイブリダイズすることができるオリゴマー化合物を形成することができるような構造を意味する。そのような構造には、フラノシルとは異なる数の原子（例えば４、６、または７員環）を含む環、酸素ではない原子（例えば、炭素、硫黄、若しくは窒素）によるフラノシルの酸素の置換を含む環、または原子数と酸素の置換の両方の変更を含む環が挙げられる。そのような構造は、置換糖部分について記載した置換（例えば、任意選択でさらなる置換基を含む６員炭素環式二環式糖代用物）に対応する置換も含んでよい。糖代用物には、さらに複雑な糖の代替物（例えばペプチド核酸の非環系）も含まれる。糖代用物には、モルホリノ、シクロヘキセニル及びシクロヘキシトールが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「二環式糖部分」とは、４〜７員環の２つの原子をつないで第２の環を形成することで二環式構造をもたらす架橋を含む４〜７員環（フラノシルを含むが、これに限定されない）を含む修飾糖部分を意味する。ある特定の実施形態では、４〜７員環は糖環である。ある特定の実施形態では、４〜７員環はフラノシルである。ある特定のそのような実施形態では、架橋はフラノシルの２’−炭素と４’−炭素をつなぐ。
本明細書において、「ヌクレオチド」は、リン酸連結基をさらに含むヌクレオシドを意味する。本明細書において、「連結されたヌクレオシド」はリン酸結合で連結されていてもいなくてもよく、したがって、それらには「連結されたヌクレオチド」が含まれるが、これに限定されない。本明細書において、「連結されたヌクレオシド」とは、順次連続して結合しているヌクレオシドである（すなわち、連結されているそれらのヌクレオシド同士の間に別のヌクレオシドが存在しない）。
本明細書において、「核酸塩基」とは、糖部分に結合して、オリゴヌクレオチドに取り込まれうるヌクレオシドを形成できる原子団であり、別のオリゴヌクレオチドまたは核酸の天然に生じる相補的核酸塩基と結合することができる原子団を意味する。核酸塩基は天然に生じるもの、または修飾したものであってよい。「核酸塩基配列」とは、如何なる糖、結合、または核酸塩基修飾とも無関係の、連続する核酸塩基の順番を意味する。
本明細書において、用語「非修飾核酸塩基」」または「天然に生じる核酸塩基」とは、ＲＮＡまたはＤＮＡの天然に生じる複素環式核酸塩基、すなわち、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）（５−メチルＣを含む）、及びウラシル（Ｕ）を意味する。
本明細書において、「修飾核酸塩基」とは、天然に生じる核酸塩基ではない任意の核酸塩基を意味する。
本明細書において、「修飾ヌクレオシド」とは、天然に生じるＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオシドと比較して少なくとも１つの化学修飾を含むヌクレオシドを意味する。修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分及び／または修飾核酸塩基を含む。
本明細書において、「二環式ヌクレオシド」または「ＢＮＡ」とは、二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
本明細書において、「拘束エチルヌクレオシド」または「ｃＥｔ」とは、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
本明細書において、「架橋型（ｌｏｃｋｅｄ）核酸ヌクレオシド」または「ＬＮＡ」とは、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
本明細書において、「２’−置換ヌクレオシド」とは、２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含むヌクレオシドを意味する。特に明記しない限り、２’−置換ヌクレオシドは二環式ヌクレオシドではない。
本明細書において、「デオキシヌクレオシド」とは、天然に生じるデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）に見られるように、２’−Ｈフラノシル糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ある特定の実施形態において、２’−デオキシヌクレオシドは修飾核酸塩基を含むか、またはＲＮＡ核酸塩基（例えばウラシル）を含んでよい。
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、連結された複数のヌクレオシドを含む化合物を意味する。ある特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の非修飾リボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／または非修飾デオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）及び／または１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
本明細書において、「オリゴヌクレオシド」とは、オリゴヌクレオチドであって、どのヌクレオシド間結合にもリン原子が含まれていないものを意味する。本明細書において、オリゴヌクレオチドにはオリゴヌクレオシドが含まれる。
本明細書において、「修飾オリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド及び／または少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書において、「結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」または「連結基」とは、２つ以上の他の原子団と互いに連結する原子団を意味する。
本明細書において、「ヌクレオシド間結合」とは、一つのオリゴヌクレオチド内で隣接するヌクレオシド同士の共有結合を意味する。
本明細書において、「天然に生じるヌクレオシド間結合」とは、３’→５’ホスホジエステル結合を意味する。
本明細書において、「修飾ヌクレオシド間結合」とは、天然に生じるヌクレオシド間結合以外の任意のヌクレオシド間結合を意味する。
本明細書において、「末端ヌクレオシド間結合」とは、オリゴヌクレオチドまたはその定義された領域の終端にある２つのヌクレオシド間の結合を意味する。
本明細書において、「リン連結基」とは、リン原子を含む連結基を意味する。リン連結基には、以下の式
［式中、
Ｒａ及びＲｄはそれぞれ、独立して、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＮＪ１であり、Ｊ１は、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ＲｂはＯまたはＳであり、
ＲｃはＯＨ、ＳＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、アミノまたは置換アミノであり、かつ
Ｊ１はＲｂはＯまたはＳである］を有する基が含まれるが、これに限定されない。リン連結基には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホネート、ホスホラミデート、ホスホロチオアミデート、チオノアルキルホスホネート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「ヌクレオシド間リン連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結するリン連結基を意味する。
本明細書において、「非ヌクレオシド間リン連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結しないリン連結基を意味する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基はヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。の実施形態では、非ヌクレオシド間リン連結基は、どちらもヌクレオシドではない２つの基を連結する。
本明細書において、「中性連結基」とは荷電していない連結基を意味する。中性連結基には、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、ＭＭＩ（−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−）、アミド−３（−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−）、アミド−４（−ＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（＝Ｏ）−）、ホルムアセタール（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）、及びチオホルムアセタール（−Ｓ−ＣＨ２−Ｏ−）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、中性連結基には、シロキサン（ジアルキルシロキサン）、カルボン酸エステル、カルボキサミド、硫化物、スルホン酸エステル、及びアミドを含む非イオン性結合も含まれる（例えば、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 Ｙ．Ｓ． Ｓａｎｇｈｖｉ ａｎｄ Ｐ．Ｄ． Ｃｏｏｋ Ｅｄｓ． ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、第３章及び第４章，（ｐｐ．４０−６５）を参照されたい）。さらに、中性連結基には、混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分部分を含む非イオン性結合も含まれる。
本明細書において、「ヌクレオシド間中性連結基」とは、２つのヌクレオシドを直接連結する中性連結基を意味する。
本明細書において、「非ヌクレオシド間中性連結基とは、２つのヌクレオシドを直接連結しない中性連結基を意味する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基は、ヌクレオシドをヌクレオシド以外の基に連結する。ある特定の実施形態では、非ヌクレオシド間中性連結基は、どちらもヌクレオシドではない２つの基を連結する。
本明細書において、「オリゴマー化合物」とは、２つ以上のサブ構造を含む高分子構造を意味する。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物はオリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は１つ以上の共役基及び／または末端基を含む。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物はオリゴヌクレオチドからなる。オリゴマー化合物には、天然に生じる核酸も含まれる。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物は、モノマーサブユニットが１つ以上連結した骨格を含み、そこでは連結した各モノマーサブユニットは直接または間接的に複素環式塩基部分に結合している。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物には、複素環式塩基部分に連結せず、そのために非塩基性部位ができるモノマーサブユニットも含んでよい。ある特定の実施形態では、モノマーサブユニット、糖部分または代用物と、複素環式塩基部分とをつないでいる各結合は、独立して修飾可能である。ある特定の実施形態では、結合糖ユニットは、複素環式塩基を含むものでも、または含まないものでも、ペプチド核酸のモノマーのような模倣物で置換してよい。
本明細書において、「末端基」とは、オリゴヌクレオチドの３’末端若しくは５’末端のいずれか、またはそれらの両方に結合している１個以上の原子を意味する。ある特定の実施形態では、末端基は共役基である。ある特定の実施形態では、末端基は１つ以上の末端基ヌクレオシド含む。
本明細書において、「共役体」または「共役基」とは、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合される原子または原子団を意味する。一般に、共役基は、その結合している化合物の特性、例えば限定するわけではないが、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び／またはクリアランス特性などを１つ以上修飾する。
本明細書において、共役基に関連して「共役リンカー」または「リンカー」とは、任意の原子または原子団を含む共役基の一部分であって、（１）オリゴヌクレオチドを共役基の別の部分と共有結合で連結するか、または（２）共役基の２つ以上の部分を共有結合で連結するものを意味する。
共役基は、本明細書においてはラジカルとして示され、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー化合物への共有結合を形成するための結合を提供する。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点は、オリゴマー化合物の３’末端ヌクレオシドの３’−ヒドロキシル基の３’−酸素原子である。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物における結合点が、オリゴマー化合物の５’末端ヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基の５’−酸素原子である。ある特定の実施形態では、オリゴマー化合物への結合を形成するための結合は、切断可能な結合である。ある特定のそのような実施形態において、そのような切断可能な結合は、切断可能部分のすべてまたは一部を構成する。
ある特定の実施形態では、共役基は、切断可能部分（例えば、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシド）と、ＧａｌＮＡｃクラスター部分などの炭水化物クラスター部分とを含む。そのような炭水化物クラスター部分は、標的部分と、任意選択で共役リンカーとを含む。あるある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分は、リガンドの数及びその識別子によって特定される。例えば、ある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分は３個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ３」と表記される。ある特定の実施形態では、炭水化物クラスター部分が４個のＧａｌＮＡｃ基を含み、「ＧａｌＮＡｃ４」と表記される。特定の炭水化物クラスター部分（特定のテザー基、分岐基、及び共役リンカー基を有するもの）を、本明細書では、ローマ数字と、それに続く下付き文字「ａ」で説明し、表記する。したがって、「ＧａｌＮａｃ３−１ａ」とは、３個のＧａｌＮａｃ基、並びに具体的に特定されたテザー基、分岐基、及び連結基を有する共役基の特定炭水化物クラスター部分を指す。そのような炭水化物クラスター断片は、切断可能な結合または切断可能なヌクレオシドなどの切断可能部分を介してオリゴマー化合物に結合している。
「切断可能部分」とは、生理学的条件下で開裂されうる結合または基を意味する。ある特定の実施形態では、切断可能部分が、細胞の内部またはリソソームなどの細胞内コンパートメントの内部で切断される。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ヌクレアーゼなどの内在性酵素によって切断される。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、１個、２個、３個、４個、または５個以上の切断可能な結合を有する原子団を含む。
「切断可能な結合」とは、開裂されうる任意の化学結合を意味する。ある特定の実施形態では、切断可能な結合は、アミド、ポリアミド、エステル、エーテル、ホスホジエステルの一方若しくは両方のエステル、リン酸エステル、カルバメート、ジスルフィド、またはペプチドのなかから選択される。
本明細書において、「炭水化物クラスター」とは、足場基またはリンカー基に結合している１つ以上の炭水化物残基を有する化合物を意味する。（例えば、炭水化物共役クラスターの例として、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ”，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，（１４）：１８−２９、またはＲｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，（４７）：５７９８−５８０８を参照のこと）。
本明細書において、「修飾炭水化物」とは、天然に生じる炭水化物に対して１つ以上の化学修飾を有する任意の炭水化物を意味する。
本明細書において、「炭水化物誘導体」とは、出発物質または中間体として炭水化物を用いて合成されうる任意の化合物を意味する。
本明細書において、「炭水化物」とは、天然に生じる炭水化物、修飾炭水化物、または炭水化物誘導体を意味する。
「保護基」とは、当業者に知られている任意の化合物または保護基を意味する。保護基の非限定的な例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ，ＩＳＢＮ ０−４７１−６２３０１−６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ”に見いだすことができる。
本明細書において、「一本鎖の」とは、相補鎖にハイブリダイズしていないオリゴマー化合物であり、安定な自己二重鎖（ｓｅｌｆ−ｄｕｐｌｅｘ）を形成するための十分な自己相補性（ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）を欠いたものを意味する。
本明細書において、「二本鎖の」とは、一対のオリゴマー化合物が互いにハイブリダイズしているもの、またはヘアピン構造を形成する単一の自己相補的オリゴマー化合物を意味する。ある特定の実施形態では、二本鎖のオリゴマー化合物は第１及び第２のオリゴマー化合物を含む。
本明細書において、「アンチセンス化合物」とは、オリゴヌクレオチドを含むか、またはそれからなる化合物であり、そのオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、それがハイブリダイズできる標的核酸に相補的であり、少なくとも１つのアンチセンス活性をもたらす化合物を意味する。
「アンチセンス活性」とは、アンチセンス化合物によるその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能な変化または測定可能な変化を意味する。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性には、標的核酸の転写（例えば、ｍＲＮＡ）の量または活性の調節が含まれる。ある特定の実施形態では、アンチセンス活性にはプレｍＲＮＡのスプライシングの調節が含まれる。
本明細書において、「ＲＮａｓｅ Ｈベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部が、標的核酸へのアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションと、それに続くＲＮａｓｅ Ｈによる標的核酸の切断に起因する、アンチセンス化合物を意味する。
本明細書において、「ＲＩＳＣベースのアンチセンス化合物」とは、当該アンチセンス化合物のアンチセンス活性の少なくとも一部がＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に起因するアンチセンス化合物を意味する。
本明細書において、「検出する」または「測定する」とは、検出または測定のための試験またはアッセイが実施されることを意味する。そのような検出及び／または測定の結果はゼロ値になってよい。したがって、検出または測定のための試験の結果、活性がみとめられない場合（ゼロ活性）でも、活性を検出または測定するためのステップは行われている。
本明細書において、「検出可能及び／または測定可能な活性」とは、ゼロではない、統計的に有意な活性を意味する。
本明細書において、「本質的に未変化」とは、特定のパラメータ、特に、変化がより大きい別のパラメータに比して変化がほとんどない、または全くないことを意味する。ある特定の実施形態では、変化が５％未満の場合、パラメータは本質的に未変化である。ある特定の実施形態では、別のパラメータの変化が少なくとも１０倍であるのに対し変化が２倍未満の場合、パラメータは本質的に未変化である。例えば、ある特定の実施形態では、アンチセンス活性は標的核酸の量的変化である。ある特定のそのような実施形態において、標的ではない核酸の量的変化が標的核酸のそれよりはるかに少ないが、その変化が必ずしもゼロではない場合、標的ではない核酸の量は本質的に未変化である。
本明細書において、「発現」とは、遺伝子が最終的にタンパク質を生成する過程を意味する。発現には、転写、転写後修飾（例えば、スプライシング、ポリアデニル化、５’キャップ付加）、及び翻訳が含まれるが、これに限定されない。
本明細書において、「標的核酸」とは、アンチセンス化合物がそれにハイブリダイズして所望のアンチセンス活性をうることが意図される核酸分子を意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、その標的核酸に対し十分な相補性を有しており、生理的条件下でハイブリダイゼーションできる。
本明細書において、核酸塩基に関して使用される「核酸塩基の相補性」または「相補性」とは、別の核酸塩基と塩基対合できる核酸塩基を意味する。例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）に相補的である。例えば、ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に相補的である。ある特定の実施形態では、相補的核酸塩基とは、アンチセンス化合物の核酸塩基であって、その標的核酸の核酸塩基と塩基対合することができるものを意味する。例えば、あるアンチセンス化合物の特定の位置にある核酸塩基が、標的核酸の特定の位置にある核酸塩基と水素結合することができるなら、そのオリゴヌクレオチドと標的核酸の間の水素結合の位置は、その核酸塩基対において相補的であるとみなされる。特定の修飾を含む核酸塩基は、対応核酸塩基との対合能力を維持し得るため、依然として核酸塩基相補的であることができる。
本明細書において、核酸塩基に関して使用する「非相補的」とは、互いに水素結合を形成することのない一対の核酸塩基を意味する。
本明細書において、オリゴマー化合物（例えば、連結されたヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、または核酸）に関して使用する「相補的」とは、そのようなオリゴマー化合物またはその領域が、別のオリゴマー化合物またはその領域に核酸塩基相補性を介してハイブリダイズする能力を意味する。相補的オリゴマー化合物は、必ずしも各ヌクレオシドにおいて核酸塩基相補性を有しているわけではない。むしろ、いくつかのミスマッチが許容される。ある特定の実施形態では、相補的オリゴマー化合物または領域は、核酸塩基の７０％において相補的である（７０％相補性）。ある特定の実施形態では、相補的オリゴマー化合物または領域は、８０％相補的である。ある特定の実施形態では、相補的オリゴマー化合物または領域は、９０％相補的である。ある特定の実施形態では、相補的オリゴマー化合物または領域は、９５％相補的である。ある特定の実施形態では、相補的オリゴマー化合物または領域は、１００％相補的である。
本明細書において、「ミスマッチ」とは、第１及び第２のオリゴマー化合物を整列させた場合に、第１のオリゴマー化合物の核酸塩基が、第２のオリゴマー化合物の対応する位置の核酸塩基と対形成できないことを意味する。第１及び第２のオリゴマー化合物の一方または両方はオリゴヌクレオチドであってよい。
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的オリゴマー化合物（例えば、アンチセンス化合物とその標的核酸）の対形成を意味する。特定の機序に限定されるわけではないが、対形成の最も一般的な機序では水素結合が形成されるが、その結合は相補的核酸塩基間のワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合形成であってよい。
本明細書において、「特異的にハイブリダイズする」とは、オリゴマー化合物が、ある核酸部位に対し、別の核酸部位にハイブリダイズする場合よりも高い親和性でハイブリダイズできることを意味する。
本明細書において、オリゴヌクレオチドまたはその部分に関して使用する「完全に相補的」とは、オリゴヌクレオチドまたはその部分の各核酸塩基が、相補的核酸の核酸塩基またはその連続する部分と対合すできることを意味する。したがって、完全に相補的領域は、どちらの鎖にもミスマッチまたはハイブリダイズされていない核酸塩基を含んでいない。
本明細書において、「パーセント相補性」とは、オリゴマー化合物の核酸塩基が標的核酸の等しい長さの部分に相補的なパーセンテージを意味する。パーセント相補性は、標的核酸内の対応する位置の核酸塩基に相補的なオリゴマー化合物の核酸塩基数を、オリゴマー化合物の総長で除算し計算する。
本明細書において、「パーセント同一性」とは、第１の核酸において、第２の核酸の対応する位置の核酸塩基と同一型（化学修飾とは無関係）である核酸塩基数を、第１の核酸内の総核酸塩基数で除算したものを意味する。
本明細書において、「調節」とは、調節前の分子、機能、または活性の量若しくは性質と比較した場合の、分子、機能、または活性の量若しくは性質の変化を意味する。例えば、調節には、遺伝子発現における増加（刺激または誘導）または減少（阻害または抑制）のいずれの変化も含まれる。さらなる例として、発現の調節には、調節がない場合と比較して、特定のスプライシング多様体の絶対量または相対量を変化させる、プレｍＲＮＡプロセッシングにおけるスプライシング部位の選択の変化を挙げることができる。
本明細書において、「化学モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域の化学修飾パターンを意味する。モチーフは、オリゴヌクレオチドの、特定のヌクレオシドにおける修飾及び／または特定の連結基における修飾によって定義してよい。
本明細書において、「ヌクレオシドモチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域におけるヌクレオシド修飾のパターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドの結合は修飾されていても修飾されていなくてもよい。特に明記しない限り、ヌクレオシドのみ記載する本明細書におけるモチーフは、ヌクレオシドのモチーフを意図する。したがって、そのような事例では、結合は限定されない。
本明細書において、「糖モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域における糖修飾パターンを意味する。
本明細書において、「結合モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその領域における結合修飾パターンを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドのヌクレオシドは修飾されていても修飾されていなくてもよい。特に明記しない限り、結合のみを説明する本明細書におけるモチーフは、結合モチーフを意図している。したがって、そのような事例では、ヌクレオシドは限定されない。
本明細書において、「核酸塩基修飾モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドに沿った核酸塩基への修飾パターンを意味する。特に明記しない限り、核酸塩基修飾モチーフは核酸塩基配列には無関係である。
本明細書において、「配列モチーフ」とは、オリゴヌクレオチドまたはその部分に沿って配置された核酸塩基のパターンを意味する。特に明記しない限り、配列モチーフは化学修飾には無関係であるため、化学修飾がない場合も含め、化学修飾のあらゆる組み合わせを有してよい。
本明細書において、ヌクレオシドまたは「タイプ」のヌクレオシドに関して使用する「修飾タイプ」とは、ヌクレオシドの化学修飾を意味し、これには、修飾及び非修飾ヌクレオシドが含まれる。したがって、特に明記しない限り、「第１タイプの修飾を有するヌクレオシド」は非修飾ヌクレオシドであってよい。
本明細書において、「異なる修飾がなされた」とは、修飾の不在を含めて、互いに異なる化学修飾または化学置換基を意味する。したがって、例えば、ＭＯＥヌクレオシドと非修飾ＤＮＡヌクレオシドは、ＤＮＡヌクレオシドが非修飾であっても、「異なる修飾がなされている」という。同様に、ＤＮＡとＲＮＡは、たとえそのどちらもが天然に生じる非修飾ヌクレオシドであったとしても、「異なる修飾がなされている」という。異なる核酸塩基を含んでいる点以外は同じであるヌクレオシドは、異なる修飾がなされているとは言わない。例えば、２’−ＯＭｅ修飾糖及び非修飾アデニン核酸塩基を含むヌクレオシドと、２’−ＯＭｅ修飾糖及び非修飾チミン核酸塩基を含むヌクレオシドとは、異なる修飾がなされているとは言わない。
本明細書において、「同一タイプの修飾」とは、修飾が存在しない場合も含め、互いに同一である修飾を言う。したがって、例えば、２つの非修飾ＤＮＡヌクレオシドは、そのＤＮＡヌクレオシドは非修飾であるが「同一タイプの修飾」を有している。同一タイプの修飾を有するそのようなヌクレオシドは異なる核酸塩基を含んでよい。
本明細書において、「別個の領域」とは、オリゴヌクレオチドの複数の部分であって、任意の隣接する部分の化学修飾または化学修飾モチーフが、当該別個の領域を互いに区別することを可能にする少なくとも１つの相違点を含むものを意味する。
本明細書において、「薬理学的に許容される担体または希釈剤」とは、動物への投与において使用に好適なあらゆる物質を意味する。ある特定の実施形態では、薬理学的に許容される担体または希釈剤は滅菌生理食塩水である。ある特定の実施形態では、このような滅菌生理食塩水は医薬品グレードの生理食塩水である。
本明細書において、用語「代謝障害」とは、エネルギーを生産するための食物分解に関連する複雑な化学反応セットである代謝が調節不全であることを主な特徴とする疾患または状態を意味する。
本明細書において、「心血管疾患」または「心血管障害」という用語は、心臓または血管の機能不全を主な特徴とする疾患または状態を意味する。心血管系の疾患または障害の例には、動脈瘤、狭心症、不整脈、アテローム性動脈硬化症、脳血管疾患（脳卒中）、冠動脈心疾患、高血圧、脂質異常症、高脂血症、及び高コレステロール血症が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書において、「単環式または多環式の環系」という用語は、単環式、または縮合若しくは連結された多環式のラジカル環系から選択されるすべての環系が含まれ、これには、脂肪族、脂環式、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、アリールアルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロ芳香族、及びヘテロアリールアルキルから個別に選択される単一環系及び混成環系が包含されることを意図する。そのような単環式及び多環式の構造は、それぞれが同一飽和レベルである環を含有するか、またはそれぞれが独立して、完全飽和、部分飽和、若しくは完全不飽和を含むさまざまな飽和度である環を含有することができる。各環は、例えば一方の環が炭素環原子のみを有し縮合環が窒素原子２個を有するベンズイミダゾールのような混合モチーフに存在し得る、複素環式環並びにＣ環原子のみを含む環が生じるように、Ｃ、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される環原子を含むことができる。単環式または多環式の環系は、例えば一方の環に２つの＝Ｏ基が結合しているフタルイミドのような置換基でさらに置換することができる。単環式または多環式の環系は、環原子を介した直接結合、複数の環原子を介した縮合、置換基を介した結合、または二機能性連結部分を介した結合といったさまざまな戦略を用いて、親分子に結合させることができる。
本明細書において、「プロドラッグ」とは、不活性な形態または低活性形態の化合物であって、対象に投与した場合に、代謝されて活性な、またはより活性な化合物（例えば薬物）を形成するものを意味する。
本明細書において、「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」及び「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」とは、指名された親化合物の原子または基を置換する原子または基を意味する。例えば、修飾ヌクレオシドの置換基は、天然に生じるヌクレオシドに見られる原子または基とは異なる任意の原子または基である（例えば、修飾２’−置換基はヌクレオシドの２’位にある、ＨまたはＯＨ以外の任意の原子または基である）。置換基は、保護されていても保護されていなくてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の化合物は、親化合物の１つの位置または２つ以上の位置に置換基を有する。置換基は、他の置換基でさらに置換されてもよく、直接、またはアルキル基若しくはヒドロカルビル基などの連結基を介して親化合物に結合させてもい。
同様に、本明細書において、化学官能基に関して使用する「置換基」とは、指名された官能基に通常存在する原子または原子団とは異なる原子または原子団を意味する。ある特定の実施形態では、置換基は官能基の水素原子を置換する（例えば、ある特定の実施形態では、置換メチル基の置換基は、非置換メチル基の水素原子の１つを置換する、水素以外の原子または基である）。特に明記しない限り、置換基としての使用に適する基には、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ（−Ｏ−Ｒａａ）、アリール、アラルキル、複素環式のラジカル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、イミノ（＝ＮＲｂｂ）、アミド（Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）若しくは−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）若しくはＮ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａａ）、ウレイド（Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、チオウレイド（Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、グアニジニル（Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、アミジニル（Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）若しくはＮ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）（Ｒａａ））、チオール（−ＳＲｂｂ）、スルフィニル（Ｓ（Ｏ）Ｒｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）及びスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）若しくはＮ（Ｒｂｂ）Ｓ−（Ｏ）２Ｒｂｂ）が含まれるが、これらに限定されない。ここで、各Ｒａａ、Ｒｂｂ及びＲｃｃは、独立して、Ｈ、任意選択で連結された化学官能基、またはさらなる置換基であり，好ましい置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、及びヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載する化合物内の選択置換基は、再帰的に（ｔｏ ａ ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｄｅｇｒｅｅ）存在する。
本明細書において、「アルキル」とは、最高２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等の各基が含まれるが、これらに限定されない。アルキル基は、典型的には、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ１２アルキル）を含み、より好ましくは１〜約６個の炭素原子を含む。
本明細書において、「アルケニル」とは、最高２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素鎖ラジカルを意味する。アルケニル基の例として、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエン等が挙げられるが、これらに限定されない。アルケニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含み、より好ましくは２〜約６個の炭素原子を含む。本明細書においてアルケニル基は、任意選択で、さらなる置換基を１つ以上含んでよい。
本明細書において、「アルキニル」とは、最高２４個の炭素原子を含有し、かつ少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキニル基の例には、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル等が含まれるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には、２〜約２４個の炭素原子、より典型的には、２〜約１２個の炭素原子を含むが、２〜約６個の炭素原子がより好ましい。本明細書において、アルキニル基は、任意選択で１つ以上のさらなる置換基を含んでよい。
本明細書において、「アシル」とは、有機酸からヒドロキシル基を除去することによって形成されるラジカルを意味し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、Ｘは典型的には脂肪族、脂環式、または芳香族である。例として、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルフィニル、脂肪族スルフィニル、芳香族リン酸エステル、脂肪族リン酸エステル等が挙げられる。本明細書において、アシル基は、さらなる置換基を任意選択で含んでよい。
本明細書において、「脂環」とは、環が脂肪族である環式環系を意味する。かかる環系は、少なくとも１つの環は脂肪族である環を１つ以上含むことができる。好ましい脂環には、環内に約５〜約９個の炭素原子を有する環が含まれる。本明細書において脂環には、任意選択でさらなる置換基が含まれてよい。
本明細書において「脂肪族」とは、任意の２つの炭素原子間の飽和度が単結合、二重結合または三重結合である、最高２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖炭化水素ラジカルを意味する。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には、１〜約１２個の炭素原子を含有し、１〜約６個の炭素原子がより好ましい。脂肪族基の直鎖または分岐鎖は、窒素、酸素、硫黄、及びリンを含む１つ以上のヘテロ原子で中断されていてもよい。ヘテロ原子で中断されるそのような脂肪族基には、ポリアルコキシ類、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書において脂肪族基は、任意選択でさらなる置換基を含んでよい。
本明細書において「アルコキシ」とは、アルキル基と酸素原子との間で形成されるラジカルを意味し、その酸素原子を使用してアルコキシ基が親分子に結合する。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においてアルコキシ基には、任意選択でさらなる置換基が含まれてよい。
本明細書において「アミノアルキル」とは、アミノ置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル基を意味する。かかるアルキル基のアルキル部分は、親分子と共有結合を形成する。アミノ基は、どの位置でも配されることができ、アミノアルキル基を、アルキル部分及び／またはアミノ部分において、さらなる置換基で置換することができる。
本明細書において「アラルキル」及び「アリールアルキル」とは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル基に共有結合で連結している芳香族基を意味する。生成したアラルキル（またはアリールアルキル）基のアルキル基部分は、親分子と共有結合を形成する。例として、ベンジル、フェネチル等が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書においてアラルキル基には、任意選択で、遊離基を形成するアルキル基、アリール基、またはその両方の基に結合しているさらなる置換基を含んでよい。
本明細書において「アリール」及び「芳香族」とは、１つ以上の芳香環を有する単環式または多環式の炭素環系ラジカルを意味する。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいアリール環系は、１つ以上の環内に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書においてアリール基には、任意選択でさらなる置換基が含まれてよい。
本明細書において、「ハロ」及び「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を意味する。
「ヘテロアリール」及び「ヘテロ芳香族」とは、少なくとも１つの環が芳香環であるとともに１つ以上のヘテロ原子を含んでいる、単環式または多環式の芳香環、芳香環系若しくは縮合芳香環系を含むラジカルを意味する。ヘテロアリールは、縮合環の１つ以上がヘテロ原子を含有していない系を含む縮合環系も意味する。ヘテロアリール基には、典型的に、硫黄、窒素、または酸素から選択される１つの環原子が含まれる。ヘテロアリール基の例として、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール遊離基は、直接、または脂肪族基若しくはヘテロ原子などの連結部分を介して親分子に結合させることができる。本明細書においてヘテロアリール基には、任意選択で、さらなる置換基を含んでよい。
本明細書において、「共役化合物」とは、共役基としての使用に好適な任意の原子、原子団、または連結された原子団を意味する。ある特定の実施形態では、共役化合物は、１つ以上の特性を有する、または付与してよく、これらには、薬力学的特性、薬物動態学的特性、結合特性、吸収特性、細胞分布特性、細胞取り込み特性、電荷特性、及び／またはクリアランス特性が挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において、特に明記または変更しない限り、「二本鎖」とは、互いにハイブリダイズしている２つの別個のオリゴマー化合物を指す。そのような二本鎖化合物は、生理的に妥当な条件下でハイブリダイゼーションを維持するのに十分な相補性があるのであれば、一本若しくは両鎖の一端若しくは両端に１つ以上のハイブリダイズしていないヌクレオシド（突出末端）及び／または１つ以上のハイブリダイズしていない内部ヌクレオシド（ミスマッチ）を有してよい。
本明細書において、「２’−Ｏ−メトキシエチル」（または、２’−ＭＯＥ及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３）とは、フロシル環（ｆｕｒｏｓｙｌ ｒｉｎｇ）の２’位のＯ−メトキシ−エチル修飾を言う。２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖は修飾糖である。
本明細書において、「２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド」とは、２’−Ｏ−メトキシエチル修飾糖部分を含むヌクレオチドを意味する。
「３’標的部位」または「３’終止部位」とは、特定アンチセンス化合物の最も３’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。
本明細書において、「５’標的部位」または「５開始部位」とは、特定アンチセンス化合物の最も５’側のヌクレオチドに相補的な標的核酸のヌクレオチドを指す。
本明細書において、「５−メチルシトシン」とは、５’位に結合しているメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５−メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
本明細書において、「約」とは、ある値の±１０％以内を意味する。例えば、「マーカーは約５０%増加してよい」と記載されていれば、そのマーカーが４５％〜５５％増加して得ることを意味する。
本明細書において、「活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）」とは、個体に投与された時に治療上の利益を与える医薬組成物中の物質（複数可）を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは活性薬剤（ａｃｔｉｖｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）である。
本明細書において、「活性標的領域」または「標的領域」とは、１つ以上の活性アンチセンス化合物が標的とする領域を意味する。
本明細書において、「活性アンチセンス化合物」とは、標的の核酸レベル若しくはタンパク質レベルを低下させるアンチセンス化合物を意味する。
本明細書において、「脂肪生成」とは、前脂肪細胞からの脂肪細胞に発達することを意味する。「脂質生成」とは、「脂質生成」とは、脂肪の生成または形成、脂肪変性または脂肪浸潤のいずれかを意味する。
本明細書において、「脂肪症」または「肥満」とは、肥満である状態または除脂肪体重と比べて体脂肪若しくは脂肪組織が過剰量であることを言う。体脂肪の量には、体全体における脂肪の分布並びに脂肪組織沈着物の大きさおよび質量の両方に関する問題が含まれる。体脂肪分布は、皮下脂肪測定、ウエストとヒップの外周比、または超音波、コンピュータ断層撮影法、若しくは磁気共鳴画像法等の技術により推定することができる。疾病管理予防センターによれば、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０以上の個体が肥満と見なされる。本発明において、「肥満」という用語には、体内に脂肪組織が過剰に蓄積されることにより身体に必要な量を超えて体脂肪が増加している状態が含まれる。「肥満」という用語には、成人発症型肥満;食事性肥満;内因性または代謝性の肥満;内分泌性肥満;家族性肥満;高インスリン肥満;過形成−肥大性肥満;機能低下性肥満;甲状腺機能低下性肥満;生涯肥満;病的肥満;および外因性肥満といった状態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「同時に投与」とは、両方の薬理学的効果が同時に患者に現れるような任意の様式での２つの薬剤を併用投与することを意味する。同時投与は、両薬剤を単一の医薬組成物または同一剤形にして、または同じ投与経路によって投与される必要はない。両方の薬剤の効果は同時に発現しなくてもよい。効果は、ある期間重複するだけでよく、同じ期間続く必要はない。
本明細書において、「投与する」とは、動物に薬剤を与えることを意味し、これには、医療従事者による投与および自己投与が含まれるが、これに限定されない。
本明細書において、「薬剤」とは、動物に投与した場合に治療上の利益を与えうる活性物質を意味する。「第１剤」とは、本発明の治療化合物を意味する。例えば、第１剤は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。「第２剤」とは、本発明の第２の治療化合物（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする第２のアンチセンスオリゴヌクレオチド）および/または非ＡＮＧＰＴＬ３治療化合物を意味する。
本明細書において、「改善」とは、関連する疾患、障害、または状態の少なくとも１つの指標、兆候、または症状の軽減を意味する。指標の重度は、当業者に公知の主観的または客観的尺度によって決定することができる。
本明細書において、「ＡＮＧＰＴＬ３」とは、ＡＮＧＰＴＬ３の任意の核酸またはタンパク質を意味する。
本明細書において、「ＡＮＧＰＴＬ３の発現」とは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル、またはｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルを意味する。ＡＮＧＰＴＬ３の発現は、ノーザンブロットまたはウエスタンブロット等の当該技術分野において公知の方法により測定できる。
本明細書において、「ＡＮＧＰＴＬ３核酸」とは、ＡＮＧＰＴＬ３をコードする任意の核酸を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸にはＡＮＧＰＴＬ３をコードするＤＮＡ配列、ＡＮＧＰＴＬ３をコードするＤＮＡ（イントロンおよびエクソンを含むゲノムＤＮＡを含む）から転写されるＲＮＡ配列、およびＡＮＧＰＴＬ３をコードするｍＲＮＡが含まれる。「ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ」とはＡＮＧＰＴＬ３タンパク質をコードするｍＲＮＡを意味する。
本明細書において、「動物」とは、ヒトまたはヒト以外の動物を指し、これには、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、及び非ヒト霊長類（サル及びチンパンジーを含むが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「アポＢ含有リポタンパク質」とは、そのタンパク質成分としてアポリポタンパク質Ｂを有する任意のリポタンパク質を意味し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、およびリポタンパク質（ａ）を含むと理解され、一般に、脂質を下げる薬剤または治療の標的となり得る。「アポＢ−１００含有ＬＤＬ」とは、アポＢ−１００アイソフォームを含有するＬＤＬを意味する。
本明細書において、「アテローム性動脈硬化症」とは、大および中サイズの動脈に影響する動脈の硬化を意味し、脂肪沈着物の存在を特徴とする。脂肪沈着物は、「アテローム」または「プラーク」と呼ばれ、これは主にコレステロールおよびその他の脂肪、カルシウム、および瘢痕組織からなり、動脈内膜に損傷を与える。
本明細書において、「心血管代謝系疾患」または「心血管代謝系障害」は、心血管系及び代謝系の両方に関係する疾患若しくは障害である。心血管代謝系疾患または障害の例には糖尿病及び脂質異常症が挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書において、「併用投与」とは、個体への２つ以上の薬剤の投与を意味する。２つ以上の薬剤は、単一の医薬組成物であってもよく、または、別々の医薬組成物であってもよい。２つ以上の薬剤のそれぞれは、同一投与経路で投与されてもよく、異なる投与経路で投与されてもよい。併用投与は、並行投与または連続投与を包含する。
本明細書において、「コレステロール」とは、全動物組織の細胞膜中に見られるステロール分子である。コレステロールは、動物の血漿中で、超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中間比重リポタンパク質（ＩＤＬ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）等のリポタンパク質により輸送される必要がある。「血漿コレステロール」とは、血漿または血清中に存在する、すべてのリポタンパク質（ＶＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）でエステル化されたおよび/またはエステル化されていないコレステロールの和を意味する。
本明細書において、「コレステロール吸収阻害剤」とは、食事から得られる外因性コレステロールの吸収を阻害する薬剤を意味する。
本明細書において、「冠動脈心疾患（ＣＨＤ）」とは、心臓に血液および酸素を供給する小血管の狭窄を意味し、これは多くの場合アテローム性動脈硬化症により生じる。
本明細書において、「真性糖尿病」または「糖尿病」とは、不十分なインスリン濃度またはインスリン感受性の低下による代謝異常および異常に高い血糖（高血糖症）を特徴とする症候群である。特徴的な症状は、高血糖値による過剰な尿生成（多尿症）、排尿増加を補おうとする過剰な渇きおよび水分摂取の増加（多飲症）、高血糖の目への影響による視朦、原因不明の体重減少、および嗜眠である。
本明細書において、「糖尿病性脂質異常症」または「脂質異常症を伴う２型糖尿病」とは、２型糖尿病、ＨＤＬ−Ｃの減少、トリグリセリドの増加、および小粒子ＬＤＬ粒子の増加を特徴とする状態を意味する。
本明細書において、「希釈剤」とは、組成物中の、薬理学的活性を有さないが薬理学的に必要または望ましい成分を意味する。例えば、注射される組成物中の希釈剤は液体、例えば生理食塩水であり得る。
本明細書において、「脂質異常症」とは、脂質および/またはリポタンパク質の代謝障害、例えば脂質および/またはリポタンパク質の過剰生成または欠乏を意味する。脂質異常症は、コレステロールおよびトリグリセリドなどの脂質並びに低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールなどのリポタンパク質の増加により顕在化する場合がある。
本明細書において、「投与単位」とは、医薬剤が提供される形態、例えば丸剤、錠剤、または当該技術分野で公知その他の投与単位を意味する。ある特定の実施形態では、投与単位は凍結乾燥したアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。ある特定の実施形態では、投与単位は再構成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むバイアルである。
本明細書において、「用量」とは、１回の投与で、または特定の期間中に与えられる医薬剤の特定量を意味する。ある特定の実施形態では、用量は、１、２、若しくはそれ以上のボーラス、錠剤、または注射で投与され得る。例えば、皮下投与が望ましいある特定の実施形態では、所望の用量は、１回の注射に含めることが容易でない容量が必要となるため、所望の用量を達成するために２回以上の注射を用いてもよい。ある特定の実施形態では、医薬剤は、長期間にわたるかまたは連続的に注入することにより投与される。用量は、時間、日、週、または月当たりの医薬剤量として記載され得る。用量は、ｍｇ／ｋｇまたはｇ／ｋｇで表され得る。
本明細書において、「有効量」または「治療有効量」とは、医薬剤を必要とする個体において所望の生理学的結果を達成するのに十分な活性薬剤の量を意味する。有効量は、処置される個体の健康および身体的状態、治療すべき個体の分類学的群、組成物の処方、個体の医学的状態の評価、並びにその他の関連因子に応じて個体間で異なり得る。
本明細書において、「グルコース」とは、エネルギー源および代謝性中間体として細胞に使用される単糖である。「血漿グルコース」とは、血漿中に存在するグルコースを意味する。
本明細書において、「高比重リポタンパク質Ｃ（ＨＤＬ−Ｃ）」とは、高比重リポタンパク質粒子と会合したコレステロールを意味する。血清（または血漿）中のＨＤＬ−Ｃ濃度は典型的にはｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量される。「血清ＨＤＬ−Ｃ」及び「血漿ＨＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ、血清中及び血漿中のＨＤＬ−Ｃを意味する。
本明細書において、「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤」とは、酵素ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の阻害を介して作用する薬剤、例えば、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、及びシンバスタチンを意味する。
本明細書において、「高コレステロール血症」とは、Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ （ＮＣＥＰ） ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｉｇｈ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ （Ａｒｃｈ． Ｉｎｔ． Ｍｅｄ． （１９８８） １４８，３６−３９を参照のこと）の指針通り、コレステロールまたは循環（血漿）コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール及びＶＬＤＬ−コレステロールの上昇を特徴とする状態を意味する。
本明細書において、「高脂血症」または「高脂血症」は、血清脂質または循環（血漿）脂質の上昇を特徴とする状態である。この状態は、異常に高い脂肪濃度を呈する。循環血液中の脂質画分はコレステロール、低比重リポタンパク質、超低比重リポタンパク質、およびトリグリセリドである。
本明細書において、「高トリグリセリド血症」とは、高いトリグリセリド濃度を特徴とする状態を意味する。
本明細書において、「代謝性または心血管系の疾患を有する対象を特定する」または「代謝性または心血管系の疾患を有する対象を選択する」とは、代謝性疾患、心血管系疾患、若しくはメタボリック症候群の診断を受けた対象を選択または同定すること;または、代謝性疾患、心血管系疾患、若しくはメタボリック症候群の何らかの症状、例えば、限定されるものではないが、高コレステロール血症、高血糖症、高脂血症、高トリグリセリド血症、高血圧、インスリン抵抗性の上昇、インスリン感受性の低下、正常より多い体重、および/または正常より高い体脂肪量、またはその任意の組合せを有する対象を選択または特定することを意味する。そのような特定は、任意の方法、例えば、限定されるものではないが、標準的な臨床検査または評価、例えば血清若しくは循環（血漿）コレステロールの測定、血清若しくは循環（血漿）血糖の測定、血清若しくは循環（血漿）トリグリセリドの測定、血圧の測定、体脂肪量の測定、体重の測定等により実現してよい。
本明細書において、「糖尿病の対象を特定する」または「糖尿病の対象を選択する」とは、糖尿病と同定された対象を同定または選択すること、あるいは、糖尿病（１型または２型）の何らかの症状、例えば、限定されるものではないが、少なくとも１１０ｍｇ/ｄＬの空腹時血糖、多尿、多渇症、インスリン抵抗性の上昇、および/またはインスリン感受性の低下を有する対象を特定または選択することを意味する。
本明細書において、「肥満の対象を特定する」または「肥満の対象を選択する」とは、肥満と診断された対象を特定または選択すること、または、ＢＭＩが３０超かつ/または腹囲が男性で１０２ｃｍ超、女性で８８ｃｍ超である対象を特定または選択することを意味する。
本明細書において、「脂肪異常症を有する対象を特定する」または「脂肪異常症を有する対象を選択する」とは、脂質および/またはリポタンパク質の過剰生産または欠乏を含む、脂質および/またはリポタンパク質代謝の障害と診断された対象を特定または選択することを意味する。脂質異常症は、コレステロールおよびトリグリセライド等の脂質並びに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール等のリポタンパク質の上昇が認められることがある。
本明細書において、「脂肪蓄積増加を有する対象を特定する」または「脂肪蓄積増加を有する対象を選択する」とは、全身にわたる脂肪の分布並びに脂肪組織沈着物の大きさおよび質量の１つまたは両方に対する懸念が含まれる体脂肪量の増加（または脂肪蓄積）を有する対象を特定または選択することを意味する。体脂肪分布は、皮下脂肪測定、ウエストとヒップの外周比、または超音波、コンピュータ断層撮影法、若しくは磁気共鳴画像法等の技術により推定することができる。疾病管理予防センターによれば、肥満度指数（ＢＭＩ）が３０以上の個体が肥満と見なされる。
本明細書において、「心血管転帰の改善」とは、心血管の有害事象の発生またはそのリスクの低減を意味する。心血管有害事象の例としては、限定されるものではないが、死亡、再梗塞、脳卒中、心原性ショック、肺水腫、心停止、および心房律動異常が含まれる。
本明細書において、「直接隣接した」とは、すぐ隣接した要素間に介在する要素がないことを意味する。
本明細書において、「個体」または「対象」または「動物」とは、処置または治療に選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。
本明細書において、「インスリン抵抗性」とは、細胞、例えば、脂肪細胞、筋細胞、および/または肝臓細胞から正常なインスリン反応をうるのに通常の量のインスリンでは不十分である状態として定義される。脂肪細胞におけるインスリン抵抗性は、貯蔵トリグリセリドの加水分解を引き起こして、血漿中の遊離脂肪酸を増加させる。筋肉におけるインスリン抵抗性はグルコースの取込みを減らし、肝臓におけるインスリン抵抗性はグルコースの貯蔵を減らすが、どちらの作用も血糖を上昇させる。インスリン抵抗性による血漿中のインスリンおよびグルコースの高値はメタボリック症候群および２型糖尿病を招くことが多い。
本明細書において、「インスリン感受性」とは、個体がグルコースをどれだけ効果的に処理するかの尺度である。インスリン感受性の高い個体はグルコースを効果的に処理するが、インスリン感受性の低い個体はグルコースを効果的に処理しない。
本明細書において、「静脈内投与」とは、静脈中への投与を意味する。
本明細書において、「脂質低下」とは、対象における１種類以上の脂質の低下を意味する。脂質低下は、経時的な１つ以上の投薬によって起こり得る。
本明細書において、「脂質低下剤」とは、例えば、対象において脂質の低下を達成するために対象に与えられる、ＡＮＧＰＴＬ３特異的調節因子を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、脂質低下剤は、対象においてアポＢ、アポＣ−ＩＩＩ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小粒子ＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）の１つ以上を低減するために対象に与えられる。
本明細書において、「脂質低下療法」とは、対象において１種類以上の脂質を低減するために対象に与えられる治療レジメンを意味する。ある特定の実施形態では、脂質低下療法は、対象においてアポＢ、アポＣ−ＩＩＩ、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＩＤＬ−Ｃ、非ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、小粒子ＬＤＬ粒子、およびＬｐ（ａ）の１つ以上を低減するために与えられる。
本明細書において、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬなどの「リポタンパク質」とは、血清、血漿、およびリンパ中に見られる一群のタンパク質を意味し、これらは脂質輸送にとって重要である。各リポタンパク質の化学的組成は、ＨＤＬでは脂質に対するタンパク質の割合が高いがＶＬＤＬでは脂質に対するタンパク質の割合が低い点で異なる。
本明細書において、「低比重リポタンパク質−コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）」とは、低比重リポプロテイン粒子中で運搬されているコレステロールを意味する。血清（血漿）中のＬＤＬ−Ｃ濃度は典型的にはｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで定量される。「血清ＬＤＬ−Ｃ」および「血漿ＬＤＬ−Ｃ」とは、それぞれ血清および血漿中のＬＤＬ−Ｃを意味する。
本明細書において、「主要危険因子」とは、特定の疾患または状態に対する高リスクに寄与する因子を意味する。ある特定の実施形態では、冠動脈心疾患の主要危険因子として、限定されるものではないが、喫煙、高血圧、低ＨＤＬ−Ｃ、冠動脈心疾患の家族歴、年齢、および本明細書に開示されているその他の因子が含まれる。
本明細書において、「代謝障害」または「代謝性疾患」とは、代謝機能の変化または障害を特徴とする状態を意味する。「代謝性」および「代謝」は当該技術分野で周知の用語であり、一般的に、生きている生物内で起こるあらゆる範囲の生化学的プロセスを含む。代謝障害には、高血糖症、糖尿病前症、糖尿病（１型および２型）、肥満、インスリン抵抗性、メタボリック症候群、および２型糖尿病による脂質異常症が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「メタボリック症候群」とは、代謝に由来する脂質および非脂質の、心血管系危険因子のクラスタリングを特徴とする状態を意味する。ある特定の実施形態では、メタボリック症候群は、以下の因子のいずれか３つの存在により特定される:腹囲が男性で１０２ｃｍ超、女性で８８ｃｍ超;血清トリグリセリドが少なくとも１５０ｍｇ/ｄＬ;ＨＤＬ−Ｃが男性で４０ｍｇ/ｄＬ未満、女性で５０ｍｇ/ｄＬ未満;血圧が少なくとも１３０/８５ｍｍＨｇ;および空腹時血糖が少なくとも１１０ｍｇ/ｄＬ。これらの決定因子は診療により容易に測定可能である（ＪＡＭＡ、２００１、２８５：２４８６−２４９７）。
本明細書において、「混合型脂質異常症」とは、コレステロールの上昇およびトリグリセリドの上昇を特徴とする状態を意味する。
本明細書において、「ＭＴＰ阻害剤」とは、酵素、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質を阻害する薬剤を意味する。
本明細書において、「非アルコール性脂肪性肝疾患」または「ＮＡＦＬＤ」とは、アルコールの過剰摂取（例えばアルコール消費量が２０ｇ/日を超える）によるものでない肝臓の脂肪炎症を特徴とする状態を意味する。ある特定の実施形態では、ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性およびメタボリック症候群に関連する。ＮＡＦＬＤには、単純な幹細胞中へのトリグリセリド蓄積（脂肪肝）から炎症を伴う脂肪肝（脂肪性肝炎）、線維症、硬変症にいたるまでの疾患が包含される。
本明細書において、「非アルコール性脂肪性肝炎」（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤがトリグリセリドの沈着から更に進行して起こる。ＮＡＳＨが発症するには、壊死、炎症、繊維症を誘導できる「第２撃（ｓｅｃｏｎｄ ｈｉｔ）」が必要とされる。第２撃（ｓｅｃｏｎｄ−ｈｉｔ）の候補は、酸化ストレスの増加を起こす因子および炎症促進性サイトカインの発現を促進する因子の広いカテゴリーに分類することができる。肝臓トリグリセリドの増加により動物およびヒトの肝細胞において酸化ストレスが引き起こされることが示唆されており、このことは、肝臓トリグリセリドの蓄積と、酸化的ストレスと、脂肪肝のＮＡＳＨへの進行との間に因果関係がある可能性を示している（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｒｔｏｎ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，２００４，１１４，１４７−１５２）。高トリグリセリド血症および高脂肪酸血症により、末梢組織においてトリグリセリドの蓄積が引き起こされうる（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ，２００４，３２２，１０８０−１０８５）。
本明細書において、「核酸」とは、単量体ヌクレオチドで構成される分子を意味する。核酸には、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸、二本鎖核酸、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれる。核酸は１分子中にこれらの要素の組合せを含んでもよい。
本明細書において、「非経口投与」とは、消化管を介する以外の方法による投与を意味する。非経口投与には、局所投与、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または頭蓋内投与、例えば髄腔内投与、または脳室内投与が含まれる。投与は、持続投与、慢性投与、短期間投与、または間欠投与であり得る。
本明細書において、「医薬剤」とは、個体に投与した場合に治療上の利益をもたらす物質を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドが医薬剤である。
本明細書において、「医薬組成物」とは、個体への投与に適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性薬剤および無菌水溶液を含み得る。
本明細書において、「薬理学的に許容される担体」とは、オリゴヌクレオチドの構造または機能を妨害しない媒体または希釈剤を意味する。ある特定のそのような担体は、例えば、対象が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁液、および薬用ドロップとして医薬組成物を製剤化することを可能にする。ある特定のそのような担体は、注射または注入用に医薬組成物を製剤化することを可能にする。例えば、薬理学的に許容される担体は無菌水溶液であり得る。
本明細書において、「薬理学的に許容される塩」とは、アンチセンス化合物の生理学的および薬理学的に許容される塩、すなわち親オリゴヌクレオチドの所望の生物学的活性を保持しており、望ましくない毒性作用をそこに付与しない塩を意味する。
本明細書において、「部分」とは、核酸の所定の数の連続する（すなわち、連結された）核酸塩基を意味する。ある特定の実施形態では、一部分は、標的核酸の、所定の数の連続する核酸塩基である。ある特定の実施形態では、一部分は、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基である。
本明細書において、「予防」とは、数分から永久までの期間、疾患、障害、または状態の発症、発達を遅延させまたは未然に防ぐことを指す。予防とは、疾患、障害、または状態を発達させるするリスクを低減することも意味する。
本明細書において、「副作用」とは、所望の効果以外の、処置に起因する生理学的反応を意味する。ある特定の実施形態では、副作用は、注射部位反応、肝機能検査異常、腎機能異常、肝毒性、腎毒性、中枢神経系異常、ミオパシー、および倦怠感が含まれる。例えば、血清中のアミノトランスフェラーゼ濃度の上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。例えば、ビリルビンの上昇は、肝毒性または肝機能異常を示し得る。
本明細書において、「スタチン」とは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性を阻害する薬剤を意味する。
本明細書において、「皮下投与」とは、皮膚の直下での投与を意味する。
本明細書において、「標的とする」または「標的とした」とは、標的核酸に特異的にハイブリダイズして所望の効果を誘導するアンチセンス化合物を設計および選択するプロセスを意味する。
本明細書において、「標的核酸」、「標的ＲＮＡ」、および「標的ＲＮＡ転写産物」はすべて、アンチセンス化合物の標的となりうる核酸を指す。
本明細書において、「標的領域」とは、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部分と定義される。
本明細書において、「標的セグメント」とは、１つ以上のアンチセンス化合物の標的となる、標的核酸のヌクレオチドの配列を意味する。「５’標的部位」または「５’開始部位」とは、標的セグメントの最も５'側のヌクレオチドを指す。「３’標的部位」または「３’終止部位」とは、標的セグメントの最も３'側のヌクレオチドを指す。
本明細書において、「治療有効量」とは、個体に治療上の利益を与える薬剤の量を意味する。
本明細書において、「ライフスタイルの治療的変更」とは、脂肪/脂肪組織質量および/またはコレステロールを下げることを意図した食事およびライフスタイルの変更を意味する。そのような変更により心疾患を発達させるリスクを低減することができ、これらには、食事から摂取する一日の総カロリー、総脂肪、飽和脂肪、多価不飽和脂肪、一価不飽和脂肪、炭水化物、タンパク質、コレステロール、不溶性繊維についての推奨および身体活動についての推奨を含んでよい。
本明細書において、「トリグリセリド」とは、３個の脂肪酸分子と結合したグリセロールからなる脂質または中性脂肪を意味する。
本明細書において、「２型糖尿病」（「２型真性糖尿病」または「真性糖尿病、２型」、及び以前の呼称で「真性糖尿病２型」、「インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）」、「肥満関連糖尿病」、または成人発症型糖尿病」としても知られる）とは、インスリン抵抗性、相対的インスリン欠乏、および高血糖症を主な特徴とする代謝障害である。
本明細書において、「処置する」とは、疾患、障害、または状態を変化または改善させるために医薬組成物を投与することを意味する。
ある特定の実施形態
本明細書に開示するある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ_０１４４９５．２（配列番号１として本明細書に組み込まれる）に記載の配列を有する。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＴ_０３２９７７．９ヌクレオチド３３０３２００１〜３３０４６０００（配列番号２として本明細書に組み込まれる）に記載の配列を有する。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜２の等しい長さの部分に相補的な少なくとも８個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する１２〜３０個のヌクレオシドからなる。
ある特定の実施形態では、化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする当技術分野で公知のｓｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド及び本明細書に記載する共役基を含む。ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする共役に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例には、限定されることなく、米国特許第８，６５３，０４７号（国際公開第２０１１/０８５２７１号）に開示のものが含まれ、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ある特定の実施形態では、化合物は、米国特許第８，６５３，０４７号に開示される配列番号３４〜１１１の任意の核酸塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド及び本明細書に記載する共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物は、米国特許第８，６５３，０４７号に開示される配列番号３４〜１１１の任意の核酸塩基配列を有するｓｉＲＮＡセンス鎖またはアンチセンス鎖及び本明細書に記載する共役基を含む。上で参照した全配列番号の核酸塩基配列は、参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする、長さが１２〜３０個の連結したヌクレオシドからなる。ＡＮＧＰＴＬ３標的は、配列番号１〜２のいずれか１配列から選択される配列を有することができる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９の長さが等しい部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９の等しい長さの部分に相補的な、連続する少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基である
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９に相補的な核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１９０７〜１９２６の等しい長さの部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１９０７〜１９２６の等しい長さの部分に相補的な、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の連続核酸塩基である
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号１の核酸塩基１９０７〜１９２６に相補的な核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１４７〜１６２の等しい長さの部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１の核酸塩基１４７〜１６２の等しい長さの部分に相補的な、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または１６個の連続核酸塩基である
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号１の核酸塩基１４７〜１６２に相補的な核酸塩基配列を含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、１２〜３０個、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５または１６〜２４個の連結したヌクレオシドからなる。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個若しくは３０個の連結したヌクレオシドまたはこれらの値のうちいずれか２つにより規定される範囲からなる。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドはヌクレオシドが１６個連結した長さである。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドはヌクレオシドが２０個連結した長さである。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１または２の等しい長さの部分に相補的な、連続する少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基部分を含む核酸塩基配列を含む。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、核酸塩基配列が配列番号１５〜２７、３０〜７３、７５〜８５、８７〜２３２、２３８、２４０〜２４３，２４５〜２４７、２４９〜２６２、２６４〜３９７、３９９〜４６９、４７１〜５４１、５４３〜６００、６０４〜７６０、７６２〜８１９、８２１〜９６６、９６８〜９７１、９７３〜９７５、９７７〜９９０、９９２〜１１１０，１１１２〜１１８６，１１８８〜１２１６，１２１８〜１２２６，１２２８〜１２７９，１２８１〜１２９３，１２９５〜１３０４，１３０６〜１９４３，１９４５〜１９５１、１９５３〜１９７７、１９７９〜１９８１、１９８３〜２０４４、２０４６〜２０９７、２０９９〜２１８１、２１８３〜２２３２、２２３４〜２２３８、２２４０〜２２５８、２２６０〜２２６５、２２６７〜２９７１、２９７３〜２９７６、２９７８〜４１６２、４１６４〜４３２９、４３３１〜４３８９、４３９１〜４３９４、４３９６〜４８７７のいずれか１つから選択される、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号７７の核酸塩基配列のうち少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６３５８０及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６３５８０及び共役基からなる。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５６３５８０を含み、ここで、ＸはＧａｌＮＡｃを含む共役基である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は５’−Ｘを有する修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ５６３５８０からなり、ここで、ＸはＧａｌＮＡｃを含む共役基である。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０１を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０１からなる。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態において、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０２を含む。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、共役修飾オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ７０３８０２からなる。
ある特定の実施形態では、本開示は、以下の構造によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾（ｓｕｇａｒ ｍｏｄｓ）が多様な５’−ＧａｌＮＡｃを有する、配列番号７７の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ウィングの糖修飾（ｓｕｇａｒ ｍｏｄｓ）が多様な５’−ＧａｌＮＡｃを有する、配列番号７７の核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドからなる。
［式中、Ｒ１は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（ＭＯＥ）であるとともにＲ２はＨであるか、または、Ｒ１及びＲ２は互いに結合して架橋を形成し、ここで、Ｒ１は−Ｏ−であるとともにＲ２は−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ１及びＲ２を、形成される架橋が−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、及び−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−から選択されるよう直接結合させ、
また、同一環上のＲ３とＲ４との各対は、環ごとに独立して、Ｒ３はＨ及び−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３から選択されるとともにＲ４はＨであるかまたはＲ３とＲ４とが互いに結合して架橋を形成し、ここで、Ｒ３は−Ｏ−であるとともにＲ４は−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）−、または−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｒ３及びＲ４を、形成される架橋が−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−、及び−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−から選択されるよう直接結合させ、
また、Ｒ５はＨ及び−ＣＨ３から選択され、
また、Ｚは、Ｓ−及びＯ−から選択される］。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号２０の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５４４１９９及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５４４１９９及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号３５の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６０４００及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６０４００及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号９０の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７２３３及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７２３３及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号９３の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７３２０及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７３２０及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号９４の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７３２１及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６７３２１及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号１１０の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または１６個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５５９２７７及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５５９２７７及び共役基からなる。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、配列番号１１４の核酸塩基配列のうち、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または１６個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６１０１１及び共役基を含む。ある特定の実施形態では、化合物はＩＳＩＳ５６１０１１及び共役基からなる。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、修飾オリゴヌクレオチド全体にわたる測定で配列番号１〜２のいずれか１配列に少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％相補的である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は一本鎖オリゴヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物は一本鎖修飾オリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、かかる修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシド間結合は修飾ヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、かかる修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または少なくとも１０個のホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオシドは修飾糖を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は二環式糖である。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの修飾糖は、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡまたは４’（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、ここで、ｎは１または２である。
ある特定の実施形態では、かかる修飾オリゴヌクレオチドの少なくとも１つヌクレオシドは修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。
本明細書に開示するある特定の実施形態は、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物または組成物を提供し、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、ａ）連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、ｂ）連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、及びｃ）連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを有する。ギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物または組成物は、配列番号１〜２の等しい長さの部分に相補的な、少なくとも８個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する連結された２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは２０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物または組成物は、配列番号７７から選択される核酸塩基配列のうち少なくとも８個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する、連結された２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号７７の核酸塩基配列を有する連結したヌクレオシド２０個からなり、かつ、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物または組成物は、配列番号２０から選択される核酸塩基配列の少なくとも８個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する、連結された２０個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号２０の核酸塩基配列を有する連結されたヌクレオシド２０個からなり、かつ、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、連結した５個のヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物または組成物は、配列番号１１０の核酸塩基配列の少なくとも８個の核酸塩基が連続している核酸塩基配列を有する、連結された１６個のヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含み、ここで、かかる修飾オリゴヌクレオチドは、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、３個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、３個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル糖と少なくとも１つのｃＥｔ糖とを含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、配列番号１１０の核酸塩基配列を有する連結されたヌクレオシド１６個からなり、かつ、連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメントと、３個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメントと、３個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントとを含み、ここで、かかるギャップセグメントは５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、ここで、各ウィングセグメントは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル糖と少なくとも１つのｃＥｔ糖とを含み、ここで、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で修飾オリゴヌクレオチドに連結されている。ある特定の実施形態では、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドの３’末端で修飾オリゴヌクレオチドに連結されている。
ある特定の実施形態では、共役基は厳密に１つのリガンドを含む。ある特定の実施形態では、共役基は１つ以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、共役基は厳密に２つのリガンドを含む。ある特定の実施形態では、共役基は２つ以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、共役基は３つ以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、共役基は厳密に３つのリガンドを含む。ある特定の実施形態では、各リガンドは、の中から選択される：多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、ガラクトース誘導体、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコロイル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏ−ヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボース。ある特定の実施形態では、各リガンドはＮ−アセチルガラクトサミンである。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、少なくとも１つリン連結基または中性連結基を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、ｎは１〜１２であり、かつ
ｍは１〜１２である］
の中から選択される構造を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、下の中から選択される構造を有するテザーを有する
［式中、Ｌはリン連結基または中性連結基のいずれかであり、
Ｚ１はＣ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
Ｚ２はＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２はＨ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
各ｍ１は独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］。
ある特定の実施形態では、共役基は、下記の中から選択される構造を有するテザーを有する
［式中、Ｚ２はＨまたはＣＨ３であり、かつ
各ｍ１は独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、ｎは１〜１２であり、かつ
ｍは１〜１２である］の中から選択される構造を有するテザーを有する。
ある特定の実施形態では、共役基は、修飾オリゴヌクレオチドに共有結合で結合している。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、
各ｎは独立して０または１であり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、化合物は式、
［式中、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｄは、分岐基であり、
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
［式中、各Ｌは、独立してリン連結基または中性連結基であり、かつ
各ｎは、独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーはピロリジンを含む。ある特定の実施形態では、共役リンカーはピロリジンを含まない。
ある特定の実施形態では、共役リンカーはＰＥＧを含む。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは１つのアミドを含む。ある特定の実施形態では、共役リンカーは少なくとも２つのアミドを含む。ある特定の実施形態では、共役リンカーは、アミドを含まない。ある特定の実施形態では、共役リンカーはポリアミドを含む。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは１つのアミンを含む。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは１つ以上のジスルフィド結合を含む。
ある特定の実施形態では、共役リンカーはタンパク質結合部分を含む。ある特定の実施形態では、タンパク質結合部分は脂質を含む。ある特定の実施形態では、タンパク質結合部分は、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えばウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えばトリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質の中から選択される。ある特定の実施形態では、タンパク質結合部分は、飽和または不飽和のＣ１６〜Ｃ２２長鎖脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタンまたは１−ペンタフルオロプロピルの中から選択される。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
［式中、各ｎは、独立して１〜２０であり、かつ、ｐは１〜６である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
［式中、各ｎは、独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
［式中、ｎは１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、
［式中、各ｎは、独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、以下の構造を有する
。
ある特定の実施形態では、分岐基は、以下の構造の１つを有する
［式中、各Ａ１は、独立してＯ、Ｓ、Ｃ=ＯまたはＮＨであり、かつ
各ｎは、独立して１〜２０である］。
ある特定の実施形態では、分岐基は、以下の構造の１つを有する
［式中、各Ａ１は、独立してＯ、Ｓ、Ｃ=ＯまたはＮＨであり、かつ
各ｎは、独立して１〜２０である］。
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は、エーテルを含む。
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
各ｎは、独立して１〜２０であり、かつ
ｍは２〜６である。
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、各ｊは１〜３の整数であり、かつ
式中、各ｎは１〜２０の整数である］を含む。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、各テザーは、
［式中、Ｌは、リン連結基及び中性連結基から選択され、
Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
各ｍ１は、独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各テザーは、
［式中、Ｚ２はＨまたはＣＨ３であり、かつ
各ｍ２は独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ２は０より大きい］の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各テザーは、
［式中、ｎは１〜１２であり、かつ
ｍは１〜１２である］の中から選択される。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのテザーは、エチレングリコールを含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのテザーは、アミドを含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのテザーは、ポリアミドを含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのテザーは、アミンを含む。
ある特定の実施形態では、少なくとも２つのテザーは互いに異なる。ある特定の実施形態では、すべてのテザーは互いに同一である。
ある特定の実施形態では、各テザーは、
［式中、各ｎは、独立して１〜２０であり、かつ
各ｐは１〜約６である］の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各テザーは、
の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各テザーは、以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して１〜２０である］。
ある特定の実施形態では、各テザーは、以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、各ｎは、独立して０、１、２、３、４、５、６、または７である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リガンドはガラクトースである。
ある特定の実施形態では、リガンドはマンノース−６−リン酸塩である。
ある特定の実施形態では、各リガンドは、
［式中、各Ｒ１は、ＯＨ及びＮＨＣＯＯＨから選択される］の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各リガンドは、
の中から選択される。
ある特定の実施形態では、各リガンドは、以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、各リガンドは、以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、共役基は、細胞を標的とする部分を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、以下の構造を有する、細胞を標的とする部分を含む
［式中、各ｎは、独立して１〜２０である］。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して１〜２０である］。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、
［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］を含む。
ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は以下の構造を有する
［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、ホスホジエステル、アミド、またはエステルの中から選択される切断可能部分を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、ホスホジエステル切断可能部分を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、切断可能部分を含まず、また、かかる共役基は、該共役基とオリゴヌクレオチドとの間のホスホロチオエート結合を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、アミド切断可能部分を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、エステル切断可能部分を含む。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、各ｎは、独立して、１〜２０であり、
Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、化合物は、以下の構造を有する
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］を含む。
ある特定の実施形態では、共役基は、
［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］を含む。
ある特定の実施形態では、Ｂｘは、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、またはシトシン、または５−メチルシトシンの中から選択される。ある特定の実施形態では、Ｂｘはアデニンである。ある特定の実施形態では、Ｂｘはチミンである。ある特定の実施形態では、Ｑ１３はＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、Ｑ１３はＨである。
本発明のある特定の実施形態では、本明細書に開示する組成物または化合物を含むプロドラッグが提供される。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害するための、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物及び組成物を使用する方法が提供される。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物または組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%または少なくとも９５%阻害する。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも５０％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも５５％低下させる。好ましい実施形態では修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも６０％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも６５％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも７０％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも７５％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも８０％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも８５％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも９０％低下させる。好ましい実施形態では、修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含むアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも９５％低下させる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物は、実施例２〜３及び７〜１０に記載のようにヒト細胞、例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株で試験した場合に、ＩＣ５０が２０μＭ未満、１０μＭ未満、８μＭ未満、５μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、または０．８μＭ未満である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物は、実施例１３に記載のパラメータで測定した場合に、粘度が４０ｃＰ未満、３５ｃＰ未満、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満または１５ｃＰ未満であることから、有効である。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物は、各実施例に記載の生体内忍容性測定で実証されるように、忍容性が高い。ある特定の実施形態では、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物は、食塩水で処置した動物と比較して、ＡＬＴ値及び／またはＡＳＴ値の上昇が４倍を超えない、３倍を超えない、２倍を超えない、または１．５倍を超えないことから実証されるように、忍容性が高い。
本明細書に開示するある特定の実施形態では、明細書に開示する共役アンチセンス化合物の塩が提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示する化合物または組成物は、共役基を有する修飾オリゴヌクレオチドの塩を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物は、薬理学的に許容される担体または希釈剤をさらに含む。
ある特定の実施形態において、動物はヒトである。
本明細書に開示するある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物を動物に投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物または組成物の投与は治療的である。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物または組成物の投与により、ＡＮＧＰＴＬ３に関連した疾患の進行を治療、予防、または減速する。ある特定の実施形態では、疾患はＡＮＧＰＴＬ３高値に関連している。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物または組成物の投与により、心血管性及び／または代謝性疾患の進行を予防、治療、改善、または減速する。
本明細書に開示するある特定の実施形態では、ヒトの心血管性及び／または代謝性疾患を治療するために、心血管性及び／または代謝性疾患に罹患しているヒトを特定し、かつ、かかるヒトに本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物のいずれかを治療有効量投与することを含む、心血管性及び／または代謝性疾患に罹患したヒトの治療方法が提供される。
ある特定の実施形態では、治療法で使用するための本明細書に記載の共役アンチセンス化合物及び組成物が提供される。ある特定の実施形態では、治療法は、ＡＮＧＰＴＬ３に関連した疾患の進行の治療、予防、または減速に使用される。ある特定の実施形態では、治療法は、ＡＮＧＰＴＬ３高値に関連した疾患の進行の治療、予防、または減速に使用される。
ある特定の実施形態では、疾患は心血管性及び／若しくは代謝性疾患、障害または状態である。ある特定の実施形態では、代謝性及び／または心血管疾患には、肥満、糖尿病、インスリン抵抗性、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、リポジストロフィー、冠動脈心疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、高脂肪酸血症またはメタボリック症候群、またはその組み合わせが含まれるが、これに限定されない。脂質異常症は、高脂血症であり得る。高脂血症は、複合型高脂血症（ＣＨＬ）、高コレステロール血症、または高トリグリセリド血症、または、高コレステロール血症と高トリグリセリド血症の双方であり得る。複合型高脂血症は、家族性または非家族性であり得る。高コレステロール血症は、ホモ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）であり得る。高トリグリセリド血症は、家族性カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）またはＩＶ型高リポ蛋白血症であり得る。ＮＡＦＬＤは、脂肪肝または脂肪性肝炎であり得る。糖尿病は、２型糖尿病または脂質異常症を伴う２型糖尿病であり得る。インスリン抵抗性は、脂質異常症を伴うインスリン抵抗性であり得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物または組成物を第１剤とし、本明細書に開示する方法または使用は、第２剤の投与をさらに含む。ある特定の実施形態では、第１剤及び第２剤を同時投与する。ある特定の実施形態では、第１剤及び第２剤を順次または同時に同時投与する。
ある特定の実施形態では、第２剤は血糖降下剤である。血糖降下剤には、ライフスタイルの治療的変更、ＰＰＡＲ作動薬、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１類似体、インスリン若しくはインスリン類似体、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトのアミリン類似体、ビグアナイド、α−グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。血糖降下剤には、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤またはその組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、またはグリクラジドであり得る。メグリチニドは、ナテグリニドまたはレパグリニドであり得る。チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンであり得る。α−グルコシダーゼは、アカルボースまたはミグリトールであり得る。
ある特定の実施形態では、第２剤は脂質低下療法である。ある特定の実施形態において、脂質低下療法には、ライフスタイルの治療的変更、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＭＴＰ阻害剤（例えば、ＭＴＰを標的とする低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、アポＢ阻害剤（例えば、アポＢを標的とする低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、ＡｐｏＣ３阻害剤（例えば、ＡｐｏＣ３を標的とする低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、ＰＣＳＫ９阻害剤（例えば、ＰＣＳＫ９を標的とする低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、ＣＥＴＰ阻害剤（例えば、ＣＥＴＰを標的とする低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、フィブラート系薬、有益な油（例えば、オキアミ油または魚油（例えば、Ｖａｓｃｅｐａ（登録商標））、亜麻仁油、またはオメガ３脂肪酸に富むその他の油、例えば、α−リノレン酸（ＡＬＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）若しくはエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ））、またはその任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、またはシンバスタチンであり得る。コレステロール吸収阻害剤は、エゼチミブであり得る。フィブラート系薬は、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル等であり得る。
ある特定の実施形態では、投与は非経口投与を含む。ある特定の実施形態では、投与は皮下投与を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する共役アンチセンス化合物の投与により、トリグリセリド値、コレステロール値、インスリン抵抗性、グルコース値またはその組み合わせなど脂質濃度が低下する。個々別々の１つ以上の濃度が、少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも３５%、少なくとも４０%、少なくとも４５%、少なくとも５０%、少なくとも５５%、少なくとも６０%、少なくとも６５%、少なくとも７０%、少なくとも７５%、少なくとも８０%、少なくとも８５%、少なくとも９０%または少なくとも９５%低下し得る。共役アンチセンス化合物の投与よにより、インスリン感受性または肝インスリン感受性が改善され得る。本明細書に開示する共役アンチセンス化合物の投与により、アテローム性動脈硬化班、肥満、グルコース、脂質、グルコース耐性、コレステロールの低下、またはインスリン感受性若しくはその任意の組み合わせの改善がもたらされ得る。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＮＧＰＴＬ３関連疾患を治療、改善、遅延または予防するための薬品の製造において、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物を使用することが提供される。ある特定の実施形態では、１つ以上の代謝性疾患または心血管疾患を処置、改善、遅延または予防するための薬品の製造において、本明細書に記載する共役アンチセンス化合物を使用することが提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する代謝性疾患または心血管疾患の１つ以上を治療、予防、または改善するためのキットが提供され、かかるキットは、ａ）本明細書に記載する共役アンチセンス化合物、及び任意選択でｂ）本明細書に記載する別の薬剤または治療法を含む。キットには、代謝性疾患または心血管疾患の１つ以上を治療、予防、または改善に使用するためのキットの指示書またはラベルがさらに含まれる。
アンチセンス化合物
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣物、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であり得、これは、該化合物が水素結合によって標的核酸にハイブリダイゼーションされうることを意味する。
ある特定の実施形態では、ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、５’→３’方向に記載した場合に、そのアンチセンス化合物が標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補を含む核酸塩基配列を有する。ある特定のそのような実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５’→３’方向に記載した場合に、それが標的とする標的核酸の標的セグメントの逆相補を含む核酸塩基配列を有する。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は長さが１０〜３０ヌクレオチドである。すなわち、アンチセンス化合物は、連結した１０〜３０個の核酸塩基である。その他の実施形態では、アンチセンス化合物は、８〜８０個、１０〜８０個、１２〜５０個、１２〜３０個、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、または２０個の連結した核酸塩基からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある特定のそのような実施形態において、アンチセンス化合物は、連結した核酸塩基が長さ８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、または８０個、または上記値のいずれか２値で定義される範囲からなる修飾オリゴヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、短縮または切断された修飾オリゴヌクレオチドを含む。短縮または切断された修飾オリゴヌクレオチドは、単一ヌクレオシドが５’末端から（５’切断）、または代替的に３’末端から（３’切断）から欠失していてよい。短縮または切断されたオリゴヌクレオチドは、２つ以上のヌクレオシドが５’末端から欠失しているか、または代替的に２つ以上のヌクレオシドが３’末端から欠失していてよい。別法として、欠失ヌクレオシドは、修飾オリゴヌクレオチド全体に、例えば、５’末端から欠失させたヌクレオシドが１つ以上及び３’末端から欠失させたヌクレオシドが１つ以上あるアンチセンス化合物において分散され得る。
延長オリゴヌクレオチドに付加ヌクレオシドが１個存在する場合、付加ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端または中央部分に位置し得る。付加ヌクレオシドが２つ以上存在する場合、付加ヌクレオシドは、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端（５’付加）、または代替的に３’末端（３’付加）または中央部分に２個のヌクレオシドが付加されているオリゴヌクレオチドにおいて、互いに隣接していてよい。別法として、付加ヌクレオシドは、アンチセンス化合物全体に、例えば、５’末端に１個のヌクレオシドが付加されたオリゴヌクレオチド、３’末端に１個のヌクレオシドが付加されたオリゴヌクレオチド、及び／または中央部分に１個のヌクレオシドが付加されたオリゴヌクレオチドにおいて、分散され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物の長さの増減、及び／またはミスマッチ塩基の導入を、活性を排除することなく行うことができる。例えば、Ｗｏｏｌｆら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７３０５−７３０９，１９９２）では、１３〜２５核酸塩基長の一連のアンチセンスオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡの切断を誘導する能力について、卵母細胞注射モデルで試験が行われた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの末端近くに８個または１１個のミスマッチ塩基を含む２５核酸塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ミスマッチを含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドほどではなかったものの、標的ｍＲＮＡの特異的切断を指示することができた。同様に、標的特異的切断は、１３核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド（１つまたは３つのミスマッチを持つものを含む）を使って達成された。
Ｇａｕｔｓｃｈｉら（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９３：４６３−４７１，Ｍａｒｃｈ ２００１）は、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡに対して１００％の相補性を有し、かつｂｃｌ−ｘＬ ｍＲＮＡに対して３つのミスマッチを有するオリゴヌクレオチドが、生体外及び生体内でｂｃｌ−２とｂｃｌ−ｘＬの両発現を低下させることができること実証した。さらに、このオリゴヌクレオチドは強力な抗腫瘍活性を生体内で示した。
ＭａｈｅｒとＤｏｌｎｉｃｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１６：３３４１−３３５８，１９８８）は、一連のタンデム１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該タンデムアンチオリゴヌクレオチドの配列の２つまたは３つで構成される２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチド及び４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それぞれ、ヒトＤＨＦＲの翻訳を停止させる能力について、ウサギ網状赤血球アッセイで試験した。３つの１４核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ単独で、２８核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは４２核酸塩基アンチセンスオリゴヌクレオチドよりもレベルは低かったものの、翻訳を阻害することができた。
ある特定のアンチセンス化合物モチーフ及び機序
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物に高い阻害活性、標的核酸に対する高い結合親和性、または生体内でのヌクレアーゼによる分解に対する耐性といった特性を付与するため、アンチセンス化合物はパターンまたはモチーフで配された化学修飾サブユニットを有してる。キメラアンチセンス化合物は、典型的に、ヌクレアーゼ分解に対する高い耐性、高い細胞取り込み、標的核酸に対する高い結合親和性、及び／または高い阻害活性が付与されるよう修飾された領域を少なくとも１つ含有する。キメラアンチセンス化合物の第２の領域では、所望される別の特性、例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅ Ｈの基質として作用する特性が付与されてよい。
アンチセンス活性は、最終的に生物学的活性をもたらす、アンチセンス化合物（例えばオリゴヌクレオチド）と標的核酸とのハイブリダイゼーションが関与するあらゆる機序に起因してよい。ある特定の実施形態では、標的核酸の量及び／または活性が調節される。ある特定の実施形態では、標的核酸の量及び／または活性が低下する。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物と標的核酸とのハイブリダイゼーションにより、最終的に、標的核酸の分解がもたらされる。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物と標的核酸とをハイブリダイゼーションしても標的核酸の分解がもたらされない。ある特定のそのような実施形態では、標的核酸とハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在（占有）により、アンチセンス活性の調節がもたらされる。ある特定の実施形態では、１つ以上の機序を利用するために、特に、ある特定の化学モチーフまたは化学修飾のパターンを有するアンチセンス化合物が適している。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、２つ以上の機序を介して、かつ／または、まだ解明されていない機序を介して機能する。したがって、本明細書に記載するアンチセンス化合物は、ある特定の機序によって限定されるものではない。
アンチセンス機序には、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性のアンチセンス、ＲＮＡｉ機序（これはＲＩＳＣ経路を利用し、ｓｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ機序がこれに含まれるが、これらに限定されない）、及び占有に基づく機序が含まれるが、これらに限定されない。特定のアンチセンス化合物は、２つ以上のそのような機序を介して、かつ／または別の機序を介して作用してよい。
ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性アンチセンス
ある特定の実施形態では、アンチセンス活性は、少なくとも一部は、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの分解に起因する。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。哺乳動物細胞において「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス化合物はＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発することが当技術分野で知られている。したがって、ＤＮＡヌクレオシドまたはＤＮＡ様ヌクレオシドの少なくとも一部分を含むアンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化して、標的核酸の切断をもたらしてよい。ある特定の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈを利用するアンチセンス化合物は１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス化合物は、修飾ヌクレオシド１〜８個のブロックを少なくとも１つ含む。ある特定のそのような実施形態では、修飾ヌクレオシドはＲＮａｓｅ Ｈ活性を支持しない。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス化合物が、本明細書に記載するギャップマーである。ある特定のそのような実施形態では、ギャップマーのギャップはＤＮＡヌクレオシドを含む。ある特定のそのような実施形態では、ギャップマーのギャップはＤＮＡ様ヌクレオシドを含む。ある特定のそのような実施形態では、ギャップマーのギャップはＤＮＡヌクレオシドとＤＮＡ様ヌクレオシドを含む。
ギャップマーモチーフを有するある特定のアンチセンス化合物をキメラアンチセンス化合物とみなす。ギャップマーでは、ＲＮａｓｅＨ切断を支持する複数のヌクレオチドを有する内部領域は、内部領域ヌクレオシドとは化学的に別個である複数のヌクレオチドを有する外部領域の間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップセグメントは一般にエンドヌクレアーゼ切断の基質として作用し、一方、ウィングセグメントは修飾ヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、ギャップマーの領域は、各別個の領域領域を構成する糖部分の種類によって区別される。いくつかの実施形態では、ギャップマーの領域を区別するために使用される糖部分の種類として、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド（そのような２’−修飾ヌクレオシドとして、中でも、２’−ＭＯＥや２’−Ｏ-ＣＨ３を含めてよい）、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドとして拘束エチルを有するものを含めてよい）を含めてよい。ある特定の実施形態では、ウィング内のヌクレオシドとにはいくつかの修飾糖部分が含まれてよく、これには例えば、２’−ＭＯＥ及び拘束エチル若しくはＬＮＡなどの二環式糖部分が挙げられる。ある特定の実施形態では、ウィングには修飾糖部分及び非修飾糖部分がいくつか含まれてよい。ある特定の実施形態では、ウィングには、２’−ＭＯＥヌクレオシド、拘束エチルヌクレオシド若しくはＬＮＡヌクレオシドなどの二環式糖部分、及び２’−デオキシヌクレオシドのさまざまな組み合わせを含んでよい。
各別個の領域は、一様な糖部分、改変体、または交互に並んだ糖部分を含んでよい。ウィング−ギャップ−ウィングモチーフは、しばしば「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記載されるが、この場合、「Ｘ」は５’−ウィングの長さを表し、「Ｙ」はギャップの長さを表し、「Ｚ」は３’−ウィングの長さを表す。「Ｘ」と「Ｚ」は、一様な糖部分、改変体、または交互に並んだ糖部分を含んでよい。ある特定の実施形態では、「Ｘ」と「Ｙ」は、１つ以上の２’−デオキシヌクレオシドを含んでよい。「Ｙ」は２’−デオキシヌクレオシドを含んでよい。本明細書において、「Ｘ−Ｙ−Ｚ」と記述されるギャップマーは、ギャップが５’−ウィング及び３’−ウィングのそれぞれに直接隣接して位置するような配置を有する。したがって、５’−ウィングとギャップの間にも、ギャップと３’−ウィングの間にも、介在するヌクレオチドは存在しない。本明細書に記載するアンチセンス化合物はいずれもギャップマーモチーフを有し得る。ある特定の実施形態では、「Ｘ」及び「Ｚ」は同一であり、その他の実施形態では、それらは異なっている。ある特定の実施形態では、「Ｙ」は８〜１５ヌクレオシドである。Ｘ、Ｙ、またはＺは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオシドのいずれでもあり得る。
ある特定の実施形態において、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は、連結した６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個のヌクレオシドからギャップがなっているギャップマーモチーフを有する。
ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の式Ａで記述される糖モチーフを有する：（Ｊ）ｍ−（Ｂ）ｎ−（Ｊ）ｐ−（Ｂ）ｒ−（Ａ）ｔ−（Ｄ）ｇ−（Ａ）ｖ−（Ｂ）ｗ−（Ｊ）ｘ−（Ｂ）ｙ−（Ｊ）ｚ
［式中、
各Ａは、独立して２’−置換ヌクレオシドであり、
各Ｂは、独立して二環式ヌクレオシドであり、
各Ｊは、独立して２’−置換ヌクレオシドまたは２’−デオキシヌクレオシドであり、
各Ｄは、２’−デオキシヌクレオシドであり、
ｍは０〜４、ｎは０〜２、ｐは０〜２、ｒは０〜２、ｔは０〜２、ｖは０〜２、ｗは０〜４、ｘは０〜２、ｙは０〜２、ｚは０〜４、ｇは６〜１４であるが、
ｍ、ｎ、及びｒの少なくとも１つは０以外であり、
ｗ及びｙの少なくとも１つは０以外であり、
ｍ、ｎ、ｐ、ｒ、及びｔの和は２〜５であり、かつ
ｖ、ｗ、ｘ、ｙ、及びｚの和２〜５である］。
ＲＮＡｉ化合物
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は干渉ＲＮＡ化合物（ＲＮＡｉ）であり、これには、二本鎖ＲＮＡ化合物（短鎖干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡともいう）と一本鎖ＲＮＡｉ化合物（すなわちｓｓＲＮＡ）が含まれる。そのような化合物は、少なくとも部分的にはＲＩＳＣ経路を介して作用し、標的核酸の分解及び／または隔離を行う（したがって、マイクロＲＮＡ／マイクロＲＮＡ模倣化合物を含む）。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、そのような機序に特に適したアンチセンス化合物となる修飾を含む。
１． ｓｓＲＮＡ化合物
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、一本鎖ＲＮＡｉ化合物（ｓｓＲＮＡ）としての使用に特に適したものも含めて、修飾５’末端を含む。ある特定のそのような実施形態では、５’末端は修飾ホスフェート部分を含む。ある特定の実施形態では、そのような修飾ホスフェートは安定化されている（例えば、非修飾５’−ホスフェートと比較して分解／切断に対する耐性がある）。ある特定の実施形態では、そのような５’末端ヌクレオシドは５’−リン部分を安定化させる。ある特定の修飾５’末端ヌクレオシドは当該技術分野、例えばＷＯ／２０１１／１３９７０２に見い出され得る。
ある特定の実施形態では、ｓｓＲＮＡ化合物の５’−ヌクレオシドは式ＩＩｃ
［式中、
Ｔ１は、任意選択で保護されたリン部分であり、
Ｔ２は、式ＩＩｃの化合物とオリゴマー化合物とを連結するヌクレオシド間連結基であり、
Ａは、式
の１つを有し、
Ｑ１及びＱ２は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＮ（Ｒ３）（Ｒ４）であり、
Ｑ３は、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ５）またはＣ（Ｒ６）（Ｒ７）であり、
各Ｒ３、Ｒ４ Ｒ５、Ｒ６及びＲ７は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシであり、
Ｍ３は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１４、Ｃ（Ｒ１５）（Ｒ１６）、Ｃ（Ｒ１５）（Ｒ１６）Ｃ（Ｒ１７）（Ｒ１８）、Ｃ（Ｒ１５）=Ｃ（Ｒ１７）、ＯＣ（Ｒ１５）（Ｒ１６）またはＯＣ（Ｒ１５）（Ｂｘ２）であり、
Ｒ１４は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
ＢＸ１は、複素環式塩基部分であるか、
またはＢｘ２が存在するならば、Ｂｘ２は複素環式塩基部分であり、ＢＸ１はＨ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６及びＪ７は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであるか、
またはＪ４は、Ｊ５またはＪ７の一方と、Ｏ、Ｓ、ＮＲ１９、Ｃ(Ｒ２０)(Ｒ２１)、Ｃ(Ｒ２０)=Ｃ(Ｒ２１)、Ｃ［=Ｃ(Ｒ２０)(Ｒ２１)］及びＣ（=Ｏ）から選択される１〜３個の連結したビラジカル基を含む架橋を形成し、かつ、残るＪ５、Ｊ６及びＪ７のうちの２つは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
各Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、ハロゲンまたはＯ−［Ｃ（Ｒ８）（Ｒ９）］ｎ−［（Ｃ=Ｏ）ｍ−Ｘ１］ｊ−Ｚであり、
各Ｒ８及びＲ９は、互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルでありであり、
Ｘ１はＯ、ＳまたはＮ（Ｅ１）であり、
Ｚは、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたはＮ（Ｅ２）（Ｅ３）であり、
Ｅ１、Ｅ２及びＥ３は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｎは、１〜約６であり、
ｍは、０または１であり、
ｊは、０または１であり、
各置換基は、互いに独立して、ハロゲン、ＯＪ１、Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）、=ＮＪ１、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＮ、ＯＣ（=Ｘ２）Ｊ１、ＯＣ（=Ｘ２）−Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）及びＣ（=Ｘ２）Ｎ（Ｊ１）（Ｊ２）から選択される、任意選択で保護された置換基を１つ以上含み、
Ｘ２は、Ｏ、ＳまたはＮＪ３であり、
各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり、
ｊが１の時、Ｚはハロゲン若しくはＮ（Ｅ２）（Ｅ３）以外であり、かつ
ここで、上記オリゴマー化合物は８〜４０個の単量体サブユニットを含み、標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズ可能である］を有する。
ある特定の実施形態では、Ｍ３はＯ、ＣＨ=ＣＨ、ＯＣＨ２またはＯＣ（Ｈ）（Ｂｘ２）である。ある特定の実施形態では、Ｍ３はＯである。
ある特定の実施形態では、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６及びＪ７は各々Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｊ４はＪ５またはＪ７の一方と架橋を形成する。
ある特定の実施形態では、Ａは、式
［式中、
Ｑ１及びＱ２は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシである］の１つを有する。ある特定の実施形態では、Ｑ１及びＱ２は各々Ｈである。ある特定の実施形態では、Ｑ１及びＱ２は、それぞれ互いに独立して、Ｈまたはハロゲンである。ある特定の実施形態では、Ｑ１及びＱ２はＨであり、他方のＱ１及びＱ２はＦ、ＣＨ３またはＯＣＨ３である。
ある特定の実施形態では、Ｔ１は、式
［式中、
Ｒａ及びＲｃは、それぞれ互いに独立して、保護ヒドロキシル、保護チオール、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、保護アミノまたは置換アミノであり、かつ
Ｒｂは、ＯまたはＳである］を有する。ある特定の実施形態では、ＲｂはＯであり、Ｒａ及びＲｃは、それぞれ互いに独立して、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ（ＣＨ３）２である。
ある特定の実施形態では、Ｇは、ハロゲン、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２Ｆ、ＯＣＨＦ２、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２Ｆ、ＯＣＨ２ＣＨＦ２、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ=ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＦ３、Ｏ（ＣＨ２）３−Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＮ（Ｒ１０）（Ｒ１１）、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）、ＯＣＨ２Ｃ（=Ｏ）−Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）、ＯＣＨ２Ｃ（=Ｏ）−Ｎ（Ｒ１２）−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）またはＯ（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒ１２）−Ｃ（＝ＮＲ１３）［Ｎ（Ｒ１０）（Ｒ１１）］であり、ここで、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｇは、ハロゲン、ＯＣＨ３、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＦ３、ＯＣＨ２−ＣＨ=ＣＨ２、Ｏ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＨ２Ｃ（=Ｏ）−Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、ＯＣＨ２Ｃ（=Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ３）２またはＯＣＨ２−Ｎ（Ｈ）−Ｃ（=ＮＨ）ＮＨ２である。ある特定の実施形態では、Ｇは、Ｆ、ＯＣＨ３またはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。ある特定の実施形態では、ＧはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である。
ある特定の実施形態では、５’末端ヌクレオシドは、式ＩＩｅ
を有する。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、特にｓｓＲＮＡに好適なものも含めて、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、所定のパターンまたは糖修飾モチーフで配置された、１つ以上の修飾糖部分及び／または天然に生じる糖部分を含む。そのようなモチーフには、本明細書で論じる糖修飾及び／または他の既知の糖修飾のいずれも含まれてよい。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一様な糖修飾を有する領域からなるか、または含む。ある特定のそのような実施形態では、かかる領域の各ヌクレオシドは同じＲＮＡ様糖修飾を含む。ある特定の実施形態では、領域の各ヌクレオシドは２’−Ｆ ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、領域の各ヌクレオシドは２’−ＯＭｅヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、領域の各ヌクレオシドは２’−ＭＯＥヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、領域の各ヌクレオシドはｃＥｔヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、領域の各ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、一様な領域は、オリゴヌクレオチドの全部または本質的に全部を構成する。ある特定の実施形態では、領域は、末端ヌクレオシド１〜４個を除いた全オリゴヌクレオシドを構成する。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、糖修飾が交互に並んだ１つ以上の領域を含み、ここで、かかるヌクレオシドは、第１タイプの糖修飾を有するヌクレオチドと、第２タイプの糖修飾を有するヌクレオチドとが交互に並ぶ。ある特定の実施形態では、どちらのタイプのヌクレオシドもＲＮＡ様ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、交互に並ぶヌクレオシドは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−ＭＯＥ、ＬＮＡ、及びｃＥｔから選択される。ある特定の実施形態では、交互に並ぶ修飾は２’−Ｆ及び２’−ＯＭｅである。そのような領域は連続していてもよいし、異なる修飾がなされたヌクレオシドまたは共役ヌクレオシドによって中断されていてもよい。
ある特定の実施形態では、交互に並ぶ修飾の交互に並ぶ領域はそれぞれ、単一ヌクレオシドからなる（すなわち、パターンは（ＡＢ）ｘＡｙであり、ここで、Ａは第１タイプの糖修飾を有するヌクレオシドであり、Ｂは第２タイプの糖修飾を有するヌクレオシドであり、また、ｘは１〜２０であり、ｙは０または１である）。ある特定の実施形態では、交互モチーフ内の交互に並ぶ１つ以上の領域は、あるタイプのヌクレオシドを２つ以上含む。例えば、オリゴヌクレオチドには、以下のヌクレオシドモチーフのいずれかの領域が１つ以上含まれてよい
ＡＡＢＢＡＡ、
ＡＢＢＡＢＢ、
ＡＡＢＡＡＢ、
ＡＢＢＡＢＡＡＢＢ、
ＡＢＡＢＡＡ、
ＡＡＢＡＢＡＢ、
ＡＢＡＢＡＡ、
ＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ、
ＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ、または
ＡＢＡＢＢＡＡＢＢＡＢＡＢＡＡ
［式中、Ａは第１タイプのヌクレオシドであり、Ｂは第２タイプのヌクレオシドである］。ある特定の実施形態では、Ａ及びＢはそれぞれ、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、ＢＮＡ、及びＭＯＥから選択される。
ある特定の実施形態では、そのような交互モチーフを有するオリゴヌクレオチドは、修飾５’末端ヌクレオシド、例えば式ＩＩｃまたは式ＩＩｅに示すものも含む。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２−２−３モチーフを有する領域を含む。そのような領域は、以下のモチーフを含む：
−（Ａ）２−（Ｂ）ｘ−（Ａ）２−（Ｃ）ｙ−（Ａ）３−
[式中、Ａは第１タイプの修飾ヌクレオシドであり、
Ｂ及びＣは、修飾がＡとは異なるヌクレオシドであるが、ＢとＣの修飾は互いに同じでも異なっていてもよく、
ｘ及びｙは、１〜１５である]。
ある特定の実施形態では、Ａは２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、Ｂ及びＣはともに２’−Ｆ 修飾ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、Ａは２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドであり、Ｂ及びＣはいずれも２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオシドは以下の糖モチーフを有する
５’−（Ｑ）−（ＡＢ）ｘＡｙ−（Ｄ）ｚ
［式中、
Ｑは、安定化されたホスフェート部分を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、Ｑは、式ＩＩｃまたは式ＩＩｅを有するヌクレオシドであり、
Ａは、第１タイプの修飾ヌクレオシドであり、
Ｂは、第２タイプの修飾ヌクレオシドであり、
Ｄは、それに隣接するヌクレオシドとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。したがって、ｙが０ならば、Ｄには、Ｂとは異なって修飾をしなければならず、ｙが１ならば、Ｄには、Ａとは異なる修飾をしなければならない。ある特定の実施形態では、ＤはＡともＢとも異なる。
Ｘは５〜１５であり、
Ｙは、０または１であり、
Ｚは、０〜４である］。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオシドは以下の糖モチーフを有する
５’−（Ｑ）−（Ａ）ｘ−（Ｄ）ｚ
［式中、
Ｑは、安定化されたホスフェート部分を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、Ｑは、式ＩＩｃまたは式ＩＩｅを有するヌクレオシドであり、
Ａは、第１タイプの修飾ヌクレオシドであり、
Ｄは、Ａとは異なる修飾を含む修飾ヌクレオシドである。
Ｘは１１〜３０であり、
Ｚは、０〜４である］。
ある特定の実施形態では、上記のモチーフのＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤは、２’−ＯＭｅ、２’−Ｆ、２’−ＭＯＥ、ＬＮＡ、及びｃＥｔから選択される。ある特定の実施形態では、Ｄは、末端ヌクレオシドを表す。ある特定の実施形態では、そのような末端ヌクレオシドは、標的核酸にハイブリダイズするようには設計されていない（ただし、偶然ハイブリダイズするものが多少あるかもしれない）。ある特定の実施形態では、各Ｄヌクレオシドの核酸塩基は、標的核酸の対応する位置にある核酸塩基の同一性には関わりなく、アデニンである。ある特定の実施形態では、各Ｄヌクレオシドの核酸塩基はチミンである。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ｓｓＲＮＡとしての使用に特に適したものも含めて、オリゴヌクレオチドまたはその領域に沿って、所定のパターンまたは修飾ヌクレオシド間結合モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、交互に並ぶヌクレオシド間結合モチーフを有する領域を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一様な修飾ヌクレオシド間結合の領域を含む。ある特定のそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって一様に連結された領域を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって一様に連結されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートである。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも６個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも８個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも１０個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合１２個の連続が少なくとも１つあるブロックを少なくとも１つ含む。ある特定のそのような実施形態において、少なくとも１つのそのようなブロックはオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。ある特定のそのような実施形態において、少なくとも１つのそのようなブロックは、オリゴヌクレオチドの３’末端の３ヌクレオシド以内に位置する。
本明細書に記載するさまざまな糖モチーフのいずれを有するオリゴヌクレオチドも、あらゆる結合モチーフを有してよい。例えば、オリゴヌクレオチド（例えば上述のものが挙げられるが、それらに限定されない）は、非限定的な下記表から選択される結合モチーフを有してよい。
２． ｓｉＲＮＡ化合物
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、二本鎖のＲＮＡｉ化合物（ｓｉＲＮＡ）である。そのような実施形態では、一方の鎖または両鎖は、ｓｓＲＮＡについて上記修飾モチーフのいずれを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ｓｓＲＮＡ化合物は非修飾ＲＮＡであってよい。ある特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、非修飾ＲＮＡヌクレオシド、及び修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。
いくつかの実施形態は、修飾ヌクレオシドまたは非修飾ヌクレオシドの場所によって定義されるモチーフを１つ以上各鎖に含む、二本鎖組成物に関する。ある特定の実施形態では、完全または少なくとも部分的にハイブリダイズして二重鎖領域を形成する第１オリゴマー化合物と第２オリゴマー化合物とを含む組成物であり、核酸標的に相補的で該標的とハイブリダイズする領域をさらに含む組成物が提供される。そのような組成物は、核酸標的に対する完全または部分的な相補性を有するアンチセンス鎖である第１オリゴマー化合物、並びに、第１オリゴマー化合物に対して相補的な領域を１つ以上有して第１オリゴマー化合物と共に二重鎖領域を少なくとも１つ形成する第２オリゴマー化合物を含むことが好適である。
いくつかの実施形態の組成物は、核酸標的にハイブリダイズしてその正常な機能を失わせることにより、遺伝子発現を調節する。いくつかの実施形態では、標的核酸はＡＮＧＰＴＬ３である。ある特定の実施形態では、標的としたＡＮＧＰＴＬ３の分解は、本明細書で開示される組成物とともに形成される活性化ＲＩＳＣ複合体によって促進される。
いくつかの実施形態は、二本鎖組成物を対象とし、ここで、一方の鎖は、例えば、反対側の鎖がＲＩＳＣ（または切断）複合体に選択的に取り込まれることに影響を与える点で有用である。組成物は、選択核酸分子を標的とさせ、１つ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、標的ＲＮＡの一部分にハイブリダイズし、それにより標的ＲＮＡの正常な機能の喪失がもたらされる。
ある特定の実施形態は、二本鎖組成物であって、両鎖がヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）モチーフ、完全修飾モチーフ、位置修飾モチーフまたは交互モチーフを含む、当該二本鎖組成物に向けられる。本発明の組成物の各鎖を修飾して、例えばｓｉＲＮＡ経路において、ある特定の役割を果たさせることができる。各鎖に異なるモチーフを使用する、または各鎖に化学修飾の異なる同じモチーフを使用することにより、アンチセンス鎖にＲＩＳＣ複合体を標的とさせる一方、センス鎖の組込みを阻害することができる。このモデルでは、各鎖の特定の役割が強化されるように、それぞれの鎖を独立して修飾することができる。アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣの一領域におけるその役割を強化するために５’末端を修飾することができ、一方、３’末端には、ＲＩＳＣの異なる領域におけるその役割を強化するために、異なる修飾をすることができる。
二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域とを含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってよく、かかるアンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、また、センス領域は標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有する。二本鎖オリゴヌクレオチド分子は、一方の鎖がセンス鎖、他方がアンチセンス鎖である２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、これにおいて、かかるアンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的である（すなわち、各鎖は、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、例えばアンチセンス鎖とセンス鎖は二重鎖構造または二本鎖構造を形成し、その場合、例えば、かかる二本鎖領域は約１５〜約３０、例えば約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０塩基対であり、また、アンチセンス鎖は標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を含む（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド分子のうちの約１５〜約２５ヌクレオチドまたはそれ以上が、標的核酸またはその一部分に相補的である）。別法として、二本鎖オリゴヌクレオチドは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、この場合、ｓｉＲＮＡの自己相補的なセンス領域とアンチセンス領域は、核酸系リンカーまたは非核酸系リンカーにより連結される。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、自己相補的センス領域とアンチセンス領域とを有する、二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであってよく、ここで、かかるアンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、また、センス領域は、標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有する。二本鎖オリゴヌクレオチドは、２つ以上のループ構造と、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含むステムとを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよく、ここで、かかるアンチセンス領域は標的核酸分子またはその一部分のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列またはその一部分に対応するヌクレオチド配列を有し、また、環状ポリヌクレオチドは、生体内または生体外でプロセシングを受けて、ＲＮＡｉを媒介する能力を有する活性ｓｉＲＮＡ分子を生成させることができる。
ある特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、別個のセンス及びアンチセンスの配列若しくは領域を含み、ここで、かかるセンス領域とアンチセンス領域は、当技術分野で公知のヌクレオチド連結分子または非ヌクレオチド連結分子によって共有結合で連結されているか、または、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、及び／またはスタッキング相互作用によって非共有結合で連結されている。ある特定の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子の発現阻害を引き起こすような形で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。
本明細書において、二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡしか含有していない分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドもさらに包含する。ある特定の実施形態では、短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠く。ある特定の実施形態では、短鎖干渉核酸は、任意選択で、リボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を一切含まない。しかし、ＲＮＡｉを支持するために分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのような二本鎖オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨ基を持つ１つ以上のヌクレオチドを含有している、１つまたは複数の結合したリンカー、または結合若しくは会合したその他の基、部分、若しくは鎖を有することができる。任意選択で、二本鎖オリゴヌクレオチドは、約５、１０、２０、３０、４０、または５０％のヌクレオチド位置でリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書において、用語ｓｉＲＮＡは、配列特異的ＲＮＡｉの媒介能を有する核酸分子の記載に使用される他の用語、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）及びその他と等価であることが意図される。さらに、本明細書において、ＲＮＡｉという用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉の記載に使用される他の用語、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、またはエピジェネティクスなどと等価であることが意図される。例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドは、転写後レベルと転写前レベルの双方において、遺伝子をエピジェネティックにサイレンシングするために使用することができる。非限定的な一例において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティックな調整は、遺伝子発現を改変するためにクロマチン構造またはメチル化パターンをｓｉＲＮＡを媒介して修飾した結果であり得る（例えば、Ｖｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６７２−６７６；Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，６６９−６７２；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照のこと）。
本明細書で提供するいくつかの実施形態の化合物及び組成物は、ｄｓＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシング若しくはＲＮＡｉ機序によってＡＮＧＰＴＬ３を標的とできることが意図され、これには、例えば、自己相補的配列を持つ一本のＲＮＡ鎖が二本鎖コンフォメーションをとる能力を持つ「ヘアピン」またはステム−ループ二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、または、２本の別個のＲＮＡ鎖を含む二重鎖ｄｓＲＮＡエフェクター分子が挙げられる。さまざまな実施形態において、ｄｓＲＮＡはリボヌクレオチドのみからなるか、または、例えば、２０００年４月１９日に出願されたＷＯ００／６３３６４または１９９９年４月２１日に出願された米国出願第６０／１３０，３７７号に開示されているＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのように、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合からなる。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子は、分子の一セグメントにあるヌクレオチドと該分子の別のセグメントにあるヌクレオチドとが塩基対を形成するように自己相補性領域を持つ単一の分子であってよい。さまざまな実施形態では、単一分子からなるｄｓＲＮＡは、リボヌクレオチドのみからなるか、またはデオキシリボヌクレオチドの領域に相補的なリボヌクレオチドの領域を含む。別法として、ｄｓＲＮＡは、互いに相補性領域を有する２つの異なる鎖を含んでよい。
さまざまな実施形態では、両鎖ともリボヌクレオチドのみからなるか、一方の鎖がリボヌクレオチドのみからなり、一方の鎖がデオキシリボヌクレオチドのみからなるか、または、両鎖若しくは一方がリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合を含有する。ある特定の実施形態では、相補性領域は、領域間で互いに、また、標的核酸配列に対して、少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％相補的である。ある特定の実施形態では、二本鎖コンフォメーションで存在するｄｓＲＮＡの領域には、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００ヌクレオチドが含まれるか、またはｃＤＮＡの全ヌクレオチド若しくはｄｓＲＮＡに表わされている他の標的核酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、一本鎖末端などの一本鎖領域を一切含有しないか、またはｄｓＲＮＡはヘアピンである。その他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは１つ以上の一本鎖領域または突出末端を有する。ある特定の実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドには、アンチセンス鎖またはアンチセンス領域であるＤＮＡ鎖またはＤＮＡ領域（例えば、標的核酸に対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％の相補性を有する）と、センス鎖またはセンス領域であるＲＮＡ鎖またはＲＮＡ領域（例えば、標的核酸に対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％の同一性を有する）、またはその逆が含まれる。
さまざまな実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、酵素合成法または化学合成法、例えば、本明細書に記載するもの、または２０００年４月１９日に出願されたＷＯ００／６３３６４若しくは１９９９年４月２１日に出願された米国出願第６０／１３０，３７７号に記載されている方法を使用して、生体外で作製される。その他の実施形態では、生体外で合成されたＤＮＡ鎖を、細胞へのＤＮＡ鎖の形質転換の前、後、または並行して生体内若しくは生体外で作製されたＲＮＡ鎖と複合体化させる。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス領域とアンチセンス領域とを含有する単一の環状核酸であるか、またはｄｓＲＮＡに、環状核酸及び第二の環状核酸または線状核酸が含まれる（例えば、２０００年４月１９日に出願されたＷＯ００／６３３６４または１９９９年４月２１日に出願された米国出願第６０／１３０，３７７号を参照のこと）。例示的環状核酸として、あるヌクレオチドの遊離５’ホスホリル基が別のヌクレオチドの２’ヒドロキシル基にループを描いて戻るように連結された状態になる、投げ縄（ｌａｒｉａｔ）構造が挙げられる。
その他の実施形態では、ｄｓＲＮＡには、糖の２’位にハロゲン（フッ素基など）を含有するか、アルコキシ基（メトキシ基など）を含有する修飾ヌクレオチドが１つ以上含まれ、このハロゲンまたはアルコキシ基により、対応する２’位が水素またはヒドロキシル基を含有する対応するｄｓＲＮＡと比較して、ｄｓＲＮＡの生体外または生体内での半減期が延長する。さらに別の実施形態では、ｄｓＲＮＡには、隣接するヌクレオチド間に、天然に生じるホスホジエステル結合以外の結合が１つ以上含まれる。そのような結合の例として、ホスホルアミド結合、ホスホロチオエート結合、及びホスホロジチオエート結合が挙げられる。ｄｓＲＮＡは、米国特許第６，６７３，６６１号に教示されているような化学修飾核酸分子であってもよい。その他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、２０００年４月１９日に出願されたＷＯ００／６３３６４または１９９９年４月２１日に出願された米国出願第６０／１３０，３７７号に開示されているように、１本または２本のキャップ鎖を含有する。
ｄｓＲＮＡは、ＷＯ００／６３３６４に開示されている少なくとも部分的なｄｓＲＮＡ分子のいずれかであることも、米国仮特許出願第６０／３９９，９９８号及び米国仮特許出願第６０／４１９，５３２号、並びにＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３４６６に記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれかであることもでき、これらの文献の教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ｄｓＲＮＡはいずれも、本明細書に記載の方法、または、ＷＯ００／６３３６４に記載のような標準的方法を使って、生体外または生体内で発現させてよい。
占有
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈによる標的核酸の切断をもたらすとも、ＲＩＳＣ経路による切断または隔離をもたらすとも予想されない。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンス活性は占有に起因してよく、その場合、ハイブリダイズしたアンチセンス化合物の存在により標的核酸の活性が損なわれる。ある特定のそのような実施形態では、アンチセンス化合物は、一様に修飾されていてもよいし、複数の修飾の混在並びに／または修飾ヌクレオシド及び非修飾ヌクレオシドを含んでよい。
標的核酸、標的領域及びヌクレオチド配列
ＡＮＧＰＴＬ３をコードするヌクレオチド配列には、以下が含まれるが、これらに限定されない：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ_０１４４９５．２（配列番号１として本明細書に組み込まれる）またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＴ_０３２９７７．９ヌクレオチド３３０３２００１〜３３０４６０００（配列番号２として本明細書に組み込まれる）に記載のヒトの配列。本明細書に含まれる実施例の各配列番号に記載の配列は、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対するいかなる修飾にも依存しないことが理解される。したがって、配列番号により定義されるアンチセンス化合物は、独立して、糖部分、ヌクレオシド間結合、または核酸塩基に対する１つ以上の修飾を含み得る。Ｉｓｉｓ番号（Ｉｓｉｓ Ｎｏ）により記載されるアンチセンス化合物は核酸塩基配列とモチーフの組み合わせを示す。
ある特定の実施形態では、標的領域は、標的核酸の構造的に定義された領域である。例えば、標的領域は、３'ＵＴＲ、５'ＵＴＲ、エクソン、イントロン、エクソン/イントロン接合部、コード領域、翻訳開始領域、翻訳終結領域、または他の定義された核酸領域を包含し得る。ＡＮＧＰＴＬ３について構造的に定義された領域は、ＮＣＢＩなどの配列データベースからのアクセション番号によりうることができ、そうした情報は参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的領域は、標的領域内のある標的セグメントの５'標的部位から、標的領域内の別の標的セグメントの３'標的部位までの配列を包含し得る。
ある特定の実施形態では、「標的セグメント」は、核酸内の標的領域の、さらに小さな下位部分である。例えば、標的セグメントは、１つ以上のアンチセンス化合物の標的となる標的核酸のヌクレオチド配列であり得る。「５’標的部位」または「５’開始部位」とは、標的セグメントの最も５’側のヌクレオチドを言う。「３’標的部位」または「３’終止部位」とは、標的セグメントの最も３’側のヌクレオチドを指す。
標的化には、アンチセンス化合物とハイブリダイズさせる標的セグメントを少なくとも１つ決定して、所望の効果が生じるようにすることが含まれる。ある特定の実施形態では、所望の効果はｍＲＮＡ標的核酸濃度の低下である。ある特定の実施形態では、所望の効果は、標的核酸によりコードされるタンパク質濃度の低下、または標的核酸と会合する表現型の変化である。
標的領域は、１つ以上の標的セグメントを含有し得る。標的領域内の複数の標的セグメントは重複し得る。別法として、複数の標的セグメントは非重複であり得る。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは約３００を超えないヌクレオチドで分離される。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントはいくつかのヌクレオチド、すなわち、標的核酸上で、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０という各値の概数、該値以下の数、該値の概数以下の数のヌクレオチドにより分離されているか、または上記値のいずれか２つで定義される範囲の数のヌクレオチドにより分離されている。ある特定の実施形態では、標的領域内の標的セグメントは、標的核酸上で５以下のヌクレオチドまたは約５以下のヌクレオチドで分離されている。ある特定の実施形態では、標的セグメントは、連続している。本明細書に列挙された５’標的部位または３’標的部位のいずれかである開始核酸を有する範囲で定義される標的領域が意図される。
好適な標的セグメントは、５’ＵＴＲ、コード領域、３’ＵＴＲ、イントロン、エクソン、またはエクソン/イントロン接合部のいずれかの内部に見出され得る。開始コドンまたは終止コドンを含む標的セグメントもまた好適な標的セグメントである。好適な標的セグメントは、開始コドンまたは終止コドンのような構造的に定義された領域を特異的に除外し得る。
好適な標的セグメントの決定には、標的核酸配列とゲノム全体の他の配列との比較を含み得る。例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、さまざまな核酸の中から類似する領域を特定することができる。この比較をすることにより、選択した標的核酸以外の配列（すなわち、非標的または標的外配列）に非特異的にハイブリダイズできるアンチセンス化合物配列を選択してしまわないように防ぐことができる。
活性標的領域内ではアンチセンス化合物の活性（例えば、標的核酸濃度の低下パーセントで定義されるもの）にばらつきがあり得る。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ濃度の低下はＡＮＧＰＴＬ３タンパク質発現の阻害を示す。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質濃度の低下はまた、標的ｍＲＮＡ発現の阻害を示す。さらに、例えば、コレステロール、ＬＤＬ、トリグリセリド、またはグルコースの濃度低下といった表現型の変化は、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡおよび/またはタンパク質発現の阻害を示し得る。
ハイブリダイゼーション
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションは本明細書に開示するアンチセンス化合物とＡＮＧＰＴＬ３核酸の間で生じる。最も一般的なハイブリダイゼーション機構では、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合（例えば、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合）を伴う。
ハイブリダイゼーションはさまざまな条件下で生じ得る。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、ハイブリダイズされる核酸分子の性質と組成により決定される。
配列が標的核酸と特異的にハイブリダイズできるか否か決定法は当技術分野で周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）。ある特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸と特異的にハイブリダイズ可能である。
相補性
アンチセンス化合物と標的核酸とは、アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合して所望の効果が生じる場合（例えば、ＡＮＧＰＴＬ３核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害）、互いに相補的である。
アンチセンス化合物は、介在セグメントまたは隣接セグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）ＡＮＧＰＴＬ３核酸の１つ以上のセグメントにわたりハイブリダイズすることができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、またはその特定部分はＡＮＧＰＴＬ３核酸、標的領域、標的セグメント、またはその特定部分に（少なくとも）７０%、７５%、８０%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、または１００%相補的である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供するアンチセンス化合物、またはその特定部分は配列番号１〜２の１つ以上の配列に（少なくとも）７０%、７５%、８０%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、または１００％相補的である。アンチセンス化合物の標的核酸とのパーセント相補性は、常法を用いて決定し得る。
例えば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基中１８核酸塩基が標的領域に相補的であり、そのために特異的にハイブリダイズすると考えられるアンチセンス化合物は、相補性が９０パーセントを呈すると考えられる。この例では、残存する非相補的核酸塩基はクラスター形成、または相補的核酸塩基とともに散在していてよく、必ずしも互いに隣接するまたは相補的核酸塩基に隣接していなくてよい。したがって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域に挟まれた４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長のアンチセンス化合物は、標的核酸に対して７７．８％の総相補性を有すると考えられ、したがって本発明の範囲に包含されるであろう。標的核酸の一領域に対するアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３ ４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９ ６５６）を使って、ルーチンに決定することができる。相同性パーセント、配列同一性パーセントまたは配列相補性パーセントは、例えばＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２ ４８９）を使用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）のデフォルト設定を使って決定することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に提供するアンチセンス化合物またはその指定部分は、標的核酸またはその指定部分に完全に相補的（すなわち１００％相補的）である。例えば、アンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸、またはその標的領域、または標的セグメント若しくは標的配列に完全に相補的であり得る。本明細書において、「完全に相補的」とは、アンチセンス化合物の各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対合する能力を有することを意味する。例えば、２０核酸塩基アンチセンス化合物は、そのアンチセンス化合物に完全に相補的な対応する２０核酸塩基部分が標的核酸中に存在するのであれば、４００核酸塩基長の標的配列に対して完全に相補的である。第１及び／または第２核酸の特定部分に関して完全に相補的という表現を使用することもできる。例えば、３０核酸塩基アンチセンス化合物の２０核酸塩基部分は、４００核酸塩基長の標的配列に対して「完全に相補的」であり得る。３０核酸塩基オリゴヌクレオチドの２０核酸塩基部分は、標的配列が対応する２０核酸塩基部分（それぞれの核酸塩基はアンチセンス化合物の２０核酸塩基部分に相補的であるもの）を有するのであれば、標的配列に対して完全に相補的である。同時に、上記３０核酸塩基アンチセンス化合物全体は、標的配列に対して完全に相補的であり得、それは、アンチセンス化合物の残りの１０核酸塩基が標的配列に相補的であるか否かに依存する。
非相補的核酸塩基の位置は、アンチセンス化合物の５’末端または３’末端であり得る。別法として、非相補的核酸塩基または核酸塩基は、アンチセンス化合物の内部位置であり得る。非相補的な核酸塩基が２つ以上存在する場合、それらは連続している（すなわち、連結されて）か、または不連続であり得る。一実施形態では、非相補的核酸塩基はギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント内に位置する。
ある特定の実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基長のアンチセンス化合物、または１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０核酸塩基長までのアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸、またはその特定一部分などの標的核酸に対して４以下、３以下、２以下、または１以下の非相補的核酸塩基（複数可）を含む。
ある特定の実施形態では、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長のアンチセンス化合物、または１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基長までのアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３核酸、またはその特定一部分などの標的核酸に対して６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下の非相補的核酸塩基（複数可）を含む。
本明細書で提供するアンチセンス化合物には、標的核酸の一部に相補的なものも含まれる。本明細書において、「一部分」とは、標的核酸の一領域または一セグメント内の所定の数の連続する（すなわち連結された）核酸塩基を指す。「一部分」は、アンチセンス化合物の、所定の数の連続する核酸塩基も意味し得る。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ある標的セグメントの少なくとも８核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ある標的セグメントの少なくとも１０核酸塩基部分に相補的である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、ある標的セグメントの少なくとも１５核酸塩基部分に相補的である。ある標的セグメントの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０核酸塩基部分若しくはそれ以上の核酸塩基部分、またはこれらの値のうちいずれか２つにより規定される範囲に相補的なアンチセンス化合物もまた意図される。
同一性
本明細書で提供するアンチセンス化合物はまた、特定のヌクレオチド配列、配列番号、若しくは具体的Ｉｓｉｓ番号により表される化合物の配列、またはその一部分に対して、所定のパーセント同一性をもち得る。本明細書において、あるアンチセンス化合物の核酸塩基対合能が同じ場合、そのアンチセンス化合物は本明細書に開示する配列と同一である。例えば、ウラシルとチミジンはどちらもアデニンと対合するので、開示したＤＮＡ配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するＲＮＡは、そのＤＮＡ配列と同一であるとみなされるであろう。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮型及び延長型、並びに本明細書で提供するアンチセンス化合物に対して同一ではない塩基を有する化合物も意図される。同一ではない塩基は互いに隣接するか、またはアンチセンス化合物全体に分散していてよい。アンチセンス化合物のパーセント同一性は、比較対象である配列に対して同一塩基対合を有する塩基の数に従って計算される。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物またはその一部分は、本明細書に開示するアンチセンス化合物、配列番号、またはその一部分の１つ以上と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
修飾
ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基（塩基としても知られる）部分は、通常、複素環式塩基部分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基がさらに含まれるヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に連結することができる。オリゴヌクレオチドは、互いに隣接するヌクレオシドの共有結合で形成され、線状の高分子オリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチド構造内では、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成していると、一般に言われる。
アンチセンス化合物の修飾には、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する置換または変更が包含される。修飾アンチセンス化合物は、例えば、高い細胞取り込み、核酸標的に対する高親和性、ヌクレアーゼ存在下での高い安定性、または高い阻害活性などといった望ましい特性ゆえに、天然型より好ましいことが多い。
化学修飾ヌクレオシドは、短縮型または切断型アンチオリゴヌクレオチドの、その標的核酸に対する結合親和性を高めるために使用することもできる。結果として、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する短いアンチセンス化合物を用いて、匹敵する結果が得られることが多い。
修飾ヌクレオシド間結合
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に生じるヌクレオシド間結合は、３’→５’ホスホジエステル結合である。修飾された（すなわち天然には生じない）ヌクレオシド間結合を１つ以上有するアンチセンス化合物は、例えば、高い細胞取り込み、核酸標的に対する高い親和性、及びヌクレアーゼ存在下での高い安定性などといった望ましい特性ゆえに、天然に生じるヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも選択されることが多い。
修飾ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子が保たれているヌクレオシド間結合と、リン原子を有さないヌクレオシド間結合とが含まれる。代表的なリン含有ヌクレオシド間結合には、ホスホジエステル結合、ホスホトリエステル結合、メチルホスホネート結合、ホスホラミデート結合、及びホスホロチオエート結合が含まれるが、これらに限定されない。リン含有結合及び非リン含有結合を調製する方法は周知である。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物の各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはその一領域に沿って、所定のパターンまたは修飾ヌクレオシド間結合モチーフで配置された修飾ヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオシド間結合は、ギャップモチーフ（ｇａｐｐｅｄ ｍｏｔｉｆ）で配置される。そのような実施形態では、２つのウィング領域それぞれのヌクレオシド間結合は、ギャップ領域中のヌクレオシド間結合とは異なる。ある特定の実施形態では、ウィング中のヌクレオシド間結合はホスホジエステル結合であり、ギャップ中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。ヌクレオシドモチーフは独立して選択されるので、ギャップヌクレオシド間結合モチーフを有するそのようなオリゴヌクレオチドは、ギャップヌクレオシドモチーフを有しても有さなくてもよく、ギャップヌクレオシドモチーフを有する場合、ウィング長とギャップ長は同じであっても同じでなくてもよい。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、交互に並ぶヌクレオシド間結合モチーフを有する領域を含む。ある特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、一様に修飾されたヌクレオシド間結合の一領域を含む。ある特定のそのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合によって一様に連結された領域を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートによって一様に連結されている。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル及びホスホロチオエートから選択され、少なくとも１つのヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも６つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも６個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも８個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも１０個連続したブロックを少なくとも１つ含む。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合が少なくとも１２個連続したブロックを少なくとも含む。ある特定のそのような実施形態では、そのようなブロックの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドの３’末端に位置する。ある特定のそのような実施形態では、そのようなブロックの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドの３’末端から３ヌクレオシド以内に位置する。
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のメチルホスホネート結合を含む。ある特定の実施形態では、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドは、１つまたは２つのメチルホスホネート結合を除くすべてがホスホロチオエート結合である結合モチーフを含む。ある特定の実施形態では、１つのメチルホスホネート結合は、ギャップマーヌクレオシドモチーフを有するオリゴヌクレオチドの中央のギャップ内にある。
ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合とホスホジエステルヌクレオシド間結合の数を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数と位置及びホスホジエステルヌクレオシド間結合の数と位置を、ヌクレアーゼ耐性が維持されるように定めることが望ましい。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数を少なくしてよく、またホスホジエステルヌクレオシド間結合の数を多くしてよい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を維持したまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数を少なくし、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の数を多くしてよい。実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を保ったまま、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合の数を少なくすることが望ましい。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を保ったまま、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の数を多くすることが望ましい。
修飾糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、任意選択で、糖基が修飾されているヌクレオシドを１つ以上含有し得る。そのような糖修飾ヌクレオシドは、優れたヌクレアーゼ安定性、高い結合親和性、または他の何らかの有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に付与してよい。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドは化学修飾リボフラノース環部分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、置換基の付加（５’置換基、２’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸（ＢＮＡ）の形成、リボシル環酸素原子のＳ、Ｎ（Ｒ）、またはＣ（Ｒ１）（Ｒ２）による置換（Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは保護基である）、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。化学修飾糖の例としては、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（開示されている他の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについては、ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００８／１０１１５７（公開日２００８年８月２１日）を参照のこと）、またはリボシル環酸素原子のＳによる置換と２’位におけるさらなる置換（米国特許出願公開ＵＳ２００５−０１３０９２３（公開日２００５年６月１６日）を参照のこと）、または別法としてＢＮＡの５’−置換（ＬＮＡが、例えば５’−メチル基または５’−ビニル基で置換されている、ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１（公開日２００７年１１月２２日）を参照のこと）などがある。
修飾糖部分を有するヌクレオシドの例には、５’−ビニル、５’−メチル（ＲまたはＳ）、４’−Ｓ、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ３、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ及び２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３置換基を含むヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。２’位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０ アルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＨ２Ｆ、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、Ｏ-ＣＨ２-Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、及びＯ-ＣＨ２-Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｌ）−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択することもでき、その場合、各Ｒｌ、Ｒｍ及びＲｎは、互いに独立して、Ｈまたは置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
本明細書において「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾ヌクレオシドを指す。二環式ヌクレオシド（ＢＮＡ）の例には、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子の間に架橋を含むヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では；本明細書で提供するアンチセンス化合物には；ＢＮＡヌクレオシドが１つ以上含まれ，その場合；架橋は次式の１つを含む：４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’（ＬＮＡ）；４’−（ＣＨ２）−Ｓ−２’；４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）；４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’及び４’−Ｃ-Ｈ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００８年７月１５日発行の米国特許第７，３９９，８４５号を参照のこと）；４’−Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）−Ｏ−２’（及びその類似体；２００９年１月８日ＷＯ２００９／００６４７８として公開のＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６８９２２を参照のこと）；４’−ＣＨ２-Ｎ（ＯＣＨ３）−２’（及びその類似体；２００８年１２月１１日ＷＯ／２００８／１５０７２９として公開のＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６４５９１を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−２’（２００４年９月２日公開；米国特許出願公開ＵＳ２００４-０１７１５７０を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’；ここで；ＲはＨ；Ｃ１〜Ｃ１２アルキル；または保護基（２００８年９月２３日発行の米国特許第７，４２７，６７２号を参照のこと）；４’−ＣＨ２−Ｃ-（Ｈ）（ＣＨ３）−２’（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−１３４を参照のこと）；及び４’−ＣＨ２−Ｃ（＝ＣＨ２）−２’（及びその類似体；２００８年１２月８日にＷＯ２００８／１５４４０１として公開のＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６６１５４を参照のこと）。
さらなる二環式ヌクレオシドが公表されている文献に報告されている（例えば：Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（２６） ８３６２−８３７９；Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２；Ｅｌａｙａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｉｎｖｅｎｓ． Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８，１−７；Ｏｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３；Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９；米国特許第７，７４１，４５７号；同第７，３９９，８４５号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０３４，１３３号；同第６，７９４，４９９号；同第６，７７０，７４８号；同第６，６７０，４６１号；同第６，５２５，１９１号；同第６，２６８，４９０号；米国特許公開番号ＵＳ２００８−００３９６１８；ＵＳ２００７−０２８７８３１；ＵＳ２００４−０１７１５７０；米国特許出願第６１／０９７，７８７号；同第６１／０２６，９９５号；及び国際出願ＷＯ ２００９／００６４７８；同ＷＯ２００８／１５４４０１；同ＷＯ２００８／１５０７２９；同ＷＯ２００９／１００３２０；同ＷＯ２０１１／０１７５２１；同ＷＯ２００９／０６７６４７；同ＷＯ２０１０／０３６６９８；同ＷＯ２００７／１３４１８１；同ＷＯ２００５／０２１５７０；同ＷＯ２００４／１０６３５６；同ＷＯ９９／１４２２６を参照のこと。上述の二環式ヌクレオシドはそれぞれ、例えば、α−Ｌ−リボフラノースとβ−Ｄ−リボフラノースなど、１つ以上の立体化学的糖構造を有するものを調製することができる（１９９９年３月２５日にＷＯ９９／１４２２６として公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＤＫ９８／００３９３を参照のこと）。
本明細書において、「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分ではない修飾糖部分を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、どの位置で修飾または置換されていてもよい。
本明細書において「４’−２’二環式ヌクレオシド」または「４’→２’二環式ヌクレオシド」とは、フラノース環の２つの炭素原子をつなぐ架橋を含むフラノース環を含み、架橋が糖環の２’炭素原子と４’炭素原子をつなぐ、二環式ヌクレオシドを指す。
ある特定の実施形態では、ＢＮＡヌクレオシドの二環式糖部分として、限定するわけではないが、ペントフラノシル糖部分の４’位と２’位の炭素原子間に少なくとも１つの架橋を有する化合物が挙げられ、限定されることなく，架橋は、-［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、Ｃ（＝ＮＲａ）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−、及びＮ（Ｒａ）−から独立して選択される１基または連結された２〜４つの基を含み、ここで、ｘは０、１、または２であり、ｎは１、２、３、または４であり、各Ｒａ及びＲｂは、互いに独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環式ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２-Ｊ１）、またはスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、かつ、各Ｊ１及びＪ２は、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキルまたは保護基である。
ある特定の実施形態では、二環式糖部分の架橋は、［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−、［Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）］ｎ−Ｏ−、Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｎ（Ｒ）−Ｏ-または−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−である。ある特定の実施形態では、架橋は４’−ＣＨ２−２’、４’−（ＣＨ２）２−２’、４’−（ＣＨ２）３−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’−であり、ここで、各Ｒは、互いに独立して、Ｈ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、さらに異性立体配置によって定義される。例えば、４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’架橋を含むヌクレオシドは、α−Ｌ立体配置またはβ−Ｄ立体配置をとってよい。これまでに、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれており、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンチセンス活性を示した（Ｆｒｉｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、４’→２’架橋を有するものが含まれ、そのような架橋には、限定されることなく、α−Ｌ−４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’、β-Ｄ-４’−ＣＨ２−Ｏ−２’、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’、４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’、４’−ＣＨ２-Ｓ−２’、４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’、４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’、及び４’−（ＣＨ２）３−２’が挙げられる、ここで、ＲはＨ、保護基またはＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
-Ｑａ-Ｑｂ-Ｑｃ-は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｃ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｃ）−、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ-または−Ｎ（Ｒｃ）−Ｏ−ＣＨ２であり、
Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル保護基またはアミノ保護基であり、かつ
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合である］を有する。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
Ｚａは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオールである］を有する。
一実施形態では、置換基はそれぞれ、互いに独立して、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、ＯＪｃ、ＮＪｃＪｄ、ＳＪｃ、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ））Ｊｃ、及びＮＪｅＣ（＝Ｘ）ＮＪｃＪｄから独立して選択される置換基で一置換または多置換され、ここで、各Ｊｃ、Ｊｄ及びＪｅは、互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、または置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつＸはＯまたはＮＪｃである。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
Ｚｂは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換アシル（Ｃ（＝Ｏ）−）である］を有する。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
Ｒｄは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、
各ｑａ、ｑｂ、ｑｃ及びｑｄは、互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルコキシル、アシル、置換アシル、Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アミノアルキルである］を有する、
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
ｑａ、ｑｂ、ｑｅ及びｑｆは、それぞれ互いに独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）−ＮＪｊＪｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであるか、
または、ｑｅ及びｑｆは全体として＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、
ｑｇ及びｑｈは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである］を有する。
４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を有する、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン及びウラシルの二環式ヌクレオシドの合成及び調製については、そのオリゴマー形成、及び核酸認識特性と共に記載がある（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。二環式ヌクレオシドの合成もまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
４’−ＣＨ２−Ｏ−２’及び４’−ＣＨ２-Ｓ−２’のような４’→２’架橋基を有するさまざまな二環式ヌクレオシド類似体が調製されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質として使用するための二環式ヌクレオシドを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖の調製も既に記載されている（Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９９／１４２２６）。さらにまた、コンフォメーションが制限された新規の高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＢＮＡの合成も当技術分野で既に記載されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。その上、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＢＮＡも調製されており、これらと、相補的なＲＮＡ鎖及びＤＮＡ鎖との二重鎖の熱安定性が、これまでに報告されている。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドは、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔａ及びＴｂは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ヒドロキシル保護基、共役基、反応性リン基、リン部分または支持媒体への共有結合であり、
各ｑｉ、ｑｊ、ｑｋ及びｑｌは、互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシル、ＯＪｊ、ＳＪｊ、ＳＯＪｊ、ＳＯ２Ｊｊ、ＮＪｊＪｋ、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＪｊ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｃ（＝Ｏ）Ｊｊ、Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＪｊＪｋ、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＪｊＪｋまたはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＪｊＪｋであり、かつ
ｑｉとｑｊまたはｑｌとｑｋは全体として＝Ｃ（ｑｇ）（ｑｈ）であり、ここで、ｑｇ及びｑｈは、それぞれ互いに独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキルである］を有する。
４’−（ＣＨ２）３−２’架橋及びアルケニル類似体架橋４’−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−２’を有する炭素環式二環式ヌクレオシドの一つは既に記載がある（Ｆｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３及びＡｌｂａｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００６，７１，７７３１−７７４０）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー形成及び生化学的研究と共に記載がある（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９）。
ある特定の実施形態では、二環式ヌクレオシドには、下記に図示する（Ａ）α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｂ）β-Ｄ-メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｃ）エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｄ）アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｅ）オキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡ、（Ｆ）メチル（メチレンオキシ）（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）ＢＮＡ（拘束エチルまたはｃＥｔともいう）、（Ｇ）メチレン-チオ（４’−ＣＨ２-Ｓ−２’）ＢＮＡ、（Ｈ）メチレン-アミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、（Ｉ）メチル炭素環式（４’−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−２’）ＢＮＡ、（Ｊ）プロピレン炭素環式（４’−（ＣＨ２）３−２’）ＢＮＡ、及び（Ｋ）ビニルＢＮＡが挙げられるが、これに限定されない。
式中、Ｂｘは塩基部分であり、Ｒは、独立して、Ｈ、保護基、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルコキシである。
本明細書において、用語「修飾テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾ＴＨＰヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシド中のペントフラノシル残基が六員テトラヒドロピラン「糖」で置換されているヌクレオシドを意味し、これは糖代用物とも言われ得る。修飾ＴＨＰヌクレオシドには、当技術分野においてヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、アニトール（ａｎｉｔｏｌ）核酸（ＡＮＡ）、マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）核酸（ＭＮＡ）（Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０，８４１−８５４を参照のこと）またはフルオロＨＮＡ（Ｆ−ＨＮＡ）と呼ばれ、以下に図解するようにテトラヒドロピラン環系を有するものが挙げられるが、これに限定されない。
ある特定の実施形態では、式
［式中、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ３及びＴ４は、それぞれ互いに独立して、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とオリゴマー化合物とを連結するヌクレオシド間連結基であるか、または、Ｔ３及びＴ４の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とオリゴマー化合物若しくはオリゴヌクレオチドとを連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｔ３及びＴ４の他方がＨ、ヒドロキシル保護基、連結された共役基または５’若しくは３’末端基であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルであり、かつ
Ｒ１及びＲ２の一方は水素であり、もう一方は、ハロゲン、置換または非置換アルコキシ、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＯＣ（＝Ｘ））Ｊ１、ＯＣ（＝Ｘ））ＮＪ１Ｊ２、ＮＪ３Ｃ（＝Ｘ）ＮＪ１Ｊ２及びＣＮから選択され、ここで、ＸはＯ、ＳまたはＮＪ１であり、かつ、各Ｊ１、Ｊ２及びＪ３は、互いに独立して、ＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである］を有する糖代用物が選択される。
ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７は各々Ｈである。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７の少なくとも１つはＨ以外である。ある特定の実施形態では、ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６及びｑ７の少なくとも１つはメチルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１及びＲ２の一方がＦであるＴＨＰヌクレオシドが提供される。ある特定の実施形態では、Ｒ１がフルオロかつＲ２がＨであり、Ｒ１がメトキシかつＲ２がＨであり、また、Ｒ１がメトキシエトキシかつＲ２がＨである。
ある特定の実施形態では、糖代用物は、６つ以上の原子及び２つ以上のヘテロ原子を有する環を含む。例えば、モルホリノ糖部分を含むヌクレオシド、及びオリゴマー化合物におけるそれらの使用が報告されている（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１，４５０３−４５１０；及び米国特許第５，６９８，６８５号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；及び同第５，０３４，５０６号を参照のこと）。ここで使用する用語「モルホリノ」とは、以下の式
を有する糖代用物を意味する。
ある特定の実施形態では、例えば、上記モルホリノ構造にさまざまな置換基を付加するか、上記モルホリノ構造のさまざまな置換基を改変することによって、モルホリノを修飾してよい。そのような糖代用物を本明細書では「修飾モルホリノ」という。
修飾の組み合わせ、例えば限定するわけではないが、２’−Ｆ−５’−メチル置換ヌクレオシド（開示されている他の５’，２’−ビス置換ヌクレオシドについてはＰＣＴ国際出願第ＷＯ２００８／１０１１５７号（公開日２００８年８月２１日）を参照のこと）、及びリボシル環酸素原子のＳによる置換と２’位におけるさらなる置換（米国特許出願公開ＵＳ２００５−０１３０９２３（公開日２００５年６月１６日）を参照のこと）、または代替的に二環式核酸の５’−置換（４’-ＣＨ２-Ｏ−２’二環式ヌクレオシドの５’位が５’−メチル基または５’−ビニル基でさらに置換されているＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／１３４１８１（公開日２００７年１１月２２日）を参照のこと）なども提供される。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成及び調製も、それらのオリゴマー形成及び生化学的研究と共に記載されている（例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９（２６），８３６２−８３７９を参照のこと）。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、天然に生じるヌクレオシド中のペントフラノシル残基の代わりに六員シクロヘキセニルを有するヌクレオシドである修飾シクロヘキセニルヌクレオシドを１つ以上含む。修飾シクロヘキセニルヌクレオシドとして、当技術分野に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、同一譲受人による、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１０／０３６６９６（公開日２０１０年４月１０日）；Ｒｏｂｅｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８，１３０（６），１９７９−１９８４；Ｈｏｒｖａ［ａ＋’］ｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００７，４８，３６２１−３６２３；Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００７，１２９（３０），９３４０−９３４８；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００５，２４（５−７），９９３−９９８；Ｎａｕｗｅｌａｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５，３３（８），２４５２−２４６３；Ｒｏｂｅｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ，Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｆ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００５，Ｆ６１（６），５８５−５８６；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００４，６０（９），２１１１−２１２３；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００３，１３（６），４７９−４８９；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３，６８，４４９９−４５０５；Ｖｅｒｂｅｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２９（２４），４９４１−４９４７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００１，６６，８４７８−８２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００１，２０（４−７），７８５−７８８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２；ＰＣＴ出願公開ＷＯ０６／０４７８４２；及びＰＣＴ出願公開ＷＯ０１／０４９６８７を参照のこと。なお；各々の本文は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ある特定の修飾シクロヘキセニルヌクレオシドは式Ｘを有する。
［式中、上記少なくとも１つの式Ｘのシクロヘキセニルヌクレオシド類似体のそれぞれについて、独立して、
Ｂｘは、複素環式塩基部分であり、
Ｔ３及びＴ４は、それぞれ互いに独立して、シクロヘキセニルヌクレオシド類似体とアンチセンス化合物を連結するヌクレオシド間連結基であるか、またはＴ３及びＴ４の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体とアンチセンス化合物とを連結するヌクレオシド間連結基であり、Ｔ３及びＴ４の他方はＨ、ヒドロキシル保護基、連結された共役基、または５’末端基若しくは３’末端基であり、かつ
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ５、ｑ６、ｑ７、ｑ８及びｑ９は、それぞれ互いに独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ６アルキニルまたは他の糖置換基である］。
他にも多数の単環式、二環式及び三環式の環系が当技術分野で公知であり、それらは、本明細書で提供されるオリゴマー化合物への組込み用ヌクレオシドの修飾に使用できる糖代用物として好適である（例えば、総説：Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００２，１０，８４１−８５４を参照のこと）。そのような環系には、活性をさらに高めるために、さまざまな追加の置換を行うことができる。
本明細書において、「２’−修飾糖」とは、２’位が修飾されたフラノシル糖を意味する。ある特定の実施形態では、そのような修飾には、ハロゲン化物、例えば、限定するわけではないが、置換及び非置換アルコキシ、置換及び非置換チオアルキル、置換及び非置換アミノアルキル、置換及び非置換アルキル、置換及び非置換アリル、及び置換及び非置換アルキニルから選択される置換基が挙げられる。ある特定の実施形態では、２’修飾が、限定するわけではないが、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＦ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＣＨ３、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２などといった置換基（式中、ｎ及びｍは１〜約１０である）から選択される。他の２’−置換基は、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、Ｆ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリ−アルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、アンチセンス化合物の薬物動態特性を改善するための基または薬力学的特性を改善するための基、及び類似の特性を有する他の置換基から選択することもできる。ある特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ側鎖を含む（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４−１２０００）。そのような２’−ＭＯＥ置換は、非修飾ヌクレオシド及び他の修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルと比較して、改善された結合親和性を有すると記述されている。２’−ＭＯＥ置換基を有するオリゴヌクレオチドは、生体内での用途に有望な特徴を持つ遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている（Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０−６３７；及びＡｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７−９２６）。
本明細書において、「２’−修飾」または「２’−置換」は、２’位にＨまたはＯＨ以外の置換基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。２’−修飾ヌクレオシドには、糖環の２つの炭素原子をつなぐ架橋が糖環の２’炭素ともう一つの炭素とをつないでいる二環式ヌクレオシド、及び非架橋２’置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１−Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ-（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ-（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）［式中、各Ｒｍ及びＲｎは、互いに独立して、Ｈまたは置換若しくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである］を有するヌクレオシドが挙げられるが、これに限定されない。２’−修飾ヌクレオシドは、例えば糖の他の位置及び／または核酸塩基において、他の修飾をさらに含んでもよい。
本明細書において、「２’−Ｆ」とは、糖環の２’位にフルオロ基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」、「２’−Ｏ−メチル」または「２’−メトキシ」は、各々、糖環の２’位に−ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
本明細書において、「ＭＯＥ」または「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」または「２’−Ｏ−メトキシエチル」とは、それぞれ、糖環の２’位に−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドを指す。
修飾糖の調製方法は当業者に周知である。そのような修飾糖の調製を教示する代表的米国特許の一部として、限定することなく、Ｕ．Ｓ．：４，９８１，９５７、５，１１８，８００、５，３１９，０８０、５，３５９，０４４、５，３９３，８７８、５，４４６，１３７、５，４６６，７８６、５，５１４，７８５、５，５１９，１３４、５，５６７，８１１、５，５７６，４２７、５，５９１，７２２、５，５９７，９０９、５，６１０，３００、５，６２７，０５３、５，６３９，８７３、５，６４６，２６５、５，６７０，６３３、５，７００，９２０、５，７９２，８４７及び６，６００，０３２並びに２００５年１２月２２日にＷＯ２００５／１２１３７１として公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１９２１９（出願日２００５年６月２日）が挙げられ、これらは各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」とは、複数の連結されたヌクレオシドを含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、複数のヌクレオシドの１つ以上が修飾される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上のリボヌクレオシド（ＲＮＡ）及び／またはデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を含む。
修飾糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾またはそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのために維持される。
ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、修飾糖部分を有する１つ以上のヌクレオシドを含む。ある特定の実施形態では、修飾糖部分は２’−ＭＯＥである。ある特定の実施形態では、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドは、ギャップマーモチーフで配置される。ある特定の実施形態では、修飾糖部分は、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）架橋基を有する二環式ヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、（４’−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ−２’）修飾ヌクレオシドが、ギャップマーモチーフのウィング全体にわたって配置される。
修飾核酸塩基
核酸塩基（または塩基）の修飾または置換は、天然に生じる非修飾核酸塩基または合成非修飾核酸塩基とは構造上識別できるが、機能的には天然に生じる非修飾核酸塩基または合成非修飾核酸塩基と交換可能である。天然核酸塩基及び修飾核酸塩基はどちらも水素結合に関与できる。そのような核酸塩基修飾により、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性または他の何らかの有益な生物学的特性がアンチセンス化合物に付与されてよい。修飾核酸塩基には、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）などの合成及び天然の核酸塩基が含まれる。５−メチルシトシン置換などのある特定の核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を高めるために特に有用である。例えば５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ． ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）。
別の修飾核酸塩基として、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル誘導体及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル誘導体及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルとシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニンとグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシルとシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン並びに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。
複素環式塩基部分として、プリン塩基またはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンで置換されているものも挙げることができる。アンチセンス化合物の結合親和性を高めるためにとりわけ有用な核酸塩基として、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン並びにＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリン、例えば２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とする短縮型またはギャップ拡大型（ｇａｐ−ｗｉｄｅｎｅｄ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾核酸塩基を含む。ある特定の実施形態では、修飾核酸塩基は５−メチルシトシンである。ある特定の実施形態では、各シトシンは５−メチルシトシンである
組成物および医薬組成物の製剤化方法
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、医薬組成物または製剤を調製するために、薬理学的に許容される活性または不活性物質と混合してよい。組成物および医薬組成物の製剤化方法は、いくつかの基準に依存し、それには投与経路、疾患の程度、または投与すべき用量などが含まれるが、これらに限定されない。
ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物を好適な薬理学的に許容される希釈剤または担体と組み合わせることにより医薬組成物に利用することができる。薬理学的に許容される希釈剤として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。ＰＢＳは非経口的に送達される組成物での使用に好適な希釈剤である。したがって、一実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物および薬理学的に許容される希釈剤を含む医薬組成物が、本明細書に記載の方法において使用される。ある特定の実施形態では、薬理学的に許容される希釈剤はＰＢＳである。ある特定の実施形態では、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンス化合物を含む医薬組成物は、あらゆる薬理学的に許容される塩、エステル、若しくはエステルの塩、または、ヒトを含む動物に投与した場合に生物学的に活性な代謝物またはその残留物を（直接的または間接的に）与えることができる他のあらゆるオリゴヌクレオチドを包含する。したがって、例えば、本開示はまた、アンチセンス化合物の薬理学的に許容される塩、プロドラッグ、該プロドラッグの薬理学的に許容される塩、および他の生物学的同等物に関する。好適な薬理学的に許容される塩として、ナトリウム及びカリウム塩が挙げられるが、これに限定されない。
プロドラッグは、アンチセンス化合物の一端または両端に別のヌクレオシドの組込みを含むことができ、それらのヌクレオシドは体内で内在性ヌクレアーゼにより切断され、活性アンチセンス化合物を形成する。
共役アンチセンス化合物
アンチセンス化合物は、得られるアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取込みを増強する１つ以上の部分若しくは共役体と共有結合で連結され得る。典型的な共役基としては、コレステロール部分および脂質部分が挙げれる。さらなる共役基としては、炭水化物、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が挙げられる。
また、アンチセンス化合物を修飾して、一般にアンチセンス化合物の一端または両端に結合される安定化基を１つ以上持たせ、特性、例えばヌクレアーゼ安定性などを増強させることもできる。安定化基として、キャップ構造が含まれる。これらの末端修飾により、末端核酸を有するアンチセンス化合物がエクソヌクレアーゼ分解から保護され、また、細胞内の送達および／または局在化に役立ち得る。キャップは５’末端（５’キャップ）または３’末端（３’キャップ）に存在し得るか、または両端に存在し得る。キャップ構造は当技術分野に周知であり、例えば、反転デオキシ脱塩基キャップ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｃａｐ）が挙げられる。アンチセンス化合物の一端または両端にキャップをしてヌクレアーゼ安定性を付与するために使用できる、さらなる３’安定化基および５’安定化基には、ＷＯ０３／００４６０２（公開日２００３年１月１６日）に記載のものが含まれる。
ある特定の実施形態では、本開示は、式
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］によって表される共役アンチセンス化合物を提供する。
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される
ある特定の実施形態では、次の構造を有する共役アンチセンス化合物が提供される
本開示は、非限定的な以下の番号付き実施形態を提供する。
［式中、
Ｔ２はヌクレオシド、ヌクレオチド、単量体サブユニット、またはオリゴマー化合物である］。
ある特定変数を２つ以上（例えば２つ以上の「ｍ」または２つ以上の「ｎ」を）有する実施形態では、別段の表示がある場合を除き、そのような特定変数のそれぞれは、独立して選択される。したがって、２つ以上のｎを有する構造の場合、各ｎは独立して選択されるため、それらは互いに同一であっても、または同一でなくてもよい。
ｉ． ある特定の切断可能部分
ある特定の実施形態では、切断可能部分は切断可能な結合である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態では、共役基は、切断可能部分を含む。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分は、細胞を標的とする部分に直接結合する。ある特定のそのような実施形態において、切断可能部分は共役リンカーに結合する。ある特定の実施形態では、切断可能部分はホスフェートまたはホスホジエステルを含む。ある特定の実施形態では、切断可能部分は切断可能なヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体である。ある特定の実施形態では、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、プリン、置換プリン、ピリミジン、または置換ピリミジンから選択される任意選択で保護された複素環式塩基を含む。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ウラシル、チミン、シトシン、４−Ｎ−ベンゾイルシトシン、５−メチルシトシン、４−Ｎ−ベンゾイル−５−メチルシトシン、アデニン、６−Ｎ−ベンゾイルアデニン、グアニン、及び２−Ｎ−イソブチリルグアニンから選択される、任意選択で保護された複素環式塩基を含むヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合し、かつホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によってリンカーに結合している、２’−デオキシヌクレオシドである。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合し、かつホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によってリンカーに結合している、２’−デオキシアデノシンである。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、ホスホジエステル結合によってアンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合し、かつホスホジエステル結合によってリンカーに結合している、２’−デオキシアデノシンである。
ある特定の実施形態では、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’位に結合している。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’位に結合している。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２’位に結合している。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにホスホジエステル結合によって結合している。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、リンカーにホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合によって結合している。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、リンカーにホスホジエステル結合によって結合している。ある特定の実施形態では、共役基は切断可能部分を含まない。
ある特定の実施形態では、切断可能部分は、複合体が動物に投与された後に、標的細胞によって内部に取り込まれて初めて切断される。細胞内では、切断可能部分が切断され、これにより活性アンチセンスオリゴヌクレオチドが放出される。理論に束縛されることは望まないが、切断可能部分は細胞内で１つ以上のヌクレアーゼによって切断されると考えられる。ある特定の実施形態では、１つ以上のヌクレアーゼが切断可能部分とリンカーとの間のホスホジエステル結合を切断する。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、以下の中から選択される構造を有し、
式中、Ｂｘ、Ｂｘ１、Ｂｘ２、及びＢｘ３の各々は互いに独立して複素環式塩基部分である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、以下の中から選択される構造を有する
ｉ．ある特定のリンカー
ある特定の実施形態では、共役基はリンカーを含む。ある特定のそのような実施形態では、リンカーは切断可能部分と共有結合される。ある特定のそのような実施形態では、リンカーはアンチセンスオリゴヌクレオチドと共有結合される。ある特定の実施形態では、リンカーは細胞を標的とする部分と共有結合される。ある特定の実施形態では、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、タンパク質結合部分への共有結合をさらに含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、固体支持体への共有結合をさらに含み、タンパク質結合部分への共有結合もさらに含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、係留される（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）リガンドを結合させるための位置を複数含んでいる。ある特定の実施形態では、リンカーは、係留されるリガンドを結合させるための位置を複数含み、分岐基には結合していない。ある特定の実施形態では、リンカーは、１つ以上の切断可能な結合をさらに含む。ある特定の実施形態では、共役基はリンカーを含まない。
ある特定の実施形態では、リンカーは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル（−Ｓ−）、及びヒドロキシルアミノ（−Ｏ−Ｎ（Ｈ）−）基から選択される基を含む線状基を少なくとも１つのは含む。ある特定の実施形態では、線状基は、アルキル基、アミド基及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態では、線状基は、アルキル基及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態では、線状基は、少なくとも１つのリン連結基を含む。ある特定の実施形態では、線状基は、少なくとも１つのホスホジエステル基を含む。ある特定の実施形態では、線状基は、少なくとも１つの中性連結基を含む。ある特定の実施形態では、線状基は、細胞を標的とする部分及び切断可能部分に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、細胞を標的とする部分及びアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、細胞を標的とする部分、切断可能部分及び固体支持に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、細胞を標的とする部分、切断可能部分、固体支持及びタンパク質結合部分に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基には、１つ以上の切断可能な結合が含まれる。
ある特定の実施形態では、リンカーには、共有結合で足場基に結合している線状基が含まれる。ある特定の実施形態では、足場には、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基が含まれる。ある特定の実施形態では、足場には、アルキル、アミド及びエーテル基から選択される基を含む分岐脂肪族基が含まれる。ある特定の実施形態では、足場には、少なくとも１つの単環式または多環式の環系が含まれる。ある特定の実施形態では、足場には、少なくとも２つの単環式または多環式の環系が含まれる。ある特定の実施形態では、線状基は、足場基に共有結合で結合し、足場基は切断可能部分及びリンカーに共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、足場基に共有結合で結合し、足場基は切断可能部分、リンカー及び固体支持に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、足場基に共有結合で結合し、足場基は切断可能部分、リンカー及びタンパク質結合部分に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、線状基は、足場基に共有結合で結合し、足場基は切断可能部分、リンカー、タンパク質結合部分及び固体支持に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、足場基には、１つ以上の切断可能な結合が含まれる。
ある特定の実施形態では、リンカーには、タンパク質結合部分が含まれる。ある特定の実施形態では、タンパク質結合部分は脂質であり、例えば、限定されることなく、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えばウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質などが挙げられる。ある特定の実施形態では、タンパク質結合部分は、飽和または不飽和のＣ１６〜Ｃ２２長鎖脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタンまたは１-ペンタフルオロプロピル。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有し、式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、ｐは１〜６である。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
［式中、ｎは１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
［式中、各Ｌは、互いに独立してリン連結基または中性連結基であり、かつ
各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
［式中、ｎは１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、構造：
を有する。
ある特定の実施形態では、共役リンカーは、構造、
を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、リンカーは、
［式中、各ｎは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である］の中から選択される構造を有する。
ｉｉ． 特定の細胞を標的とする部分
ある特定の実施形態では、共役基は、細胞を標的とする部分を含む。ある特定のそのような細胞を標的とする部分は、アンチセンス化合物の細胞取り込みを増加させる。ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、分岐基、１つ以上のテザー、及び１つ以上のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、細胞を標的とする部分は、分岐基、１つ以上のテザー、１つ以上のリガンド及び１つ以上の切断可能な結合を含む。
１． ある特定の分岐基
ある特定の実施形態では、共役基は、分岐基及び少なくとも２つの係留されるリガンドを含む標的とする部分を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は共役リンカーを結合する。ある特定の実施形態では、分岐基は切断可能部分を結合する。ある特定の実施形態では、分岐基はアンチセンスオリゴヌクレオチドを結合する。ある特定の実施形態では、分岐基は、リンカー及び係留されるリガンドの各々に共有結合で結合している。ある特定の実施形態では、分岐基は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテル及びヒドロキシルアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は、アルキル、アミド及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は、アルキル及びエーテル基から選択される基を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は、単環式または多環式の環系を含む。ある特定の実施形態では、分岐基は、１つ以上の切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態では、共役基は分岐基を含まない。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０でありであり、
ｊは、１〜３であり、かつ
ｍは、２〜６である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、かつ
ｍは、２〜６である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、各Ａ１は、互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、かつ
各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、各Ａ１は、互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、かつ
各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
［式中、Ａ１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、かつ
各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、分岐基は、
の中から選択される構造を有する。
２． ある特定のテザー
ある特定の実施形態では、共役基は、分岐基に共有結合で結合している１つ以上のテザーを含む。ある特定の実施形態では、共役基は、連結基に共有結合で結合している１つ以上のテザーを含む。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド及びポリエチレングリコール基から選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、置換アルキル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、アミド、ホスホジエステル及びポリエチレングリコール基から選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、エーテル及びアミド基から選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル、置換アルキル、ホスホジエステル、エーテル及びアミド基から選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、アルキル及びホスホジエステルから選択される１つ以上の基を任意の組み合わせで含む線状脂肪族基である。ある特定の実施形態では、各テザーは、リン連結基または中性連結基を少なくとも１つ含む。
ある特定の実施形態では、テザーには、１つ以上の切断可能な結合が含まれる。ある特定の実施形態では、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介して分岐基に結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、ホスホジエステル基を介して分岐基に結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、リン連結基または中性連結基を介して分岐基に結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、エーテル基を介して分岐基に結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、アミド基またはエーテル基のいずれかを介してリガンドに結合している。ある特定の実施形態では、テザーは、エーテル基を介してリガンドに結合している。
ある特定の実施形態では、各テザーは、リガンドと分岐基との間に約８〜約２０原子の鎖長を含む。ある特定の実施形態では、各テザー基は、リガンドと分岐基との間に約１０〜約１８原子の鎖長を含む。ある特定の実施形態では、各テザー基は、約１３原子の鎖長を含む。
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、かつ
各ｐは、１〜約６である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、Ｌは、リン連結基または中性連結基のいずれかであり、
Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｒ２であり、
Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
各ｍ１は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、Ｚ２は、ＨまたはＣＨ３であり、かつ
各ｍ１は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーは、
［式中、各ｎは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である］
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、テザーはリン連結基を含む。ある特定の実施形態では、テザーは、いかなるアミド結合も含まない。ある特定の実施形態では、テザーはリン連結基を含み、いかなるアミド結合も含まない。
３． ある特定のリガンド
ある特定の実施形態では、本開示は、各リガンドがテザーに共有結合で結合しているリガンドを提供する。ある特定の実施形態では、各リガンドは、標的細胞において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するように選択される。ある特定の実施形態では、哺乳類肝臓細胞の表面において少なくとも１種類の受容体に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態では、肝アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）に対する親和性を有するリガンドが選択される。ある特定の実施形態では、各リガンドは炭水化物である。ある特定の実施形態では、各リガンドは、互いに独立して、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトースアミン、マンノース、グルコース、グルコサモン（ｇｌｕｃｏｓａｍｏｎｅ）及びフコースから選択される。ある特定の実施形態では、各リガンドはＮ−アセチルガラクトースアミン（ＧａｌＮＡｃ）である。ある特定の実施形態では、標的とする部分は、２〜６個のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、標的とする部分は、３個のリガンドを含む。ある特定の実施形態では、標的とする部分は、３個のＮ−アセチルガラクトースアミンリガンドを含む。
ある特定の実施形態では、リガンドは、炭水化物、炭水化物誘導体、修飾炭水化物、多価炭水化物クラスター、多糖、修飾多糖、または多糖類誘導体である。ある特定の実施形態では、リガンドは、アミノ糖またはチオ糖である。例えば、アミノ糖は、当技術分野で公知の化合物、例えば、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース（ＧａｌＮＡｃ）、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（β−ムラミン酸）、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン、及びＮ−グリコロイル−α−ノイラミン酸から任意の数で選択されてよい。例えば、チオ糖は、５−チオ−β-Ｄ-グルコピラノース、メチル２，３，４-トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル-α-Ｄ-グルコピラノシド、４−チオ−β-Ｄ-ガラクトピラノース、及びエチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル-２−デオキシ−１，５−ジチオ-α-Ｄ−ｇｌｕｃｏ−ヘプトピラノシドからなる群から選択されてよい。
ある特定の実施形態では、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」とは、文献内で一般にＮ−アセチルガラクトサミンと称される２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態では、「Ｎ−アセチルガラクトサミン」とは、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ-ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態では、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」とは、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ-ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態では、「ＧａｌＮａｃ」または「Ｇａｌ−ＮＡｃ」とは、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース，及びα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの両型を含む、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指す。ある特定の実施形態では、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β-Ｄ-ガラクトピラノース及びα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ-ガラクトピラノースはいずれも互換的に使用されてよい。したがって、一方の型が図示される構造において、これらの構造は、他方の型も同様に含まれることが意図される。例えば、α型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースの構造が示される場合は、この構造に他方の型も同様に含まれることが意図される。ある特定の実施形態において、特定の好ましい実施形態では、β型の２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ-ガラクトピラノースが好ましい実施形態である。
ある特定の実施形態では、１つ以上のリガンドは、
［式中、各Ｒ１は、ＯＨ及びＮＨＣＯＯＨから選択される］の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、１つ以上のリガンドは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、１つ以上のリガンドは、
の中から選択される構造を有する。
ある特定の実施形態では、１つ以上のリガンドは、
の中から選択される構造を有する。
ｉｉｉ． ある特定の共役体
ある特定の実施形態では、共役基は、上述の構造的特徴を含む。ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を含む
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］。
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を含む
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、
Ｑは、アンチセンス化合物であり、
Ｘは、ＯまたはＳであり、かつ
Ｂｘは、複素環式塩基部分である］。
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を含む
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を含む
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定のそのような実施形態において、共役基は以下の構造を有する
ある特定の実施形態では、共役体はピロリジンを含まない。
ｂ． ある特定の共役アンチセンス化合物
ある特定の実施形態では、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位で、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。
ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある特定のそのような実施形態において、分岐基は、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある実施形態では、各テザーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。ある特定の実施形態では、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位で、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｃは、共役リンカーであり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。ある特定の実施形態では、共役体は、ヌクレオシドの２’、３’、または５’位で、アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオシドに結合される。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｃは、共役リンカーであり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｂは、切断可能部分であり
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は以下の構造を有する
［式中、
Ａは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、
Ｄは、分岐基であり
各Ｅは、テザーであり、
各Ｆは、リガンドであり、かつ
ｑは、１〜５の整数である］。
ある特定のそのような実施形態において、共役リンカーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある実施形態では、各テザーは、少なくとも１つの切断可能な結合を含む。
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、以下の中から選択される構造を有する
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、以下の構造を有する
上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、並びに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な米国特許、米国特許出願公開、及び国際特許出願公開には、ＵＳ５，９９４，５１７、ＵＳ６，３００，３１９、ＵＳ６，６６０，７２０、ＵＳ６，９０６，１８２、ＵＳ７，２６２，１７７、ＵＳ７，４９１，８０５、ＵＳ８，１０６，０２２、ＵＳ７，７２３，５０９、ＵＳ２００６／０１４８７４０、ＵＳ２０１１／０１２３５２０号、ＷＯ２０１３／０３３２３０、及びＷＯ２０１２／０３７２５４が含まれるが、これらに限定されるものではなく、これらの文献はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
上述の共役体、共役アンチセンス化合物、テザー、リンカー、分岐基、リガンド、切断可能部分、並びに他の修飾のいくつかの調製を教示する代表的な刊行物には、ＢＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．”Ｔｈｅ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａ Ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｌｏｗｅｒｉｎｇ Ａｇｅｎｔ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１８４６−１８５２、ＢＩＥＳＳＥＮ ｅｔ ａｌ．”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）３８：１５３８−１５４６、ＬＥＥ ｅｔ ａｌ．”Ｎｅｗ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｇｌｙｃｏ−ｌｉｇａｎｄｓ ｆｏｒ ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１１）１９：２４９４−２５００、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．”Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（４０）：３７５７７−３７５８４、ＲＥＮＳＥＮ ｅｔ ａｌ．”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２００４）４７：５７９８−５８０８、ＳＬＩＥＤＲＥＧＴ ｅｔ ａｌ．”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｃ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）４２：６０９−６１８、及びＶａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．”Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ Ｃｌｕｓｔｅｒ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３（２），７５９−７７０が含まれるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、ＲＮａｓｅ Ｈベースのオリゴヌクレオチド（ギャップマーなど）またはスプライシング調節オリゴヌクレオチド（完全修飾オリゴヌクレオチドなど）、及び少なくとも１つ、２つ、または３つのＧａｌＮＡｃ基を含む任意の共役基を含む。ある特定の実施形態では、共役アンチセンス化合物は、以下の任意の参考文献に記載されているあらゆる共役基を含む：Ｌｅｅ， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ，１９７８，６７，５０９−５１４；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９８２，２５７，９３９−９４５；Ｐａｖｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，１９８３，２２，５３９−５４８；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８４，２３，４２５５−４２６１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ，１９８７，４，３１７−３２８；Ｔｏｙｏｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９０，３１，２６７３−２６７６；Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１５３８−１５４６；Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９７，５３，７５９−７７０；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，１９９７，３８，３４８７−３４９０；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，７６２−７６５；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ，２００１，１１，８２１−８２９；Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６，３７５７７−３７５８４；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００３，３６２，３８−４３；Ｗｅｓｔｅｒｌｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ Ｊ，２００４，２１，２２７−２４１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ，２００６，１６（１９），５１３２−５１３５；Ｍａｉｅｒｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００７，１５，７６６１−７６７６；Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００８，１６，５２１６−５２３１；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１１，１９，２４９４−２５００；Ｋｏｒｎｉｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１２，４２５，４３−４６；Ｐｕｊｏｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ，２０１２，５１，７４４５−７４４８；Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９５，３８，１８４６−１８５２；Ｓｌｉｅｄｒｅｇｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１９９９，４２，６０９−６１８；Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２００４，４７，５７９８−５８０８；Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ，２００６，２６，１６９−１７５；ｖａｎ Ｒｏｓｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４，１１，４５７−４６４；Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ，２００４，１２６，１４０１３−１４０２２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ，２０１２，７７，７５６４−７５７１；Ｂｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ，２０００，１４，１７８４−１７９２；Ｒａｊｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９７，８，９３５−９４０；Ｄｕｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２０００，３１３，２９７−３２１；Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００３，１４，１８−２９；Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ，２０１０，１２，５４１０−５４１３；Ｍａｎｏｈａｒａｎ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２，１２，１０３−１２８；Ｍｅｒｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，１９９４，５，６１２−６２０；Ｔｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２０１３，２１，５２７５−５２８１；国際出願ＷＯ１９９８／０１３３８１；ＷＯ２０１１／０３８３５６；ＷＯ１９９７／０４６０９８；ＷＯ２００８／０９８７８８；ＷＯ２００４／１０１６１９；ＷＯ２０１２／０３７２５４；ＷＯ２０１１／１２００５３；ＷＯ２０１１／１００１３１；ＷＯ２０１１／１６３１２１；ＷＯ２０１２／１７７９４７；ＷＯ２０１３／０３３２３０；ＷＯ２０１３／０７５０３５；ＷＯ２０１２／０８３１８５；ＷＯ２０１２／０８３０４６；ＷＯ２００９／０８２６０７；ＷＯ２００９／１３４４８７；ＷＯ２０１０／１４４７４０；ＷＯ２０１０／１４８０１３；ＷＯ１９９７／０２０５６３；ＷＯ２０１０／０８８５３７；ＷＯ２００２／０４３７７１；ＷＯ２０１０／１２９７０９；ＷＯ２０１２／０６８１８７；ＷＯ２００９／１２６９３３；ＷＯ２００４／０２４７５７；ＷＯ２０１０／０５４４０６；ＷＯ２０１２／０８９３５２；ＷＯ２０１２／０８９６０２；ＷＯ２０１３／１６６１２１；ＷＯ２０１３／１６５８１６；米国特許第４，７５１，２１９号；同第８，５５２，１６３号；同第６，９０８，９０３号；同第７，２６２，１７７号；同第５，９９４，５１７号；同第６，３００，３１９号；同第８，１０６，０２２号；同第７，４９１，８０５号；同第７，４９１，８０５号；同第７，５８２，７４４号；同第８，１３７，６９５号；同第６，３８３，８１２号；同第６，５２５，０３１号；同第６，６６０，７２０号；同第７，７２３，５０９号；同第８，５４１，５４８号；同第８，３４４，１２５号；同第８，３１３，７７２号；同第８，３４９，３０８号；同第８，４５０，４６７号；同第８，５０１，９３０号；同第８，１５８，６０１号；同第７，２６２，１７７号；同第６，９０６，１８２号；同第６，６２０，９１６号；同第８，４３５，４９１号；同第８，４０４，８６２号；同第７，８５１，６１５号；米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００９７２６４；ＵＳ２０１１／００９７２６５；ＵＳ２０１３／０００４４２７；ＵＳ２００５／０１６４２３５；ＵＳ２００６／０１４８７４０；ＵＳ２００８／０２８１０４４；ＵＳ２０１０／０２４０７３０；ＵＳ２００３／０１１９７２４；ＵＳ２００６／０１８３８８６；ＵＳ２００８／０２０６８６９；ＵＳ２０１１／０２６９８１４；ＵＳ２００９／０２８６９７３；ＵＳ２０１１／０２０７７９９；ＵＳ２０１２／０１３６０４２；ＵＳ２０１２／０１６５３９３；ＵＳ２００８／０２８１０４１；ＵＳ２００９／０２０３１３５；ＵＳ２０１２／００３５１１５；ＵＳ２０１２／００９５０７５；ＵＳ２０１２／０１０１１４８；ＵＳ２０１２／０１２８７６０；ＵＳ２０１２／０１５７５０９；ＵＳ２０１２／０２３０９３８；ＵＳ２０１３／０１０９８１７；ＵＳ２０１３／０１２１９５４；ＵＳ２０１３／０１７８５１２；ＵＳ２０１３／０２３６９６８；ＵＳ２０１１／０１２３５２０；ＵＳ２００３／００７７８２９；ＵＳ２００８／０１０８８０１；及びＵＳ２００９／０２０３１３２。なお、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
細胞培養及びアンチセンス化合物処理
アンチセンス化合物がＡＮＧＰＴＬ３核酸の濃度、活性、または発現に与える効果は、さまざまな細胞型での生体外試験が可能である。そのような解析に使用される細胞型は、商業的供給業者（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓｕｓ，ＶＡ； Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ； Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手可能であり、細胞は供給業者の指示書に従い市販の試薬（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて培養し得る。例示的な細胞型には、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７（肝細胞癌）細胞、初代肝細胞、Ａ５４９細胞、ＧＭ０４２８１線維芽細胞及びＬＬＣ-ＭＫ２細胞が挙げられるが、これに限定されない。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの生体外試験
本明細書には、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するための方法を記載し、この方法は、他のアンチセンス化合物で処理するために適宜変更を加えることができる。
一般に、細胞は、細胞が培養中で約６０〜８０％コンフルエントな状態に達した時に、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。
培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入するためによく使用される試薬の一つに、カチオン性脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の最終濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭあたり２〜１２μｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度を達成する。
培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド導入に使用する別の試薬に、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００（登録商標）と混合し、所望のアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭ当たり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）濃度を達成する。
培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド導入に使用する別の試薬には、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）と混合し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの所望の濃度と、典型的にはアンチセンスオリゴヌクレオチド１００ｎＭ当たり２〜１２ｕｇ／ｍＬの範囲のＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度を達成する。
培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド導入に使用する別の試薬には、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）と混合し、オリゴヌクレオチドに対してＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）が１００ｎＭ当たり約０．２〜０．８μＬの比で含まれる、所望のオリゴヌクレオチド濃度を達成する。
培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド導入に使用する別の試薬には、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）が挙げられる。アンチセンスオリゴマー化合物を１ｍｌの無血清ＲＰＭＩ中でＦｕＧＥＮＥ６と混合し、オリゴマー化合物に対するＦｕＧＥＮＥ６の比が、１００ｎＭ当たり１〜４μＬのＦｕＧＥＮＥ６という比で含まれる、所望のオリゴヌクレオチド濃度を達成する。
培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド導入に使用される別の技法に、電気穿孔法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）がある。
細胞は、常法によりアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される。細胞を、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理から１６〜２４時間後に回収し、その時、標的核酸のＲＮＡ濃度またはタンパク質レベルを当技術分野で公知の、本明細書に記載の方法により測定する。に、複数の複製試料に処理を行う場合は、複製試料処理の平均としてデータを表す。
使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株ごとに異なる。ある特定の細胞株について最適なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を決定するための方法は、当技術分野では周知である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（登録商標）、ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎまたはＣｙｔｏｆｅｃｔｉｎを用いてトランスフェクションする場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、１ｎＭ〜３００ｎＭの濃度範囲で使用される。電気穿孔法によるトランスフェクションの場合は、それより高い６２５ｎＭから２０，０００ｎＭの濃度範囲でアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用される。
ＲＮＡの単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施可能である。ＲＮＡの単離方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）。ＲＮＡは、当技術分野において周知の方法を使用して、例えば、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者が推奨するプロトコルに従って使用し調製される。
標的の濃度または発現の阻害に関する分析
ＡＮＧＰＴＬ３核酸の濃度または発現の阻害については、当技術分野で公知の多種多様な方法で分析し調べることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）。例えば、標的核酸濃度は、例えば、ノーザンブロット法、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または定量リアルタイムＰＣＲで定量できる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施可能である。ＲＮＡの単離方法は、当技術分野において周知である。ノーザンブロット法もまた、当技術分野で常法である。定量リアルタイムＰＣＲは、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから入手でき製造者の指示書に従い使用される市販のＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて好都合に実現される。
標的ＲＮＡレベルの定量リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００、または７９００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造者の指示書に従って使用し、定量リアルタイムＰＣＲにより実現できる。定量リアルタイムＰＣＲ法は当技術分野において周知である。
リアルタイムＰＣＲに先立ち、単離されたＲＮＡを逆転写酵素（ＲＴ）反応に供し、これにより相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成され、これが、次にリアルタイムＰＣＲ増幅用の基質として使用される。ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ反応を同じ試料ウェルにて順次実施する。ＲＴ試薬およびリアルタイムＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手する。ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に公知の方法で行われる。
リアルタイムＰＣＲにより得られた遺伝子（またはＲＮＡ）標的量を、発現が一定である遺伝子、例えばシクロフィリンＡまたはＧＡＤＰＨのいずれかの発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標），Ｉｎｃ． Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用したトータルＲＮＡの定量化により正規化してもよい。シクロフィリンＡまたはＧＡＤＰＨの発現は、リアルタイムＰＣＲにより、標的と同時に、多重化して、または別々に実施して定量できる。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬で定量できる。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）でＲＮＡを定量する方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ，（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）に教示されている。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光を測定できる。
リアルタイムＰＣＲ用のプローブおよびプライマーを設計する方法は当技術分野で周知であり、ＰＲＩＭＥＲ ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などのソフトウェアの使用が含まれ得る。リアルタイムＰＣＲで使用されたプローブ及びプライマーは、ＡＮＧＰＴＬ３の特定配列にハイブリダイズするよう設計されたものであり、これらを下記実施例に開示する。標的特異的ＰＣＲプローブは、５’末端に共有結合で連結されたＦＡＭ及び３’末端に共有結合で連結されたＴＡＭＲＡ若しくはＭＧＢを有することができ、その場合、ＦＡＭは蛍光色素、ＴＡＭＲＡまたはＭＧＢはクエンチャー色素である。
タンパク質レベル分析
ＡＮＧＰＴＬ３核酸のアンチセンス阻害は、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを測定することにより評価され得る。ＡＮＧＰＴＬ３のタンパク質レベルは、当技術分野で周知のさまざまな手法、例えば、免疫沈降法、ウエスタンブロット法（免疫ブロット法）、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、定量的タンパク質分析、タンパク質活性分析（例えば、カスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫細胞化学、または蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．，２００１）などで評価または定量が可能である。標的を対象とする抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＩ）などのさまざまな供給源により同定および入手可能であり、または、当技術分野で周知である従来のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体生成方法により調製してよい。
アンチセンス化合物の生体内試験
アンチセンス化合物、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡＮＧＰＴＬ３の発現を阻害し表現型の変化を生じさせる能力を評価するため、これらの化合物を動物で試験する。試験は、正常動物で、または実験用疾患モデルで実施され得る。動物への投与用に、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン酸緩衝生理食塩水などの薬理学的に許容される希釈剤に配合する。投与としては、非経口投与経路が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置期間後、ＲＮＡを細胞から単離してＡＮＧＰＴＬ３核酸発現の変化を測定する。ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの変化も測定する。
ある特定の適応
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する医薬組成物の１つ以上を投与することを含む、個体を処置する方法が本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、個体は、代謝性疾患及び／または心血管疾患に罹患している。ある特定の実施形態では、個体は、複合型高脂血症（例えば、家族性または非家族性）、高コレステロール血症（例えば、ホモ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ））、脂質異常症、リポジストロフィー、高トリグリセリド血症（例えば、ヘテロ接合体性ＬＰＬ欠損症、ホモ接合体性ＬＰＬ欠損症）、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、家族性カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）、ＩＶ型高リポ蛋白血症）、メタボリック症候群、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病（例えば、２型糖尿病、脂質異常症を伴う２型糖尿病）、インスリン抵抗性（例えば、脂質異常症を伴うインスリン抵抗性）、血管壁肥厚、高血圧（例えば、肺動脈性肺高血圧）、硬化症（例えば、アテローム性動脈硬化症、全身性硬化症、進行性皮膚硬化症、及び、手指潰瘍及び肺血管病変などの増殖性閉塞性血管障害（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｏｂｌｉｔｅｒａｔｉｖｅ ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ））、またはその組み合わせに罹患している。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする化合物は、動物において脂質及び／またはエネルギーの代謝を調節する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする化合物は、高コレステロール血症、脂質異常症、リポジストロフィー、高トリグリセリド血症、メタボリック症候群、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ及び／または糖尿病の生理的なマーカーまたは表現型を調節する。例えば、動物に化合物を投与することにより、ＶＬＤＬ、非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、ＬＤＬ、コレステロール、トリグリセリド、グルコース、インスリンまたはＡＮＧＰＴＬ３のレベルの１つ以上が調節されうる。ある特定の実施形態では、生理的なマーカーまたは表現型の調節には、化合物によるＡＮＧＰＴＬ３阻害が関連し得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする化合物は、肝臓のＴＧ蓄積（すなわち、脂肪肝）、アテローム性動脈硬化症、血管壁の肥厚（例えば、動脈内膜中膜肥厚）、複合型高脂血症（例えば、家族性または非家族性）、高コレステロール血症（例えば、ホモ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ））、脂質異常症、リポジストロフィー、高トリグリセリド血症（例えば、ヘテロ接合体性ＬＰＬ欠損症、ホモ接合体性ＬＰＬ欠損症、家族性カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）、ＩＶ型高リポ蛋白血症）、メタボリック症候群、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病（例えば、２型糖尿病、脂質異常症を伴う２型糖尿病）、インスリン抵抗性（例えば、脂質異常症を伴うインスリン抵抗性）、高血圧及び硬化症、またはその任意の組み合わせの１つ以上を低下させる、かつ／または予防する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とする化合物はインスリン感受性を改善する。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与により約少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％、またはこれらの値のうちいずれか２つにより規定される範囲の率でＡＮＧＰＴＬ３発現が低下する。
ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、代謝性疾患または心血管疾患に罹患している、または罹患しやすい患者を治療するための薬品の調製に使用される。ある特定の実施形態では、ＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンス化合物を含む医薬組成物は、複合型高脂血症（例えば、家族性または非家族性）、高コレステロール血症（例えば、ホモ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合体性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ））、脂質異常症、リポジストロフィー、高トリグリセリド血症（例えば、家族性カイロミクロン血症症候群（ＦＣＳ）、ＩＶ型高リポ蛋白血症）、メタボリック症候群、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、糖尿病（例えば、２型糖尿病、脂質異常症を伴う２型糖尿病）、インスリン抵抗性（例えば、脂質異常症を伴うインスリン抵抗性）、血管壁肥厚、高血圧及び硬化症、またはその組み合わせの１つ以上に罹患している、または罹患しやすい患者を治療するための薬品の調製に使用される。
投与
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する化合物及び組成物は、非経口投与される。
ある特定の実施形態では、非経口投与は注入による。注入は、慢性的若しくは持続的または短期若しくは間欠的であり得る。ある特定の実施形態では、注入される医薬剤はポンプで送達される。
ある特定の実施形態では、非経口投与は注射による。注射物は、注射器またはポンプでで送達され得る。ある特定の実施形態では、注射はボーラス注射である。ある特定の実施形態では、注射は組織または器官に直接投与される。ある特定の実施形態では、注射は皮下注射である。
ある特定の併用療法
ある特定の実施形態では、本明細書に開示する修飾オリゴヌクレオチドを含む第１剤は１つ以上の第２の薬剤と同時投与される。ある特定の実施形態では、そのような第２剤を、本明細書に記載する第１剤と同じ疾患、障害または状態を処置するよう設計する。ある特定の実施形態では、そのような第２剤を、本明細書に記載する第１剤とは異なる疾患、障害、または状態を処置するよう設計する。ある特定の実施形態では、そのような第２剤を、本明細書に記載する１つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を治療するよう設計する。ある特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与して、第１剤の望ましくない作用を治療する。ある特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与して併用効果を生じさせる。ある特定の実施形態では、第２剤を第１剤と同時投与して相乗効果を生じさせる。
ある特定の実施形態では、第１剤及び１つ以上の第２剤を同時に投与する。ある特定の実施形態では、第１剤及び１つ以上の第２剤を異なる時間に投与する。ある特定の実施形態では、第１剤及び１つ以上の第２剤を併せて単一医薬製剤に調製する。ある特定の実施形態では、第１剤及び１つ以上の第２剤を別々に調製する。
ある特定の実施形態では、第２剤には、血糖降下剤または脂質低下剤が含まれるが、これに限定されない。血糖降下剤には、ライフスタイルの治療的変更、ＰＰＡＲ作動薬、ジペプチジルペプチダーゼ（ＩＶ）阻害剤、ＧＬＰ−１類似体、インスリン若しくはインスリン類似体、インスリン分泌促進物質、ＳＧＬＴ２阻害剤、ヒトのアミリン類似体、ビグアナイド、α−グルコシダーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。血糖降下剤には、メトホルミン、スルホニル尿素、ロシグリタゾン、メグリチニド、チアゾリジンジオン、α−グルコシダーゼ阻害剤またはその組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。スルホニル尿素は、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、またはグリクラジドであり得る。メグリチニドは、ナテグリニドまたはレパグリニドであり得る。チアゾリジンジオンは、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンであり得る。α−グルコシダーゼは、アカルボースまたはミグリトールであり得る。ある特定の実施形態において、脂質低下療法には、ライフスタイルの治療的変更、ナイアシン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、コレステロール吸収阻害剤、ＭＴＰ阻害剤（例えば、ＭＴＰを標的とする、低分子、ポリペプチド、抗体またはアンチセンス化合物）、フィブラート系薬、ＰＣＳＫ９阻害剤（例えば、ＰＣＳＫ９を標的とする、ＰＣＳＫ９抗体、ポリペプチド、低分子核酸化合物）、ＣＥＴＰ阻害剤（例えば、ＣＥＴＰを標的とする、トルセトラピブ及びアナセトラピブのような低分子、ポリペプチド、抗体または核酸化合物）、アポＣ-ＩＩＩ阻害剤（例えば、アポＣ-ＩＩＩを標的とする、低分子、ポリペプチド、抗体または核酸化合物）、アポＢ阻害剤（例えば、アポＢを標的とする、低分子、ポリペプチド、抗体または核酸化合物）、オメガ３脂肪酸に富む有益な油、オメガ３脂肪酸またはその任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤は、アトルバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン等であり得る。コレステロール吸収阻害剤は、エゼチミブであり得る。フィブラート系薬は、フェノフィブラート、ベザフィブラート、シプロフィブラート、クロフィブラート、ゲムフィブロジル等であり得る。オメガ３脂肪酸に富む有益な油は、オキアミ油、魚油（例えば、Ｖａｓｃｅｐａ（登録商標））、亜麻仁油等であり得る。オメガ３脂肪酸は、ＡＬＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ等であり得る。
ある特定の化合物
ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、先の公開に記載された（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１１／０８５２７１（公開日２０１１年７月１４日）を参照のこと）。かかる公開に記載のいくつかのオリゴヌクレオチド（２３３６７６、２３３６９０、２３３７１０、２３３７１７、２３３７２１、２３３７２２、３３７４５９、３３７４６０、３３７４７４、３３７４７７、３３７４７８、３３７４７９、３３７４８１、３３７４８４、３３７４８７、３３７４８８、３３７４９０、３３７４９１、３３７４９２、３３７４９７、３３７４９８、３３７５０３、３３７５０５、３３７５０６、３３７５０８、３３７５１３、３３７５１４、３３７５１６、３３７５２０、３３７５２１、３３７５２５、３３７５２６及び３３７５２８）は、生体外で最も強力であった１０のアンチセンス化合物も含めて、以下の、及びＵＳ６１／９２０，６５２号に記載するアンチセンス化合物を生体外スクリーニングで選択する際に全体を通して基準として使用した。ＷＯ２０１１／０８５２７１に記載された最も強力な化合物のうち、ＩＳＩＳ２３３７２２はそのＡＮＧＰＴＬ３阻害能が非常に多様であることがわかった。そのため、当初は生体外試験に組み入れられたが、後のさらなる試験には２３３７２２を基準として選択しなかった。先に同定された強力な生体外基準化合物のうち、５化合物（２３３７１０、２３３７１７、３３７４７７、３３７４７８、３３７４７９及び３３７４８７）を、下に記載のように、ｈｕＡＮＧＰＴＬ３トランスジェニックマウスでの生体内試験用に選択し、ヒトｍＲＮＡ転写産物及びタンパク質の発現を最も強力に抑制する化合物について調べた（実施例１２６）。初期に生体内でのＡＮＧＰＴＬ３レベル抑制能が最も高かったアンチセンスオリゴヌクレオチド（２３３７１０）を、下に記載する新しいアンチセンス化合物の生体内試験の基準として使用した。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載するアンチセンス化合物は、ＷＯ２０１１／０８５２７１及びＵＳ６１／９２０，６５２に記載のアンチセンス化合物に比べ、１つ以上の特性が改善され有益である。これらの改善された特性を本明細書の実施例で示し、参照しやすいよう、それらの例の非網羅的な概要を下記に提供する。
本明細書に記載の最初のスクリーニングでは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とする、新たに設計した約３０００の５−１０−５ＭＯＥギャップマーアンチセンス化合物を、生体外でのヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する作用についてＨｅｐ３Ｂ細胞で試験した（実施例１１６）。先に設計されたいくつかのアンチセンス化合物（２３３７１７、３３７４８４、３３７４８７、３３７４９２及び３３７５１６）を選択試験における基準に使用して新アンチセンス化合物のｍＲＮＡ阻害レベルを評価した。この第１のスクリーニングの約３０００の新たに設計したアンチセンス化合物のうち、約８５のアンチセンス化合物を生体外での用量依存的阻害試験用に選択し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した（実施例１１７〜１１８）。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）について試験した約８５の新しいアンチセンス化合物のうち、強力な用量依存的ＡＮＧＰＴＬ３抑制を示した約３８のアンチセンス化合物を選択し、マウスにおける生体内での力価及び忍容性（ＡＬＴ及びＡＳＴ）試験（実施例１２６〜１２７）に供し、アンチセンス化合物２３３７１０を基準として使用した。
本明細書に記載の第２のスクリーニングでは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とする、ＭＯＥギャップマーモチーフまたは混合モチーフを有する約２０００の新たに設計したアンチセンス化合物（デオキシ、５−１０−５ＭＯＥ及びｃＥＴギャップマー）もまた、生体外でのヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する作用についてＨｅｐ３Ｂ細胞で試験した（実施例１１９〜１２１）。新アンチセンス化合物の阻害レベルを、先に設計したいくつかのアンチセンス化合物（２３３７１７、３３７４８７、３３７５１３、３３７５１４及び３３７５１６）を選択試験における基準として使用して評価した。この第２のスクリーニングの約２０００の新たに設計したアンチセンス化合物のうち、約１４７のアンチセンス化合物を生体外での用量依存的阻害試験用に選択し、その５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定した（実施例１２２〜１２５）。５０％阻害濃度（ＩＣ５０）について試験した約１４７の新しいアンチセンス化合物のうち、強力な用量依存的ＡＮＧＰＴＬ３抑制を示した約７３のアンチセンス化合物を選択し、マウスにおける生体内での力価及び忍容性（例えば、ＡＬＴ及びＡＳＴ）試験（実施例１２６〜１２７）に供し、アンチセンス化合物２３３７１０を基準として使用した。
力価及び忍容性についてマウスで試験した、スクリーニング１及びスクリーニング２から得た約１１１のアンチセンス化合物のうち、２４化合物を選択し、マウスにおけるより広範な忍容性試験に供して、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルブミン及びビリルビンのような肝臓代謝マーカー、並びに、ＢＵＮ及びクレアチニンといった腎臓の代謝マーカー、及び臓器重量を評価した（実施例１２７）。
生体内でのマウスを用いた試験と並行して、１７のアンチセンス化合物を、粘度試験用に選択した（実施例１２８）。一般に、粘度が至適ではないアンチセンス化合物はその後の試験には使用しなかった。
マウスでの忍容性試験の結果に基づき、２０のアンチセンス化合物を選択し、ラットにおける生体内での忍容性試験に供した（実施例１２９）。ラットでは、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルブミン及びビリルビンのような肝臓の代謝マーカー、体重及び臓器重量、並びに、ＢＵＮ、クレアチニン及び総タンパク質／クレアチニン比のような腎臓の代謝マーカーを測定し、生体内における化合物の忍容性を決定した。
ラットで試験した２０のアンチセンス化合物を、アカゲザルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子配列との交差反応性についても評価した（実施例１３０）。本試験のアンチセンス化合物は、カニクイザルでも試験を行ったが、完全長化合物の配列と比較するためのカニクイザルＡＮＧＰＴＬ３配列を入手できなかったため、アンチセンス化合物の配列を密接に関連するアカゲザルの配列と比較した。８のアンチセンス化合物の配列は、アカゲザルＡＮＧＰＴＬ３遺伝子配列と０〜２つのミスマッチがあることがわかり、それらをカニクイザルにおいてさらに試験した（実施例１３０）。上記の８のアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ５６３５８０、ＩＳＩＳ５６０４００、ＩＳＩＳ５６７３２０、ＩＳＩＳ５６７３２１、ＩＳＩＳ５４４１９９、ＩＳＩＳ５６７２３３、ＩＳＩＳ５６１０１１及びＩＳＩＳ５５９２７７）を、したＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現の阻害、並びに忍容性についてサルを用いて試験した。忍容性試験では、体重、肝臓の代謝マーカー（ＡＬＴ、ＡＳＴ及びビリルビン）、腎臓の代謝マーカー（ＢＵＮ及びクレアチニン）、血液学パラメータ（血球数、ヘモグロビン及びヘマトクリット）、及び炎症誘発マーカー（ＣＲＰ及びＣ３）を測定した。さらに、肝臓及び腎臓中の完全長オリゴヌクレオチド濃度を測定し、腎臓／肝臓の完全長オリゴヌクレオチドの比を計算した。
カニクイザルで評価した、強力かつ忍容性のあるアンチセンス化合物ＩＳＩＳ５６３５８０の配列を、実施例１１３〜１１５及び１３１に示すように、ＧａｌＮＡｃの共役及び／または変更を用いて骨格化学をさらに修飾し、力価の増加について評価した。
したがって、本明細書では、任意の改善された特徴を１つ以上有する、例えば、ＷＯ２０１１／０８５２７１及びＵＳ６１／９２０，６５２号に記載のアンチセンス化合物に比べて改善されているアンチセンス化合物が提供される。ある特定の実施形態では、配列番号１〜２のどちらかのヌクレオチドの領域を標的とするか、またはそれと特異的にハイブリダイズ可能な本明細書に記載の修飾オリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物がここに提供される。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３発現を阻害する効力があることから、有効である。ある特定の実施形態では、化合物または組成物は、ＡＮＧＰＴＬ３を少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、ヒトの細胞、例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞株で試験した場合に生体外でのＩＣ５０が２０μＭ未満、１０μＭ未満、８μＭ未満、５μＭ未満、２μＭ未満、１μＭ未満、０．９μＭ未満、０．８μＭ未満、０．７μＭ未満、０．６μＭ未満、または０．５μＭ未満である（実施例１１７〜１１８及び１２２〜１２５に記載）ことから、有効である。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜１．０μＭであり、これには、配列番号１５、２０、２４、３４、３５、３６、３７、４２、４３、４４、４７、５０、５１、５７、５８、６０、７７、７９、８２、８７、８８、９０、９１、９３、９４、１００、１０１、１０４、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１６９、１７０、１７７、１８８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、及び２３２が含まれる。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜０．９μＭであり、これには、配列番号１５、２０、３５、３６、４２、４３、４４、５０、５７、６０、７７、７９、８７、８８、９０、９１、９３、９４、１０１、１０４、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１７７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、及び２３２が含まれる。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜０．８μＭであり、これには、配列番号１５、２０、３５、３６、４２、４３、４４、５０、５７、６０、７７、７９、８７、８８、９０、９１、９３、９４、１０１、１０４、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１７７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、及び２３２が含まれる。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜０．７μＭであり、これには、配列番号１５、２０、３６、４２、４３、５７、６０、１１４、１１７、１２７、１３１、１７７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、及び２３２が含まれる。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜０．６μＭであり、これには、配列番号１５、２０、３６、４２、４３、５７、６０、１１４、１１７、１２７、１３１、１７７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２４、２２５、２２８、２２９、２３０、２３１、及び２３２が含まれる。ある特定の実施形態では、好ましいアンチセンス化合物は、ＩＣ５０＜０．５μＭであり、これには、配列番号４３、１１４、１１７、１２７、１３１、１７７、２０９、２１０、２１１、２１２、２１５、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２９、２３０、及び２３２が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、アッセイで測定した場合に、粘度が４０ｃＰ未満、３５ｃＰ未満、３０ｃＰ未満、２５ｃＰ未満、２０ｃＰ未満、１５ｃＰ未満、または１０ｃＰ未満である（実施例１２８に記載）ことから、有効である。粘度が４０ｃＰより大きいオリゴヌクレオチドは、至適粘度に満たないと考えられる。ある特定の実施形態では、粘度が２０ｃＰ未満である好ましいアンチセンス化合物には、配列番号１６、１８、２０、３４、３５、３６、３８、４９、７７、９０、９３、及び９４が含まれる。ある特定の実施形態では、粘度が１５ｃＰ未満である好ましいアンチセンス化合物には、配列番号１６、１８、２０、３４、３５、３８、４９、９０、９３、及び９４が含まれる。ある特定の実施形態では、粘度が１０ｃＰ未満である好ましいアンチセンス化合物には、配列番号１８、３４、３５、４９、９０、９３、及び９４が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、各実施例に記載の生体内忍容性測定で実証されるように、忍容性が高い。ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、食塩水で処置した動物と比較して、ＡＬＴ値及び／またはＡＳＴ値の上昇が３倍を超えない、２倍を超えない、または１．５倍を超えないことから実証されるように、忍容性が高い。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する特定のアンチセンス化合物は、阻害力価５０％超、生体外でのＩＣ５０が１μＭ未満、粘度２０ｃＰ未満、及び３倍を超えないＡＬＴ及び／またはＡＳＴの上昇、のうち１つ以上を有することから、有効である。
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ５６３５８０（配列番号７７）が好ましい。この化合物は、ＡＮＧＰＴＬ３トランスジェニックマウスにおいて強力な阻害剤であり、最も忍容性が高いアンチセンス化合物であることがわかった。この化合物は、生体外において、許容される粘度が約１６．８３ｃＰ、ＩＣ５０値＜０．８μＭであった。マウスでは、食塩水で処置した動物と比較して、ＡＬＴ及び／またはＡＳＴレベルの上昇は３倍をこえないものであった。また、サルでは、ＡＮＧＰＴＬ３阻害において最も忍容性が高く、かつ、強力な化合物の１つであり、完全長オリゴヌクレオチド濃度比が最高であった。
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ５４４１９９（配列番号２０）が好ましい。この化合物は、強力かつ忍容性のあるアンチセンス化合物であることがわかった。この化合物は、生体外において、許容される粘度が１．７ｃＰ、ＩＣ５０値＜０．５μＭであった。マウスでは、食塩水で処置した動物と比較して、ＡＬＴ及び／またはＡＳＴレベルの上昇は３倍を超えないものであった。また、サルでは、ＡＮＧＰＴＬ３阻害において最も強力な化合物の１つであり、完全長オリゴヌクレオチド濃度比が良好であった。
ある特定の実施形態では、ＩＳＩＳ５５９２７７（配列番号１１０）が好ましい。この化合物は、強力かつ忍容性のあるアンチセンス化合物であることがわかった。この化合物は生体外においてＩＣ５０値＜０．８μＭであった。マウスでは、食塩水で処置した動物と比較して、ＡＬＴ及び／またはＡＳＴレベルの上昇は３倍を超えないものであった。また、サルでは、ＡＮＧＰＴＬ３阻害において最も強力な化合物の１つであり、完全長オリゴヌクレオチド濃度比が良好であった。
ある特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ共役アンチセンス化合物ＩＳＩＳ６５８５０１（配列番号４９１２）が好ましい。このアンチセンス化合物は、阻害レベルで示されるように、その親化合物ＩＳＩＳ５６３５８０（配列番号７７）よりもさらに強力であることがわかった。
ある特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ共役アンチセンス化合物ＩＳＩＳ７０３８０１（配列番号７７）が好ましい。このアンチセンス化合物は、その親化合物ＩＳＩＳ５６３５８０（配列番号７７）よりも数倍さらに強力であることがわかった。ＩＳＩＳ７０３８０１はＩＤ５０値が１であり、一方、ＩＳＩＳ５６３５８０はＩＤ５０値が６であった。
ある特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃ共役アンチセンス化合物ＩＳＩＳ７０３８０２（配列番号７７）が好ましい。このアンチセンス化合物は、その親化合物ＩＳＩＳ５６３５８０（配列番号７７）よりも数倍さらに強力であることがわかった。ＩＳＩＳ７０３８０２はＩＤ５０値が０．３であり、一方、ＩＳＩＳ５６３５８０はＩＤ５０値が６であった。
以下の実施例は、本開示のある特定の実施形態を例証するものであり、限定するものではない。さらに、具体的実施形態を記載する場合、本発明者らは、それらの具体的実施形態の一般的応用を企図している。例えば、ある特定モチーフを有するオリゴヌクレオチドの開示は、そのモチーフまたは同様のモチーフを有する他のオリゴヌクレオチドについて合理的な裏付けを提供する。同様に、例えば、ある特定の高親和性修飾がある特定位置に見られる場合は、特に明記しない限り、同じ位置での他の高親和性修飾も好適であるとみなされる。
実施例１：ホスホラミダイト（化合物１、１ａ、及び２）の調製のための一般的方法
化合物１、１ａ、及び２それぞれを、本明細書に記載する当技術分野で周知の手順どおりに調製した（Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，２１（４），１１２２−１１２５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，７５（５），１５６９−１５８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，２００８，５２（１），５５３−５５４），並びに、公開されたＰＣＴ国際出願（ＷＯ２０１１／１１５８１８，ＷＯ２０１０／０７７５７８，ＷＯ２０１０／０３６６９８，ＷＯ２００９／１４３３６９，ＷＯ２００９／００６４７８，及びＷＯ２００７／０９００７１）、及び米国特許第７，５６９，６８６号も参照のこと）。
実施例２：化合物７の調製
化合物３（２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−β−Ｄガラクトピラノースまたはガラクトサミンペンタアセテート）は、市販されている。化合物５を、公開されている手順（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，３４，２６９２）にしたがって調製した。
実施例３：化合物１１の調製
化合物８及び９は市販されている。
実施例４：化合物１８の調製
化合物１１を、実施例３に例示される手順に従い調製した。化合物１４は市販されている。化合物１７を、Ｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００４，４７，５７９８−５８０８により報告されている同様の手順を使用して調製した。
実施例５：化合物２３の調製
化合物１９及び２１は市販されている。
実施例６：化合物２４の調製
化合物１８及び２３を、実施例４及び５に例示される手順に従い調製した。
実施例７：化合物２５の調製
化合物２４を、実施例６に例示される手順に従い調製した。
実施例８：化合物２６の調製
化合物２４を、実施例６に例示される手順に従い調製する。
実施例９：３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物２９）の一般的調製
ここで、保護されたＧａｌＮＡｃ３−１は構造
を有する。
共役ＧａｌＮＡｃ３−１（ＧａｌＮＡｃ３−１ａ）のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基をうることができる。ここで、ＧａｌＮＡｃ３−１ａは式
を有する。
固体支持体に結合された保護ＧａｌＮＡｃ３−１（化合物２５）を実施例７に例示される手順に従い調製した。３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１を含むオリゴマー化合物２９を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１及び１ａ）を実施例１に例示される手順どおりに調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて所定の配列及び組成物を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例示されるホスホラミダイトは代表例であり、限定することを意図しない。固体支持体に加えるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップト（ｇａｐｐｅｄ）オリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される所定の組成及び塩基配列を有し得る。
実施例１０：５’末端にＧａｌＮＡｃ３−１を含む共役ＡＳＯ（化合物３４）の一般的調製
Ｕｎｙｌｉｎｋｅｒ（商標）３０は市販されている。５’末端にＧａｌＮＡｃ３−１クラスターを含むオリゴマー化合物３４を、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成における標準的手順を用いて調製する（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト構築ブロック（化合物１及び１ａ）を実施例１に例示される手順に従い調製した。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて所定の配列及び組成物を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例示されるホスホラミダイトは代表例であり、限定することを意図しない。固体支持体に加えるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。そのようなギャップトオリゴマー化合物は、任意の所与の標的によって指示される所定の組成及び塩基配列を有し得る。
実施例１１：化合物３９の調製
化合物４、１３及び２３を、実施例２、４、及び５に例示される手順に従い調製した。化合物３５を、Ｒｏｕｃｈａｕｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，１２，２３４６−２３５３に公開されている同様の手順を使用して調製する。
実施例１２：化合物４０の調製
化合物３８を、実施例１１に例示される手順に従い調製する。
実施例１３：化合物４４の調製
化合物２３及び３６を、実施例５及び１１に例示される手順に従い調製する。化合物４１を、ＷＯ２００９０８２６０７に公開されている同様の手順を使用して調製する。
実施例１４：化合物４５の調製
化合物４３を、実施例１３に例示される手順に従い調製する。
実施例１５：化合物４７の調製
化合物４６は市販されている。
実施例１６：化合物５３の調製
化合物４８及び４９は市販されている。化合物１７及び４７を、実施例４及び１５に例示される手順に従い調製する。
実施例１７：化合物５４の調製
化合物５３を、実施例１６に例示される手順に従い調製する。
実施例１８：化合物５５の調製
化合物５３を、実施例１６に例示される手順に従い調製する。
実施例１９：固相技法による３’位にＧａｌＮＡｃ３−１を含む共役ＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ６４７５３５、６４７５３６、及び６５１９００の調製）
特に明記しない限り、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、及びｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。無水アセトニトリルに溶解させたホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−ＭＯＥに用いた。
ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＡｅＫＴＡオリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）で、カラムに充填したＧａｌＮＡｃ３−１負荷ＶＩＭＡＤ固体支持体（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）でのホスホラミダイトカップリング法によりＡＳＯ合成を実施した。このカップリングステップでは、固体支持体の負荷量に対して４倍過剰量のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイト縮合を１０分間行った。他のすべてのステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエンに溶解させたジクロロ酢酸６％溶液を使用して、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメチルトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）含有無水ＣＨ３ＣＮを活性化剤として用いた。ホスホロチオエート結合は、１：１のピリジン／ＣＨ３ＣＮ中で３分間接触させキサンタンヒドリド０．１Ｍ溶液を用いた硫化によって導入した。６％の水を含有する２０％ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド含有ＣＨ３ＣＮ溶液を酸化剤として用い、接触時間１２分でホスホジエステルヌクレオシド間結合を得た。
所望の配列が組み立てられた後、トリエチルアミンとアセトニトリルの１：１（ｖ／ｖ）混合物を接触時間４５分で用いて、シアノエチルホスフェート保護基を脱保護した。固体支持体に結合したＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。
その後、結合が解かれたＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝１００ｍＭ酢酸アンモニウム含有３０％水性ＣＨ３ＣＮ、Ｂ＝１．５Ｍ ＮａＢｒ含有Ａ、６０分でＢの０〜４０％、流量１４ｍＬ／分−１、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラムでのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。
当技術分野で周知の標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて共役体を含まないアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。
これらの方法を用いて、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個の別個のアンチセンス化合物を調製した。下記表１７に要約されるように、ＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３個のアンチセンス化合物はそれぞれ、同一の核酸塩基配列を有し、ＩＳＩＳ３０４８０１は、すべてがホスホロチオエート結合である５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、ＩＳＩＳ６４７５３５は、ＧａｌＮＡｃ３−１がその３’末端に共役していること以外はＩＳＩＳ３０４８０１と同一であり、ＩＳＩＳ６４７５３６は、特定のヌクレオシド間結合がホスホジエステル結合であること以外はＩＳＩＳ６４７５３５と同一であった。表１７にさらに要約されるように、ＳＲＢ−１を標的とする２つの別個のアンチセンス化合物を合成した。ＩＳＩＳ４４０７６２は、すべてがホスホロチオエートヌクレオシド間結合である２−１０−２ ｃＥｔギャップマーであり、ＩＳＩＳ６５１９００は、その３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１が含まれること以外は、ＩＳＩＳ４４０７６２と同一であった。
配列番号。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ３−１」は、先の実施例９に示された構造を有する共役基を示す。ＧａｌＮＡｃ３−１は、ＡＳＯを共役体の残りの部分と連結する切断可能なアデノシンを含み、これを「ＧａｌＮＡｃ３−１ａ」と指定することに留意されたい。上述の表ではこの命名法を用いて、共役体の一部であるアデノシンを含む完全核酸塩基配列を示す。したがって、上述の表において、「Ａｄｏ」を省略して「ＧａｌＮＡｃ３−１」で終了する配列を列記することもできる。切断可能なヌクレオシドまたは切断可能部分を欠く共役基の部分を示すために下付き文字「ａ」を用いるというこの慣例は、これらの実施形態全体を通して用いられる。切断可能部分を欠く共役基のこの部分は、本明細書において「クラスター」または「共役クラスター」または「ＧａｌＮＡｃ３クラスター」と称される。ある特定の事例では、ある共役基を、そのクラスター及びその切断可能部分を別々に提供することによって説明することが好都合である。
実施例２０：ｈｕＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスにおけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩの用量依存的アンチセンス阻害
ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする上述のＩＳＩＳ３０４８０１及びＩＳＩＳ６４７５３５を、そのヒトＡｐｏＣ ＩＩＩ阻害能について、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスで用量依存的試験を行い、別々に検討し評価した。
処置
ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期で維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験食餌を自由に摂食させた。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。注射用にＡＳＯを０．９％ＰＢＳに溶解させた。
ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、ＩＳＩＳ３０４８０１若しくは６４７５３５を、０．０８、０．２５、０．７５、２．２５、若しくは６．７５μｍｏｌ／ｋｇで、または対照としてＰＢＳを、週１回２週間、腹腔内注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終用量投与から４８時間後に各マウスの血液を採取し、マウスを屠殺して組織を収集した。
ＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡ分析
標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いてマウスの肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化する前に、トータルＲＮＡに対するＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）決定した。下記の結果は、ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化された、処置群ごとのＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表記される。各ＡＳＯの５０％有効量（ＥＤ５０）も下記表１８に示される。
例示されるように、両アンチセンス化合物ともＰＢＳ対照に比べてＡｐｏＣ ＩＩＩ ＲＮＡを減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１に共役させたアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）よりもさらに強力であった。
ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析（比濁アッセイ）
２０１３年３月２９日の出版前にオンラインで公開されたＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈによって報告された手順を用いて、血漿ＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質分析を行った。
マウスから単離した血漿約１００μlを希釈せずにＯｌｙｍｐｕｓ臨床分析装置及び市販の比濁ＡｐｏＣ ＩＩＩアッセイ（Ｋａｍｉｙａ、カタログ番号ＫＡＩ−００６、Ｋａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を用いて分析した。アッセイプロトコルを供給業者による記載のとおりに実施した。
下記表１９に示すように、両アンチセンス化合物ともＰＢＳ対照に比べてＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質を減少させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１に結合したアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）より実質的にさらに強力であった。
血漿トリグリセリド及びコレステロールをＢｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒの方法（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ． ａｎｄ Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１−９１７，１９５９）を用いて抽出し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ臨床分析装置及び市販の試薬を用いて測定した。
ＰＢＳを注入したマウスと比べたトリグリセリドレベルを測定し、「％ＰＢＳ」で表記する。結果を表２０に提示する。例示されるように、両アンチセンス化合物ともトリグリセリド値を低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１に結合したアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）より実質的にさらに強力であった。
血漿試料をＨＰＬＣによって分析して、総コレステロールの量及びコレステロールの異なる画分（ＨＤＬ及びＬＤＬ）の量を決定した。結果を表２１及び２２に提示する。例示されるように、両アンチセンス化合物とも、総コレステロール値を低下させ、ＬＤＬを低下させ、またＨＤＬを上昇させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１に結合したアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３５）は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）より実質的にさらに強力であった。ＨＤＬレベルの上昇とＬＤＬレベルの低下は、ＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害が心血管に与える有益な効果である。
薬物動態分析（ＰＫ）
ＡＳＯのＰＫも評価した。肝臓及び腎臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。試料をＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳを利用するＭＳＤ１で分析した。完全長ＩＳＩＳ３０４８０１及び６４７５３５の組織濃度（μｇ／ｇ）を測定した結果を表２３に提供する。総完全長アンチセンス化合物の肝臓濃度は、これら２つのアンチセンス化合物と同様であった。したがって、ＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物は、肝臓でより活性ではあるが（上述のＲＮＡ及びタンパク質データによる実証のとおり）、肝臓内で実質的に高い濃度では存在しない。実際、計算したＥＣ５０（表２３に提供）は、共役化合物の力価で観察された増加が蓄積増加に完全に起因するわけではないことを裏付けている。この結果から、共役体は、肝臓蓄積単独以外の機序、おそらくアンチセンス化合物の細胞内への生産的取り込みを改善することによって、力価を改善したことが示唆される。
また、結果は、腎臓におけるＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物の濃度が、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くアンチセンス化合物の濃度よりも低いことも示している。このことには、有益な治療的意味が複数ある。腎臓における活性が求められていない治療的適応の場合、腎臓への曝露には、腎毒性のリスクがあり、それに見合う利益がない。さらに、腎臓における高濃度は、典型的には、尿への化合物の損失をもたらし、その結果、クリアランスが速くなる。したがって、腎臓以外の標的には腎臓蓄積は望ましくない。これらのデータは、ＧａｌＮＡｃ３−１共役が腎臓蓄積を抑制することを示唆している。
ＩＳＩＳ６４７５３５の代謝物も同定し、それらの質量を高分解能質量分析によって確認した。観察された代謝物の切断部位及び構造を以下に示する。標準的手順を用いて完全長ＡＳＯの相対％を計算した結果を表２３ａに提示する。ＩＳＩＳ６４７５３５の主な代謝物は、全共役体を欠く完全長ＡＳＯ（すなわち、ＩＳＩＳ３０４８０１）であったが、これは、以下に示す切断部位Ａにおける切断の結果である。さらに、他の切断部位に由来するさらなる代謝物も観察された。これらの結果は、細胞内の酵素によって切断されうるか、またはサイトゾルの還元環境下で切断されうるか、またはエンドソーム及びリソソーム内の酸性ｐＨに対して不安定である、他の切断可能な結合，例えば、エステル結合、ペプチド結合、ジスルフィド結合、ホスホラミデート結合、またはアシルヒドラゾン結合をＧａｌＮＡｃ３−１糖とＡＳＯとの間に導入することも有用であってよいことを示唆している。
実施例２１：ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスでの単回投与試験におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩのアンチセンス阻害
それぞれヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする表１７に記載のＩＳＩＳ３０４８０１、６４７５３５、及び６４７５３６を、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを阻害するそれらの能力について、ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスでの単回投与試験においてさらに評価した。
処置
ヒトＡｐｏＣＩＩＩトランスジェニックマウスを１２時間の明暗周期で維持し、Ｔｅｋｌａｄ実験動物用固形飼料を自由に摂食させた。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。ＡＳＯをＰＢＳ中に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。注射用にＡＳＯを０．９％ＰＢＳに溶解させた。
ヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウスに、下記に示す用量のＩＳＩＳ３０４８０１、６４７５３５、若しくは６４７５３６（上述）、または対照処置のＰＢＳを腹腔内に１回注入した。処置群は３匹の動物で構成され、対照群は４匹の動物で構成された。処置前及び最終投与後にそれぞれのマウスの血液を採取し、血漿試料を分析した。最終投与後から７２時間後マウスを屠殺した。
試料を収集、分析して、肝臓におけるＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル、血漿トリグリセリド、並びにＨＤＬ及びＬＤＬ画分などのコレステロールを決定し、上述（実施例２０）のように評価した。それらの解析データを下記表２４〜２８に提示する。生理食塩水を注入したマウスと比べた、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわちアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴ濃度から、アンチセンス化合物は、いずれの投与量においても忍容性が良好であることが示された。
これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）と比較して、３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を含むアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３５及び６４７５３６）の力価が改善されていることを示す。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体及びいくつかのホスホジエステル結合を含むＩＳＩＳ６４７５３６は、同一の共役体を含み、かつＡＳＯ内の全ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合であるＩＳＩＳ６４７５３５と同程度に強力であった。
これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体がアンチセンス化合物の力価を改善することを裏付けている。これらの結果はまた、アンチセンスオリゴヌクレオチドが複数種の結合を有するＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６４７５３６：６個のホスホジエステル結合を有する）と、同一アンチセンス化合物の全結合がホスホロチオエート結合であるバージョン（ＩＳＩＳ６４７５３５）とは力価が同等であることも示している。
ホスホロチオエート結合により、いくつかの特性がアンチセンス化合物に与えられる。例えば、これらは、ヌクレアーゼ消化に抵抗してタンパク質を結合し、腎臓／尿にではなく、むしろ肝臓に化合物を蓄積させる。これらは、肝臓内の適応を治療する際に特に望ましい特性である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は炎症反応とも関連している。したがって、化合物内のホスホロチオエート結合の数を減らすことで炎症のリスクが低下すると予想されるが、肝臓中の化合物濃度も低下させ、腎臓及び尿中での濃度を上昇させ、ヌクレアーゼ存在下での安定性を低下させるとともに、全体の力価を低下させる。本結果では、ある特定のホスホロチオエート結合をホスホジエステル結合で置換したＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物は、全結合がホスホロチオエート結合であるＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物と同程度に肝臓内の標的に対して強力であることが示されている。こうした化合物は炎症誘発性が低いと予想される（ＰＳの減少が炎症作用低下をもたらすことを示す実験を記載する実施例２４を参照のこと）。
実施例２２：ＳＲＢ−１を標的とするＧａｌＮＡｃ３−１共役修飾ＡＳＯの生体内での作用
それぞれＳＲＢ−１を標的とする表１７に記載のＩＳＩＳ４４０７６２及び６５１９００を、ＳＲＢ−１を阻害するそれらの能力についてＢａｌｂ／ｃマウスで用量依存的試験にて評価した。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ４４０７６２、６５１９００、または対照処置のＰＢＳを１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から４８時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓におけるＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化する前に、トータルＲＮＡに対するＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）決定した。下記の結果は、ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表記される。
表２９に例示されるように、両アンチセンス化合物ともＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。さらに、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体（ＩＳＩＳ６５１９００）を含むアンチセンス化合物は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ４４０７６２）より実質的にさらに強力であった。これらの結果は、異なる標的に相補的であり、かつ異なる化学修飾ヌクレオシドを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体の力価有益性が観察されることを実証しており、この事例では、修飾ヌクレオシドは、拘束エチル糖部分（二環式糖部分）を含んでいる。
実施例２３：ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）アッセイ操作手順
ＢＤ Ｖａｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴチューブ法を用いてｈＰＢＭＣアッセイを実施した。ＵＳ ＨｅａｌｔｈＷｏｒｋｓ ｃｌｉｎｉｃ（Ｆａｒａｄａｙ ＆ Ｅｌ Ｃａｍｉｎｏ Ｒｅａｌ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）においてインフォームドコンセントを得た志願ドナー由来の全血試料を得て、４〜１５個のＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＣＰＴ８ｍＬチューブ（ＶＷＲカタログ番号ＢＤ３６２７５３）内に収集した。ＰＢＭＣアッセイデータシートを用いて、各ドナーのＣＰＴチューブ内の開始時総全血量の近似値を記録した。
遠心分離の直前に、チューブを８〜１０回、穏やかに反転させて血液試料を再度混合した。ＣＰＴチューブを、水平（スイングアウト）ローター内で、室温（１８〜２５℃）にて３０分間、ブレーキをかけずに１５００〜１８００ＲＣＦで遠心分離した（２７００ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）。細胞を（Ｆｉｃｏｌｌとポリマーゲル層との間の）バフィーコート界面から回収し、５０ｍＬの滅菌コニカルチューブに移し、最大５個のＣＰＴチューブ／５０ｍＬコニカルチューブ／ドナーをプールした。その後、細胞をＰＢＳ（Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋不含、ＧＩＢＣＯ）で２回洗浄した。チューブを最大５０ｍＬまで満たし、数回反転させて混合した。その後、試料を、室温にて１５分間、３３０×ｇで遠心分離し（１２１５ＲＰＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ）、ペレットを乱すことなくできるだけ多くの上清を吸引した。チューブを穏やかに回転させて細胞ペレットを取り除き、細胞をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（約１ｍＬ／１０ｍＬの開始時全血量）中に再懸濁させた。６０μＬの試料を、６００μＬのＶｅｒｓａＬｙｓｅ試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ０９７７７）の入った試料バイアル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にピペット注入し、１０〜１５秒間穏やかにボルテックスした。試料を室温で１０分間インキュベートし、計数前に再度混合した。ＰＢＭＣ細胞型を用いたＶｉｃｅｌｌ ＸＲ細胞生存率分析器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞懸濁液を計数した（１：１１の希釈倍率を他のパラメータと共に保存した）。１ｍＬ当りの生細胞数及び生存率を記録した。細胞懸濁液をＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中に１×１０７生存ＰＢＭＣ／ｍＬとなるよう希釈した。
細胞を９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ）の５０μＬ／ウェル中に５×１０５でプレーティングした。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ中に希釈した２倍濃度のオリゴ／対照の５０μＬ／ウェルを実験テンプレートに従って添加した（合計１００μＬ／ウェル）。プレートを振盪器に設置し、約１分間混合させた。３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、プレートを４００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、ＭＳＤサイトカインアッセイ（すなわち、ヒトＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、及びＭＣＰ−１）用に上清を除去した。
実施例２４：ｈＰＢＭＣアッセイにおけるＧａｌＮＡｃ３−１共役ＡＳＯの炎症誘発作用の評価
表３０に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を、炎症誘発作用について、実施例２３に記載の操作手順を用いてｈＰＢＭＣアッセイで評価した。ＩＳＩＳ３５３５１２は、このアッセイにおいてＩＬ−６放出に対する高レスポンダーであることが既知の内部標準物である。ｈＰＢＭＣを新鮮な志願ドナーから単離し、それらを濃度０、０．０１２８、０．０６４、０．３２、１．６、８、４０、及び２００μＭのＡＳＯで処理した。処理から２４時間後、サイトカインレベルを測定した。
ＩＬ−６のレベルを主要測定値として用いた。標準的手順を用いてＥＣ５０及びＥｍａｘを計算した。結果は、２ドナーから得たＥｍａｘ／ＥＣ５０の平均比率として表され、「Ｅｍａｘ／ＥＣ５０」で表記される。より低い比率は、炎症誘発応答の相対的低下を示し、より高い比率は、炎症誘発応答の相対的増加を示す。
各検体化合物では、炎症誘発性が最も低い化合物は、ＰＳ／ＰＯ連結ＡＳＯ（ＩＳＩＳ６１６４６８）であった。ＧａｌＮＡｃ３−１共役ＡＳＯであるＩＳＩＳ６４７５３５は、その非共役ＡＳＯであるＩＳＩＳ３０４８０１よりもわずかに炎症誘発性が低かった。これらの結果は、ＰＯ結合をいくつか組み込むと炎症誘発反応は低下し、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体の付加により化合物の炎症誘発性が高まることはないため、炎症誘発応答を低下させうることを示している。したがって、ＰＳ／ＰＯ混合型結合及びＧａｌＮＡｃ３−１共役体の両方を含むアンチセンス化合物は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役体の有無にかかわらず、全結合がＰＳ結合のアンチセンス化合物と比べて、炎症誘発応答が低くなると予測するであろう。これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役アンチセンス化合物、特にＰＳ含有量の少ないものは炎症誘発性がより低いことを示している。
総合すると、これらの結果は、ＧａｌＮＡｃ３−１共役化合物、特にＰＳ含有量を減らしたものは、全結合がＰＳ結合であるＧａｌＮＡｃ３−１共役体を欠くアンチセンス化合物より高い用量で投与可能であることを示唆している。これらの化合物の半減期は実質的に異ならないと予想されるため、そのような高用量の投与により投与頻度が低くなるであろう。事実、そのような投与は頻度がさらに低くなる可能性があり、その理由として、ＧａｌＮＡｃ３−１共役化合物の方が強力であり（実施例２０〜２２を参照のこと）、また、化合物の濃度が、力価に基づく所望のレベルを下回った時に再投与すればよいことが挙げられる。
下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「Ａｄｏ’−ＧａｌＮＡｃ３−１ａ」は、実施例９に示す構造ＧａｌＮＡｃ３−１を有し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合されている共役体を示す。
実施例２５：生体外におけるヒトＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とするＧａｌＮＡｃ３−１共役修飾ＡＳＯの効果
上述のＩＳＩＳ３０４８０１及び６４７５３５を生体外で試験した。密度２５，０００細胞／ウェルのトランスジェニックマウス由来初代肝細胞を、濃度の０．０３，０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、及び２０μｍの修飾オリゴヌクレオチドで処理した。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定し、ｈＡｐｏＣ ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをＲＩＢＯＧＲＥＥＮで測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。
標準的方法を用いてＩＣ５０を計算し、結果を表３２に提示する。対照ＩＳＩＳ３０４８０１と比較して、同程度の力価がＩＳＩＳ６４７５３５で処理した細胞において観察された。
この実験では、生体外において、生体内で観察されるＧａｌＮＡｃ３−１共役の大きな力価有益性は観察されなかった。その後の、生体外における初代肝細胞の自由取り込み実験では、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドと比較して、さまざまなＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの力価増加が示された（実施例６０、８２、及び９２を参照のこと）。
実施例２６：ＡｐｏＣ ＩＩＩ ＡＳＯ活性に対するＰＯ／ＰＳ結合の効果
ＩＳＩＳ３０４８０１若しくはＩＳＩＳ６１６４６８（両方ともに上述）のヒトＡｐｏＣ ＩＩＩトランスジェニックマウス、または対照にはＰＢＳ処置、２５ｍｇ／ｋｇで週１回２週間、腹腔内注入した。処置群は３匹の動物で構成され、対照群は４匹の動物で構成された。処置前及び最終投与後にそれぞれのマウスの血液を採取し、血漿試料を分析した。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。
試料を収集して分析し、肝臓内のＡｐｏＣ ＩＩＩタンパク質レベルを上記のように（実施例２０）決定した。それらの解析データを下記表３３に提示する。
これらの結果は、完全ＰＳ化合物（ＩＳＩＳ３０４８０１）と比較して、ウィングにＰＯ／ＰＳを有するアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ６１６４６８）の力価減少を示している。
実施例２７：化合物５６
化合物５６は、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されており、または公開されているＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された手順に従って調製してよい。
実施例２８：化合物６０の調製
化合物４を、実施例２に例示される手順に従い調製した。化合物５７は市販されている。化合物６０を構造分析で確認した。
他の単保護された置換または非置換アルキルジオール、例えば、限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて、所定の組成を有するホスホラミダイトを調製することができるため、化合物５７は代表例であり、限定することを意図しない。
実施例２９：化合物６３の調製
化合物６１及び６２を、Ｔｏｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，３，５６６−５７７、及びＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００７，６３（１９），３９８２−３９８８によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
別法として、化合物６３を、科学文献及び特許第文献（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００３，１２，１８３８−１８４０、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．、公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ２００４０６３２０８）に報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３０：化合物６３ｂの調製
化合物６３ａを、Ｈａｎｅｓｓｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，７４（９），１７３１−１７３７によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３１：化合物６３ｄの調製
化合物６３ｃを、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，９（５），４５１−４５３によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
実施例３２：化合物６７の調製
化合物６４を、実施例２に例示される手順に従い調製した。化合物６５を、Ｏｒ ｅｔ ａｌ．の公開されたＰＣＴ国際出願ＷＯ２００９／００３００９によって報告された手順と同様の手順を用いて調製する。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物６５に用いた保護基は代表例であり，限定することを意図しない
実施例３３：化合物７０の調製
化合物６４を、実施例２に例示される手順に従い調製した。化合物６８は市販されている。他の保護基、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いることができるため、化合物６８に用いた保護基は代表例であり，限定することを意図しない
実施例３４：化合物７５ａの調製
化合物７５を、公開されているＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された手順にしたがって調製する。
実施例３５：化合物７９の調製
化合物７６を、公開されているＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４によって報告された手順にしたがって調製した。
実施例３６：化合物７９ａの調製
化合物７７を、実施例３５に例示される手順に従い調製する。
実施例３７：固体支持体による５’末端にホスホジエステル連結ＧａｌＮＡｃ３−２共役体を含む共役オリゴマー化合物８２の調製のための一般的方法（方法Ｉ）
式中、ＧａｌＮＡｃ３−２は構造、
を有する。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−２のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−２ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ここで、ＧａｌＮＡｃ３−２ａは式
を有する。
ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成の標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ホスホラミダイト化合物５６及び６０をそれぞれ、実施例２７及び２８に例示される手順に従い調製した。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて、５’末端にホスホジエステル結合共役基を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例示のホスホラミダイトは代表例であり、限定することを意図ない。固体支持体に加えるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の所定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例３８：５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体を含むオリゴマー化合物８２の調製のための代替方法（方法ＩＩ）
ＶＩＭＡＤ結合オリゴマー化合物７９ｂを、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成の標準的手順を用いて調製した（Ｄｕｐｏｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．，２００６，４５，３６２３−３６２７を参照のこと）。ＧａｌＮＡｃ３−２クラスターホスホラミダイトである化合物７９を、実施例３５に例示される手順に従い調製した。この代替方法により、合成の最終ステップで、ホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体をオリゴマー化合物にワンステップで導入できる。他のホスホラミダイト構築ブロック、例えば限定するわけではないが、本明細書に提示されるものを用いて５’末端にホスホジエステル共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例示のホスホラミダイトは代表例であり，限定することを意図しない、固体支持体に加えるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、本明細書に記載するギャップトオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例３９：固体支持体による、５’末端にＧａｌＮＡｃ３−３共役体（５’末端結合用にＧａｌＮＡｃ３−１を修飾したもの）を含むオリゴマー化合物８３ｈの調製のための一般的方法
化合物１８を、実施例４に例示される手順に従い調製した。化合物８３ａ及び８３ｂは市販されている。ホスホジエステル結合ヘキシルアミンを含むオリゴマー化合物８３ｅを標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて調製した。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理することにより５’−ＧａｌＮＡｃ３−３共役オリゴマー化合物（８３ｈ）を得た。
ここで、ＧａｌＮＡｃ３−３は構造
を有する。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−３のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−３ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ここで、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは式
を有する。
実施例４０：固体支持体による３’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−４共役体を含むオリゴマー化合物８９の調製のための一般的方法
ここで、ＧａｌＮＡｃ３−４は構造
を有し、ここで、ＣＭは切断可能部分である。ある特定の実施形態では、切断可能部分は
である。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−４のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−４ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ここで、ＧａｌＮＡｃ３−４ａは式
を有する。
保護されたＵｎｙｌｉｎｋｅｒ機能化固体支持体化合物３０は市販されている。化合物８４を、文献（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５（２２），４４４７−４４５４；Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，２７，３０３５−３０４１；及びＨｏｒｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５，４８４２−４８４９を参照のこと）に報告された手順と同様の手順を用いて調製する。
ホスホラミダイト構築ブロックである化合物６０及び７９ａを、実施例２８及び３６に例示される手順に従い調製する。他のホスホラミダイト構築ブロックを用いて、既定の配列及び組成を有する３’末端にホスホジエステル結合共役体を有するオリゴマー化合物を調製することができるため、例示されるホスホラミダイトは代表例であり、限定することを意図しない。固体支持体に加えるホスホラミダイトの順序及び量を調整して、任意の所定の配列及び組成を有する本明細書に記載するオリゴマー化合物を調製することができる。
実施例４１：固相技法による５’位にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２（Ｂｘがアデニンである実施例３７を参照のこと）共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ６６１１３４の調製）
特に明記しない限り、オリゴマー化合物の合成に用いるすべての試薬及び溶液を商業的供給源から購入する。標準のホスホラミダイト構築ブロック及び固体支持体を、例えば、Ｔ、Ａ、Ｇ、及びｍＣ残基を含む、ヌクレオシド残基の組み込みのために用いる。ホスホラミダイト化合物５６及び６０を使用して、５’末端のホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体を合成した。無水アセトニトリルに溶解させたホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液をβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシド及び２’−ＭＯＥに用いた。
ＡＢＩ ３９４合成装置（１〜２μｍｏｌの規模）またはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ
［注：Ａｅはアクセントの付いたＡ］オリゴパイロット合成装置（４０〜２００μｍｏｌの規模）で、カラムに充填したＶＩＭＡＤ固体支持体でのホスホラミダイトカップリング法（１１０μｍｏｌ／ｇ、Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００３）により、ＡＳＯ合成を実施した。このカップリングステップでは、固体支持体の初期負荷量に対して４倍過剰量のホスホラミダイトを送達し、ホスホラミダイトカップリングを１０分間行った。他のすべてのステップは、製造業者から提供された標準のプロトコルに従った。トルエンに溶解させたジクロロ酢酸６％溶液を使用して、ヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基からジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基を除去した。カップリングステップ中、４，５−ジシアノイミダゾール（０．７Ｍ）含有無水ＣＨ３ＣＮを活性化剤として使用した。ホスホロチオエート結合は、１：１のピリジン／ＣＨ３ＣＮ中で３分間接触させキサンタンヒドリド０．１Ｍ溶液を用いた硫化によって導入した。６％の水を含有する２０％ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド含有ＣＨ３ＣＮ溶液を酸化剤として用い、接触時間１２分でホスホジエステルヌクレオシド間結合を得た。
所望の配列が組み立てられた後、トルエンに溶解させた２０％ジエチルアミン（ｖ／ｖ）を接触時間４５分で用いて、シアノエチルホスフェート保護基を脱保護した。固体支持体に結合したＡＳＯをアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で６時間加熱した。その後、結合が解かれたＡＳＯを濾過し、アンモニアを沸去した。残渣を強アニオン交換カラムでの高圧液体クロマトグラフィーによって精製した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｒｃｅ ３０Ｑ、３０μｍ、２．５４×８ｃｍ、Ａ＝１００ｍＭ酢酸アンモニウム含有３０％水性ＣＨ３ＣＮ、Ｂ＝１．５Ｍ ＮａＢｒ含有Ａ、６０分でＢの０〜４０％、流量１４ｍＬ／分−１、λ＝２６０ｎｍ）。残渣を逆相カラムでのＨＰＬＣにより脱塩して、固体支持体への初期負荷量に基づいて１５〜３０％の単離収率で所望のＡＳＯを得た。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。
下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ３二環式ヌクレオシド（例えば、ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。ＧａｌＮＡｃ３−２ａの構造を実施例３７に示す。
実施例４２：固相技法による５’位にＧａｌＮＡｃ３−３共役体を含むＡＳＯの調製のための一般的方法（ＩＳＩＳ６６１１６６の調製）
実施例３９及び４１に例示の手順と同様の手順を使用してＩＳＩＳ６６１１６６の合成を実施した。
ＩＳＩＳ６６１１６６は５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、その５’位にＧａｌＮＡｃ３−３共役体を含む。ＡＳＯを、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＭＳＤシステムを用いたイオン対ＨＰＬＣ／ＭＳ分析によって特徴付けた。
下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「５’−ＧａｌＮＡｃ３−３ａ」の構造を実施例３９に示す。
実施例４３：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’末端でのホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２（Ｂｘがアデニンである実施例３７及び４１を参照のこと）の用量依存的試験
５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体を含むＩＳＩＳ６６１１３４（実施例４１を参照のこと）を、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害について、マウスでの用量依存的試験において試験した。非共役ＩＳＩＳ４４０７６２及び６５１９００（３’末端でのＧａｌＮＡｃ３−１共役体、実施例９を参照のこと）を比較対照用に試験に含めた。なお、これらは先の表１７に記載されている。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ４４０７６２、６５１９００、６６１１３４、または対照処置のＰＢＳを皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化する前に、トータルＲＮＡに対するＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）決定した。下記の結果は、ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表記される。ＥＤ５０ｓを、先に記載の方法と同様の方法を用いて測定し、以下に提示する。
表３５に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。事実、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体（ＩＳＩＳ６６１１３４）または３’末端に連結されたＧａｌＮＡｃ３−１共役体（ＩＳＩＳ６５１９００）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４４０７６２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体を含むＩＳＩＳ６６１１３４は、３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を含むＩＳＩＳ６５１９００と比較して、等効力であった。
３’ＧａｌＮＡｃ３−１及び５’ＧａｌＮＡｃ３−２の構造は先の実施例９及び３７において記載した。
薬物動態分析（ＰＫ）
高用量群（７ｍｇ／ｋｇ）のＡＳＯのＰＫを調べ、実施例２０に例示の方法と同一の方法で評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出した。６６１１３４（５’ＧａｌＮＡｃ３−２）及びＩＳＩＳ６５１９００（３’ＧａｌＮＡｃ３−１）の完全長代謝物を同定し、それらの質量を高分解能質量分析によって確認した。結果から、５’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−２共役体（ＩＳＩＳ６６１１３４）を含むＡＳＯで検出された主な代謝物は、ＩＳＩＳ４４０７６２（データ示さず）であることが示された。検出可能レベルでは、それ以外の代謝物は観察されなかった。３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ６５１９００）では、もう一方の被験ＡＳＯとは異なり、先の表２３ａに報告された代謝物と同様のさらなる代謝物が観察された。これらの結果は、ホスホジエステル結合したＧａｌＮＡｃ３−１共役体またはＧａｌＮＡｃ３−２共役体を有していると、その力価を損なうことなくＡＳＯのＰＫプロファイルが改善されうることを示唆している。
実施例４４：ＳＲＢ−１を標的とする３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体（実施例９を参照のこと）を含むＡＳＯのアンチセンス阻害に対するＰＯ／ＰＳ結合の効果
３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするＩＳＩＳ６５５８６１及び６５５８６２を、ＳＲＢ−１阻害能について、マウスでの単回投与試験において試験した。非共役の親化合物ＩＳＩＳ３５３３８２を比較のために試験に含めた。
ＡＳＯは５−１０−５ＭＯＥギャップマーであり、そのギャップ領域は１０個の２’−デオキシリボヌクレオシドを含み、各ウィング領域は５個の２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを含む。先の実施例１９に例示の方法と同様の方法を用いて調製したＡＳＯを以下の表３６に示す。
下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。上付き文字「ｍ」は、５−メチルシトシンを示す。「ＧａｌＮＡｃ３−１」の構造を実施例９に示す。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ３５３３８２、６５５８６１、６５５８６２、または対照処置のＰＢＳを１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。処置前及び最終投与後にそれぞれのマウスの血液を採取し、血漿試料を分析した。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化する前に、トータルＲＮＡに対するＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎを用いて）決定した。下記の結果は、ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示され、「％ＰＢＳ」で表記される。ＥＤ５０ｓを先に記載の方法と同様の方法を用いて測定し、それらを以下に報告する。
表３７に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ処置した対照と比較して、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。事実、３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６５５８６１及び６５５８６２）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２）と比較して、力価の大幅な改善を示した。さらに、ＰＳ／ＰＯ混合型結合を有するＩＳＩＳ６５５８６２は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ６５５８６１）と比較して、力価の改善を示した。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。臓器重量も評価した。結果から、ＡＳＯで処理したマウスでは、ＰＢＳ対照と比較して、トランスアミナーゼレベル（表３８）も臓器重量（データ示さず）も上昇が観察されなかったことが示された。さらに、ＰＳ／ＰＯ混合型結合を有するＡＳＯ（ＩＳＩＳ６５５８６２）は、完全ＰＳ（ＩＳＩＳ６５５８６１）と比較して、同様のトランスアミナーゼレベルを示した。
実施例４５：ＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）の調製
化合物４（９．５ｇ、２８．８ｍｍｏｌｅ）を化合物１０３ａまたは１０３ｂ（３８ｍｍｏｌｅ）で個別に処理し、ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＴＭＳＯＴｆ（０．５当量）及びモレキュラーシーブで処理し、室温で１６時間撹拌した。その時点で、有機層をセライトを通してろ過し、その後、炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。その後、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で還元させた。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、化合物１０４ａ及び１０４ｂを収率８０％超で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０４ａ及び１０４ｂを１００ａ−ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、化合物１０５ａ及び１０５ｂを収率９０％超で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０５ａ及び１０５ｂを、化合物９０１ａ−ｄと同一の条件で、化合物９０を用いて個々別々に処理して、化合物１０６ａ（８０％）及び１０６ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０６ａ及び１０６ｂを９６ａ−ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、１０７ａ（６０％）及び１０７ｂ（２０％）を得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０７ａ及び１０７ｂを９７ａ−ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、化合物１０８ａ及び１０８ｂを収率４０〜６０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０８ａ（６０％）及び１０８ｂ（４０％）を１００ａ−ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、化合物１０９ａ及び１０９ｂを収率８０％超で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０９ａを化合物１０１ａ−ｄ（実施例４７）と同一の条件で処理して、化合物１１０ａを収率３０〜６０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。別法として、化合物１１０ｂは、化合物１０９ｂで開始して同様の方法で調製可能である。
実施例４６：ＰＦＰエステル（オリゴヌクレオチド１１１）との共役のための一般的手順、ＩＳＩＳ６６６８８１（ＧａｌＮＡｃ３−１０）の調製
標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを合成し、精製した。５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドを０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）に溶解させ、ＤＭＳＯ（５０μＬ）に溶解させた選択されたＰＦＰエステル化ＧａｌＮＡｃ３クラスター３当量を添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈降した場合は、ＰＦＰエステルがすべて溶解するまでＤＭＳＯを添加した。反応は、室温で約１６時間混合後に完了した。得られた溶液を水で希釈して１２ｍＬとし、その後、質量カットオフ３０００Ｄａのスピンフィルター内で３０００ｒｐｍにて遠心にかけた。このプロセスを２回繰り返し、低分子の不純物を除去した。次いで、溶液を凍結乾燥乾固させてから濃縮アンモニア水に再溶解させ、室温で２．５時間混合した後、減圧濃縮してアンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製及び脱塩し、凍結乾燥させてＧａｌＮＡｃ３共役オリゴヌクレオチドを得た。
オリゴヌクレオチド１１１をＧａｌＮＡｃ３−１０と共役させる。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１０のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１０ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分は、下記ＧａｌＮＡｃ３−１０を用いて合成されたオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６６６８８１）に示すような−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１０（ＧａｌＮＡｃ３−１０ａ−ＣＭ-）の構造を下記に示す
この一般的手順に従って、ＩＳＩＳ６６６８８１を調製した。標準の固相オリゴヌクレオチド手順を用いて、５’−ヘキシルアミノ修飾オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ６６０２５４を合成し、精製した。ＩＳＩＳ６６０２５４（４０ｍｇ、５．２μｍｏｌ）を０．１Ｍ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５、２００μＬ）に溶解させ、ＤＭＳＯ（５０μＬ）に溶解させたＰＦＰエステル（化合物１１０ａ）３当量を添加した。ＡＳＯ溶液への添加時にＰＦＰエステルが沈降し、ＰＦＰエステルが完全に溶解するまでＤＭＳＯ（６００μＬ）をさらに必要とした。反応は、室温で１６時間混合後に完了した。溶液を水で希釈して総容積１２ｍＬとし、質量カットオフ３０００Ｄａのスピンフィルター内で３０００ｒｐｍにて遠心にかけた。このプロセスを２回繰り返し、低分子の不純物を除去した。溶液を凍結乾燥乾固させてから濃縮アンモニア水に再溶解させ、室温で２．５時間混合した後、減圧濃縮してアンモニアの大部分を除去した。共役オリゴヌクレオチドをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製及び脱塩し、凍結乾燥させて、ＩＳＩＳ６６６８８１を収率９０％重量（４２ｍｇ、４．７μｍｏｌ）で得た。
ＧａｌＮＡｃ３−１０共役オリゴヌクレオチド
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字にしている。
実施例４７：ＧａｌＮＡｃ３−８を含むオリゴヌクレオチド１０２の調製
三酸９０（４ｇ、１４．４３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２０ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）に溶解させた。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（８．９ｍＬ、５２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌させた。Ｂｏｃ−ジアミン９１ａまたは９１ｂ（６８．８７ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１２．３５ｍＬ、７２ｍｍｏｌｅ）とともに添加し、反応物を室温で１６時間撹拌させた。その時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量した後、混合物をジクロロメタンに溶解させた。有機層を炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。次いで、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた減圧下で濾過及び減量を行い油とした。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィー（２％→１０％メタノール／ジクロロメタン）で精製し、化合物９２ａ及び９２ｂを収率約８０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物９２ａまたは９２ｂ（６．７ｍｍｏｌｅ）を、２０ｍＬのジクロロメタン及び２０ｍＬのトリフルオロ酢酸で室温にて１６時間処理した。得られた溶液を蒸発させ、その後、メタノール中に溶解させてＤＯＷＥＸ−ＯＨ樹脂で３０分間処理した。得られた溶液を減圧下で濾過及び減量して油とし、化合物９３ａ及び９３ｂを収率８５〜９０％で得た。
化合物７または６４（９．６ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させたＨＢＴＵ（３．７ｇ、９．６ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）で１５分間処理した。これに、化合物９３ａまたは９３ｂ（３ｍｍｏｌｅ）いずれかを添加し、室温で１６時間撹拌した。その時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量した後、混合物をジクロロメタンに溶解させた。有機層を炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。次いで、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた減圧下で濾過及び減量を行い油とした。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）、化合物９６ａ〜ｄを収率２０〜４０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物９６ａ〜ｄ（０．７５ｍｍｏｌｅ）を、個々別々に、エタノール（７５ｍＬ）中のラネーニッケル上で３時間、水素化した。セライトを通して触媒をろ去し、エタノールを減圧下で除去して、化合物９７ａ〜ｄを収率８０〜９０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物２３（０．３２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させたＨＢＴＵ（０．２ｇ、０．５３ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．１９ｍＬ、１．１４ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．３８ｍｍｏｌｅ）を個々別々に添加し、室温で１６時間撹拌した。その時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量した後、混合物をジクロロメタンに溶解させた。有機層を炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。次いで、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた減圧下で濾過及び減量を行い油とした。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（２％→２０％メタノール／ジクロロメタン）、化合物９８ａ〜ｄを収率３０〜４０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物９９（０．１７ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）を、ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させたＨＢＴＵ（０．２９ｇ、０．７６ｍｍｏｌｅ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ、２．０ｍｍｏｌｅ）で１５分間処理した。これに、化合物９７ａ〜ｄ（０．５１ｍｍｏｌｅ）を個々別々に添加し、室温で１６時間撹拌した。その時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量した後、混合物をジクロロメタンに溶解させた。有機層を炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。次いで、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた減圧下で濾過及び減量を行い油とした。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（５％→２０％メタノール／ジクロロメタン）、化合物１００ａ〜ｄを収率４０〜６０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１００ａ〜ｄ（０．１６ｍｍｏｌｅ）を、個々別々に、メタノール／酢酸エチル（１：１、５０ｍＬ）中の１０％Ｐｄ（ＯＨ）２／Ｃ上で３時間水素化した。その時点で、セライトを通して触媒をろ去し、有機物を減圧下で除去して化合物１０１ａ〜ｄを収率８０〜９０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物１０１ａ〜ｄ（０．１５ｍｍｏｌｅ）を、個々別々に、ＤＭＦ（１５ｍＬ）及びピリジン（０．０１６ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）に溶解させた。トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（０．０３４ｍＬ、０．２ｍｍｏｌｅ）をアルゴン下で滴加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。その時点で、ＤＭＦを減圧下で７５％超、減量した後、混合物をジクロロメタンに溶解させた。有機層を炭酸水素ナトリウム、水及びブラインで洗浄した。次いで、有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた減圧下で濾過及び減量を行い油とした。生じた油をシリカゲルクロマトグラフィーで精製し（２％→５％メタノール／ジクロロメタン）、化合物１０２ａ〜ｄを収率約８０％で得た。ＬＣＭＳ及びプロトンＮＭＲは、その構造と一致した。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−８を含むオリゴマー化合物１０２を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−８のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−８ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。好ましい実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。
ＧａｌＮＡｃ３−８（ＧａｌＮＡｃ３−８ａ−ＣＭ-）の構造を下記に示す
実施例４８：ＧａｌＮＡｃ３−７を含むオリゴヌクレオチド１１９の調製
化合物１１２を、文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載の手順に従って合成した。
化合物１１２（５ｇ、８．６ｍｍｏｌ）を、１：１メタノール／酢酸エチル（２２ｍＬ／２２ｍＬ）に溶解させた。炭素上の水酸化パラジウム（０．５ｇ）を添加した。反応混合物を水素下で室温にて１２時間撹拌した。セライトパッドを通して反応混合物を濾過し、そのパッドを１：１メタノール／酢酸エチルで洗浄した。濾液と洗液を合わせ、濃縮乾固させて、化合物１０５ａ（定量的）を得た。構造をＬＣＭＳによって確認した。
化合物１１３（１．２５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．２ｇ、８．４ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２．８ｍＬ、１６．２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１７ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させた化合物１０５ａ（３．７７ｇ、８．４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、油を得た。残渣を、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解させ、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、１０〜２０％ＭｅＯＨ含有ジクロロメタンで溶出させて化合物１１４（１．４５ｇ、３０％）を得た。構造をＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。
化合物１１４（１．４３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を、１：１メタノール／酢酸エチル（４ｍＬ／４ｍＬ）に溶解させた。パラジウム炭素（湿性、０．１４ｇ）を添加した。反応混合物に水素を流し、水素下で室温にて１２時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドを通してろ過した。セライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液及び洗液を合わせて減圧下で蒸発させ化合物１１５（定量的）を得た。構造をＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。
化合物８３ａ（０．１７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３１ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦに溶解させた化合物１１５（１．２２ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させてろ過した。有機層を濃縮乾固させ、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、３〜１５％ＭｅＯＨ含有ジクロロメタンで溶出させて化合物１１６（０．８４ｇ、６１％）を得た。構造をＬＣ ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。
化合物１１６（０．７４ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、１：１メタノール／酢酸エチル（５ｍＬ／５ｍＬ）に溶解させた。パラジウム炭素（湿性、０．０７４ｇ）を添加した。反応混合物に水素を流し、水素下で室温にて１２時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドを通してろ過した。セライトパッドをメタノール／酢酸エチル（１：１）で洗浄した。濾液及び洗液を合わせて減圧下で蒸発させ化合物１１７（０．７３ｇ、９８％）を得た。構造をＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。
化合物１１７（０．６３ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。この溶液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）及びトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル（７２μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に注いだ。混合物をジクロロメタンで抽出し、ブラインで洗浄してから無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。ジクロロメタン溶液を濃縮乾固させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５〜１０％ＭｅＯＨ含有ジクロロメタンで溶出させて化合物１１８（０．５１ｇ、７９％）を得た。この構造を、ＬＣＭＳと、１Ｈ並びに１Ｈ及び１９Ｆ ＮＭＲによって確認した。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−７を含むオリゴマー化合物１１９を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−７のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−７ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。
ＧａｌＮＡｃ３−７（ＧａｌＮＡｃ３−７ａ−ＣＭ-）の構造を下記に示す
実施例４９：ＧａｌＮＡｃ３−５を含むオリゴヌクレオチド１３２の調製
化合物１２０（１４．０１ｇ、４０ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（１４．０６ｇ、３７ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（８０ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（１１．２ｍＬ、８０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷却し、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させた化合物１２１（１０ｇ、ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。さらなるトリエチルアミン（４．５ｍＬ、３２．２８ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物をアルゴン雰囲気下で１８時間撹拌した。ＴＬＣ（１：１の酢酸エチル：ヘキサン；Ｒｆ＝０．４７）によって反応を監視した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）中に取り込み、１Ｍ ＮａＨＳＯ４（３×１５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＳＯ３水溶液（３×１５０ｍＬ）、及びブライン（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。乾燥剤をろ去し、有機層をロータリーエバポレーションにより濃縮した。粗混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、３５〜５０％ＥｔＯＡｃ含有ヘキサンを用いて溶出させて化合物１２２（１５．５０ｇ、７８．１３％）を得た。構造をＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。質量（ｍ／ｚ）５８９．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
水（２０ｍＬ）及びＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解させたＬｉＯＨ（９２．１５ｍｍｏｌ）の溶液を、メタノール（１５ｍＬ）に溶解させた化合物１２２の冷溶液（７．７５ｇ、１３．１６ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を室温で４５分間撹拌し、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン；１：１）によって監視した。反応混合物を減圧下で濃縮し、容積を半分にした。残りの溶液を氷浴中で冷却して、濃縮ＨＣｌを添加して中和した。反応混合物を希釈し、ＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で抽出してブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。エマルジョン生じたが、一晩静置すると濁りがなくなった。有機層を分離し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、蒸発させて化合物１２３（８．４２ｇ）を得た。質量が大きすぎる原因はおそらく残留塩である。ＬＣＭＳは、構造と一致した。この生成物を、それ以上精製せずに使用した。Ｍ．Ｗ．計算値：５７４．３６；Ｍ.Ｗ．実測値：５７５．３［Ｍ＋Ｈ］＋。
化合物１２６を、文献（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，９５８−９６３）に記載の手順に従って合成した。
化合物１２３（７．４１９ｇ、１２．９１ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（３．４９ｇ、２５．８２ｍｍｏｌ）及び化合物１２６（６．３３ｇ、１６．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、得られた反応混合物を氷浴中で冷却した。これに、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（４．４２ｍＬ、２５．８２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢｏｐ（８．７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、続いて、Ｂｏｐカップリング試薬（１．１７ｇ、２．６６ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で添加した。氷浴を除去し、溶液を室温まで温めた。ＴＬＣ（８９：１０：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡＡ）で測定したところ、反応は１時間後に完了していた。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）に溶解させ、１Ｍ ＮａＨＳＯ４（３ｘ１００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３ｘ１００ｍＬ）及びブライン（２ｘ１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過して濃縮した。残渣を５０％ヘキサン／ＥｔＯＡＣ：１００％ＥｔＯＡｃの勾配でのシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色の泡状物として化合物１２７（９．４ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）７７８．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
トリフルオロ酢酸（１２ｍＬ）をジクロロメタン（１２ｍＬ）に溶解させた化合物１２７（１．５７ｇ、２．０２ｍｍｏｌ）溶液に添加し、室温で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下でトルエン（３０ｍＬ）と共に共蒸発乾固させた。得られた残渣をアセトニトリル（３０ｍＬ）及びトルエン（４０ｍＬ）を用いて共蒸発させ、トリフルオロ酢酸塩として化合物１２８（１．６７ｇ）を得て、それ以上精製せずに次のステップに使用した。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）４７８．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
丸底フラスコ内で、化合物７（０．４３ｇ、０．９６３ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（０．３５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、及びＨＯＡｔ（０．０３５ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を一つに合わせ、減圧下、Ｐ２Ｏ５上で４時間乾燥させた後、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させて５分間撹拌した。これに、無水ＤＭＦ（０．２ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ）に溶解させた化合物１２８（０．２０ｇ、０．２６ｍｍｏｌ）溶液を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で室温にて撹拌した。ＬＣＭＳ及びＴＬＣ（７％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で測定したところ、反応は３０分後に完了していた。反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、ＤＣＭ（３０ｍＬ）に溶解させ、１Ｍ ＮａＨＳＯ４（３ｘ２０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（３×２０ｍＬ）水溶液及びブライン（３ｘ２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して濃縮した。残渣を、５〜１５％ＭｅＯＨ含有ジクロロメタンを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物１２９（９６．６ｍｇ）を得た。ＬＣ ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）８８３．４［Ｍ＋２Ｈ］＋。
化合物１２９（０．０９ｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を、２０ｍＬシンチレーションバイアルに入れたメタノール（５ｍＬ）に溶解させた。これに、少量の１０％Ｐｄ／Ｃ（０．０１５ｍｇ）を添加し、反応容器をＨ２ガスで洗い流した。反応混合物をＨ２雰囲気下、室温で１８時間撹拌した。反応混合物をセライトのパッドを通してろ過し、そのセライトパッドをメタノールで洗浄した。濾液と洗液を合わせてプールし、減圧下で濃縮して化合物１３０（０．０８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、構造と一致した。この生成物を、それ以上精製せずに使用した。質量（ｍ／ｚ）８３８．３［Ｍ＋２Ｈ］＋。
１０ｍＬの目盛り付き丸底フラスコに、化合物１３０（７５．８ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）、０．３７Ｍピリジン／ＤＭＦ（２００μＬ）、及び撹拌子を加えた。この溶液に、０．７Ｍトリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル／ＤＭＦ（１００μＬ）を撹拌しながら滴加した。ＬＣ ＭＳで測定したところ、反応は１時間後に完了していた。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨＣｌ３（約１０ｍＬ）に溶解させた。有機層を、ＮａＨＳＯ４（１Ｍ、１０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）、及びブライン（１０ｍＬ）について、３回ずつ分配した。有機相を分離し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、化合物１３１（７７．７ｍｇ）を得た。ＬＣＭＳは、構造と一致した。それ以上精製せずに使用した。質量（ｍ／ｚ）９２１．３［Ｍ＋２Ｈ］＋。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−５を含むオリゴマー化合物１３２を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−５のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−５ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。
ＧａｌＮＡｃ３−５（ＧａｌＮＡｃ３−５ａ−ＣＭ-）の構造を下記に示す
実施例５０：ＧａｌＮＡｃ４−１１を含むオリゴヌクレオチド１４４の調製
化合物１３４の合成。
メリフィールドフラスコ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｆｌａｓｋ）に、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジクロロメタン、及びアセトニトリルで洗浄したアミノメチルＶＩＭＡＤ樹脂（２．５ｇ、４５０μｍｏｌ／ｇ）を添加した。この樹脂は、アセトニトリル（４ｍＬ）中で膨潤した。化合物１３３を、１００ｍＬの丸底フラスコ内で、２０（１．０ｍｍｏｌ、０．７４７ｇ）、ＴＢＴＵ（１．０ｍｍｏｌ、０．３２１ｇ）、アセトニトリル（５ｍＬ）、及びＤＩＥＡ（３．０ｍｍｏｌ、０．５ｍＬ）を添加して事前に活性化させた。この溶液を５分間撹拌し、次いで、振盪しながらメリフィールドフラスコ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ｆｌａｓｋ）に添加した。懸濁液を３時間振盪させた。反応混合物を排出し、樹脂をアセトニトリル、ＤＭＦ、及びＤＣＭで洗浄した。ＤＣＭ中のＤＭＴカチオンの吸光度を５００ｎｍ（消光係数＝７６０００）で測定することにより新たな樹脂負荷量を定量し、２３８μｍｏｌ／ｇであると決定した。樹脂を、無水酢酸溶液中に１０分間ずつ３回懸濁させることによりキャップした。
反復Ｆｍｏｃベース固相ペプチド合成法を用いて、固体支持体に結合された化合物１４１を合成した。少量の固体支持体を回収し、アンモニア水（２８〜３０重量％）中に６時間懸濁した。切断された化合物をＬＣ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量は、その構造と一致した。質量（ｍ／ｚ）１０６３．８［Ｍ＋２Ｈ］＋。
固体支持体に結合された化合物１４２を固相ペプチド合成法を用いて合成した。
ＤＮＡ合成装置の標準的な固相合成を用いて、固体支持体に結合された化合物１４３を合成した。
固体支持体に結合された化合物１４３をアンモニア水（２８〜３０重量％）中に懸濁し、５５℃で１６時間加熱した。溶液を冷却し、固体支持体をろ過した。残渣を水中に溶解させ、強アニオン交換カラム上でＨＰＬＣによって精製した。完全長化合物１４４を含有する画分を合わせてプールし、脱塩した。得られたＧａｌＮＡｃ４−１１共役オリゴマー化合物を、ＬＣ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量はその構造と一致した。
共役基ＧａｌＮＡｃ４−１１のＧａｌＮＡｃ４のクラスター部分（ＧａｌＮＡｃ４−１１ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。
ＧａｌＮＡｃ４−１１（ＧａｌＮＡｃ４−１１ａ−ＣＭ）の構造を下記に示す
実施例５１：ＧａｌＮＡｃ３−６を含むオリゴヌクレオチド１５５の調製
文献（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，２２９，５４−６０）に記載されるように、化合物１４６を合成した。
化合物４（１５ｇ、４５．５５ｍｍｏｌ）及び化合物３５ｂ（１４．３グラム、５７ｍｍｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）に溶解させた。活性化モレキュラーシーブ（４オングストローム、２ｇ、粉末）を添加し、反応物を窒素雰囲気下で３０分間撹拌した。ＴＭＳ−ＯＴｆを添加し（４．１ｍｌ、２２．７７ｍｍｏｌ）、反応物を室温で一晩撹拌した。完了時、粉砕した氷（約１５０ｇ）を入れた飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５００ｍｌ）を注いで反応物の反応を停止させた。有機層を分離しブラインで洗浄してからＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮してオレンジ色の油を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、２〜１０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させて化合物１１２（１６．５３ｇ、６３％）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、予想した化合物と一致した。
化合物１１２（４．２７ｇ、７．３５ｍｍｏｌ）を、１：１ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（４０ｍｌ）に溶解させた。反応混合物を、その溶液にアルゴン流を１５分間バブリングさせてパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム、４００ｍｇ）を添加し、この溶液を通して水素ガスを３０分間バブリングした。完了時（ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２）及びＬＣＭＳ）、触媒をセライトパッドに通してろ去した。濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮し、高真空下で短時間乾燥させたて化合物１０５ａ（３．２８ｇ）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、所望生成物と一致した。
化合物１４７（２．３１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３．９ｍＬ、２２ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＨＢＴＵ（４ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約１５分間撹拌した。これに、乾燥ＤＭＦに溶解させた化合物１０５ａ（３．３ｇ、７．４ｍｍｏｌ）溶液を添加し、窒素雰囲気下で２時間撹拌した。反応物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液及びブラインで洗浄した。有機相を分離して乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、濾過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。粗物質をカラムクロマトグラフィー（２〜５％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製し、化合物１４８（３．４４ｇ、７３％）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、予想した生成物と一致した。
化合物１４８（３．３ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を、１：１ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（７５ｍｌ）に溶解させた。反応混合物を、この溶液にアルゴン流を１５分間バブリングして通しパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（３５０ｍｇ）。この溶液に水素ガスを３０分間バブリングして通した。完了時（ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ含有ＤＣＭ）、及びＬＣＭＳ）、触媒をセライトパッドに通してろ去した。濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて化合物１４９（２．６ｇ）を得た。ＬＣＭＳは所望の生成物と一致した。残渣を、乾燥ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解させ、直ちに次のステップで使用した。
化合物１４６（０．６８ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（２０ｍｌ）に溶解させた。これに、ＤＩＥＡ（４５０μＬ、２．６ｍｍｏｌ、１．５当量）及びＨＢＴＵ（１．９６ｇ、０．５.２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で室温にて１５分間撹拌した。無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させた化合物１４９（２．６ｇ）の溶液を添加した。反応物のｐＨを、ＤＩＥＡを添加することにより（必要に応じて）にｐＨ＝９〜１０に調整した。反応物を窒素下で室温にて２時間撹拌した。完了時、反応物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、２〜１０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させて化合物１５０（０．６２ｇ、２０％）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。
化合物１５０（０．６２ｇ）を、１：１ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（５Ｌ）に溶解させた。反応混合物を、この溶液にアルゴン流を１５分間バブリングして通しパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（６０ｍｇ）。この溶液に水素ガスを３０分間バブリングして通した。完了時（ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ含有ＤＣＭ）、及びＬＣＭＳ）、触媒をろ去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて化合物１５１（０．５７ｇ）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。生成物を、乾燥ＤＭＦ４ｍＬに溶解させ、直ちに次のステップで使用した。
化合物８３ａ（０．１１ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（７５μＬ、１ｍｍｏｌ）に溶解させ、ＰＦＰ-ＴＦＡ（９０μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物は、接触と同時に赤紫色になり、その後３０分間かけて徐々にオレンジ色になった。ＴＬＣ及びＬＣＭＳにより反応の進行を監視した。完了時（ＰＦＰエステル形成）、ＤＭＦに溶解させた化合物１５１（０．５７ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物のｐＨを、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを添加して（必要に応じて）ｐＨ＝９〜１０に調整した。反応混合物を窒素下で約３０分撹拌した。完了時、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（２〜１０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２）、化合物１５２（０．３５ｇ、５５％）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。
化合物１５２（０．３５ｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）を、１：１ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を、この溶液にアルゴン流を１５分間バブリングして通しパージした。パールマン触媒（炭素上の水酸化パラジウム）を添加した（３５ｍｇ）。この溶液に水素ガスを３０分間バブリングして通した。完了時（ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ含有ＤＣＭ）、及びＬＣＭＳ）、触媒をろ去した（シリンジチップＴｅｆｌｏｎフィルター、０．４５μｍ）。濾液をロータリーエバポレーションにより濃縮し、高真空下で短時間乾燥させて化合物１５３（０．３３ｇ、定量的）を得た。ＬＣＭＳは、所望の生成物と一致した。
化合物１５３（０．３３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を、窒素下で撹拌しながら無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解させた。これに、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（６５μＬ、０．３７ｍｍｏｌ）及びＰＦＰ-ＴＦＡ（３５μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を窒素下で約３０分撹拌した。反応混合物は、接触と同時に赤紫色になり、徐々にオレンジ色になった。Ｎ、−ジイソプロピルエチルアミンをさらに添加して、反応物混合物のｐＨをｐＨ＝９〜１０に維持した。ＴＬＣ及びＬＣＭＳによって反応の進行を監視した。完了時、溶媒の大部分を減圧下で除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈して飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄し、続いて、ブラインで洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過し、濃縮してオレンジ色のシロップを得た。残基をカラムクロマトグラフィーで精製し、２〜１０％ＭｅＯＨ含有ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させて化合物１５４（０．２９ｇ、７９％）を得た。ＬＣＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲは、所望の生成物と一致した。
共役基ＧａｌＮＡｃ３−６を含むオリゴマー化合物１５５を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−６のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−６ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。
ＧａｌＮＡｃ３−６（ＧａｌＮＡｃ３−６ａ−ＣＭ-）の構造を下記に示す
実施例５２：ＧａｌＮＡｃ３−９を含むオリゴヌクレオチド１６０の調製
化合物１５６を、文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ２００４，４７，５７９８−５８０８）に記載の手順に従って合成した。
化合物１５６、（１８．６０ｇ、２９．２８ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）に溶解させた。パラジウム炭素（６．１５ｇ、１０重量％、担持（乾燥ベース）、マトリックス炭素粉末、湿潤）を添加した。反応混合物を水素下で室温にて１８時間撹拌した。反応混合物をセライトパッドを通してろ過し、セライトパッドをメタノールで完全に洗浄した。合わせた濾液を洗浄し、濃縮乾固させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５〜１０％メタノール含有ジクロロメタンで溶出させて化合物１５７（１４．２６ｇ、８９％）を得た。質量（ｍ／ｚ）５４４．１［Ｍ−Ｈ］−。
化合物１５７（５ｇ、９．１７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（３０ｍＬ）に溶解させた。ＨＢＴＵ（３．６５ｇ、９．６１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（１３．７３ｍＬ、７８．８１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で５分間撹拌した。これに、化合物４７（２．９６ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応物を室温で８時間撹拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液に注いだ。混合物を、酢酸エチルで抽出し、有機層をブラインで洗浄して乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し蒸発させた。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５０％酢酸エチル含有ヘキサンで溶出させて化合物１５８（８．２５ｇ、７３．３％）を得た。構造を、ＭＳ及び１Ｈ ＮＭＲ分析によって確認した。
化合物１５８（７．２ｇ、７．６１ｍｍｏｌ）を減圧下でＰ２Ｏ５上で乾燥させた。乾燥させた化合物を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）に溶解させた。これに、１Ｈ−テトラゾール（０．４３ｇ、６．０９ｍｍｏｌ）及びＮ-メチルイミダゾール（０．３ｍＬ、３．８１ｍｍｏｌ）及び２-シアノエチル-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（３．６５ｍＬ、１１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で４時間撹拌したｔ。反応混合物を酢酸エチル（２００ｍＬ）で希釈した。反応混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３及びブラインで洗浄した。有機相を分離し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５０〜９０％酢酸エチル含有ヘキサンで溶出させて化合物１５９（７．８２ｇ、８０．５％）を得た。構造をＬＣＭＳ及び３１Ｐ ＮＭＲ分析によって確認した。
ＧａｌＮＡｃ３−９共役基を含むオリゴマー化合物１６０を標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて調製した。３単位の化合物１５９を固体支持体にカップリングさせ、その後、ヌクレオチドホスホラミダイトをカップリングさせた。保護されたオリゴマー化合物をアンモニア水で処理して化合物１６０を得た。共役基ＧａｌＮＡｃ３−９のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−９ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−９（ＧａｌＮＡｃ３−９ａ−ＣＭ）の構造を下記に示す
実施例５３：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ３−１ａ及びＧａｌＮＡｃ３−３ａ）の調製のための代替手順
ラクトン１６１を、ジアミノプロパン（３〜５当量）またはモノＢｏｃ保護ジアミノプロパン（１当量）と反応させてアルコール１６２ａまたは１６２ｂを得た。保護していないプロパンジアミンを上述の反応で用いた場合、過剰なジアミンを高真空下で蒸発させて除去し、ＣｂｚＣｌを用いて１６２ａ中の遊離アミノ基を保護して、カラムクロマトグラフィーにより精製後、１６２ｂを白色の固体として得た。アルコール１６２ｂをＴＭＳＯＴｆの存在下で化合物４とさらに反応させて１６３ａを得、これを、接触水素化を用いてＣｂｚ基を除去することにより、１６３ｂに変換した。ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル１６４を、三酸１１３（実施例４８を参照のこと）と、ＤＭＦ（０．１〜０．５Ｍ）に溶解させたＰＦＰＴＦＡ（３．５当量）及びピリジン（３．５当量）とを反応させて調製した。トリエステル１６４をアミン１６３ｂ（３〜４当量）及びＤＩＰＥＡ（３〜４当量）と直接反応させて、化合物１８を得た。上記方法により、中間体の精製が大幅に促進され、実施例４に記載の手順を用いて形成される副生成物の形成が最小限に抑えられる。
実施例５４：化合物１８（ＧａｌＮＡｃ３−１ａ及びＧａｌＮＡｃ３−３ａ）の調製のための代替手順
上記実施例５３に概説される手順を用いて酸１１３からトリＰＦＰエステル１６４を調製し、モノＢｏｃ保護ジアミンと反応させて、１６５を本質的に定量収率で得た。Ｂｏｃ基を塩酸またはトリフルオロ酢酸で除去してトリアミンを得、これをＤＩＰＥＡなどの好適な塩基の存在下でＰＦＰ活性化酸１６６と反応させて化合物１８を得た。
ＤＭＦに溶解させたＰＦＰＴＦＡ（１〜１．２当量）及びピリジン（１〜１．２当量）で処理することにより、ＰＦＰ保護Ｇａｌ−ＮＡｃ酸１６６を対応する酸から調製した。次いで、アセトニトリルと水に溶解させたＴＥＭＰＯ（０．２当量）及びＢＡＩＢを用いて酸化させることにより、前駆酸を対応するアルコールから調製した。先の実施例４７に記載される条件を用いて１，６−ヘキサンジオール（または１，５−ペンタンジオール若しくは他のｎ値の他のジオール）（２〜４当量）及びＴＭＳＯＴｆと反応させることにより、前駆アルコールを糖中間体４から調製した。
実施例５５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ３−１、３、８及び９の比較）
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。非共役ＩＳＩＳ３５３３８２を標準物として含めた。多様なＧａｌＮＡｃ３共役基の各々を、さまざまなＧａｌＮＡｃ３共役基のそれぞれは、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）により、それぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端のいずれかで結合させた。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−９の構造は、先の実施例５２に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−３の構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−８の構造は、先の実施例４７に示されている。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ３５３３８２、６５５８６１、６６４０７８、６６１１６１、６６５００１、または生理食塩水を１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。
表４０に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。事実、アンチセンスオリゴヌクレオチドのうち、ホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−１及びＧａｌＮＡｃ３−９共役体を３’末端に含むもの（それぞれ、ＩＳＩＳ６５５８６１及びＩＳＩＳ６６４０７８）、並びにＧａｌＮＡｃ３−３及びＧａｌＮＡｃ３−８共役体が５’末端に連結されているもの（それぞれ、ＩＳＩＳ６６１１６１及びＩＳＩＳ６６５００１）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２）と比較して、力価の実質的な改善を示した。さらに、３’末端にＧａｌＮＡｃ３−９共役体を含むＩＳＩＳ６６４０７８は、３’末端にＧａｌＮＡｃ３−１共役体を含むＩＳＩＳ６５５８６１と比較して、本質的に等効力であった。それぞれ、ＧａｌＮＡｃ３−３またはＧａｌＮＡｃ３−９を含む５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ６６１１６１及びＩＳＩＳ６６５００１は、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６５５８６１及びＩＳＩＳ６６４０７８）と比較して、力価を増加させた。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間の有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表に示す。
実施例５６：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基または５’−共役基のいずれかを含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ３−１、２、３、５、６、７及び１０の比較）
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。非共役ＩＳＩＳ３５３３８２を標準物として含めた。多様なＧａｌＮＡｃ３共役基の各々は、ＧａｌＮＡｃ３共役基が３’末端で結合しているＩＳＩＳ６５５８６１以外は、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端でホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）により結合している。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−２ａの構造は、先の実施例３７に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−５ａの構造は、先の実施例４９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−６ａの構造は、先の実施例５１に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は、先の実施例４８に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は、先の実施例４６に示されている。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ３５３３８２、６５５８６１、６６４５０７、６６１１６１、６６６２２４、６６６９６１、６６６９８１、６６６８８１、または生理食塩水を１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして提示される。
表４３に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。事実、共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２）と比較して、力価の実質的な改善を示した。５’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’共役アンチセンスオリゴヌクレオチドと比較して力価のわずかな増加を示した。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間の有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表４４に示す。
実施例５７：生体内におけるＡｐｏＣ ＩＩＩを標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの作用持続時間試験
マウスに下記用量を１回注入し、ＡｐｏＣ−ＩＩＩ及び血漿トリグリセリド（血漿ＴＧ）レベルを４２日間にわたって監視した。各群におけるヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩを発現するトランスジェニックマウス３匹を用いて、この試験を実施した。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。
上表に見られるように、作用持続時間は、非共役オリゴヌクレオチドと比較して、３’−共役基の付加によって増加した。共役完全ＰＳオリゴヌクレオチド６４７５３５と比較して、共役ＰＯ／ＰＳ混合型オリゴヌクレオチド６４７５３６の作用持続時間がさらに増加した。
実施例５８：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする３’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ３−１及びＧａｌＮＡｃ４−１１の比較）
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。非共役ＩＳＩＳ４４０７６２を非共役標準物として含めた。共役基の各々を、それぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端で、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド切断可能部分により結合させた。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１１ａの構造は、先の実施例５０に示されている。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ４４０７６２、６５１９００、６６３７４８、または生理食塩水を１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表４７に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。３’末端にホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−１及びＧａｌＮＡｃ４−１１共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６５１９００及びＩＳＩＳ６６３７４８）は、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４４０７６２）と比較して、力価の実質的な改善を示した。２つの共役オリゴヌクレオチド、ＧａｌＮＡｃ３−１とＧａｌＮＡｃ４−１１は等効力であった。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ３二環式ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β-Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間の有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表４８に示す。
実施例５９：生体内におけるＦＸＩを標的とするＧａｌＮＡｃ３−１共役ＡＳＯの効果
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＦＸＩのアンチセンス阻害についてマウスでの複数回投与試験で試験した。ＩＳＩＳ４０４０７１を非共役標準物として含めた。共役基の各々は、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端で、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド切断可能部分により結合している。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。
処置
６週齢雄Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に下記に示す用量のＩＳＩＳ４０４０７１、６５６１７２、６５６１７３または対照処置のＰＢＳを週２回３週間、皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを決定した。ＥＬＩＳＡを用いてＦＸＩタンパク質血漿濃度も測定した。ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化する前に、トータルＲＮＡに対するＦＸＩ ｍＲＮＡレベルを測定した（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）使用）。下記の結果は、処置群ごとのＦＸＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。データを、ＰＢＳ処置した対照を基準として正規化したものを「％ＰＢＳ」で表記している。先に記載の方法と同様の方法を用いてＥＤ５０を測定し、それを以下に提示する。
表５０に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＦＸＩ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。３’−ＧａｌＮＡｃ３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４０４０７１）と比較して、力価の実質的な改善を示した。これら２つの共役オリゴヌクレオチド間では、ＰＳ結合のいくつかをＰＯ結合で置換することにより（ＩＳＩＳ６５６１７３）、力価の改善がさらに得られた。
表５０ａに例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＦＸＩタンパク質レベルが用量依存的に低下した。３’−ＧａｌＮＡｃ３−１共役基を含むオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ４０４０７１）と比較して、力価の実質的な改善を示した。これら２つの共役オリゴヌクレオチド間では、ＰＳ結合のいくつかをＰＯ結合で置換することにより（ＩＳＩＳ６５６１７３）、力価の改善がさらに得られた。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン、総アルブミン、ＣＲＥ及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群からの有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表に示す。
実施例６０：生体外におけるＳＲＢ−１を標的とする共役ＡＳＯの影響
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウス初代肝細胞での複数回投与試験で試験した。ＩＳＩＳ３５３３８２を非共役標準物として含めた。共役基の各々を、それぞれのオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端でホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド切断可能部分により結合させた。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−８ａの構造は、先の実施例４７に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−９ａの構造は、先の実施例５２に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−６ａの構造は、先の実施例５１に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−２ａの構造は、先の実施例３７に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は、先の実施例４６に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−５ａの構造は、先の実施例４９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は、先の実施例４８に示されている。
処置
上に列記されるオリゴヌクレオチドを、ウェル当たり２５，０００細胞の密度でプレーティングされ、０．０３、０．０８、０．２４、０．７４、２．２２、６．６７、または２０ｎＭの修飾オリゴヌクレオチドで処理されたマウス初代肝細胞で生体外の試験を行った。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離してｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定し、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがってＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを調整した。
標準的方法を用いてＩＣ５０を計算し、結果を表５３に提示する。結果は、オリゴヌクレオチドの細胞への侵入を人工的に促進するために試薬も電気穿孔技法も用いない自由取り込み条件下で、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２）よりも肝細胞において有意に強力であったことを示している。
実施例６１：ＧａｌＮＡｃ３−１２を含むオリゴマー化合物１７５の調製
化合物１６９は市販されている。化合物１７１にベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレートを添加することにより化合物１７２を調製した。ベンジル（ペルフルオロフェニル）グルタレートは、ＤＭＦに溶解させた５−（ベンジルオキシ）−５-オキソペンタン酸にＰＦＰ-ＴＦＡ及びＤＩＥＡを添加することにより調製した。実施例４６に例示の一般的手順を用いて、化合物１７４から、ＧａｌＮＡｃ３−１２共役基を含むオリゴマー化合物１７５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１２のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１２ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１２（ＧａｌＮＡｃ３−１２ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６２：ＧａｌＮＡｃ３−１３を含むオリゴマー化合物１８０の調製
化合物１７６を、実施例２に示す一般的手順を用いて調製した。実施例４９に例示の一般的手順を用いて、化合物１７７から、ＧａｌＮＡｃ３−１３共役基を含むオリゴマー化合物１８０を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１３のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１３ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１３（ＧａｌＮＡｃ３−１３ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６３：ＧａｌＮＡｃ３−１４を含むオリゴマー化合物１８８の調製
化合物１８１及び１８５は市販されている。実施例４６に例示の一般的手順を用いて、化合物１８７から、ＧａｌＮＡｃ３−１４共役基を含むオリゴマー化合物１８８を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１４のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１４ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１４（ＧａｌＮＡｃ３−１４ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６４：ＧａｌＮＡｃ３−１５を含むオリゴマー化合物１９７の調製
化合物１８９は市販されている。化合物１９５を、実施例３１に示す一般的手順を用いて調製した。標準のオリゴヌクレオチド合成手順を用いて、ＧａｌＮＡｃ３−１５共役基を含むオリゴマー化合物１９７を化合物１９４及び１９５から調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１５のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１５ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１５（ＧａｌＮＡｃ３−１５ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６５：生体内におけるＳＲＢ−１を標的とする５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの用量依存的試験（ＧａｌＮＡｃ３−３、１２、１３、１４、及び１５の比較）
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。非共役ＩＳＩＳ３５３３８２を標準物として含めた。ＧａｌＮＡｃ３共役基の各々は、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端で、ホスホジエステル結合２’−デオキシアデノシンヌクレオシド（切断可能部分）により結合している。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１２ａの構造は、先の実施例６１に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１４ａの構造は、先の実施例６３に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１５ａの構造は、先の実施例６４に示されている。
処置
６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ３５３３８２、６６１１６１、６７１１４４、６７００６１、６７１２６１、６７１２６２、または生理食塩水を１回または２回皮下注射した。２回投与を受けたマウスは、初回投与から３日後に第２投与を受けた。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水の対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表５５に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。単回投与を受けた動物と２回投与を受けた動物との間に、標的ノックダウンにおける有意差は観察されなかった（ＩＳＩＳ３５３３８２の投与量３０及び２×１５ｍｇ／ｋｇ、並びにＩＳＩＳ６６１１６１の投与量５及び２×２．５ｍｇ／ｋｇを参照のこと）。ホスホジエステル結合ＧａｌＮＡｃ３−３、１２、１３、１４、及び１５共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非共役アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３３５３８２）と比較して、力価の実質的な改善を示した。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間に有意差はなかった（データ示さず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表５６に示す。
実施例６６：実施例６６：５’−ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含むＳＲＢ−１標的オリゴヌクレオチドによる、さまざまな切断可能部分が及ぼす生体内でのアンチセンス阻害に対する効果
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。ＧａｌＮＡｃ３共役基の各々は、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端でホスホジエステル連結ヌクレオシド（切断可能部分（ＣＭ））により結合している。
大文字は、各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは、５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は、先の実施例６２に示されている。
処置
６〜８週齢のＣ５７ｂｌ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、下記に示す用量のＩＳＩＳ６６１１６１、６７０６９９、６７０７００、６７０７０１、６７１１６５、または生理食塩水を１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水による対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表５８に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。さまざまな切断可能部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはすべて、同様の力価を示した。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間に有意差はなかった（データ示さず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表５６に示す。
実施例６７：ＧａｌＮＡｃ３−１６を含むオリゴマー化合物１９９の調製
ＧａｌＮＡｃ３−１６共役基を含むオリゴマー化合物１９９、実施例７及び９に例示の一般的手順を用いて調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１６のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１６ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１６（ＧａｌＮＡｃ３−１６ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６８：ＧａｌＮＡｃ３−１７を含むオリゴマー化合物２００の調製
共役基ＧａｌＮＡｃ３−１７を含むオリゴマー化合物２００を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１７のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１７ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１７（ＧａｌＮＡｃ３−１７ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例６９：ＧａｌＮＡｃ３−１８を含むオリゴマー化合物２０１の調製
共役基ＧａｌＮＡｃ３−１８を含むオリゴマー化合物２０１を、実施例４６に例示の一般的手順を用いて調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１８のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１８ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１８（ＧａｌＮＡｃ３−１８ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例７０：ＧａｌＮＡｃ３−１９を含むオリゴマー化合物２０４の調製
実施例５２に例示の一般的手順を用いて、化合物６４から、ＧａｌＮＡｃ３−１９共役基を含むオリゴマー化合物２０４を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−１９のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−１９ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−１９（ＧａｌＮＡｃ３−１９ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例７１：ＧａｌＮＡｃ３−２０を含むオリゴマー化合物２１０の調製
トリフリン酸無水物を６−アミノヘキサン酸に添加して調製したアセトニトリルに溶解させた６−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）ヘキサン酸に、ＰＦＰ−ＴＦＡ及びＤＩＥＡを添加することにより、化合物２０５を調製した。反応混合物を８０℃まで加熱し、その後、室温まで下げた。実施例５２に例示の一般的手順を用いて、化合物２０８から、ＧａｌＮＡｃ３−２０共役基を含むオリゴマー化合物２１０を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−２０のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−２０ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−２０（ＧａｌＮＡｃ３−２０ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例７２：ＧａｌＮＡｃ３−２１を含むオリゴマー化合物２１５の調製
化合物２１１は市販されている。実施例５２に例示の一般的手順を用いて、化合物２１３から、ＧａｌＮＡｃ３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２１５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ３−２１のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−２１ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−２１（ＧａｌＮＡｃ３−２１ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例７３：ＧａｌＮＡｃ３−２２を含むオリゴマー化合物２２１の調製
ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリドを用いて、化合物２１９から化合物２２０を調製した。実施例５２に例示の一般的手順を用いて、化合物２２０から、ＧａｌＮＡｃ３−２１共役基を含むオリゴマー化合物２２１を調製する。共役基ＧａｌＮＡｃ３−２２のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−２２ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、切断可能部分はＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ａｄ-Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−である。ＧａｌＮＡｃ３−２２（ＧａｌＮＡｃ３−２２ａ−ＣＭ-）の構造を下に示す。
実施例７４：５’−ＧａｌＮＡｃ３共役体を含むＳＲＢ−１標的オリゴヌクレオチドによる、さまざまな切断可能部分が及ぼす生体内アンチセンス阻害に対する効果
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。ＧａｌＮＡｃ３共役基の各々は、それぞれのオリゴヌクレオチドの５’末端で結合している。
すべての表において、大文字は各ヌクレオシドの核酸塩基を示し、ｍＣは５−メチルシトシンを示す。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示し、「ｏ’」は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−を示す。共役基は太字で表記した。
ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は、先の実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１７ａの構造は、先の実施例６８に示されており、また、ＧａｌＮＡｃ３−１８ａの構造は、実施例６９に示されている。
処置
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表６０に列記されるオリゴヌクレオチドを下記に示す用量で、または生理食塩水を、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水による対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表６１に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同様の力価を示し、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であった。
生理食塩水を注入したマウスと比較した、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度を、標準のプロトコルを用いて測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群（データ示さず）からの有意な変化は見られなかった。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表６２に示す。
実施例７５：５’−共役基を含むオリゴヌクレオチドの薬物動態分析
実施例６５、６６、及び７４に記載される処理手順に従って得た肝臓試料を用いて、上表５４、５７、及び６０におけるＡＳＯのＰＫを評価した。肝臓試料を切り刻み、標準のプロトコルを用いて抽出し、内部標準とともにＩＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。全代謝物の合わせた組織濃度（μｇ／ｇ）を、適切なＵＶピークを統合することにより測定し、共役体を欠く完全長ＡＳＯ（この場合、ＩＳＩＳ番号３５３３８２の「親」）の組織濃度を適切な抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を用いて測定した。
上表６３における結果は、特にＧａｌＮＡｃ３共役基を有するオリゴヌクレオチドとＧａｌＮＡｃ３共役基を有していないオリゴヌクレオチドとの間の用量差を考慮に入れると、オリゴヌクレオチド投与から７２時間後、ＧａｌＮＡｃ３共役基を含むオリゴヌクレオチドの肝臓組織濃度は、ＧａｌＮＡｃ３共役基を含まない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２）の肝臓組織濃度よりも高かったことを示している。さらに、７２時間後までに、ＧａｌＮＡｃ３共役基を含む各オリゴヌクレオチドの４０〜９８％が親化合物に代謝され、このことは、ＧａｌＮＡｃ３共役基がオリゴヌクレオチドから切断されたことを示す。
実施例７６：ＧａｌＮＡｃ３−２３を含むオリゴマー化合物２３０の調製
化合物２２２は市販されている。ピリジン（５００ｍＬ）に溶解させた塩化トシル（２５．３９ｇ、０．１３ｍｏｌ）で１６時間処理した。その後、反応物を蒸発させて油とし、ＥｔＯＡｃに溶解させ、水、飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。酢酸エチルを濃縮乾固させ、カラムクロマトグラフィーによって精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）、続いて、１０％メタノール含有ＣＨ２Ｃｌ２で溶出させて化合物２２３を無色の油として得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。１０ｇ（３２．８６ｍｍｏｌ）の１−トシルトリエチレングリコール（化合物２２３）を、アジ化ナトリウム（１０．６８ｇ、１６４．２８ｍｍｏｌ）含有ＤＭＳＯ（１００ｍＬ）で室温にて１７時間処理した。次いで、反応混合物を水上に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で３回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させて、５．３ｇの化合物２２４（９２％）を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。１−アジドトリエチレングリコール（化合物２２４、５．５３ｇ、２３．６９ｍｍｏｌ）及び化合物４（６ｇ、１８．２２ｍｍｏｌ）を、４Ａモレキュラーシーブ（５ｇ）及びＴＭＳＯＴｆ（１．６５ｍＬ、９．１１ｍｍｏｌ）含有ジクロロメタン（１００ｍＬ）を用いて不活性雰囲気下で処理した。１４時間後、反応物を濾過してモレキュラーシーブを除去し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させ、ラムクロマトグラフィーで精製し、メタノール含有ジクロロメタンで勾配２→４％で溶出させて化合物２２５を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２５（１１．９ｇ、２３．５９ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ／メタノール（４：１、２５０ｍＬ）中パールマン触媒上で水素化した。８時間後、触媒をろ去し、溶媒を除去乾固して化合物２２６を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。
化合物２２７を生成させるために、ＤＭＦ（１００ｍＬ）に溶解させたニトロメタントリスプロピオン酸（４．１７ｇ、１５．０４ｍｍｏｌ）及びヒューニッヒ塩基（１０．３ｍＬ、６０．１７ｍｍｏｌ）の溶液を、ペンタフルオロトリフルオロアセテート（ｐｅｎｔａｆｌｏｕｒｏｔｒｉｆｌｕｏｒｏ ａｃｅｔａｔｅ）（９．０５ｍＬ、５２．６５ｍｍｏｌ）で液滴処理した。３０分後、反応物を氷水上に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を水、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。有機層を濃縮乾固させた後、ヘプタンから再結晶させ、化合物２２７を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２７（１．５ｇ、１．９３ｍｍｏｌ）及び化合物２２６（３．７ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）を、アセトニトリル（１５ｍＬ）中で室温にて２時間撹拌した。反応物を蒸発乾固させ、カラムクロマトグラフィーで精製し、メタノール含有ジクロロメタンで勾配２→１０％で溶出させ、化合物２２８を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２２８（１．７ｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を、エタノール（１００ｍＬ）中のラネーニッケル（約２ｇ、湿潤）を用いて水素雰囲気で処理した。１２時間後、触媒をろ去し、有機層を蒸発させて固体にし、これを次のステップで直接使用した。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。この固体（０．８７ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた、ベンジルグルタル酸（０．１８ｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（２７３．７μｌ、１．６ｍｍｏｌ）で処理した。１６時間後、ＤＭＦを減圧下６５℃で除去して油にし、その油をジクロロメタンに溶解させた。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。有機層を蒸発させた後、化合物をカラムクロマトグラフィーで精製し、メタノール含有ジクロロメタンで勾配２→２０％で溶出させ、カップリング生成物を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。ベンジルエステルを、パールマン触媒を用いて水素雰囲気下で１時間脱保護した。その後、この触媒をろ去し、溶媒を除去乾固して酸を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。酸（４８６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解させた。ピリジン（５３．６１μｌ、０．６６ｍｍｏｌ）を添加し、反応物をアルゴンでパージした。ペンタフルオロトリフルオロアセテート（ｐｅｎｔａｆｌｏｕｒｏｔｒｉｆｌｕｏｒｏ ａｃｅｔａｔｅ）（４６．３９μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に緩徐に添加した。反応物の色が淡黄色からワイン色に変化して少しの煙を発した。この煙をアルゴン流で吹き飛ばした。反応物を室温で１時間撹拌した（反応完了をＬＣＭＳにより確認した）。溶媒を減圧下（ロータリーエバポレーション）、７０℃で除去した。残渣をＤＣＭで希釈し、１Ｎ ＮａＨＳＯ４、ブライン、飽和重炭酸ナトリウム、及び再度ブラインで洗浄した。有機物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過して濃縮乾固させ、黄色の脆い泡状物として２２５ｍｇの化合物２２９を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。
実施例４６に例示の一般的手順を用いて、化合物２２９から、ＧａｌＮＡｃ３−２３共役基を含むオリゴマー化合物２３０を調製した。ＧａｌＮＡｃ３−２３共役基のＧａｌＮＡｃ３クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ３−２３ａ）を任意の切断可能部分と組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ＧａｌＮＡｃ３−２３（ＧａｌＮＡｃ３−２３ａ−ＣＭ）の構造を下記に示す
実施例７７：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下に列記するオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で試験した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は先の実施例９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−９ａは実施例５２に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１９ａは実施例７０に示され、ＧａｌＮＡｃ３−２０ａは実施例７１に示され、ＧａｌＮＡｃ３−２３ａは実施例７６に示されている。
処置
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）それぞれに、表６４に列記されるオリゴヌクレオチドを下記に示す用量で、または生理食塩水を１回、皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水による対照を基準として正規化された、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表６５に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。
標準のプロトコルを用いて、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清中濃度も測定した。総ビリルビン及びＢＵＮも評価した。体重変化を評価したが、生理食塩水群との間で有意な変化はなかった（データ示さず）。ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン及びＢＵＮ値を下記表６６に示す。
実施例７８：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含むアンギオテンシノーゲンを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
以下に列記するオリゴヌクレオチドをアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）のアンチセンス阻害について、正常血圧Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットでの用量依存的試験で試験した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されている。
処置
６週齢の、雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットそれぞれに、下記に示す用量の表６７に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、週１回、全３回投与で、皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。ラットを最終投与から７２時間後に屠殺した。肝臓のＡＧＴ ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標準のプロトコルに従って測定した。ＡＧＴ血漿タンパク質レベルを、ＴｏｔａｌアンジオテンシノーゲンＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＪＰ２７４１２、ＩＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、ＯＮ）を用いて１：２０，０００で希釈した血漿で測定した。下記の結果は、ＰＢＳ対照を基準として正規化された、処置群ごとの、肝臓のＡＧＴ ｍＲＮＡレベルまたは血漿中ＡＧＴタンパク質レベルの平均パーセントとして示される。
表６８に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、肝臓のＡＧＴ ｍＲＮＡレベル及び血漿タンパク質レベルが用量依存的に低下し、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であった。
屠殺時に、標準のプロトコルを用いて、肝臓のトランスアミナーゼ、すなわち、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血漿中濃度、及び体重も測定した。結果を下記表６９に示す。
実施例７９：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
下記表７０に列記されるオリゴヌクレオチドを、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で試験した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されており、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−７ａは実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１３ａは実施例６２に示されている。
処置
ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩ を発現する６〜８週齢のトランスジェニックマウスそれぞれに、表７０に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注射した。各処置群は３匹の動物で構成された。血液を、ベースライン決定のために投与前に採取し、また、投与から７２時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、及び６週間の後に採取した。血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを、実施例２０に記載のように測定した。下記の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして提示されており、これによると、共役基のない親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３０４８０１）の投与量が、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドの投与量の３倍であったにもかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドの方が親オリゴヌクレオチドよりも長い作用持続時間を示したことがわかる
実施例８０：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、Ａｌｐｈａ-１抗トリプシン（Ａ１ＡＴ）を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
下記表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、Ａ１ＡＴに対する用量依存的阻害についてマウスでの試験において検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されており、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−７ａは実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１３ａは実施例６２に示されている。
処置
６週齢の、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）それぞれに、下記に示す用量の表７２に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、週１回、全３回投与で皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。肝臓のＡ１ＡＴ ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標準のプロトコルに従って測定した。Ａ１ＡＴ血漿タンパク質レベルを、マウスα１−抗トリプシンＥＬＩＳＡ（カタログ番号４１-Ａ１ＡＭＳ-Ｅ０１、Ａｌｐｃｏ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて測定した。下記の結果は、ＰＢＳ対照を基準として正規化された、処置群ごとの肝臓のＡ１ＡＴ ｍＲＮＡレベル及び血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして示される。
表７３に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、肝臓のＡ１ＡＴ ｍＲＮＡレベル及びＡ１ＡＴ血漿タンパク質レベルが用量依存的に低下した。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、親（ＩＳＩＳ４７６３６６）よりも有意に強力であった。
屠殺時に、標準のプロトコルを用いて、肝臓トランスアミナーゼ及びＢＵＮの血漿中濃度を測定した。体重及び臓器重量も測定した。結果を下記表７４に示す。体重は、ベースラインに対する％として示される。臓器重量は、ＰＢＳ対照群と比較した体重の％として示される。
実施例８１：ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含む、Ａ１ＡＴを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
表７２に列記されるオリゴヌクレオチドを、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。
処置
６週齢の、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスそれぞれに、表７２に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。血液を、ベースライン決定のために投与前日に採取し、また、投与から５、１２、１９、及び２５日後に採取した。血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルをＥＬＩＳＡにより測定した（実施例８０を参照のこと）。下記の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、血漿Ａ１ＡＴタンパク質レベルの平均パーセントとして示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ４７６３６６）よりも強力、かつ作用持続時間が長かったことを示している。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６７８３８１、６７８３８２、６７８３８３、及び６７８３８４）を含むオリゴヌクレオチドは、概して、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６５６３２６）を含むオリゴヌクレオチドよりさらに一層強力、かつ作用持続時間が長かった。
実施例８２：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体外でのアンチセンス阻害
処理の２時間前に、マウス初代肝細胞を１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。ウィリアムＥ培地に２、１０、５０、または２５０ｎＭで添加し、細胞を３７℃、５％ＣＯ２内で一晩インキュベートした。オリゴヌクレオチド添加後、細胞を１６時間溶解させ、ＲＮｅａｓｅ ３０００ ＢｉｏＲｏｂｏｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを精製した。ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標準のプロトコルに従って測定した。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて測定した。結果は、多様な異なるＧａｌＮＡｃ共役基及び多様な異なる切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドは、生体外自由取り込み実験において、ＧａｌＮＡｃ共役基を欠く親オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ３５３３８２及び６６６８４１）よりも有意に強力であることを示している。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されており、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−５ａは実施例４９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−６ａは実施例５１に示され、ＧａｌＮＡｃ３−７ａは実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−８ａは実施例４７に示され、ＧａｌＮＡｃ３−９ａは実施例５２に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１２ａは実施例６１に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１３ａは実施例６２に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１４ａは実施例６３に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１５ａは実施例６４に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１７ａは実施例６８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１８ａは実施例６９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１９ａは実施例７０に示され、ＧａｌＮＡｃ３−２０ａは実施例７１に示され、ＧａｌＮＡｃ３−２３ａは実施例７６に示されている。
実施例８３：ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含む、第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、第ＸＩ因子の用量依存的阻害試験においてマウスで試験した。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されており、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−７ａは実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１３ａは実施例６２に示されている。
処置
６〜８週齢マウスそれぞれに、以下に列記のオリゴヌクレオチドを下記に示す用量で、またはＰＢＳを、週１回、全３回投与で、皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。第ＸＩ因子肝臓ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定し、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンを基準として正規化した。肝臓の各トランスアミナーゼ、ＢＵＮ、及びビリルビンも測定した。下記の結果は、ＰＢＳ対照を基準として正規化された、処置群ごとの平均パーセントとして示される。
表７８に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、第ＸＩ因子肝臓ｍＲＮＡが用量依存的に低下した。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ４０４０７１）よりも一層強力であることを示している。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、及び６７８３４９）を含むオリゴヌクレオチドは３’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６５６１７３）を含むオリゴヌクレオチドよりも一層強力であった。
実施例８４：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、第ＸＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
表７７に列記されるオリゴヌクレオチドを、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。
処置
６〜８週齢マウスそれぞれに、表７７に列記されるオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。尾採血による血液採取を、ベースライン決定のための投与前、また、投与から３、１０、及び１７日後に行った。Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の第ＸＩ因子捕捉及びビオチン化検出抗体（それぞれ、カタログ番号ＡＦ２４６０及びＢＡＦ２４６０）、並びにＯｐｔＥＩＡ試薬セットＢ（カタログ番号５５０５３４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＥＬＩＳＡにより第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルを測定した。下記の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、第ＸＩ因子血漿タンパク質レベルの平均パーセントとして示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ４０４０７１）よりも強力、かつ作用持続時間が長いことを示している。さらに、５’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６６３０８６、６７８３４７、６７８３４８、及び６７８３４９）を含むオリゴヌクレオチドは、３’−ＧａｌＮＡｃ共役体（ＩＳＩＳ６５６１７３）を含むオリゴヌクレオチドよりもさらに強力、かつ作用持続時間が長かった。
実施例８５：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
表７６に列記のオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で検討した。
処置
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスそれぞれに、下記に示す用量の、表７６に列記のオリゴヌクレオチド、または生理食塩水を、週１回計３回の投与で皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から４８時間後にマウスを屠殺し、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを決定した。下記の結果は、生理食塩水による対照を基準として正規化された、処置群ごとの肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表８０及び８１に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下した。
標準のプロトコルを用いて、肝臓トランスアミナーゼレベル、総ビリルビン、ＢＵＮ、及び体重も測定した。
処置群ごとの平均値を下記表８２に示す。
実施例８６：ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含む、ＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表８３に列記のオリゴヌクレオチドを、アンチセンス阻害について、ヒトＴＴＲ遺伝子（ＴＴＲ）を発現するトランスジェニックマウスでの用量依存的試験で検討した。
処置
８週齢ＴＴＲトランスジェニックマウスそれぞれに、下記表に列記する用量のオリゴヌクレオチド、またはＰＢＳを、週１回３週間、計３回の投与で皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。実験を通してさまざまな測定時点で尾採血を実施し、血漿ＴＴＲタンパク質、ＡＬＴ、及びＡＳＴレベルを測定し、表８５〜８７に記載した。動物を屠殺後、血漿ＡＬＴ、ＡＳＴ、及びヒトＴＴＲ レベルを測定し、また、体重、臓器重量、及び肝臓ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルも測定した。臨床分析装置（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を使用してＴＴＲタンパク質レベルを測定した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を標準のプロトコルに従って使用し、肝臓ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルを測定した。表８４〜８７に提示される結果は処置群ごとの平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均に対する平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインにおけるＰＢＳ群の平均値に対する平均値である。体重は、屠殺されるまでの個体処置群それぞれのベースラインからの平均体重変化（パーセント）である。示されている臓器重量は動物の体重を基準として正規化され、その後、ＰＢＳ群の正規化された臓器重量の平均に対する処置群ごとの正規化された臓器重量平均が提示されている。
表８４〜８７では、「ＢＬ」はベースラインを示し、初回投与直前に測定したものである。表８４及び８５に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＴＴＲ発現レベルが用量依存的に低下した。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ４２０９１５）よりさらに強力であった。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役及びＰＳ／ＰＯ混合型ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役及び完全ＰＳ結合を含むオリゴヌクレオチドよりさらに一層強力であった。
表８５の凡例は実施例７４に見出される。ＧａｌＮＡｃ３−１の構造は実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は実施例４６に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は実施例６２に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１９ａの構造は実施例７０に示されている。
実施例８７：ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含む、ＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドの単回投与による、生体内における作用持続時間
ＩＳＩＳ番号４２０９１５及び６６０２６１（表８３を参照）を、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。ＩＳＩＳ番号４２０９１５、６８２８８３、及び６８２８８５（表８３を参照）も、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。
処置
ヒトＴＴＲを発現する８週齢雄トランスジェニックマウスそれぞれに、ＩＳＩＳ番号４２０９１５を１００ｍｇ／ｋｇまたはＩＳＩＳ番号６６０２６１を１３．５ｍｇ／ｋｇ、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。尾採血を、ベースライン決定のための投与前に、また、投与から３、７、１０、１７、２４、及び３９日目に実施した。血漿ＴＴＲタンパク質レベルを、実施例８６に記載のように測定した。下記の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして示される。
処置
ヒトＴＴＲを発現する雌トランスジェニックマウスそれぞれに、１００ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４２０９１５、１０．０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８２８８３、または１０．０ｍｇ／ｋｇの６８２８８５を１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。尾採血を、ベースライン決定のための投与前に、また、投与から３、７、１０、１７、２４、及び３９日目に実施した。血漿ＴＴＲタンパク質レベルを、実施例８６に記載のように測定した。下記の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、血漿ＴＴＲレベルの平均パーセントとして示される。
表８８及び８９の結果は、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、共役体（ＩＳＩＳ４２０９１５）を欠く親オリゴヌクレオチドよりさらに強力で作用持続時間が長いことを示している。
実施例８８：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＭＮを標的とするオリゴヌクレオチドによる、生体内におけるスプライシング調節
表９０に列記されるオリゴヌクレオチドを、ヒト生存運動ニューロン（ＳＭＮ）のスプライシング調節についてマウスで試験した。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は、先の実施例４８に示されている。「Ｘ」は、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ（Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ，ＯＲ）で生成された５’第一級アミンを示し、ＧａｌＮＡｃ３−７ｂは、以下に示すように、リンカーの−ＮＨ-Ｃ６-Ｏ部分を欠くＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造を示す
ＩＳＩＳ番号７０３４２１及び７０３４２２はモルホリノオリゴヌクレオチドであり、これら２つのオリゴヌクレオチドの各ヌクレオチドは、モルホリノヌクレオチドである。
処置
ヒトＳＭＮ を発現する６週齢トランスジェニックマウスに、表９１に列記されるオリゴヌクレオチドまたは生理食塩水を１回皮下注射した。各処理群は、雄２匹と雌２匹で構成された。投与から３日後にマウスを屠殺し、リアルタイムＰＣＲを標準のプロトコルに従い使用して、エクソン７の有無，双方の場合の肝臓ヒトＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを測定した。Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ試薬を用いてトータルＲＮＡを測定した。ＳＭＮ ｍＲＮＡレベルを総ｍＲＮＡを基準として正規化し、さらに生理食塩水処置群の平均を基準として正規化した。そこから得られた、エクソン７を含むＳＭＮ ｍＲＮＡと、エクソン７を欠くＳＭＮ ｍＲＮＡとの平均比を表９１に示す。結果は、スプライシング調節を行う、ＧａｌＮＡｃ共役体を含む完全修飾オリゴヌクレオチドは、ＧｌａＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも有意に一層強力に肝臓におけるスプライシングを改変させることを示す。その上、この傾向は、２’−ＭＯＥ及びモルホリノ修飾オリゴヌクレオチドを含む複数の修飾化学についても維持される。
実施例８９：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、アポリポタンパク質Ａ（Ａｐｏ（ａ））を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表９２に列記されるオリゴヌクレオチドを、Ａｐｏ（ａ）ｋの用量依存的阻害についてトランスジェニックマウスでの試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。
処置
８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）それぞれに、下記に示す用量の表９２に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、週１回、計６回投与で皮下注射した。各処置群は、動物３〜４匹で構成された。尾採血を、初回投与前日、及び各投与後に週１回実施し、血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルを測定した。最終投与から２日後にマウスを屠殺した。Ａｐｏ（ａ）肝臓ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標準のプロトコルに従って測定した。Ａｐｏ（ａ）血漿タンパク質レベルをＥＬＩＳＡを用いてを測定し、肝臓トランスアミナーゼレベルを測定した。表９３のｍＲＮＡ及び血漿タンパク質の各結果は、ＰＢＳ処置群に対する、処置群平均パーセントとして示される。血漿タンパク質レベルを、ＰＢＳ群のベースライン（ＢＬ）値を基準としてさらに正規化した。トランスアミナーゼ絶対値平均及び体重（ベースライン平均に対する％）を表９４に報告する。
表９３に例示されるように、オリゴヌクレオチドを用いた処置により、Ａｐｏ（ａ）肝臓ｍＲＮＡレベル及び血漿タンパク質レベルが用量依存的に低下した。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドより有意に一層強力で作用持続時間が長かった。表９４に例示されるように、トランスアミナーゼレベル及び体重はオリゴヌクレオチドの影響を受けておらず、このことは、オリゴヌクレオチドの忍容性が良好であることを示している。
実施例９０：ＧａｌＮＡｃ３クラスターを含む、ＴＴＲを標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表９５に列記されるオリゴヌクレオチドを、アンチセンス阻害について、ヒトＴＴＲ遺伝子（ＴＴＲ）を発現するトランスジェニックマウスでの用量依存的試験で検討した。
処置
ＴＴＲトランスジェニックマウスそれぞれに、表９６に列記される用量のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、週１回３週間、計３回の投与で皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。初回投与前に、尾採血を実施し、ベースライン（ＢＬ）における血漿ＴＴＲタンパク質レベルを測定した。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。臨床分析装置（ＡＵ４８０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＣＡ）を使用してＴＴＲタンパク質レベルを測定した。リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を標準のプロトコルに従って使用し、肝臓ヒトＴＴＲ ｍＲＮＡレベルを測定した。表９６に提示される結果はは、処置群ごとの平均値である。ｍＲＮＡレベルは、ＰＢＳ群の平均に対する平均値である。血漿タンパク質レベルは、ベースラインにおけるＰＢＳ群の平均値に対する平均値である。「ＢＬ」はベースラインを示し、初回投与直前に測定したものである。表９６に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＴＴＲ発現レベルが用量依存的に低下した。ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親（ＩＳＩＳ４２０９１５）よりさらに強力であり、ホスホジエステルまたはデオキシアデノシンの切断可能部分を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠く親と比較して、力価の有意な改善を示した（ＩＳＩＳ番号６８２８８３及び６６６９４３対４２０９１５、並びに実施例８６及び８７を参照のこと）。
表９５の凡例は実施例７４に見出される。ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は実施例４６に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は実施例６２に示されている。
実施例９１：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、第ＶＩＩ因子を標的とするオリゴヌクレオチドによる非ヒト霊長類での生体内におけるアンチセンス阻害
下記表９７に列記のオリゴヌクレオチドを、第ＶＩＩ因子のアンチセンス阻害についてサルでの非終末期用量漸増試験で検討した。
処置
処置を受けたことのある（ｎｏｎ−ｎａi ｖｅ）サルそれぞれに、０、１５、及び２９日目に、表９７に列記されるオリゴヌクレオチドを用量漸増的に、またはＰＢＳを皮下注射した。各処理群は、雄４匹と雌１匹で構成された。初回投与前、及びその後のさまざまな測定時点で、血液採取を実施し、血漿トロンボプラスチン第ＶＩＩ因子タンパク質レベルを測定した。第ＶＩＩ因子タンパク質レベルをＥＬＩＳＡで測定した。表９８に提示される結果は、初回投与直前に測定したベースラインにおけるＰＢＳ群の平均値（ＢＬ）に対する、処置群ごとの平均値である。表９８に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、第ＶＩＩ因子発現レベルが用量依存的に低下し、サルにおいて、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠くオリゴヌクレオチドよりも有意に一層強力であった。
表９７の凡例は実施例７４に見出される。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は実施例４６に示されている。
実施例９２：アンチセンスＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、Ａｐｏ−ＣＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドによる、初代肝細胞でのアンチセンス阻害
マウス初代肝細胞を、１５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、マウスＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表９９に列記のオリゴヌクレオチドを、０．４６、１．３７、４．１２、または１２．３５、３７．０４、１１１．１１、若しくは３３３．３３ｎＭまたは１．００μｍで添加した。オリゴヌクレオチドとともに２４時間インキュベートした後、細胞を溶解させ、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを精製した。ＡｐｏＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを、標準のプロトコルに従ってリアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。ＩＣ５０値をＰｒｉｓｍ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて測定した。結果は、切断可能部分がホスホジエステルであるかホスホジエステル結合デオキシアデノシンであるかにかかわらず、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも有意に一層強力であったことを示している。
ＧａｌＮＡｃ３−１ａの構造は、先の実施例９に示されてお、ＧａｌＮＡｃ３−３ａは実施例３９に示され、ＧａｌＮＡｃ３−７ａは実施例４８に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１０ａは実施例４６に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１３ａは実施例６２に示され、ＧａｌＮＡｃ３−１９ａは実施例７０に示されている。
実施例９３：混成ウィング及び５’−ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１標的オリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
表１００に列記されるオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−３ａは先の実施例３９に示されており、また、ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は先の実施例４８に示されている。下付き文字「ｅ」は、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを示し、「ｄ」は、β-Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオシドを示し、「ｋ」は、６’−（Ｓ）−ＣＨ３二環式ヌクレオシド（ｃＥｔ）を示し、「ｓ」は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合（ＰＳ）を示し、「ｏ」は、ホスホジエステルヌクレオシド間結合（ＰＯ）を示す。上付き文字「ｍ」は５-メチルシトシンを示す。
処置
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、表１００に列記されるオリゴヌクレオチドを下記に示す用量で、または生理食塩水を、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。肝臓ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンｍＲＮＡレベルを基準として正規化した。結果は、生理食塩水対照群に対する、処置群ごとのＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。表１０１に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下し、ＧａｌＮＡｃ共役体を含み、かつ完全ｃＥｔまたは混成糖修飾のいずれかのウィングを有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、かつ完全ｃＥｔ修飾ウィングを含む親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であった。
体重、肝臓の各トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮも測定し、処置群ごとの平均値を表１０１に示す。体重は、オリゴヌクレオチド投与直前に測定したベースライン体重（％ＢＬ）に対する平均体重パーセントとして示されている。
実施例９４：２’−糖修飾及び５’−ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
表１０２に列記されるオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で検討した。
下付き文字「ｍ」は、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを示す。表の全凡例については実施例７４を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ３−３ａは先の実施例３９に示されており、また、ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は、先の実施例４８に示されている。
処置
実施例９３に記載の操作手順を用いて試験を完了した。結果は下記表１０３に示され、ＧａｌＮＡｃ共役体を含む、２’−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチド及び２’−ＯＭｅ修飾オリゴヌクレオチドはいずれも、共役体を欠くそれぞれの親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であったことを示している。体重、肝臓の各トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮの測定結果から、いずれの化合物も忍容性が良好であることが示された。
実施例９５：二環式ヌクレオシド及び５’−ＧａｌＮＡｃ３共役体を含む、ＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
表１０４に列記されるオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で検討した。
下付き文字「ｇ」は、フルオロ−ＨＮＡヌクレオシドを示し、下付き文字「ｌ」は、２’−Ｏ−ＣＨ２−４’架橋を含む架橋型（ｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオシドを示す。他の略語については実施例７４の表の凡例を参照されたい。ＧａｌＮＡｃ３−１ａは先に実施例９に示されており、ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は先の実施例３９に示されており、また、ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は先の実施例４８に示されている。
処置
実施例９３に記載の操作手順を用いて試験を完了した。結果は以下の表１０５に示され、ＧａｌＮＡｃ共役体及びさまざまな二環式ヌクレオシド修飾を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、二環式ヌクレオシド修飾を含む親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であったことを示している。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体及びフルオロ-ＨＮＡ修飾を含むオリゴヌクレオチドは、共役体を欠き、フルオロ-ＨＮＡ修飾を含む親よりも有意に強力であった。体重、肝臓の各トランスアミナーゼ、総ビリルビン、及びＢＵＮの測定結果から、いずれの化合物も忍容性が良好であることが示された。
実施例９６：ＧａｌＮＡｃ３共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿タンパク質結合
血漿タンパク質結合を評価するため、ＡｐｏＣ−ＩＩＩを標的とする表７０に列記のオリゴヌクレオチド及びＡｐｏ（ａ）を標的とする表１０６のオリゴヌクレオチドを限外濾過アッセイにおいて試験した。
表の凡例については実施例７４を参照のこと。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は、先の実施例４８に示されている。
Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ限外濾過ユニット（３０，０００ＮＭＷＬ、低結合再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、３００μＬの０．５％Ｔｗｅｅｎ ８０で事前コンディショニングし、２０００ｇで１０分間遠心分離し、その後、Ｈ２Ｏに溶解させた３００μｇ／ｍＬ対照オリゴヌクレオチド溶液３００μＬで事前コンディショニングし、２０００ｇで１６分間遠心分離した。表７０及び１０６の各被験オリゴヌクレオチドのフィルターへの非特異的結合を評価するために、Ｈ２Ｏ中の２５０ｎｇ／ｍＬオリゴヌクレオチド溶液（ｐＨ７．４）３００μＬを事前コンディショニングしたフィルターに設置し、２０００ｇで１６分間遠心分離した。濾過されなかった試料及び濾過された試料をＥＬＩＳＡアッセイによって分析し、オリゴヌクレオチド濃度を測定した。３つの複製試料を使用して、各試料の平均濃度を得た濾過されなかった試料に対する濾過されたた試料の平均濃度を用いて、血漿不在下でフィルターにより回収されたオリゴヌクレオチドの割合（％回収）を決定する。
薬物を使用していない健常なヒト志願者、カニクイザル、及びＣＤ−１マウスから得たＫ３−ＥＤＴＡ中に収集された凍結全血漿試料をＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）から購入した。被験オリゴヌクレオチドを、２つの濃度（５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬ）で１．２ｍＬずつ分注した血漿に添加した。スパイクされた血漿試料それぞれの分注（３００μＬ）を事前コンディショニングしたフィルターユニット内に設置し、３７℃で３０分間インキュベートし、直後に２０００ｇで１６分間遠心分離した。濾過されスパイクされた血漿試料及び濾過されずスパイクされた血漿試料の分注をＥＬＩＳＡにより分析し、各試料中のオリゴヌクレオチドの濃度を決定した。１濃度ごとに３つの複製物を用いて、各試料中の結合オリゴヌクレオチド及び非結合オリゴヌクレオチドの平均割合を決定した。濾過されなかった試料の濃度に対する濾過された試料の平均濃度を用いて、血漿タンパク質に結合されていない血漿中のオリゴヌクレオチドの割合（％非結合）を決定する。各オリゴヌクレオチドの％非結合を％回収で割ることにより、最終非結合オリゴヌクレオチド値を非特異的結合について補正する。最終％非結合値を１００から引いて、最終％結合オリゴヌクレオチド値を決定する。各種血漿で試験した２つの濃度のオリゴヌクレオチド（５μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬ）の結果を表１０７に示す。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基が血漿タンパク質結合に有意な影響を与えないことを示している。さらに、完全ＰＳヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチド及び混成ＰＯ／ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドはいずれも血漿タンパク質に結合し、完全ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドの方が、混成ＰＯ／ＰＳ結合を有するオリゴヌクレオチドよりも程度が若干高い。
実施例９７：ＧａｌＮＡｃ３共役基を含む、ＴＴＲを標的とする修飾オリゴヌクレオチド
ＧａｌＮＡｃ共役体を含む表１０８に示すオリゴヌクレオチドを、ＴＴＲを標的とするよう設計した。
表１０８の凡例は実施例７４に見出される。ＧａｌＮＡｃ３−１の構造は実施例９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−３ａの構造は実施例３９に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１０ａの構造は実施例４６に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は実施例６２に示されている。ＧａｌＮＡｃ３−１９ａの構造は実施例７０に示されている。
実施例９８：ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドの炎症誘発作用のｈＰＭＢＣアッセイにおける評価
実施例２３及び２４に記載のように、表１０９に列記されるオリゴヌクレオチドを、炎症誘発作用についてｈＰＭＢＣアッセイで試験した。（オリゴヌクレオチドの説明については表３０、８３、９５、及び１０８を参照のこと）。ＩＳＩＳ３５３５１２は陽性対照として使用する高レスポンダーであり、他のオリゴヌクレオチドは、表８３、９５、及び１０８に記載のものである。１人の志願ドナーの血液を用いて表１０９に示す結果を得た。結果は、ＰＯ／ＰＳ混合型ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、完全ＰＳ結合を有する同一のオリゴヌクレオチドと比較して、有意に低い炎症誘発応答をもたらしたことを示している。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基は、このアッセイにおいて有意には影響しなかった。
実施例９９：ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドのアシアロ糖タンパク質受容体に対する結合親和性
表１１０に列記されるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドの説明については表７６を参照のこと）のアシアロ糖タンパク質受容体に対する結合親和性を競合的受容体結合アッセイにおいて試験した。競合相手のリガンドであるα１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中で１Ｕノイラミニダーゼ−アガロースとともに３７℃で１６時間インキュベートし、シアル酸アッセイでもサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）でも９０％超の脱シアル化を確認した。Ａｔｓｍａ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９１ Ｊａｎ、３２（１）：１７３−８１を参照のこと）の手順に従って、一塩化ヨウ素を用いてＡＧＰをヨウ素化した。この方法では、脱シアル化α１−酸性糖タンパク質（ｄｅ−ＡＧＰ）を、１０ｍＭ塩化ヨウ素、Ｎａ１２５Ｉ、及び１Ｍグリシンを溶解させた０．２５Ｍ ＮａＯＨに添加した。室温で１０分間インキュベートした後、３ＫＤＭＷＣＯスピンカラムを利用してこの混合物を２回濃縮することにより、遊離１２５Ｉから１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰを分離した。このタンパク質を、標識効率及び純度について、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＥＣ−３カラム（７．８×３００ｍｍ）及びβ−ＲＡＭカウンターを装備したＨＰＬＣシステムにおいて試験した。１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及びＡＳＯ含有の各種ＧａｌＮＡｃクラスターを利用した競合実験を以下のとおりに実施した。ヒトＨｅｐＧ２細胞（１０６細胞／ｍＬ）を、２ｍＬの適切な成長培地中の６ウェルプレートにプレーティングした。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、及び１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを添加したＭＥＭ培地を用いた。細胞を、５％及び１０％のそれぞれのＣＯ２で、３７℃にて１６〜２０時間インキュベートした。実験に先立ち、細胞をＦＢＳ不含培地で洗浄した。細胞を、２％ＦＢＳ、１０-８Ｍ １２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ、及びＡＳＯを１０-１１〜１０-５Ｍの濃度範囲で含有するＧａｌＮＡｃクラスターを含む適切な成長培地を含有する競合混合物１ｍＬとともに、３７℃で３０分間インキュベートした。非特異的結合を、１０-２Ｍ ＧａｌＮＡｃ糖存在下で測定した。細胞をＦＢＳ不含培地で２回洗浄し、結合しなかった１２５Ｉ標識ｄｅ−ＡＧＰ及び競合相手のＧａｌＮＡｃ ＡＳＯを除去した。１％β−メルカプトエタノールを含有するＱｉａｇｅｎ製ＲＬＴ緩衝液を用いて細胞を溶解させた。１０分間の短時間凍結／融解サイクル後に溶解物を丸底アッセイチューブに移し、γ−カウンターで評価した。非特異的結合を差し引いてから、１２５Ｉタンパク質カウントをＧａｌＮＡｃ−ＡＳＯ濃度最低カウント値で割った。非線形回帰アルゴリズムを用いた単一部位競合結合等式に従って阻害曲線を当てはめて、結合親和性（ＫＤ）を計算した。
表１１０の結果を、日を異にして実施した５日の実験から得た。上付き文字「ａ」の付いたオリゴヌクレオチドの結果は、日を異にして実施した２日の実験の平均である。結果は、５’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、ヒトＨｅｐＧ２細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合し、３’末端にＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドよりも１．５〜１６倍高い親和性を有することを示している。
実施例１００：生体内におけるＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表１１１ａに列記されるオリゴヌクレオチドを、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。
処置
ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雌トランスジェニックマウスそれぞれに、表１１１ｂに列記される用量のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、週１回、計６回投与で皮下注射した。各処置群は３匹の動物で構成された。血液を、Ａｐｏ（ａ）タンパク質血漿中濃度のベースライン決定のために投与前日に採取し、その後は、初回投与から７２時間、１週間、及び２週間後に採取した。初回投与から３週間、４週間、５週間、及び６週間後にさらに採血する。血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。表１１１ｂの結果は、ベースラインレベル（％ＢＬ）を基準として正規化された、処置群ごとの、血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）発現を強力に低下させたことを示している。この強い作用は、完全ＰＳヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド及びＰＯ結合とＰＳ結合の混合を含むオリゴヌクレオチドにおいて観察された。
実施例１０１：安定部分を介して連結されたＧａｌＮＡｃクラスターを含むオリゴヌクレオチドによるアンチセンス阻害
表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドを、生体内におけるマウスＡＰＯＣ−ＩＩＩ発現の阻害について試験した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスそれぞれに、表１１２に列記されるオリゴヌクレオチドつまたはＰＢＳを、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。ＩＳＩＳ４４０６７０で処置をした各マウスは、２、６、２０、または６０ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。ＩＳＩＳ６８０７７２または６９６８４７で処置をした各マウス０．６、２、６、または２０ｍｇ／ｋｇの投与を受けた。ＩＳＩＳ６９６８４７のＧａｌＮＡｃ共役基は安定部分、すなわち、容易に切断可能なホスホジエステルを含む結合ではなくホスホロチオエート結合を介して連結されている。動物を投与から７２時間後に屠殺した。肝臓ＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルを、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンｍＲＮＡレベルを基準として正規化した。結果は、処置群ごとの、生理食塩水対照群に対する各処理群のＡＰＯＣ−ＩＩＩ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして表１１２に提示される。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を欠くオリゴヌクレオチドよりも有意に強力であったことを示している。さらに、切断可能部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６８０７７２）は、安定部分を介してオリゴヌクレオチドに連結されたＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ６９６８４７）よりもさらに強力であった。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。
実施例１０２：ＧａｌＮＡｃ共役体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓における分布
ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないＩＳＩＳ３５３３８２（表３６を参照のこと）及びＧａｌＮＡｃ共役体を含むＩＳＩＳ６５５８６１（表３６を参照のこと）の肝臓に内分布を評価した。雄ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＩＳＩＳ３５３３８２または６５５８６１を、表１１３に列記される投与量で１回、皮下注射した。各処置群は３匹の動物で構成されたが、ＩＳＩＳ６５５８６１投与の１８ｍｇ／ｋｇ群だけは動物２匹で構成された。動物を投与から４８時間後に屠殺し、オリゴヌクレオチドの肝臓分布を測定した。１細胞当たりのアンチセンスオリゴヌクレオチド分子数を測定するため、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン・タグ（ＭＳＤ ＴＡＧ、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）をオリゴヌクレオチドプローブに結合させ、アンチセンスオリゴヌクレオチドの検出に使用した。表１１３に提示される結果は、１細胞あたり１００万オリゴヌクレオチド分子を１単位として表した処理群ごとのオリゴヌクレオチド平均濃度である。結果は、等価用量では、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、全肝臓及び肝細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも高い濃度で存在したことを示している。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、非実質肝臓細胞において、ＧａｌＮＡｃ共役体を含まないオリゴヌクレオチドよりも低い濃度で存在した。また、１細胞当たりの肝細胞及び非実質肝臓細胞におけるＩＳＩＳ６５５８６１の濃度が同様であった一方で、肝臓は、約８０容量％が肝細胞であった。したがって、肝臓内に存在するＩＳＩＳ６５５８６１オリゴヌクレオチドの大部分が肝細胞内に見られる一方で、肝臓内に存在するＩＳＩＳ３５３３８２オリゴヌクレオチドの大部分は、非実質肝臓細胞内に見られた。
実施例１０３：ＧａｌＮＡｃ３共役体を含むＡＰＯＣ−ＩＩＩを標的とするオリゴヌクレオチドの生体内における作用持続時間
下記表１１４に列記されるオリゴヌクレオチドを、作用持続時間についてマウスでの単回投与試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−３ａは、実施例３９に示され、及びＧａｌＮＡｃ３−１９ａの構造は実施例７０に示されている。
処置
ヒトＡＰＯＣ−ＩＩＩ を発現する雌トランスジェニックマウスそれぞれに、表１１４に列記のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、１回皮下注射した。各処置群は３匹の動物で構成された。血液採取を、ベースライン決定のための投与前に、また、投与から３、７、１４、２１、２８、３５、及び４２日後に行った。血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩタンパク質レベルを、実施例２０に記載のように測定した。表１１５の結果は、ベースラインレベルを基準として正規化された、処置群ごとの、血漿トリグリセリド及びＡＰＯＣ−ＩＩＩレベルの平均パーセントとして示される。実施例７９の表７１の結果と下記表１１５の結果を比較すると、ホスホジエステルヌクレオシド間結合とホスホロチオエートヌクレオシド間結合の両方を含むオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む等価オリゴヌクレオチドよりも作用持続時間が延長していることがわかる。
実施例１０４：５’−ＧａｌＮＡｃ２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
化合物１２０は市販のものであり、化合物１２６の合成実施例４９はに記載されている。化合物１２０（１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．３９ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）、及びＨＯＢｔ（１．６４ｇ、４．３３ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（１．７５ｍＬ、１０．１ｍｍｏｌ）を添加した。約５分後、アミノヘキサン酸ベンジルエステル（１．３６ｇ、３．４６ｍｍｏｌ）を反応物に添加した。３時間後、反応混合物に１００ｍｌの１Ｍ ＮａＨＳＯ４を注ぎ、２×５０ｍＬ酢酸エチルで抽出した。４０ｍＬ飽和ＮａＨＣＯ３で３回、ブラインで２回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過して濃縮した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し（ＤＣＭ：ＥＡ：Ｈｅｘ、１：１：１）、化合物２３１を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３１（１．３４ｇ、２．４３８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させ、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を添加した。室温で２時間攪拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、トルエン（３×１０ｍＬ）で共蒸発させた。残渣を減圧下で乾燥させ、トリフルオロ酢酸塩として化合物２３２を得た。化合物１６６の合成は実施例５４に記載されている化合物１６６（３．３９ｇ、５．４０ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させた。化合物２３２（１．３ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）の溶液をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｍＬ）を添加した。反応物を室温で３０分間撹拌した後、水（８０ｍＬ）に注ぎ、水層をＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３×８０ｍＬ）、１Ｍ ＮａＨＳＯ４（３×８０ｍＬ）、及びブライン（２×８０ｍＬ）で洗浄し、その後、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過して濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、化合物２３３を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。化合物２３３（０．５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を、メタノール（２．２ｍＬ）及び酢酸エチル（２．２ｍＬ）に溶解させた。パラジウム炭素（１０重量％Ｐｄ／Ｃ、湿潤、０．０７ｇ）を添加し、反応混合物を水素雰囲気下で３時間撹拌した。反応混合物をセライトのパッドを通してろ過し、濃縮してカルボン酸を得た。カルボン酸（１．３２ｇ、１．１５ｍｍｏｌ、クラスター遊離酸）をＤＭＦ（３．２ｍＬ）に溶解させた。これに、Ｎ，Ｎ-ジイソプロピルエチルアミン（０．３ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）及びＰＦＰＴＦＡ（０．３０ｍＬ、１．７３ｍｍｏｌ）を添加した。室温で３０分攪拌した後、反応混合物を、水（４０ｍＬ）に注ぎ、ＥｔＯＡｃで抽出した（２×５０ｍＬ）。上記のように標準的な確認検査を完了し化合物２３４を得た。ＬＣＭＳ及びＮＭＲは、その構造と一致した。実施例４６に記載の一般的手順を用いてオリゴヌクレオチド２３５を調製した。共役基ＧａｌＮＡｃ２−２４のＧａｌＮＡｃ２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ２−２４ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基をうることができる。ＧａｌＮＡｃ２−２４の構造（ＧａｌＮＡｃ２−２４ａ−ＣＭ）を下に示す。
実施例１０５：ＧａｌＮＡｃ１−２５共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
化合物１６６の合成は実施例５４に記載されている。オリゴヌクレオチド２３６を実施例４６に記載の一般的手順を用いて調製した。
別法として、以下に示すスキームを用いてオリゴヌクレオチド２３６を合成し、実施例１０に記載される手順を用いて、化合物２３８を用いてオリゴヌクレオチド２３６を形成した。
共役基ＧａｌＮＡｃ１−２５のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−２５ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基をうることができる。ＧａｌＮＡｃ１−２５の構造（ＧａｌＮＡｃ１−２５ａ−ＣＭ）を下に示す。
実施例１０６：ＧａｌＮＡｃ２またはａ５’−ＧａｌＮＡｃ３共役体を含むＳＲＢ−１を標的とするオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
表１１６及び１１７に列記のオリゴヌクレオチドを、ＳＲＢ−１のアンチセンス阻害についてマウスでの用量依存的試験で検討した。
処置
６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、２、７、もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号４４０７６２、または０．２、０．６、２、６、若しくは２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ番号６８６２２１、６８６２２２、もしくは７０８５６１、または生理食塩水を１回皮下注入した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から７２時間後にマウスを屠殺した。リアルタイムＰＣＲを用いて、肝臓のＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを測定した。ＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを、標準のプロトコルに従ってシクロフィリンｍＲＮＡレベルを基準として正規化した。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、用量依存的にＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させ、そのＥＤ５０の結果を表１１６及び１１７に示す。先の研究において、三価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドは二価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であり、これら、次いで、一価ＧａｌＮＡｃ共役オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であることが示されたが（例えば、Ｋｈｏｒｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．１６，５２１６−５２３１（２００８）を参照のこと）、表１１６及び１１７に示されるように、一価、二価、及び三価ＧａｌＮＡｃクラスターを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置は、同様の力価でＳＲＢ−１ ｍＲＮＡレベルを低下させた。
表の凡例については実施例９３を参照のこと。ＧａｌＮＡｃ３−１３ａの構造は実施例６２に示されており、ＧａｌＮＡｃ２−２４の構造は実施例１０４に示されている。
表の凡例については実施例９３を参照のこと。ＧａｌＮＡｃ１−２５ａの構造は実施例１０５に示されている。
実施例７５に記載の手順を用いて、表１１６及び１１７のオリゴヌクレオチドの肝臓中濃度も評価した。下記表１１７ａ及び１１７ｂに示される結果は、肝臓組織１ｇ当たりのオリゴヌクレオチド（単位：μｇ）をＵＶにより測定した、処置群ごとの平均総アンチセンスオリゴヌクレオチド組織濃度である。結果は、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドはＧａｌＮＡｃ共役基を欠く同一用量のオリゴヌクレオチドよりも有意に高いレベルで肝臓に蓄積したことを示している。さらに、それらのそれぞれの共役基に１、２、または３個のＧａｌＮＡｃリガンドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはいずれも同様のレベルで肝臓に蓄積した。上記で引用したＫｈｏｒｅｖらの参考文献を考慮すると、これは驚くべき結果であり、上表１１６及び１１７に示される活性データと一致する。
実施例１０７：ＧａｌＮＡｃ１−２６またはＧａｌＮＡｃ１−２７共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
ＨＢＴＵ及びＤＩＥＡ含有ＤＭＦを用いて、化合物４７（実施例１５を参照のこと）と酸６４（実施例３２を参照のこと）とのカップリングによりオリゴヌクレオチド２３９を合成する。生成されたアミド含有化合物をホスフィチル化し、その後、実施例１０に記載の手順を用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端に付加する。共役基ＧａｌＮＡｃ１−２６のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−２６ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ１−２６の構造（ＧａｌＮＡｃ１−２６ａ−ＣＭ）を下記に示す
ＧａｌＮＡｃ１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するため、実施例７に記載の手順を用いて、化合物４７と６４を反応させて生成したアミドを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載の手順を用いてオリゴヌクレオチド合成を完了し、オリゴヌクレオチド２４０を形成させる。
共役基ＧａｌＮＡｃ１−２７のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−２７ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を得ることができる。ＧａｌＮＡｃ１−２７の構造（ＧａｌＮＡｃ１−２７ａ−ＣＭ）を下記に示す
実施例１０８：生体内でＡｐｏ（ａ）を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内におけるアンチセンス阻害
下記表１１８に列記されるオリゴヌクレオチドを、マウスでの単回投与試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。
処置
ヒトＡｐｏ（ａ）を発現する雄トランスジェニックマウスそれぞれに、表１１９に列記される用量のオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳを、１回皮下注射した。各処置群は４匹の動物からなった。血液を投与前日に採取してＡｐｏ（ａ）タンパク質の血漿中濃度ベースラインを決定し、その後、初回投与の１週間後に採取した。以降、約８週間、毎週採血する。血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。表１１９の結果は、ベースラインレベル（％ＢＬ）を基準として正規化された、処置群ごとの、血漿Ａｐｏ（ａ）タンパク質レベルの平均パーセントとして提示され、結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがＡｐｏ（ａ）タンパク質の発現を低下させたことを示している。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を含まないオリゴヌクレオチドよりもさらに強力にＡｐｏ（ａ）発現を低下させることが示された。
実施例１０９：ＧａｌＮＡｃ１−２８またはＧａｌＮＡｃ１−２９共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
実施例７１に記載の手順と同様の手順を用いてオリゴヌクレオチド２４１を合成し、ホスホラミダイト中間体を生成させ、その後、実施例１０に記載の手順でオリゴヌクレオチドを合成する。共役基ＧａｌＮＡｃ１−２８のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−２８ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基をうることができる。ＧａｌＮＡｃ１−２８の構造（ＧａｌＮＡｃ１−２８ａ−ＣＭ）を下に示す。
ＧａｌＮＡｃ１共役基をオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するために、実施例７１に記載される手順と同様の手順を用いてヒドロキシル中間体を生成させ、その後、実施例７に記載される手順を用いてこれを固体支持体に付加する。その後、実施例９に記載される手順を用いてオリゴヌクレオチド合成を完了し、オリゴヌクレオチド２４２を形成させる。
共役基ＧａｌＮＡｃ１−２９のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−２９ａ）と、オリゴヌクレオチド上に存在する任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基をうることができる。ＧａｌＮＡｃ１−２９の構造（ＧａｌＮＡｃ１−２９ａ−ＣＭ）を下に示す。
実施例１１０：ＧａｌＮＡｃ１−３０共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
ＧａｌＮＡｃ１−３０共役基を含むオリゴヌクレオチド２４６（ここで、Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成した。共役基ＧａｌＮＡｃ１−３０のＧａｌＮＡｃ１クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ１−３０ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、Ｙは、切断可能部分の一部である。ある特定の実施形態では、Ｙは、安定部分の一部であり、切断可能部分はオリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ１−３０ａの構造を下に示す。
実施例１１１：ＧａｌＮＡｃ２−３１またはＧａｌＮＡｃ２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成
ＧａｌＮＡｃ２−３１共役基を含むオリゴヌクレオチド２５０（ここで、Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成した。共役基ＧａｌＮＡｃ２−３１のＧａｌＮＡｃ２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ２−３１ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接するＹ含有基は、切断可能部分の一部である。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接するＹ含有基は、安定部分の一部であり、切断可能部分はオリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ２−３１ａの構造を下に示す。
ＧａｌＮＡｃ２−３２共役体を含むオリゴヌクレオチドの合成を下記に示す。
ＧａｌＮＡｃ２−３２共役基を含むオリゴヌクレオチド２５２（ここで、Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される）を上に示されるように合成した。共役基ＧａｌＮＡｃ２−３２のＧａｌＮＡｃ２クラスター部分（ＧａｌＮＡｃ２−３２ａ）と、任意の切断可能部分とを組み合わせて、さまざまな共役基を提供することができる。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接するＹ含有基は、の一部である、切断可能部分。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端に直接隣接するＹ含有基は、安定部分の一部であり、切断可能部分はオリゴヌクレオチド上に存在する。ＧａｌＮＡｃ２−３２ａの構造を下に示す。
実施例１１２：ＧａｌＮＡｃ１共役体を含む修飾オリゴヌクレオチド
ＧａｌＮＡｃリガンドを１つ含有する共役基を含んでいるオリゴヌクレオチドの力価をさらに試験するため、ＳＲＢ−１を標的とする表１２０のオリゴヌクレオチドをＧａｌＮＡｃ１共役基と共に合成した。
実施例１１３：アンジオポエチン様因子３を標的としＧａｌＮＡｃ共役基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
表１２１のオリゴヌクレオチドを、ヒトアンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）を標的とするよう設計した。
実施例１１４：ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
ヒトＡＮＧＰＴＬ３を発現する６週齢雄Ｃ５７Ｂｌ／６トランスジェニックマウスそれぞれに、下記に示す用量の表１２２に列記（表１２１に記載）のオリゴヌクレオチド、またはＰＢＳを、週１回、計２回投与で、腹腔内に注入した。各処置群は４匹の動物からなった。最終投与から２日後にマウスを屠殺した。肝臓でのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＰＣＲ及びＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を用いて標準のプロトコルに従って測定した。下記の結果は、ＰＢＳ対照を基準として正規化された、処置群ごとの、肝臓でのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルの平均パーセントとして示される。
表１２２に例示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、肝臓でのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルが用量依存的に低下し、ＧａｌＮＡｃ共役体を含むオリゴヌクレオチドは、ＧａｌＮＡｃ共役体を欠く親オリゴヌクレオチドよりも有意に強力であった。
屠殺時に、標準のプロトコルを用いて、肝臓のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルも測定した。結果は、どの処置群でもＡＬＴレベルが上昇しなかったことを示しており、このことは、オリゴヌクレオチドは忍容性が良好であったことを示している。
実施例１１５：マウスＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドによる生体内でのアンチセンス阻害
下記表１２３に列記されるオリゴヌクレオチドをマウスでの用量依存的試験で検討した。
ＧａｌＮＡｃ３−７ａの構造は実施例４８に示されている。
低比重リポタンパク質受容体ノックアウト（ＬＤＬＲ−／−）マウスに１週間の西洋食を給餌してから、下記に示す用量の表１２３に列記のオリゴヌクレオチド、またはＰＢＳを、週１回腹腔内に注入した。各処置群は５匹の動物で構成された。ベースラインのトリグリセリド血漿中濃度を決定定するために、初回用量の投与前に血液を採取し、その後、初回投与から２週間後に採血した。表１２４の結果は、ベースラインレベル（％ＢＬ）を基準として正規化された、処置群ごとの、血漿トリグリセリド値の平均パーセントとして提示され、結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドがトリグリセリドを用量依存的に低下させたことを示している。さらに、ＧａｌＮＡｃ共役基を含むオリゴヌクレオチドは、共役基を含まないオリゴヌクレオチドよりもトリグリセリドをさらに強力に低下させた。
実施例１１６：ＭＯＥギャップマーによるＨｅｐ３Ｂ細胞内ヒトアンジオポエチン様因子３のアンチセンス阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、アンジオポエチン様因子３（ＡＮＧＰＴＬ３）の核酸を標的とするよう設計し、そのＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対する効果について生体外で試験した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、培養条件が同様である一連の実験において試験した。各実験結果を、下記の別々の表に示す。密度２０，０００細胞／ウェルで培養したＨｅｐ３Ｂ細胞を、電気穿孔法を用いて４，５００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約２４時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢ（順方向配列ＣＣＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴＴ（本明細書ではこれを配列番号４とする）、逆方向配列ＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＡＧＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴ（本明細書ではこれを配列番号５とする）、プローブ配列ＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＴＣＡＡＡＴＡ（本明細書ではこれを配列番号６とする））を使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
下記表の新たに設計したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーは２０ヌクレオシド長であり、ここで、かかる中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、これに、５’方向及び３’方向にある、それぞれが５個のヌクレオシドを含んでいるウィングセグメントが隣接している。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの全体にわたるヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体を通してシトシン残基はすべて５-メチルシトンである。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も３’側のヌクレオシドを指す。下記表に列記する各ギャップマーは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（本明細書では配列番号１とする）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３ゲノム配列（本明細書では配列番号２とする）（ヌクレオチド３３０３２００１から３３０４６０００までを切り出したＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＴ＿０３２９７７．９）のいずれかを標的とする。「ｎ／ａ」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補性が１００％であるその特定遺伝子配列を標的としないことを示す。
実施例１１７：ＭＯＥギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外で有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記試験の５−１０−５ＭＯＥギャップマーを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．７５μＭ、１．５０μＭ、３．００μＭ、６．００μＭ及び１２．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１１８：ＭＯＥギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外で有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記試験の５−１０−５ＭＯＥギャップマーを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．８１３μＭ、１．６２５μＭ、３．２５μＭ、６．５０μＭ及び１３．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１１９：デオキシ、ＭＯＥ及び（Ｓ）−ｃＥｔギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害
別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ３の核酸を標的とするよう設計し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対するその効果について生体外で試験した。密度２０，０００細胞／ウェルで培養したＨｅｐ３Ｂ細胞を、電気穿孔法を用いて４，５００ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約２４時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
下記表の新たに設計したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、デオキシ、ＭＯＥ、及び（Ｓ）−ｃＥｔオリゴヌクレオチドとして設計した。デオキシ、ＭＯＥ及び（Ｓ）−ｃＥｔオリゴヌクレオチドは１６ヌクレオシド長であり、ここで、ヌクレオシドは、ＭＯＥ糖修飾、（Ｓ）−ｃＥｔ糖修飾、またはデオキシ糖残基のいずれかを有する。各アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖修飾は「ｅｅｋ−ｄ１０−ｋｋｅ」のように記載され、その場合、「ｋ」は（Ｓ）−ｃＥｔ糖修飾を示し、「ｄ」はデオキシリボースを示し、数字はデオキシリボース糖残基の数を示し、「ｅ」はＭＯＥ糖修飾を示す。各オリゴヌクレオチドの全体を通してヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各オリゴヌクレオチド全体を通してシトシン残基はすべて５−メチルシトシンである。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列においてオリゴヌクレオチドが標的とする、最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてオリゴヌクレオチドが標的とする、最も３’側のヌクレオシドを指す。下記表に列記する各オリゴヌクレオチドは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（本明細書では配列番号１とする）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３ゲノム配列（本明細書では配列番号２とする）（ヌクレオチド３３０３２００１から３３０４６０００までを切り出したＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＴ＿０３２９７７．９）のいずれかを標的とする。「ｎ／ａ」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補性が１００％であるその特定遺伝子配列を標的としないことを示す。
実施例１２０：デオキシ、ＭＯＥ及び（Ｓ）−ｃＥｔギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害
別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ３の核酸を標的とするよう設計し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対するその効果について生体外で試験した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ３３７４８７及びＩＳＩＳ２３３７１７も、基準オリゴヌクレオチドとしてアッセイに含めた。密度２０，０００細胞／ウェルで培養したＨｅｐ３Ｂ細胞を、電気穿孔法を用いて４，５００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約２４時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
下記表の新たに設計したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、デオキシ、ＭＯＥ、及び（Ｓ）−ｃＥｔオリゴヌクレオチドとして、または５−１０−５ＭＯＥギャップマーとして設計した。デオキシ、ＭＯＥ及び（Ｓ）−ｃＥｔオリゴヌクレオチドは１６ヌクレオシド長であり、ここで、ヌクレオシドは、ＭＯＥ糖修飾、（Ｓ）−ｃＥｔ糖修飾、またはデオキシ糖残基のいずれかを有する。各アンチセンスオリゴヌクレオチドの糖修飾は「ｅｅｋ−ｄ１０−ｋｋｅ」のように記載され、その場合、「ｋ」は（Ｓ）−ｃＥｔ糖修飾を示し、「ｄ」はデオキシリボースを示し、数字はデオキシリボース糖残基の数を示し、「ｅ」はＭＯＥ修飾を示す。５−１０−５ＭＯＥギャップマーは２０ヌクレオシド長であり、ここで、かかる中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、これに、５’方向及び３’方向にある、それぞれが５個のヌクレオシドを含んでいるウィングセグメントが隣接している。各オリゴヌクレオチドの全体を通してヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各オリゴヌクレオチド全体を通してシトシン残基はすべて５−メチルシトシンである。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列においてオリゴヌクレオチドが標的とする、最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてオリゴヌクレオチドが標的とする、最も３’側のヌクレオシドを指す。下記表に列記する各オリゴヌクレオチドは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（本明細書では配列番号１とする）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３ゲノム配列（本明細書では配列番号２とする）（ヌクレオチド３３０３２００１から３３０４６０００までを切り出したＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＴ＿０３２９７７．９）のいずれかを標的とする。「ｎ／ａ」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補性が１００％であるその特定遺伝子配列を標的としないことを示す。
実施例１２１：ＭＯＥギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害
別のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＮＧＰＴＬ３の核酸を標的とするよう設計し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡに対するその効果について生体外で試験した。密度２０，０００細胞／ウェルで培養したＨｅｐ３Ｂ細胞を、電気穿孔法を用いて４，５００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約２４時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲにより測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
下記表の新たに設計したキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを、５−１０−５ＭＯＥまたは３−１０−４ＭＯＥギャップマーとして設計した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーは２０ヌクレオシド長であり、ここで、かかる中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、これに、５’方向及び３’方向にある、それぞれが５個のヌクレオシドを含んでいるウィングセグメントが隣接している。３−１０−４ＭＯＥギャップマーは、１７ヌクレオシド長であり、ここで、かかる中央のギャップセグメントは１０個の２’−デオキシヌクレオシドを含み、これに隣接する５’方向及び３’方向にあるウィングセグメントはそれぞれ、３個及び４個のヌクレオシドを含んでいる。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。５’ウィングセグメントの各ヌクレオシド及び３’ウィングセグメントの各ヌクレオシドは、２’−ＭＯＥ修飾を有する。各ギャップマーの全体にわたるヌクレオシド間結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）結合である。各ギャップマー全体を通してシトシン残基はすべて５−メチルシトンである。「開始部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も５’側のヌクレオシドを指す。「終止部位」は、ヒト遺伝子配列においてギャップマーが標的とする、最も３’側のヌクレオシドを指す。下記表に列記する各ギャップマーは、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ（本明細書では配列番号１とする）（ＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、またはヒトＡＮＧＰＴＬ３ゲノム配列（本明細書では配列番号２とする）（ヌクレオチド３３０３２００１から３３０４６０００までを切り出したＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＴ＿０３２９７７．９）のいずれかを標的とする。「ｎ／ａ」は、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、相補性が１００％であるその特定遺伝子配列を標的としないことを示す。
実施例１２２：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外で有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記試験のデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。ＩＳＩＳ２３３７１７とＩＳＩＳ３３７８４７のいずれの５−１０−５ＭＯＥギャップマーも、試験に含めた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、培養条件が同様である一連の実験において試験した。各実験結果を以下に別々の表に示す。
細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．８１３μＭ、１．６２５μＭ、３．２５μＭ、６．５００μＭ及び１３．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１２３：Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外で有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記試験のデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ３３７８４７も試験に含めた。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、培養条件が同様である一連の実験において試験した。各実験結果を以下に別々の表に示す。
細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．１６０μＭ、０．４８１μＭ、１．４４４μＭ、４．３３３μＭ及び１３．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１２４：ＭＯＥギャップマーによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外での有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記実施例のＭＯＥギャップマーを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．１６０μＭ、０．４８１μＭ、１．４４４μＭ、４．３３３μＭ及び１３．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１２５：デオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドによる、Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるヒトＡＮＧＰＴＬ３の用量依存的アンチセンス阻害
生体外で有意なＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ阻害を示した上記試験のデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを選択し、用量をさまざまに変えてＨｅｐ３Ｂ細胞において試験した。細胞を、密度２０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、下記表に具体的に示すように、電気穿孔法を用いて濃度０．１１１μＭ、０．３３３μＭ、１．００μＭ、３．００μＭ及び９．００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクションした。約１６時間の処理期間後、細胞からＲＮＡを単離し、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを定量リアルタイムＰＣＲで測定した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを使用してｍＲＮＡレベルを測定した。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で測定したトータルＲＮＡ含有量にしたがって調整した。結果を、未処置対照細胞と比べたＡＮＧＰＴＬ３の阻害パーセントとして示す。
各オリゴヌクレオチドの５０％阻害濃度（ＩＣ５０）も提示する。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した細胞において、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルは用量依存的に有意に低下した。
実施例１２６：ｈｕＡＮＧＰＴＬ３トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害
上記試験に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの転写を抑制する能力について、ヒトＡＮＧＰＴＬ３導入遺伝子を有するＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔｇマウス）でさらに評価した。
試験１
雌Ｔｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に５−１０−５ＭＯＥギャップマーを用量５０ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢを用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。ヒトのプライマー・プローブセットＲＴＳ１９８４（順方向配列ＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＧＡＡＣＴ（本明細書ではこれを配列番号７とする）、逆方向配列ＴＣＴＣＴＡＧＧＣＣＣＡＡＣＣＡＡＡＡＴＴＣ（本明細書ではこれを配列番号８とする）、プローブ配列ＡＡＡＴＡＴＧＧＴＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＡＴ（本明細書ではこれを配列番号９とする））を用いてｍＲＮＡレベルも測定した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置によりＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低下がもたらされたことを示している。
血漿化学マーカー
１０日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験２
雄Ｔｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に５−１０−５ＭＯＥギャップマーを用量５０ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ＲＴＳ１９８４を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置によりＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低下がもたらされたことを示している。
血漿化学マーカー
８日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験３
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に、５−１０−５ＭＯＥギャップマーを２．５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇの用量で週１回３週間、腹腔内注射を行った。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２（順方向配列ＡＡＡＴＴＴＴＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣ（本明細書ではこれを配列番号１０とする）、逆方向配列ＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＴＴＧＧＣＣＣＴＴＣＧ（本明細書ではこれを配列番号１１とする）、プローブ配列ＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＣＴＴＴＧＴＣＣ（本明細書ではこれを配列番号１２とする））を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。各ギャップマーのＥＤ５０も下記表に示す。「ｎ．ｄ．」は、ＥＤ５０が測定不可能であったことを示す。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置によりＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低下がもたらされたことを示している。「ｎ．ｄ．」は、ＥＤ５０が測定不可能であったことを示す。
血漿化学マーカー
１７日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験４
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に５−１０−５ＭＯＥギャップマーを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
血漿化学マーカー
１０日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験５
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に５−１０−５ＭＯＥギャップマーまたはデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔギャップマーを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ＲＴＳ１９８４を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
血漿化学マーカー
９日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験６
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群にデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ２３３７１０も基準として含めた。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドのうちいくつかは、その処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡを有意に低下させた。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドのうちいくつかを用いた処置により、ＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルの低下がもたらされたことを示している。
血漿化学マーカー
１０日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験７
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群にデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ２３３７１０も基準として含めた。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、一部のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＡＮＧＰＴＬ３レベルの低下がもたらされたことを示している。この場合、値「０」は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置で発現が阻害されなかったことを意味し、場合によっては、発現レベルの上昇が記録された可能性もある。
血漿化学マーカー
９日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験８
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群にデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ２３３７１０も基準として含めた。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＡＮＧＰＴＬ３レベルの低下がもたらされたことを示している。
血漿化学マーカー
８日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験９
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群にデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを用量２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。５−１０−５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ２３３７１０も基準として含めた。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、一部のＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡが有意に低下した。この場合、値「０」は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置で発現が阻害されなかったことを意味し、場合によっては、発現レベルの上昇が記録された可能性もある。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。結果は、一部のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＡＮＧＰＴＬ３レベルの低下がもたらされたことを示している。この場合、値「０」は、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを用いた処置で発現が阻害されなかったことを意味し、場合によっては、発現レベルの上昇が記録された可能性もある。
血漿化学マーカー
９日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験１０
雄及び雌のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
複数のマウス群に５−１０−５ＭＯＥギャップマーまたはデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを用量５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、または２５ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内に注入した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、ＲＮＡを肝臓から抽出し、ｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２の他にＲＴＳ３４９２＿ＭＧＢも用いた、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、一部のＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの低下がもたらされた。
血漿化学マーカー
８日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらの肝機能マーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
実施例１２７：ＣＤ１マウスにおけるヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
ＣＤ１（登録商標）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＭＡ）は、多目的マウスモデルであり、安全性及び有効性試験に利用されることが多い。マウスを、上述の試験から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、各種血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
試験１
雄ＣＤ１マウス（各処置群につき動物１匹）に、２００ｍｇ／ｋｇのデオキシ、ＭＯＥ、及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを単回投与でを腹腔内に注入した。雄ＣＤ１マウス１匹にＰＢＳを単回投与で皮下注射した。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
４日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらのいずれかの肝機能マーカーのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
体重
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの単回投与の翌日、体重を測定し、下記表に示す。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験２
雄ＣＤ１マウス（各処置群につき動物１匹）に、２００ｍｇ／ｋｇのデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを単回投与でを腹腔内に注入した。雄ＣＤ１マウス１匹にＰＢＳを単回投与で皮下注射した。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
５日目のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用してトランスアミナーゼ（ＡＬＴ及びＡＳＴ）の血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらのいずれかの肝機能マーカーのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの単回投与から５日目に体重を測定したものを下記表に示す。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験３
雄ＣＤ１マウス（処置群当たり動物４匹）に、１００ｍｇ／ｋｇの５−１０−５ＭＯＥギャップマーを週１回、６週間の投与で腹腔内に注入した。雄ＣＤ１マウス４匹の一群にＰＢＳを週１回、６週間投与で、腹腔内に注入した。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、４５日目の肝臓及び腎臓機能の各種マーカーの血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらのマーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
体重
４３日目に体重を測定したものを下記表に示す。４５日目の試験終了時、腎臓、肝臓及び脾臓重量を測定した。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験４
雄ＣＤ１マウス（処置群当たり動物４匹）に、５０ｍｇ／ｋｇ若しくは１００ｍｇ／ｋｇの５−１０−５ＭＯＥギャップマー、またはデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを、週１回、６週間投与で腹腔内に注入した。雄ＣＤ１マウス４匹の一群にＰＢＳを週１回、６週間投与で、腹腔内に注入した。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、４６日目の肝臓及び腎臓機能の各種マーカーの血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらのマーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
体重
４４日目に体重を測定したものを下記表に示す。４６日目の試験終了時、腎臓、肝臓及び脾臓重量を測定した。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験５
雄ＣＤ１マウス（処置群当たり動物４匹）に、５０ｍｇ／ｋｇのデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを、週１回、６週間投与で腹腔内に注入した。雄ＣＤ１マウス４匹の一群にＰＢＳを週１回、６週間投与で、腹腔内に注入した。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、４３日目の肝臓及び腎臓機能の各種マーカーの血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。これらのマーカーのいずれかのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
体重
４１日目に体重を測定したものを下記表に示す。４３日目の試験終了時、腎臓、肝臓及び脾臓重量を測定した。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
実施例１２８：ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度測定
粘度が４０センチポアズ（ｃＰ）以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングで除くことを目的として、上述の試験から選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドの粘度を測定した。粘度より大きい４０ｃＰであるオリゴヌクレオチド至適粘度に満たないと考えられる。
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチド（３２〜３５ｍｇ）をガラス容器に秤量してから１２０μＬの水を添加し、バイアルを５０℃で加熱してアンチセンスオリゴヌクレオチドを溶液に溶解させた。予熱した試料の一部（７５μＬ）をピペットでマイクロ粘度計（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に移した。マイクロ粘度計の温度を２５℃に設定し試料の粘度を測定した。予熱した試料の別の一部（２０μＬ）をピペットで採って１０ｍｌの水に入れ、８５℃にて２６０ｎＭのＵＶ測定を行った（Ｃａｒｙ ＵＶ装置）。下記表に示す結果は、各アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度３５０ｍｇ／ｍｌで行ったものであるが、大部分のアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液は、その粘度が上述の基準下で至適であることを示している。
実施例１２９：Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの忍容性
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、安全性及び有効性評価に使用される多目的モデルである。上述の実施例に記載されている試験から得たＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドでラットを処理し、各種血漿化学マーカーのレベルの変化について評価した。
試験１
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１２時間の明暗周期で維持し、Ｐｕｒｉｎａラット用通常固形食餌５００１を自由に摂食させた。１群がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４匹からなる複数の群に、ＰＢＳまたは１００ｍｇ／ｋｇの５−１０−５ＭＯＥギャップマーを週１回、６週間、皮下注射した。最終投与から４８時間後、ラットを安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
肝機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの肝機能に対する効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを４５日目に測定し、その結果を下記表に示す（単位：ＩＵ／Ｌ）。ビリルビンの血漿レベルも同一の臨床化学分析装置を使用して測定し、その結果も下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの肝機能マーカーのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
腎機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの腎機能に対する効果を評価するため、血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの血漿中レベルを自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて測定した。結果を下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの腎機能マーカーのレベルが、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。総尿タンパク質量及び尿クレアチニン量を測定し、総尿タンパク質量とクレアチニンとの比を評価した。結果を下記表に示す。
臓器重量
４２日目に体重を測定し、下記表に示す。試験終了にあたる４５日目に肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定し、それを下記表に示す。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験２
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１２時間の明暗周期で維持し、Ｐｕｒｉｎａラット用通常固形食餌５００１を自由に摂食させた。１群がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４匹からなる複数の群に、５−１０−５ＭＯＥギャップマーまたはデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを５０ｍｇ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ、またはＰＢＳを週１回、６週間、皮下注射した。最終投与から４８時間後、ラットを安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
肝機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの肝機能に対する効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを４４日目に測定し、その結果を下記表に示す（単位：ＩＵ／Ｌ）。ビリルビンの血漿レベルも同一の臨床化学分析装置を使用して測定し、その結果も下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの肝機能マーカーのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
腎機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの腎機能に対する効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの血漿中レベルを４４日目に測定した。結果を下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの腎機能マーカーのレベルが、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。総尿タンパク質量及び尿クレアチニン量を測定し、総尿タンパク質量とクレアチニンとの比を評価した。結果を下記表に示す。
臓器重量
４２日目に体重を測定し、下記表に示す。試験終了にあたる４４日目に肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定し、それを下記表に示す。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
試験３
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１２時間の明暗周期で維持し、Ｐｕｒｉｎａラット用通常固形食餌５００１を自由に摂食させた。１群がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４匹からなる複数の群に、ＰＢＳまたは５０ｍｇ／ｋｇのデオキシ、ＭＯＥ及びｃＥｔオリゴヌクレオチドを週１回、６週間、皮下注射した。最終投与から４８時間後、ラットを安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
肝機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの肝機能に対する効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを４４日目に測定し、その結果を下記表に示す（単位：ＩＵ／Ｌ）。ビリルビンの血漿レベルも同一の臨床化学分析装置を使用して測定し、その結果も下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの肝機能マーカーのレベルを、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
腎機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの腎機能に対する効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンの血漿中レベルを４４日目に測定した。結果を下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。いずれかの腎機能マーカーのレベルが、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。総尿タンパク質量及び尿クレアチニン量を測定し、総尿タンパク質量とクレアチニンとの比を評価した。結果を下記表に示す。
臓器重量
４２日目に体重を測定し、下記表に示す。試験終了にあたる４４日目に肝臓、脾臓及び腎臓の重量を測定し、それを下記表に示す。臓器重量をアンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外まで変化させたＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、それ以降の試験では除外された。
実施例１３０：ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドのカニクイザルにおける効果
カニクイザルを、上述の実施例に記載の試験から選択したＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置した。アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性及び忍容性、並びに、肝臓及び腎臓にける薬物動態プロファイルを評価した。
本試験の実施時、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースではカニクイザルゲノム配列を入手できなかったため、カニクイザル遺伝子配列との交差反応性を確認することはできなかった。代わりに、カニクイザルに使用するＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を、相同性についてアカゲザル配列と比較した。アカゲザル配列に相同であるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、カニクイザル配列とも十分に交差反応性を有すると予想される。被験ヒトアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アカゲザルゲノム配列（ヌクレオチド３０４９００１から３０６２０００までを切り出したＧＥＮＢＡＮＫアクセション番号ＮＷ＿００１１０８６８２．１（本明細書では配列番号３とする））と交差反応性を有する。ヒトオリゴヌクレオチドとアカゲザル配列の間の相補性が高いほど、ヒトオリゴヌクレオチドがアカゲザル配列と交差反応できる可能性は高くなる。配列番号３に対する各オリゴヌクレオチドの開始部位及び終止部位を下記表に示す。「開始部位」とは、アカゲザル遺伝子配列中でギャップマーの標的になる最も５’側のヌクレオチドを示す。「ミスマッチ」は、アカゲザルゲノム配列とミスマッチしているヒトオリゴヌクレオチド中の核酸塩基の数を示す。
処置
試験に先立ち、サルを少なくとも３０日間隔離して飼育し、その期間中、動物を全身の健康状態について毎日観察した。サルは２〜４歳齢、及び体重２〜４ｋｇであった。１群が無作為に割り付けた雄カニクイザル５匹からなる９つの群それぞれに対し、背中の４部位に時計回りに（すなわち左、上、右、及び下）、１投与につき１部位にて、ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドまたはＰＢＳの皮下注射を行った。サルに対し、第１週は、ＰＢＳまたは４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの負荷量を隔日投与し（１、３、５、及び７日目）、以降は、ＰＢＳまたは４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳオリゴヌクレオチドを週１回１２週間（１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、及び８４日目）投与した。
試験期間中、病気または苦痛の徴候について１日２回サルを観察した。処置、傷害または病気のために一時的疼痛および苦痛を経験している動物はいずれも、試験責任者と相談してから、疼痛緩和のために獣医学スタッフにより承認されている鎮痛薬または薬剤を用いた処置を受けた。健康状態が不良である、または瀕死状態である可能性のある動物は、以降のモニタリング及び可能性の考えられる安楽死のために特定された。例えば、ＩＳＩＳ５６７３２１処置群の１匹の動物が４５日目に瀕死状態であることがわかり、処分された。予定されている動物の安楽死は、ケタミン／キシラジンで誘導した麻酔後の放血及びペントバルビタールナトリウム投与により８６日目に（最終投与から約４８時間後に）実施した。実施例に記載のプロトコルは、所内動物の飼育と使用に関する委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＣＵＣ）による承認を受けていた。
肝標的の低下
ＲＮＡ分析
８６日目、ＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析用にＲＮＡを肝臓から抽出した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。下記表に示すように、ＩＳＩＳアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処置により、ＰＢＳ対照と比較して、ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡの有意な低下がもたらされた。ＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルの分析により、アカゲザル配列と十分に交差反応性を有するＩＳＩＳ５４４１９９とＩＳＩＳ５５９２７７はともに発現レベルを有意に低下させることが明らかになった。ミスマッチを有するサル配列を標的とする他のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドもＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡレベルを低下させることができた。
タンパク質分析
８５日目において利用可能な全動物から血液を約１ｍＬ採取し、ＥＤＴＡのカリウム塩が入ったチューブに入れた。血液試料を氷中に置き、遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）にかけて血漿を得た。
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。血漿中ＡＮＧＰＴＬ３の分析により、ＩＳＩＳ５６３５８０、５４４１９９及びＩＳＩＳ５５９２７７は、タンパク質レベルを持続的に低下させることが明らかになった。他のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドもＡＮＧＰＴＬ３レベルを低下させることができた。
忍容性試験
体重測定
動物の全体的な健康状態に対するＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの効果を評価するため、体重を測定し、それを下記表に示す。結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドでの処置が体重に与える影響は、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲内であることを示している。具体的には、ＩＳＩＳ５６３５８０を用いた処置はサルの体重に関しては忍容性が良好であった。
肝機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの肝機能に対する効果を評価するため、全試験群から血液試料を採取した。投与から４８時間後に橈側皮静脈、伏在静脈、または大腿静脈から血液試料を採取した。サルは、血液採取前の一晩、絶食させた。血液は、血清を分離するため抗凝固剤を入れずにチューブに採取した。チューブを最低９０分間室温で維持してから、遠心分離（約３，０００ｒｐｍで１０分間）にかけて血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用して、さまざまな肝機能マーカーレベルを測定した。ＡＬＴ及びＡＳＴの血漿レベルを測定し、結果を下記表に示す（単位：ＩＵ／Ｌ）。肝機能マーカーであるビリルビンも同様に測定し、下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。結果は、大部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外となるような影響を肝機能に対して与えなかったことを示している。具体的には、ＩＳＩＳ５６３５８０を用いた処置は、サルにおける肝機能に関して忍容性が良好であった。
腎機能
ＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの腎機能に対する効果を評価するため、全試験群から血液試料を採取した。投与から４８時間後に橈側皮静脈、伏在静脈、または大腿静脈から血液試料を採取した。サルは、血液採取前の一晩、絶食させた。血液は、血清を分離するため抗凝固剤を入れずにチューブに採取した。チューブを最低９０分間室温で維持してから、遠心分離（約３，０００ｒｐｍで１０分間）にかけて血清を得た。Ｔｏｓｈｉｂａ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用して、ＢＵＮ及びクレアチニンのレベルを測定した。結果を下記表に示す（単位：ｍｇ／ｄＬ）。
血漿化学データは、大部分のＩＳＩＳオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての予想範囲外となるような影響を腎機能に対して全く与えなかったことを示している。具体的には、ＩＳＩＳ５６３５８０を用いた処置は、サルの腎機能に関して忍容性が良好であった。
血液学
カニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの血液学的パラメータに及ぼす影響を評価するため、利用可能な試験動物それぞれから血液約０．５ｍＬの血液試料を採取しＫ２−ＥＤＴＡが入ったチューブに入れた。ＡＤＶＩＡ１２０血液分析装置（Ｂａｙｅｒ、米国）を使用して、赤血球（ＲＢＣ）数、白血球（ＷＢＣ）数、各種白血球数（単球、好中球、リンパ球などの数）について、並びに血小板数、ヘモグロビン含量及びヘマトクリットについて試料を分析した。データを下記表に示す。
データは、オリゴヌクレオチドはこの用量では、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて予想される範囲外まで血液学的パラメータを変化させなかったことを示している。具体的には、ＩＳＩＳ５６３５８０を用いた処置は、サルの血液学的パラメータに関して忍容性が良好であった。
炎症誘発性分子に対する効果
カニクイザルにおけるＩＳＩＳオリゴヌクレオチドの炎症作用を評価するため、８４日目の投与前のＣ反応性タンパク質とＣ３レベルの分析用に血液試料を採取した。各動物から約血液１．５ｍＬを採取し、血清を分離するため抗凝固剤を入れずにチューブに入れた。チューブを最低９０分間室温で維持してから、遠心分離（約３，０００ｒｐｍで１０分間）にかけて血清を得た。炎症マーカーとして使用するＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び補体Ｃ３を、Ｔｏｓｈｉｂａ２００ＦＲ ＮＥＯ化学分析装置（Ｔｏｓｈｉｂａ Ｃｏ．， Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。結果は、ＩＳＩＳ５６３５８０を用いた処置は、サルにおいて忍容性があったことを示している。
オリゴヌクレオチド濃度の測定
完全長オリゴヌクレオチドの濃度を測定した。使用した方法は、先に公表されている方法（Ｌｅｅｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９）の変法であり、フェノール−クロロホルム（液−液）抽出と、それに続く固相抽出からなる。抽出に先立ち、内部標準（ＩＳＩＳ３５５８６８、２７−ｍｅｒ ２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧＴＴＴＴＴＴ（本明細書ではこれを配列番号１３とする））を付加した。組織試料濃度を、定量下限（ＬＬＯＱ）が約１．１４μｇ／ｇである検量線を使って算出した。結果を下記表に示す（単位：μｇ／肝臓または腎臓組織１ｇ）。腎臓と肝臓の完全長オリゴヌクレオチド濃度の比を計算した。ＩＳＩＳ５６３５８０で処置した後の腎臓と肝臓の完全長オリゴヌクレオチド濃度の比が、他の被験化合物の場合と比較して最も至適であることがわかった。
実施例１３１：ＧａｌＮＡｃ共役基を含むＩＳＩＳオリゴヌクレオチドと、ＧａｌＮＡｃ共役基を含まないＩＳＩＳオリゴヌクレオチドとで比較する、ｈｕＡＮＧＰＴＬ３トランスジェニックマウスにおけるヒトＡＮＧＰＴＬ３のアンチセンス阻害
ＧａｌＮＡｃ３−７ａを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドと、共役していない対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドとを、ＴｇマウスでのヒトＡＮＧＰＴＬ３ ｍＲＮＡ転写抑制能力について比較し評価した。配列番号１を標的とするギャップマーを下記表及び表１２１に記載する。骨格化学の列の記号は、「ｓ」はチオエートエステルを意味し、「ｏ」はリン酸エステルを意味する。
雌及び雄のＴｇマウスを１２時間の明暗周期で維持した。動物を実験開始前に研究施設で少なくとも７日間馴化させた。アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に調製し、０．２ミクロンフィルターを通す濾過により滅菌した。オリゴヌクレオチドを、注射用に０．９％ＰＢＳに溶解させた。
マウス４匹からなる１群に、ＩＳＩＳ５６３５８０を用量５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、または３０ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、皮下注射で投与した。１群がマウス４匹からなる複数の群それぞれに、ＩＳＩＳ７０３８０１またはＩＳＩＳ７０３８０２を用量０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇで週１回、２週間、腹腔内注射で投与した。１つのマウス群には、ＰＢＳの皮下注射を週１回、２週間行った。ＰＢＳを注入した群を対照群として使用し、これと、対応するオリゴヌクレオチド処置群とを比較した。
ＲＮＡ分析
処置期間の終了時、肝臓組織からＲＮＡを抽出し、ヒトのプライマー・プローブセットｈＡＮＧＰＴＬ３＿ＬＴＳ０１０２２を用いてＡＮＧＰＴＬ３のｍＲＮＡ発現を測定するリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）で正規化した、ＰＢＳ対照に対するｍＲＮＡの変化率として記載する。ゼロ値は、単純に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが測定可能なレベルで発現を阻害しなかったことを示す。
結果は、共役化合物は、阻害パーセント値及びＩＤ５０値から明らかなように、非共役化合物よりもさらに強力にＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させることを実証している。混合型の骨格化学を有する共役オリゴヌクレオチド（７０３８０２）は、すべての骨格化学がホスホロチオエートである共役オリゴヌクレオチド（７０３８０１）よりも発現阻害がさらに強力であった。
タンパク質分析
市販のＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＡＮＬ３０：Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及び希釈度１：２０，０００のトランスジェニック血漿試料を製造者記載の操作手順を用いて使用し、ヒトＡＮＧＰＴＬ３タンパク質レベルを定量した。結果を下記表に示す。ゼロ値は、単純に、アンチセンスオリゴヌクレオチドが測定可能なレベルで発現を阻害しなかったことを示す。
結果は、共役化合物は、阻害パーセント値から明らかなように、非共役化合物よりもさらに強力にＡＮＧＰＴＬ３発現を低下させることを実証している。混合型の骨格化学を有する共役オリゴヌクレオチド（７０３８０２）は、すべての骨格化学がホスホロチオエートである共役オリゴヌクレオチド（７０３８０１）よりも発現阻害がさらに強力であった。
実施例１３２：ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧａｌＮＡｃ共役アンチセンスオリゴヌクレオチドのＣＤ１マウスにおける忍容性
雄ＣＤ１マウス（処置群当たり動物４匹）に、ＩＳＩＳ７０３８０２を下記表に記載のようにさまざまな用量で６週間（１、３、５、８、１４、２１、２８、３５及び４２日目）皮下注射した。雄ＣＤ１マウス４匹の一群にＰＢＳの皮下注射を６週間行った。マウスを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
血漿化学マーカー
ＩＳＩＳ７０３８０２の効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて、４４日目の肝臓及び腎臓機能の各種マーカーの血漿中レベルを測定した。結果を下記表に示す。ＩＳＩＳ７０３８０２は、高用量でも忍容性のある化合物であることが示された。
体重
４４日目の試験終了時、体重、腎臓重量、肝臓重量及び脾臓重量を測定した。ＩＳＩＳ７０３８０２は、高用量を投与した場合でも体重及び臓器重量を有意には変化させなかった。
実施例１３３：ヒトＡＮＧＰＴＬ３を標的とするＧａｌＮＡｃ共役アンチセンスオリゴヌクレオチドのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける忍容性
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットは、安全性及び有効性評価に使用される多目的モデルである。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを１２時間の明暗周期で維持し、Ｐｕｒｉｎａラット用通常固形食餌５００１を自由に摂食させた。１群がＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット４匹からなる複数の群に、ＩＳＩＳ７０３８０２を下記表に記載のようにさまざまな用量で、６週間（１、３、５、８、１４、２１、２８、３５、及び４２日目）皮下注射した。ラット４匹からなる一群にＰＢＳの皮下注射を６週間行った。ラットを最終投与から４８時間後に安楽死させ、さらなる分析用に臓器及び血漿を回収した。
肝機能及び腎機能
肝機能に対するＩＳＩＳ７０３８０２の効果を評価するため、自動臨床化学分析装置（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｏｌｙｍｐｕｓ ＡＵ４００ｅ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いてトランスアミナーゼの血漿レベルを測定した。ＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）及びＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）の血漿レベルを４４日目に測定し、その結果を下記表に示す（単位：ＩＵ／Ｌ）。
腎機能に対するＩＳＩＳ７０３８０２の効果を評価するため、同一の臨床化学分析装置を使用してアルブミン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン及びビリルビンの血漿中レベルを測定し、その結果を下記表に示す（単位：ｇ／ｄＬまたはｍｇ／ｄＬ）。
腎機能に対するＩＳＩＳ７０３８０２の効果をさらに評価するため、尿タンパク質及び尿クレアチニン量を測定し、総尿タンパク質量とクレアチニンとの比を評価した。結果を下記表に示す。
ＩＳＩＳ７０３８０２は、高用量でも忍容性のある化合物であることが示された。
臓器重量
試験終了にあたる４４日目に、体重、肝臓重量、脾臓重量及び腎臓重量を測定し、それを下記表に示す。ＩＳＩＳ７０３８０２は、高用量を投与した場合でも、体重、腎臓重量及び肝臓重量を有意には変化させなかった。

Claims (187)

  1. 修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、少なくとも８個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９の長さが等しい部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である、前記化合物。
  2. 修飾オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または少なくとも２０個の核酸塩基が連続する、配列番号１の等しい長さの部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含んでいる、請求項１に記載の化合物。
  3. 修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個の核酸塩基が連続する、配列番号１の核酸塩基１１４０〜１１５９の等しい長さの部分に相補的な部分を含む核酸塩基配列を含み、ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、配列番号１に対して少なくとも８０％相補的である、前記化合物。
  4. 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号１に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％相補的である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
  5. 修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号７７、２０、３５、９０、９３または９４の核酸塩基配列のいずれかの連続する核酸塩基を少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、または２０個含む核酸塩基配列を有する、前記化合物。
  6. 修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドが、１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなり、かつ、配列番号１１０または１１４の核酸塩基配列のいずれかの連続する核酸塩基を少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または１６個含む核酸塩基配列を有する、前記化合物。
  7. 修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖または二本鎖である、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
  8. 修飾オリゴヌクレオチドが修飾ヌクレオシド間結合を少なくとも１つ含む、請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
  9. 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項８に記載の化合物。
  10. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  11. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも２つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  12. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも３つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  13. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも４つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  14. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも５つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  15. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも６つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  16. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも７つのホスホジエステルヌクレオシド間結合を含む、請求項９に記載の化合物。
  17. 修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合が、ホスホジエステルヌクレオシド間結合及びホスホロチオエートヌクレオシド間結合から選択される、請求項１０〜１６のいずれかに記載の化合物。
  18. 修飾オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項８に記載の化合物。
  19. 修飾オリゴヌクレオチドが少なくとも１つの修飾糖を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の化合物。
  20. 修飾糖の少なくとも１つが二環式糖である、請求項１９に記載の化合物。
  21. 少なくとも１つの修飾糖が、２’−Ｏ−メトキシエチル、拘束エチル、３’−フルオロ−ＨＮＡ、または４’（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’架橋を含み、ここで、ｎは１または２である、請求項１９に記載の化合物。
  22. 少なくとも１つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の化合物。
  23. 修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである、請求項２２に記載の化合物。
  24. 修飾オリゴヌクレオチドが１２〜３０個の連結されたヌクレオシドからなる請求項１〜２３のいずれかに記載の化合物であって、
    連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
    連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、
    連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメント、
    を含み、ここで、前記ギャップセグメントは前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、前記化合物。
  25. 修飾オリゴヌクレオチドが、１５〜３０個、１８〜２４個、１９〜２２個、１３〜２５個、１４〜２５個、１５〜２５個、１６個または２０個の連結されたヌクレオシドからなる、請求項１〜２４のいずれかに記載の化合物。
  26. 修飾オリゴヌクレオチド及び共役基を含む化合物であって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、連結された２０個のヌクレオシドからなり、かつ、配列番号７７のいずれかの長さの等しい部分に相補的な、連続する核酸塩基を少なくとも８個含む核酸塩基配列を有しており、ここで、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
    連結した１０個のデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、
    ヌクレオシド５個の連結からなる５’ウィングセグメント、
    ヌクレオシド５個の連結からなる３’ウィングセグメント
    を含み、前記ギャップセグメントは前記５’ウィングセグメントと前記３’ウィングセグメントとの間に位置し、各ウィングセグメントの各ヌクレオシドは２’−Ｏ−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間の連結はホスホロチオエート結合であり、かつ、各シトシン残基は５−メチルシトシンである、前記化合物。
  27. ＩＳＩＳ５６３５８０と共役基、ＩＳＩＳ５４４１９９と共役基、ＩＳＩＳ５６０４００と共役基、ＩＳＩＳ５６７２３３と共役基、ＩＳＩＳ５６７３２０と共役基、ＩＳＩＳ５６７３２１と共役基、ＩＳＩＳ５５９２７７と共役基、ＩＳＩＳ５６１０１１と共役基からなる化合物。
  28. 共役基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの５’末端で前記修飾オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の化合物。
  29. 共役基が、前記修飾オリゴヌクレオチドの３’末端で前記修飾オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の化合物。
  30. 共役基が厳密に１個のリガンドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  31. 共役基が厳密に２個のリガンドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  32. 共役基が３個以上のリガンドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  33. 共役基が厳密に３個のリガンドを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  34. 各リガンドが、多糖、修飾多糖、マンノース、ガラクトース、マンノース誘導体、ガラクトース誘導体、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｌ−ガラクトース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、α−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコロイル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコ−ヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロノニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースの中から選択される、請求項３１〜３４のいずれかに記載の化合物。
  35. 各リガンドがＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項３５に記載の化合物。
  36. 共役基が、

    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  37. 共役基が、

    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  38. 共役基が、

    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  39. 共役基が、

    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  40. 共役基が、

    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  41. 共役基が、リン連結基または中性連結基を少なくとも１つ含む、請求項３０〜３６のいずれかに記載の化合物。
  42. 共役基が、

    ［式中、ｎは１〜１２であり、かつ、
    ｍは１〜１２である］
    の中から選択される構造を含む、請求項１〜４２のいずれかに記載の化合物。
  43. 共役基が、

    ［式中、Ｌは、リン連結基または中性連結基のいずれかであり、
    Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
    Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
    各ｍ１は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］
    の中から選択される構造を有するテザーを有している、請求項１〜４２のいずれかに記載の化合物。
  44. 共役基が、

    ［式中、Ｚ２は、ＨまたはＣＨ３であり、かつ
    各ｍ１は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］
    の中から選択される構造を有するテザーを有している、請求項４４に記載の化合物。
  45. 共役基が、

    ［式中、ｎは１〜１２であり、かつ
    ｍは１〜１２である］
    の中から選択される構造を有するテザーを有している、請求項３０〜３６のいずれかに記載の化合物。
  46. 共役基が、修飾オリゴヌクレオチドに共有結合で結合している、請求項１〜４６のいずれかに記載の化合物。
  47. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｂは、切断可能部分であり
    Ｃは、共役リンカーであり
    Ｄは、分岐基であり
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  48. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｂは、切断可能部分であり
    Ｃは、共役リンカーであり
    Ｄは、分岐基であり
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、
    各ｎは、互いに独立して０または１であり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  49. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｂは、切断可能部分であり、
    Ｃは、共役リンカーであり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  50. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｃは、共役リンカーであり、
    Ｄは、分岐基であり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  51. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｃは、共役リンカーであり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  52. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｂは、切断可能部分であり、
    Ｄは、分岐基であり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  53. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｂは、切断可能部分であり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  54. 化合物が、式

    ［式中、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｄは、分岐基であり、
    各Ｅは、テザーであり、
    各Ｆは、リガンドであり、かつ
    ｑは、１〜５の整数である］
    によって表される構造を有する、請求項１〜４７のいずれかに記載の化合物。
  55. 共役リンカーが、

    ［式中、各Ｌは、互いに独立してリン連結基または中性連結基であり、かつ、
    各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物。
  56. 共役リンカーが、
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物
  57. 共役リンカーが以下の構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物。
  58. 共役リンカーが、
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物。
  59. 共役リンカーが、
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物。
  60. 共役リンカーが、

    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜５５のいずれかに記載の化合物。
  61. 共役リンカーがピロリジンを含む、請求項４８〜６１のいずれかに記載の化合物。
  62. 共役リンカーがピロリジンを含まない、請求項４８〜６１のいずれかに記載の化合物。
  63. 共役リンカーがＰＥＧを含む、請求項４８〜６３のいずれかに記載の化合物。
  64. 共役リンカーがアミドを含む、請求項４８〜６４のいずれかに記載の化合物。
  65. 共役リンカーが少なくとも２つのアミドを含む、請求項４８〜６４のいずれかに記載の化合物。
  66. 共役リンカーがアミドを含まない、請求項４８〜６４のいずれかに記載の化合物。
  67. 共役リンカーがポリアミドを含む、請求項４８〜６７のいずれかに記載の化合物。
  68. 共役リンカーがアミンを含む、請求項４８〜６８のいずれかに記載の化合物。
  69. 共役リンカーが１つ以上のジスルフィド結合を含む、請求項４８〜６９のいずれかに記載の化合物。
  70. 共役リンカーがタンパク質結合部分を含む、請求項４８〜７０のいずれかに記載の化合物。
  71. タンパク質結合部分が脂質を含む、請求項７１に記載の化合物。
  72. タンパク質結合部分が、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、ビタミン（例えば、葉酸塩、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビオチン、ピリドキサール）、ペプチド、炭水化物（例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、多糖）、エンドソーム溶解成分、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン（ｈｅｃｉｇｅｎｉｎ）、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、またはカチオン性脂質の中から選択される、請求項７１に記載の化合物。
  73. タンパク質結合部分が、飽和または不飽和のＣ１６〜Ｃ２２長鎖脂肪酸、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、アダマンタンまたは１−ペンタフルオロプロピルの中から選択される、請求項７１に記載の化合物。
  74. 共役リンカーが、

    ［式中、各ｎは互いに独立して１〜２０であり、かつ、ｐは１〜６である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７４のいずれかに記載の化合物。
  75. 共役リンカーが、

    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物。
  76. 共役リンカーが、
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物。
  77. 共役リンカーが、

    ［式中、ｎは１〜２０である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物。
  78. 共役リンカーが、

    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物。
  79. 共役リンカーが、

    ［式中、各ｎは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物。
  80. 共役リンカーが以下の構造を有する、請求項４８〜７５のいずれかに記載の化合物
  81. 分岐基が、以下の構造

    ［式中、各Ａ１は、互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、かつ
    各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    の１つを有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  82. 分岐基が、以下の構造

    ［式中、各Ａ１は、互いに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり、かつ
    各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    の１つを有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  83. 分岐基が以下の構造

    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  84. 分岐基が以下の構造

    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  85. 分岐基が以下の構造

    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  86. 分岐基が以下の構造

    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  87. 分岐基がエーテルを含む、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  88. 分岐基が以下の構造

    ［各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、かつ
    ｍは、２〜６である］
    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  89. 分岐基が以下の構造
    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  90. 分岐基が以下の構造

    を有する、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  91. 分岐基が、
    ［式中、各ｊは１〜３の整数であり、
    各ｎは１〜２０の整数である］
    を含む、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  92. 分岐基が、
    を含む、請求項４８〜８１のいずれかに記載の化合物。
  93. 各テザーが、

    ［式中、Ｌは、リン連結基及び中性連結基から選択され、
    Ｚ１は、Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ２であり、
    Ｚ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、
    Ｒ２は、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたは置換Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり、かつ
    各ｍ１は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ１は０より大きい］
    の中から選択される、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  94. 各テザーが、

    ［式中、Ｚ２は、ＨまたはＣＨ３であり、かつ
    各ｍ２は、互いに独立して０〜２０であり、ここで、各テザーの少なくとも１つのｍ２は０より大きい］
    の中から選択される、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  95. 各テザーが、

    ［式中、ｎは１〜１２であり、かつ
    ｍは１〜１２である］
    の中から選択される、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  96. 少なくとも１つのテザーがエチレングリコールを含む、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  97. 少なくとも１つのテザーがアミドを含む、請求項４８〜９３または９５のいずれかに記載の化合物。
  98. 少なくとも１つのテザーがポリアミドを含む、請求項４８〜９３または９５のいずれかに記載の化合物。
  99. 少なくとも１つのテザーがアミンを含む、請求項４８〜９３または９５のいずれかに記載の化合物。
  100. 少なくとも２つのテザーが互いに異なる、請求項４８〜９３または９５のいずれかに記載の化合物。
  101. すべてのテザーが互いに同一である、請求項４８〜９３または９５のいずれかに記載の化合物。
  102. 各テザーが、

    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
    各ｐは、１〜約６である］
    の中から選択される、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  103. 各テザーが、
    の中から選択される、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  104. 各テザーが以下の構造

    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    を有する、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  105. 各テザーが以下の構造

    を有する、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  106. テザーが、
    ［式中、各ｎは、互いに独立して、０、１、２、３、４、５、６、または７である］
    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  107. テザーが、

    の中から選択される構造を有する、請求項４８〜９３のいずれかに記載の化合物。
  108. リガンドがガラクトースである、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の化合物。
  109. リガンドがマンノース−６−リン酸塩である、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の化合物。
  110. 各リガンドが、

    ［式中、各Ｒ１は、ＯＨ及びＮＨＣＯＯＨから選択される］
    の中から選択される、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の化合物。
  111. 各リガンドが、
    の中から選択される、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の化合物。
  112. 各リガンドが、以下の構造

    を有する、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の化合物。
  113. 各リガンドが、以下の構造

    を有する、請求項１０５〜１０８のいずれかに記載の共役アンチセンス化合物。
  114. 共役基が、細胞を標的とする部分を含む、請求項１〜３０または５６〜８１のいずれかに記載の化合物。
  115. 共役基が、以下の構造

    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    を有する、細胞を標的とする部分を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  116. 細胞を標的とする部分が以下の構造

    を有する、請求項１１６のいずれかに記載の化合物。
  117. 細胞を標的とする部分が以下の構造

    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０である］
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  118. 細胞を標的とする部分が以下の構造を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  119. 細胞を標的とする部分が、

    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  120. 細胞を標的とする部分が、

    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  121. 細胞を標的とする部分が以下の構造

    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  122. 細胞を標的とする部分が以下の構造

    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  123. 細胞を標的とする部分が、

    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  124. 細胞を標的とする部分が以下の構造

    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  125. 細胞を標的とする部分が、

    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  126. 細胞を標的とする部分が、

    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  127. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  128. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  129. 前記細胞を標的とする部分が、以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  130. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  131. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  132. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  133. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  134. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  135. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  136. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  137. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  138. 細胞を標的とする部分が、
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  139. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  140. 細胞を標的とする部分が、
    ［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  141. 共役基が、
    ［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］
    を含む、請求項１１６に記載の化合物。
  142. 細胞を標的とする部分が以下の構造
    ［式中、各Ｙは、Ｏ、Ｓ、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル、アミノ、置換アミノ、アジド、アルケニル若しくはアルキニルから選択される］
    を有する、請求項１１６に記載の化合物。
  143. 共役基が、
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  144. 共役基が、
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  145. 共役基が、
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  146. 共役基が、
    を含む、請求項１１７に記載の化合物。
  147. 共役基が、ホスホジエステル、アミド、またはエステルの中から選択される切断可能部分を含む、請求項１〜１４７のいずれかに記載の化合物。
  148. 共役基が、ホスホジエステル切断可能部分を含む、請求項１〜１４７のいずれかに記載の化合物。
  149. 共役基が切断可能部分を含まず、かつ、該共役基がオリゴヌクレオチドとの間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜１４７のいずれかに記載の化合物。
  150. 共役基がアミド切断可能部分を含む、請求項１〜１４８のいずれかに記載の化合物。
  151. 共役基がエステル切断可能部分を含む、請求項１〜１４８のいずれかに記載の化合物。
  152. 化合物は、以下の構造
    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
    Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  153. 化合物は、以下の構造
    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
    Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  154. 化合物が以下の構造
    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
    Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  155. 化合物が以下の構造
    ［式中、各ｎは、互いに独立して１〜２０であり、
    Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、
    Ｚは、Ｈまたは連結された固体支持体であり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  156. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  157. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  158. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  159. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  160. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  161. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  162. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  163. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  164. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  165. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  166. 化合物が以下の構造
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を有する、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  167. 共役基が、
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  168. 共役基が、
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  169. 共役基が、
    ［式中、Ｑ１３は、ＨまたはＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３であり、
    Ａは、修飾オリゴヌクレオチドであり、かつ
    Ｂｘは、複素環式塩基部分である］
    を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の化合物。
  170. Ｂｘが、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、またはシトシンの中から選択されるか、または５−メチルシトシンである、請求項１５３〜１７０のいずれかに記載の化合物。
  171. Ｂｘがアデニンである、請求項１５３〜１７０のいずれかに記載の化合物。
  172. Ｂｘがチミンである、請求項１５３〜１７０のいずれかに記載の化合物。
  173. Ｑ１３がＯ（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である、請求項１５３〜１７０のいずれかに記載の化合物。
  174. Ｑ１３がＨである、請求項１５３〜１７０のいずれかに記載の化合物。
  175. 請求項１〜１７５のいずれかに記載の化合物またはその塩、及び少なくとも１つの薬理学的に許容される担体または希釈剤を含む組成物。
  176. 請求項１〜１７６のいずれかに記載の化合物を含むプロドラッグ。
  177. 請求項１〜１７７のいずれかに記載の化合物、組成物、またはプロドラッグを動物に投与することを含む方法。
  178. 動物がヒトである、請求項１７８に記載の方法。
  179. 前記化合物の投与が、心血管性及び／または代謝性疾患の進行を予防、治療、改善、または減速する、請求項１７８に記載の方法。
  180. 前記化合物または組成物と第２剤とを同時投与することを含む、請求項１７８に記載の方法。
  181. 化合物または組成物と第２剤とを同時に投与する、請求項１８１に記載の方法。
  182. 投与を非経口的に行う、請求項１７８に記載の方法。
  183. 投与を皮下に行う、請求項１７８に記載の方法。
  184. 心血管性及び／または代謝性疾患に罹患したヒトを特定し、請求項１〜１７７のいずれかに記載の化合物または組成物の治療有効量をそのヒトに投与し、そのヒトの心血管性及び／または代謝性疾患を治療することを含む、心血管性及び／または代謝性疾患に罹患したヒトを治療するための方法。
  185. 治療で使用するための、請求項１〜１８５のいずれかに記載の化合物を含む組成物。
  186. ＡＮＧＰＴＬ３高値に関連した疾患の進行を治療する、予防する、または減速させる際に使用するための、請求項１８５に記載の組成物。
  187. 疾患が、心血管性及び／または代謝性の疾患、障害または状態である、請求項１８５に記載の組成物。
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