JP4152955B2 - 新規フォスフォアミダイト化合物 - Google Patents
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Description
本発明は、ＤＮＡ変形体の合成に有用なフォスフォアミダイト(phosphoramidite)化合物に関する。
遺伝学分野では化学的方法によって合成ＤＮＡを製造し、これを薬に用いて疾病を克服しようとする研究が試みられている(Agrawal, S., Synthesis and Properties, Humana Press: Totowa, Chapter 1-4, (1993) 及び Kool, E. T., Chem. Rev., 97; 1473(1997))。また、構造的に興味深い変形核酸を開発する研究も多く行われてきた(Newcome, G. R., et al., Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers, New York, 116(1996); Shchepinov, M. S. et al., Nucleic Acids Res., 25, 4447-4454(1997); Shchepinov, M. S. et al., Nucleic Acids Res., 27, 3035-3041(1999); 及びWinfree, E. et al., Nature, 394, 539-544(1998))。
これらの研究から、関心ある野生型ＤＮＡの構造的及び生物学的特徴を明らかにするために、いくつかのオリゴデオキシリボヌクレオチド(oligodeoxyribonucleotide; ＯＤＮ)ストランドが一つの分子を成す分岐ＤＮＡ(ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ， ｂＤＮＡ)が合成、研究されており(Hudson, R. H. et. al., J. Am. Chem. Soc., 117, 12470-12477(1995); Collins, M. L. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 15, 2979-2984(1997); 及び Horn, T, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 23, 4835-4849(1997))。また、このようなｂＤＮＡを用いて高分岐(hyperbranched)ポリマーやデントリマー(dendrimer)を合成するか、又はこのように合成し、この合成デントリマーの末端部に多様な官能基を導入して所望の生物学的機能培養を行うことが報告されている(Newkome, G. R. et al., Chem. Rev., 99: 1689-1746(1999))。
ＤＮＡ合成機を用いれば、フォスフォアミダイト化合物をアデノシン(Ａ)、グアノシン(Ｇ)、シチジン(Ｃ) 及びチミジン(Ｔ)と結合させて多様な天然型ＤＮＡを得ることができ、 このようなフォスフォアミダイト誘導体はＤＮＡ内へ容易に挿入できる。
従って、本発明者らは多様なＯＤＮを合成するのに有用に用いられ得る新規な官能基を有するフォスフォアミダイト化合物を開発するために鋭意研究して来た。
従って、本発明者らは多様なＯＤＮを合成するのに有用に用いられ得る新規な官能基を有するフォスフォアミダイト化合物を開発するために鋭意研究して来た。
Agrawal, S., Synthesis and Properties, Humana Press: Totowa, Chapter 1-4, (1993)
Kool, E. T., Chem. Rev., 97; 1473(1997)
Newcome, G. R., et al., Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers, New York, 116(1996)
Shchepinov, M. S. et al., Nucleic Acids Res., 25, 4447-4454(1997)
Shchepinov, M. S. et al., Nucleic Acids Res., 27, 3035-3041(1999)
Winfree, E. et al., Nature, 394, 539-544(1998))
Hudson, R. H. et. al., J. Am. Chem. Soc., 117, 12470-12477(1995)
Collins, M. L. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 15, 2979-2984(1997)
Horn, T, et al., Nucleic Acids Research, Vol. 25, No. 23, 4835-4849(1997)
Newkome, G. R. et al., Chem. Rev., 99: 1689-1746(1999)
従って、本発明の目的は、目的とするＯＤＮの合成に用いられ得る新規フォスフォアミダイト化合物を提供することである。
上記目的によって、本発明では下記式(I)〜(V)から選択されるフォスフォアミダイト化合物を提供する:
式中、Ｒは、ジメトキシトリチル(ＤＭＴｒ)、レブリニル(Ｌｅｖ) 、又はｔｅｒｔ-ブチルジメチルシリル(ＴＢＤＭＳ)である。
本発明によれば、目的とするＯＤＮの合成に用いられ得る新規フォスフォアミダイト化合物を提供できる。
本発明のフォスフォアミダイト化合物は、下記式(I)〜(V)によって示される化合物の一つである:
式中、Ｒは、ジメトキシトリチル(ＤＭＴｒ)、レブリニル(Ｌｅｖ)、又はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル(ＴＢＤＭＳ)である。
本発明の式(I)のフォスフォアミダイト化合物は、その(S)-及び(R)-異性体を含む:
本発明のフォスフォアミダイト化合物のうち、好ましい化合物は次の通りである:
(Ｓ)−(＋)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−１,３-ブタンジオール；
(Ｒ)−(−)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−１,３-ブタンジオール；
Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ベンジルグリコレート；
Ｏ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−リトコールアルコール；
Ｏ−トリ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；及び
式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物。
(Ｓ)−(＋)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−１,３-ブタンジオール；
(Ｒ)−(−)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−(２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−１,３-ブタンジオール；
Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ベンジルグリコレート；
Ｏ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−リトコールアルコール；
Ｏ−トリ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−((２−シアノエチル)−Ｎ,Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；及び
式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物。
本発明のフォスフォアミダイト化合物は、下記で説明するように、１,３-ブタンジオール、ベンジルグリコレート又はリトコール酸(lithocolic acid)などの目的とする官能基を導入して製造し得る。特に、ペンタエリスリトール又はデントリマーを導入して製造されたフォスフォアミダイト化合物は、機能性分岐ＤＮＡ(ｂＤＮＡ)の合成に有用できる。
1)(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−１,３-ブタンジオールを用いた、光学的に純粋な式(I)のフォスフォアミダイト化合物の製造(反応式１)
式(IＡ)又は(１Ｂ)の(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−フォスフォアミダイトは、(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−１,３-ブタンジオールの１−ヒドロキシ基をDMTr(Dimethoxytrityl)基で保護してそれぞれ化合物６又は７を得た後、これらの化合物の２次ヒドロキシ基にフォスフォアミダイトを導入して製造できる。
本発明の(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−フォスフォアミダイトは、オリゴヌクレオチドを連結する連結子(linker)として用いられ得る。
式(IＡ)又は(１Ｂ)の(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−フォスフォアミダイトは、(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−１,３-ブタンジオールの１−ヒドロキシ基をDMTr(Dimethoxytrityl)基で保護してそれぞれ化合物６又は７を得た後、これらの化合物の２次ヒドロキシ基にフォスフォアミダイトを導入して製造できる。
本発明の(Ｓ)−(＋)−又は(Ｒ)−(−)−フォスフォアミダイトは、オリゴヌクレオチドを連結する連結子(linker)として用いられ得る。
２)ベンジルグリコレートを用いた、式(II)のフォスフォアミダイト化合物の製造(反応式２)。
式(II)のフォスフォアミダイト化合物は、DIPEA(N,N-diisopropylethylamine) の存在下でベンジルグリコレート及びクロロ-(２-シアノエチル)-Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル−ホスフィンをＴＨＦ溶媒中で反応させて製造できる。
本発明の式(II)のフォスフォアミダイト化合物は、酸性官能基をオリゴヌクレオチドに導入するのに用いられる。
式(II)のフォスフォアミダイト化合物は、DIPEA(N,N-diisopropylethylamine) の存在下でベンジルグリコレート及びクロロ-(２-シアノエチル)-Ｎ,Ｎ-ジイソプロピル−ホスフィンをＴＨＦ溶媒中で反応させて製造できる。
本発明の式(II)のフォスフォアミダイト化合物は、酸性官能基をオリゴヌクレオチドに導入するのに用いられる。
３)リトコール酸を用いた、式(III)のフォスフォアミダイト化合物の製造(反応式３)
式(III)のフォスフォアミダイト化合物はリトコール酸のカルボキシ基を還元して化合物８を得た後、この化合物の１次ヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して２次ヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(III)のフォスフォアミダイト化合物は、疎水性のリトコール酸残基の存在のため優れた細胞浸透性を示すので、遺伝子治療法(ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｈｙ)に有用である。また、式(III)のフォスフォアミダイト化合物は、ＤＮＡの２次及び３次構造変形の際、活用できる。
式(III)のフォスフォアミダイト化合物はリトコール酸のカルボキシ基を還元して化合物８を得た後、この化合物の１次ヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して２次ヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(III)のフォスフォアミダイト化合物は、疎水性のリトコール酸残基の存在のため優れた細胞浸透性を示すので、遺伝子治療法(ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｈｙ)に有用である。また、式(III)のフォスフォアミダイト化合物は、ＤＮＡの２次及び３次構造変形の際、活用できる。
４)ペンタエリスリトールを用いた、式(IV)のフォスフォアミダイト化合物の製造(反応式４)
式(IVa)のフォスフォアミダイト化合物は、ペンタエリスリトールの４個のヒドロキシ基のうち３個をＤＭＴｒで保護して化合物１０を得た後、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造でき;式(IVｂ)のフォスフォアミダイトは、ペンタエリスリトールの４個のヒドロキシ基のうち２個をＤＭＴｒ基で保護して、化合物１１を得た後、３次ヒドロキシ基をＬｅｖ(ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ)基で保護し、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。また、式(IVc)のフォスフォアミダイト化合物は、ペンタエリスリトールのヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して化合物１２を得た後、他の２個のヒドロキシ基をＬｅｖ基で保護して化合物１４を得た後、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造でき; 式(IVｄ)のフォスフォアミダイト化合物はペンタエリスリトールのヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して化合物１２を得た後、他のヒドロキシ基をＬｅｖ基で保護して化合物１５を得た後、さらに他のヒドロキシ基にTBDMS(tert-butyldimethylsilyl)基を導入して化合物１６を得、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(IV)のフォスフォアミダイト化合物は、デントリマー(dendrimer)及びｂＤＮＡを合成するのに用いられ得、特に相異する塩基配列を有するｂＤＮＡ又はナノ構造のＯＤＮを合成するのに用いられ得る。
式(IVa)のフォスフォアミダイト化合物は、ペンタエリスリトールの４個のヒドロキシ基のうち３個をＤＭＴｒで保護して化合物１０を得た後、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造でき;式(IVｂ)のフォスフォアミダイトは、ペンタエリスリトールの４個のヒドロキシ基のうち２個をＤＭＴｒ基で保護して、化合物１１を得た後、３次ヒドロキシ基をＬｅｖ(ｌｅｖｕｌｉｎｙｌ)基で保護し、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。また、式(IVc)のフォスフォアミダイト化合物は、ペンタエリスリトールのヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して化合物１２を得た後、他の２個のヒドロキシ基をＬｅｖ基で保護して化合物１４を得た後、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造でき; 式(IVｄ)のフォスフォアミダイト化合物はペンタエリスリトールのヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護して化合物１２を得た後、他のヒドロキシ基をＬｅｖ基で保護して化合物１５を得た後、さらに他のヒドロキシ基にTBDMS(tert-butyldimethylsilyl)基を導入して化合物１６を得、残りのヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(IV)のフォスフォアミダイト化合物は、デントリマー(dendrimer)及びｂＤＮＡを合成するのに用いられ得、特に相異する塩基配列を有するｂＤＮＡ又はナノ構造のＯＤＮを合成するのに用いられ得る。
５)デントリマーを用いた式(V)のデントリマーフォスフォアミダイトの製造(反応式５)
式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物は、化合物１７のヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物は、目的とする官能基を有するデントリマーをオリゴヌクレオチドに導入するのに用いられ得る。
式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物は、化合物１７のヒドロキシ基にフォスフォアミダイト基を導入して製造できる。
本発明の式(V)のデントリマーフォスフォアミダイト化合物は、目的とする官能基を有するデントリマーをオリゴヌクレオチドに導入するのに用いられ得る。
以下、本発明を下記実施例によってより詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲はこれらに限定されない。
［実施例１］：(Ｓ)−(＋)−１，３−ブタンジオールを用いた式(Iａ)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１)Ｓ−(＋)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(化合物６)の製造
Ｓ−(＋)−１，３−ブタンジオール(９６ｍｇ、１．０６５ｍｍｏｌ)をピリジン３ｍｌに溶かして氷水浴で冷却した後、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド(４３０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ)を加えた。この反応混合物を室温で６時間攪拌し、これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。得られた黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して標題化合物(４０１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ)を９６％の収率で得た。
(段階１)Ｓ−(＋)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(化合物６)の製造
Ｓ−(＋)−１，３−ブタンジオール(９６ｍｇ、１．０６５ｍｍｏｌ)をピリジン３ｍｌに溶かして氷水浴で冷却した後、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド(４３０ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ)を加えた。この反応混合物を室温で６時間攪拌し、これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。得られた黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して標題化合物(４０１ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ)を９６％の収率で得た。
Ｒｆ＝０．３(酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)；ＩＲ(ＮａＣｌ)(ｃｍ−１)３４６２，３０５９，３０３４，２９５９，２９２７，２８４８，２８３５，１６０７，１５０８，１２５０；１Ｈ−ＮＭＲ(アセトン−ｄ６)δ７．４９(ｂｒ，１Ｈ)，７．４６(ｂｒ，１Ｈ)，７．３６−７．１８(ｍ，７Ｈ)，６．８６(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ)，６．８４(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ)，３．９３(ｂｒ，１Ｈ)，３．７３(ｓ，６Ｈ)，３．５０(ｂｒ，１Ｈ)，３．２８−３．１４(ｍ，２Ｈ)，１．７３(ｍ，２Ｈ)，１．１１(ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１５８．１，１４５．３，１３６．１，１３６．０，１２９．５，１２７．６，１２７．２，１２６．１，１１２．５，８５．４，６４．２，６０．６，５４．２，３９．０，２３．１；ＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ２５Ｈ２８Ｏ４に対する［Ｍ］＋計算値：３９２；実測値：３９２；[α]２１ Ｄ＝＋１７．６(ｃ１．０，ＣＨＣｌ３)。
(段階２)(Ｓ)−(＋)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジメトキシトリチル−フォスフォアミダイト)−１，３−ブタンジオール)(式(Iａ)の化合物)の製造
上記段階１で得られたＳ−(＋)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(１５８ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ)をＴＨＦ３ｍｌに溶かした後、ＤＩＰＥＡ(１４０μｌ、０．８０４ｍｍｏｌ)を加えて３０分間攪拌した後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン(１７７μｌ、０．８０ｍｍｏｌ)を滴下した。その後、生成した白色沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液２０ｍｌを加えてから酢酸エチルで抽出し、生成した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。得られた黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製して無色の標題化合物(２０３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ)を８５％の収率で得た。
上記段階１で得られたＳ−(＋)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(１５８ｍｇ、０．４０２ｍｍｏｌ)をＴＨＦ３ｍｌに溶かした後、ＤＩＰＥＡ(１４０μｌ、０．８０４ｍｍｏｌ)を加えて３０分間攪拌した後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン(１７７μｌ、０．８０ｍｍｏｌ)を滴下した。その後、生成した白色沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液２０ｍｌを加えてから酢酸エチルで抽出し、生成した有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。得られた黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製して無色の標題化合物(２０３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ)を８５％の収率で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ７．４７−７．４３(２Ｈ，ｍ)，７．３４−７．２５(５Ｈ，ｍ)，７．２２−７．１６(１Ｈ，ｍ)，６．８９−６．８０(４Ｈ，ｍ)，４．１５(１Ｈ，ｍ)，３．７４(３Ｈ，ｓ)，３．７３(３Ｈ，ｓ)，３．６３−３．５１(３Ｈ，ｍ)，３．２０−３．１６(２Ｈ，ｍ)，２．６８(１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ)，２．５５(１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ)，１．９４−１．７３(３Ｈ，ｍ)，１．２１−１．１１(１２Ｈ，ｍ)，１．０７(１．５Ｈ，ｓ)，１．０５(１．５Ｈ，ｓ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１５８．１，１４５．２，１３６．０，１２９．６，１２９．５，１２７．７，１２７．６，１２７．２，１２６．１，１１７．７，１１７．６，１１２．５，８５．４，６８．０，６７．７，６７．４，６７．２，６０．０，５９．８，５９．２，５８．１，５７．８，５７．５，５４．２，４２．４，４２．２，３８．３，２３．７，２３．６，２３．６，２３．５，２３．４，２１．６，１９．５，１９．４；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１４９．０，１４８．３；ＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ３４Ｈ４５Ｎ２Ｏ５Ｐ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：６１５；実測値：６１５。
［実施例２］：(Ｒ)−(−)−１，３−ブタンジオールを用いた式(Iｂ)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１) Ｒ−(−)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(化合物７)の製造
Ｒ−(−)−１，３−ブタンジオール(１０３ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ)をピリジン３ｍｌに溶かして氷水浴で冷却した後、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド(４６０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ)を加えた。この混合物を室温で６時間攪拌し、これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残った黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して標題化合物(４３７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ)を９７％の収率で得た。
(段階１) Ｒ−(−)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(化合物７)の製造
Ｒ−(−)−１，３−ブタンジオール(１０３ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ)をピリジン３ｍｌに溶かして氷水浴で冷却した後、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド(４６０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ)を加えた。この混合物を室温で６時間攪拌し、これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残った黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して標題化合物(４３７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ)を９７％の収率で得た。
Ｒｆ＝０．３(酢酸：ヘキサン＝１：２)；ＩＲ(ＮａＣｌ)(ｃｍ−１)３４６２，３０５９，３０３４，２９６０，２９２９，２８３５，１６０７，１５０８，１２５０；１Ｈ ＮＭＲ(アセトン−ｄ６)δ７．４７(ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．７Ｈｚ)，７．４５(ｂｒ，１Ｈ)，７．３５−７．２０(ｍ，７Ｈ)，６．８７(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ)，６．８４(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ)，３．９２(ｂｒ，１Ｈ)，３．７３(ｓ，６Ｈ)，３．４７(ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ)，３．２５−３．１４(ｍ，２Ｈ)，１．７１(ｍ，２Ｈ)，１．０９(ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１５８．１，１４５．２，１３６．１，１３６．０，１２９．５，１２７．６，１２７．２，１２６．１，１１２．５，８５．４，６４．２，６０．５，５４．１，３８．９，２３．０；ＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ２５Ｈ２８Ｏ４に対する［Ｍ］＋計算値：３９２；実測値：３９２；[α]２１ Ｄ＝−９．９(ｃ１．０，ＣＨＣｌ３)。
(段階２)(Ｒ)−(−)−１−Ｏ−ＤＭＴｒ−３−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオールの製造
上記段階１で得たＲ−(−)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(１３８ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２ｍｌに溶かした後、これにＤＩＰＥＡ(１４０μｌ、０．８０４ｍｍｏｌ)を加えて３０分間攪拌した後、これにクロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン(１５７μｌ、０．７０ｍｍｏｌ)を滴下した。その後、生成した白色沈殿物を濾過して除去し、減圧蒸留した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １５ｍｌで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。生成した黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製して無色オイル状の標題化合物(１０８ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ)を５２％の収率で得た。
上記段階１で得たＲ−(−)−１−Ｏ−(４，４’−ジメトキシトリチル)−１，３−ブタンジオール(１３８ｍｇ、０．３１５ｍｍｏｌ)をＴＨＦ２ｍｌに溶かした後、これにＤＩＰＥＡ(１４０μｌ、０．８０４ｍｍｏｌ)を加えて３０分間攪拌した後、これにクロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン(１５７μｌ、０．７０ｍｍｏｌ)を滴下した。その後、生成した白色沈殿物を濾過して除去し、減圧蒸留した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液１０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １５ｍｌで抽出し、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留した。生成した黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)で精製して無色オイル状の標題化合物(１０８ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ)を５２％の収率で得た。
Ｒｆ＝０．４５(酢酸エチル：ヘキサン＝１：５)１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６)δ７．４７−７．４３(２Ｈ，ｍ)，７．３４−７．２５(５Ｈ，ｍ)，７．２２−７．１６(１Ｈ，ｍ)，６．８９−６．８０(４Ｈ，ｍ)，４．１５(１Ｈ，ｍ)，３．７６(３Ｈ，ｓ)，３．７５(３Ｈ，ｓ)，３．６３−３．５１(３Ｈ，ｍ)，３．２０−３．１６(２Ｈ，ｍ)，２．６８(１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ)，２．５５(１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ)，１．９４−１．７３(３Ｈ，ｍ)，１．１９−１．１０(１２Ｈ，ｍ)，１．０５(１．５Ｈ，ｓ)，１．０３(１．５Ｈ，ｓ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１５８．１，１４５．２，１３６．０，１２９．５，１２９．５，１２７．６，１２７．５，１２７．２，１２６．１，１１７．６，１１２．４，８５．３，６７．９，６７．７，６７．４，６７．２，６６．７，５９．９，５９．８，５８．０，５７．８，５７．５，５４．１，４２．４，４２．２，３８．３，３８．２，２４．８，２３．７，２３．６，２３．５，２３．４，２３．３，２１．６，１９．４，１９．３；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ１４９．０，１４８．３；ＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ３４Ｈ４５Ｎ２Ｏ５Ｐ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：６１５；実測値：６１５。
試験例１
光学異性体間のキラル構造の相異点がオリゴヌクレオチド構造に及ぶ影響を次のように測定した。
上記実施例１及び２で得られた式(Iａ)及び(１ｂ)の化合物をそれぞれ急速核酸合成機８０９０(Expedite Nucleic Acid Synthesis System 8090)を用いて任意のオリゴヌクレオチドに挿入し、このように合成されたＯＤＮの分子量をＭａｌｄｉ−Ｔｏｆマス(３−ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして使用；２５０００Ｖ；極性：陽性)を用いて確認した。
その結果は、下記の表１に示す。
光学異性体間のキラル構造の相異点がオリゴヌクレオチド構造に及ぶ影響を次のように測定した。
上記実施例１及び２で得られた式(Iａ)及び(１ｂ)の化合物をそれぞれ急速核酸合成機８０９０(Expedite Nucleic Acid Synthesis System 8090)を用いて任意のオリゴヌクレオチドに挿入し、このように合成されたＯＤＮの分子量をＭａｌｄｉ−Ｔｏｆマス(３−ヒドロキシピコリン酸をマトリックスとして使用；２５０００Ｖ；極性：陽性)を用いて確認した。
その結果は、下記の表１に示す。
また、上記多様な二重体(ｄｕｐｌｅｘ、オリゴ／オリゴ)の溶融温度(melting temperature, Tm)は、１００ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含むトリス−ＨＣｌ緩衡液(１０ｍＭ，ｐＨ７．２)で１．０℃／分で昇温しながら２６０ｎｍ(ｃｕｖｅｔｔｅ、通過長さ：１ｃｍ)で吸光度を測定して決定した。その結果を表２及び図１に示す。二重体１、２及び９の総濃度をそれぞれ４．０μＭに調整し、二重体３〜８及び１０の総濃度を６．６μＭに調整した。
上記表２から分かるように、二重体(オリゴ１／オリゴ７)及び二重体(オリゴ２／オリゴ７)のＴｍ(℃)値は二重体(オリゴ５／オリゴ７)より１２℃ぐらい低い。このようなマイナスのΔＴｍ値は、オリゴヌクレオチドに水素結合し得る塩基がなく、糖残基より柔軟性に優れた１，３−ブタンジオールを用いて行われたヌクレオシドの置換に起因する。このような結果から一対の光学異性体間のキラル構造上の差がオリゴヌクレオチドのＴｍ値に影響を及ぼさないことが分かる。
また、オリゴマーのＣＤ(circular dichroism)分光分析結果を図２及び３に示す。これらの結果から分かるように、本発明によるオリゴマーの二重螺旋構造は野生型オリゴマーと類似している。
また、オリゴマーのＣＤ(circular dichroism)分光分析結果を図２及び３に示す。これらの結果から分かるように、本発明によるオリゴマーの二重螺旋構造は野生型オリゴマーと類似している。
オリゴ１、オリゴ２及びこれらの混合物(１：１)を対象にＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography)を下記の条件下で行う：
−温度：室温
−カラム：Agilent Eclipse XDB-C18、４．６×１５０ｍｍ、５μ、空隙大きさ８０Å
−溶媒プログラム：試料注入後、５％アセトニトリール／０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート(ＴＥＡＡ)ｐＨ７．０を１０分間溶出させた。その後、勾配は５０％アセトニトリール／０．１Ｍ ＴＥＡＡになるまで線形的に増加させ、５分経過後、勾配はさらに線形的に減少させて初期状態になるようにした。
上記条件下で同一な滞留時間に溶出されたオリゴ１(ａ)、オリゴ２(ｂ)及びこれらの混合物(ｃ)のＨＰＬＣ分析結果を図４に示し、その結果(Ｓ)−及び(Ｒ)−異性体間の構造的な差はオリゴヌクレオチド構造にほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
−温度：室温
−カラム：Agilent Eclipse XDB-C18、４．６×１５０ｍｍ、５μ、空隙大きさ８０Å
−溶媒プログラム：試料注入後、５％アセトニトリール／０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート(ＴＥＡＡ)ｐＨ７．０を１０分間溶出させた。その後、勾配は５０％アセトニトリール／０．１Ｍ ＴＥＡＡになるまで線形的に増加させ、５分経過後、勾配はさらに線形的に減少させて初期状態になるようにした。
上記条件下で同一な滞留時間に溶出されたオリゴ１(ａ)、オリゴ２(ｂ)及びこれらの混合物(ｃ)のＨＰＬＣ分析結果を図４に示し、その結果(Ｓ)−及び(Ｒ)−異性体間の構造的な差はオリゴヌクレオチド構造にほとんど影響を及ぼさないことが分かる。
［実施例３］：ベンジルグリコレートを用いた式(II)のＯ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ベンジルグリコレートの製造
ベンジルグリコレート(１００μｌ、０．７０４ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(４８０μｌ、２．８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ７ｍｌに加えて３０分間攪拌した後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(２３４μｌ、１．０６ｍｍｏｌ)を滴下して３０分間攪拌した。その後、生成したかさばった白色沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液２５ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ ４０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残った黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して無色液体状の標題化合物(１６７ｍｇ、０．４５８ｍｍｏｌ)を６５％の収率で得た。
ベンジルグリコレート(１００μｌ、０．７０４ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(４８０μｌ、２．８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ７ｍｌに加えて３０分間攪拌した後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(２３４μｌ、１．０６ｍｍｏｌ)を滴下して３０分間攪拌した。その後、生成したかさばった白色沈殿物を濾過し、減圧下で乾燥した。これに５％ＮａＨＣＯ３溶液２５ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ ４０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残った黄色液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して無色液体状の標題化合物(１６７ｍｇ、０．４５８ｍｍｏｌ)を６５％の収率で得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：３８９．０［Ｍ＋Ｎａ＋］；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３０３２，２９６７，２９３２，１７５８，１４９６，１４５５，１３９５，１１８５，１０９８；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)７．３３(５Ｈ，ｓ)，５．１６(２Ｈ，ｓ)，４．２８−４．１７(２Ｈ，ｍ)，３．９１−３．８１(２Ｈ，ｍ)，３．６４−３．５７(２Ｈ，ｍ)，２．６３−２．５６(２Ｈ，ｍ)，１．７７−１．２３(１２Ｈ，ｍ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ１６９．８，１６９．８，１３４．９，１２８．１，１２８．０，１１７．３，６６．３，６０．４，６０．１，５８．６，５８．４，４２．９，４２．７，２４．２，２４．１，２４．０，１９．８，１９．８；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ１５３．７；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ１８Ｈ２７Ｎ２Ｏ４Ｐ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：３８９．１６０６；実測値：３６８．１６０３。
［実施例４］：リトコール酸(lithocolic acid)を用いた、式(III)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１)リトコールアルコール(化合物８)の製造
リトコール酸(５２７ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ)をＴＨＦ３０ｍｌに溶かし、０℃に冷却し、ＬＡＨ(Lithium aluminum hydride)(２４７．６ｍｇ、６．５８ｍｍｏｌ)を滴下して４時間攪拌した。その後、これにＨ２Ｏ ２５０μｌ及び１５％ＮａＯＨ水溶液２５０μｌを順次加えた。生成したかさばった白色沈殿物を濾過した後、減圧下で乾燥させて白色固体状の標題化合物(４８６．４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ)を９５％の収率で得た。
(段階１)リトコールアルコール(化合物８)の製造
リトコール酸(５２７ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ)をＴＨＦ３０ｍｌに溶かし、０℃に冷却し、ＬＡＨ(Lithium aluminum hydride)(２４７．６ｍｇ、６．５８ｍｍｏｌ)を滴下して４時間攪拌した。その後、これにＨ２Ｏ ２５０μｌ及び１５％ＮａＯＨ水溶液２５０μｌを順次加えた。生成したかさばった白色沈殿物を濾過した後、減圧下で乾燥させて白色固体状の標題化合物(４８６．４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ)を９５％の収率で得た。
ｍ．ｐ．９６．５−９７．８℃；
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ：３６２．３［Ｍ＋］；
ＩＲ(ニート)：ｖ＝３２０５，２９３４，２８６２，１４４６，１０６６，９１４，７２８ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝３．６１−３．５７(３Ｈ，ｍ)，１．８２−１．０１(２８Ｈ，ｍ)，０．９０(６Ｈ，ｓ)，０．６２(３Ｈ，ｓ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)７０．３，６２．０，５６．０，５５．７，４２．１，４１．６，３５．９，３５．３，３５．１，３５．０，３４．１，３１．５，３０．０，２９．０，２７．８，２６．８，２６．０，２３．７，２３．０，２０．３，１８．２，１１．６；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ２４Ｈ４１Ｏ１に対する［Ｍ−ＯＨ］＋計算値：３４５．３１５７；実測値：３４５．２０。
ＭＳ(ＥＩ)：ｍ／ｚ：３６２．３［Ｍ＋］；
ＩＲ(ニート)：ｖ＝３２０５，２９３４，２８６２，１４４６，１０６６，９１４，７２８ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝３．６１−３．５７(３Ｈ，ｍ)，１．８２−１．０１(２８Ｈ，ｍ)，０．９０(６Ｈ，ｓ)，０．６２(３Ｈ，ｓ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)７０．３，６２．０，５６．０，５５．７，４２．１，４１．６，３５．９，３５．３，３５．１，３５．０，３４．１，３１．５，３０．０，２９．０，２７．８，２６．８，２６．０，２３．７，２３．０，２０．３，１８．２，１１．６；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ２４Ｈ４１Ｏ１に対する［Ｍ−ＯＨ］＋計算値：３４５．３１５７；実測値：３４５．２０。
(段階２)Ｏ−ＤＭＴｒ−リトコールアルコール(化合物９)の製造
上記段階１で得られたリトコールアルコール(４５５．１ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(６８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ)をピリジン１０ｍｌに溶かした後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ(５４４ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ)を加え、室温で１９時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３５０ｍｌを加え、酢酸エチル５０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、オレンジ色のオイル残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル／ヘキサン＝１：４)で精製して白色固体状の標題化合物(７４４．８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ)を８９％の収率で得た。
上記段階１で得られたリトコールアルコール(４５５．１ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(６８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ)をピリジン１０ｍｌに溶かした後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ(５４４ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ)を加え、室温で１９時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３５０ｍｌを加え、酢酸エチル５０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、オレンジ色のオイル残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル／ヘキサン＝１：４)で精製して白色固体状の標題化合物(７４４．８ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ)を８９％の収率で得た。
ｍ．ｐ．８１．２−８２．１℃；ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：６６４．４(Ｍ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３４２１，２９３４，２８６３，１７３９，１６０８，１５８２，１５０９，１４４６，１２５０，１１７５，１０３６，８２７ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．４５(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ)，７．３５−７．２６(ｍ，７Ｈ)，６．８９−６．８０(ｄｄ，４Ｈ，Ｊ１＝７．０Ｈｚ，Ｊ２＝１．９Ｈｚ)，３．８０(ｓ，６Ｈ)，３．６４(ｂｒ，１Ｈ)，３．０４−２．９８(ｍ，２Ｈ)，１．９９−０．８９(ｍ，３４Ｈ)，０．６３(ｓ，３Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝１５９．０，１４８．２，１３７．６，１３０．７，１２９．０，１２８．３，１２７．２，１２６．６，１１３．７，８６．４，７２．６，６４．７，５７．３，５６．９，５５．９，４３．４，４２．９，４１．２，４０．９，３７．２，３６．６，３６．３，３６．１，３５．３，３３．１，３１．３，２８．９，２７．９，２７．４，２７．２，２４．９，２４．１，２１．６，１９．４，１２．８；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ４５Ｈ６０Ｏ４に対する［Ｍ−ＯＨ］＋計算値：６６４．４４９２；実測値：６６４．４４８９。
(段階３)Ｏ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−リトコールアルコール(式(III)の化合物)の製造
上記段階２で得られたＯ−ＤＭＴｒ−リトコールアルコール(８９．２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(７７μｌ、０．４５ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２ ２ｍｌに溶かした。これにクロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(４９μｌ、０．２２５ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１５分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、白色固体状の残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１：１．５)で精製して白色固体の標題化合物(６９．３ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ)を５４％の収率で得た。
上記段階２で得られたＯ−ＤＭＴｒ−リトコールアルコール(８９．２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(７７μｌ、０．４５ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２ ２ｍｌに溶かした。これにクロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(４９μｌ、０．２２５ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１５分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、白色固体状の残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝１：１．５)で精製して白色固体の標題化合物(６９．３ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ)を５４％の収率で得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：８６６［Ｍ＋Ｈ＋］；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３３５３，２９６２，２９３５，２８６６，１６０８，１５０９，１４６３，１４４６，１３７６，１３６４，１３００，１２５０，１１７８，１０３５，９７５，８２７，７５４ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．３５(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ)，７．２５−７．１１(ｍ，７Ｈ)，６．７３(ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ)，３．７０(ｓ，９Ｈ)，３．５２(ｍ，２Ｈ)，２．９１(ｍ，２Ｈ)，２．６５(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ)，１．８８−０．８０(ｍ，４６Ｈ)，０．５３(ｓ，３Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５９．０，１４６．２，１３７．６，１３０．７，１２９．０，１２８．３，１２７．２，１１３．７，１１０．１，８６．４，７７．９，７５．２，７４．９，６４．７，５９．１，５８．８，５７．２，５６．９，５５．９，４３．８，４３．７，４３．４，４３．０，４１．１，４０．９，３６．６，３６．２，３６．０，３５．３，３３．１，３２．３，３０．３，２８．９，２８．０，２７．４，２７．１，２５．４，２５．３，２５．２，２５．１，２４．９，２４．０，２１．５，２１．１，２１．０，１９．４，１２．７；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１４８．１，１４７．４；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ５４Ｈ７８Ｏ５Ｎ２Ｐ１に対する［Ｍ＋１］＋計算値：８６５．５６４８；実測値：８６５．５６４１。
［実施例５］：ｂＤＮＡの合成に用いられる式(IVａ)のフォスフォアミダイトの製造
(段階１)ペンタエリスリトールのＤＭＴｒ保護反応(化合物１０、１１及び１２)
ペンタエリスリトール(１．１ｇ、７．３４ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(４−dimethylaminopyridine)(２７６ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ)をＰｙ／ＤＭＦ(２／１)１５ｍｌに溶かした後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ(４．１ｇ、１２．１ｍｍｏｌ)を加え、室温で１０時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３８０ｍｌを加えて、反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、オレンジ色のオイル残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２(化合物１０)；酢酸エチル：ヘキサン＝１：１(化合物１１)；及びＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１(化合物１２))で精製して３種の標題化合物(化合物１０：２．９３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ、７０％；化合物１１：５２０ｍｇ、０．７０２ｍｍｏｌ、１１．６％；化合物１２：３９５ｍｇ、０．９０１ｍｍｏｌ、７．４％)を得た。
(段階１)ペンタエリスリトールのＤＭＴｒ保護反応(化合物１０、１１及び１２)
ペンタエリスリトール(１．１ｇ、７．３４ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(４−dimethylaminopyridine)(２７６ｍｇ、２．２６ｍｍｏｌ)をＰｙ／ＤＭＦ(２／１)１５ｍｌに溶かした後、ＤＭＴｒ−Ｃｌ(４．１ｇ、１２．１ｍｍｏｌ)を加え、室温で１０時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３８０ｍｌを加えて、反応溶液をＣＨ２Ｃｌ２ ５０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、オレンジ色のオイル残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２(化合物１０)；酢酸エチル：ヘキサン＝１：１(化合物１１)；及びＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ＝１０：１(化合物１２))で精製して３種の標題化合物(化合物１０：２．９３ｇ、２．８１ｍｍｏｌ、７０％；化合物１１：５２０ｍｇ、０．７０２ｍｍｏｌ、１１．６％；化合物１２：３９５ｍｇ、０．９０１ｍｍｏｌ、７．４％)を得た。
化合物１０：ｍ．ｐ．９６．３−９７．８℃；ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：１０６５．３(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３４１０．１，２９２９．６，１６０７．４，１５０８．１，１４６１．７，１３００．２，１２５０．６，１１７６．４，１０３４．３ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．２６−７．２４(ｍ，６Ｈ)，７．１９−７．１５(ｍ，２１Ｈ)，６．７２(ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ)，３．７６(ｓ，１８Ｈ)，３．５９(ｓ，２Ｈ)，３．３２(ｓ，２Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝１５８．８，１４５．３，１３６．３，１３０．６，１２８．６，１２８．１，１２６．９，１１３．４，８６．４，６４．３，５５．５，４５．８．
化合物１１：ｍ．ｐ．８８．８−８９．７℃．ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：７６３．２(Ｍ＋Ｎａ)＋；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３４４２，１６８４，１６５２，１６０８，１５０７，１４５７，１２５０，１２１７，１１７６，１０３４ｃｍ−１，１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．３８−７．３６(ｍ，４Ｈ)，７．２９−７．２０(ｍ，１４Ｈ)，６．８０(４，８Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ)，３．７６(ｓ，１２Ｈ)，３．６４(ｓ，４Ｈ)，３．２３(ｓ，４Ｈ)，２．３９(ｓ，２Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５８．０，１４４．３，１３５．３，１２９．７，１２７．７，１２７．４，１２６．３，１１２．７，８５．８，６５．０，６２．７，５４．７，４５．０；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ５２Ｈ５４Ｏ１０Ｎａに対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：７６３．３２４７；実測値：７６３．３２４７。
化合物１２：室温でオイル状；ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：４６１．１(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３７３４．１，３４０４．７，２９２７．３，１７３３．７，１６０７．２，１５４０．８，１５０８．１，１４５８．０，１３００．８，１２５０．１，１１７６．１，１０３３．３，８２８．９，７５４．７ｃｍ−１，１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝７．４０−７．３９(ｍ，２Ｈ)，７．３１−７．２４(ｍ，７Ｈ)，６．８４−６．８１(ｍ，４Ｈ)，３．７７(ｓ，６Ｈ)，３．７１(ｓ，６Ｈ)，３．１６(ｓ，２Ｈ)，２．３５(ｂｒ，２Ｈ)，１．６３(ｂｒ，１Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝１５８．８，１３５．７，１３０．２，１２８．２，１２７．２，１１３．５，６５．４，６４．１，５５．４，４５．５。
(段階２)Ｏ−トリ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール(式(IVａ)の化合物)の製造
上記段階１で得られた化合物１０(５６０ｍｇ、０．５３７ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(１８７μｌ、１．０７４ｍｍｏｌ)をＴＨＦ６ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(２９７μｌ、１．３４ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、黄色オイル状の残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して無色オイルの標題化合物(２３６ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ)を３５％の収率で得た。
上記段階１で得られた化合物１０(５６０ｍｇ、０．５３７ｍｍｏｌ)及びＤＩＰＥＡ(１８７μｌ、１．０７４ｍｍｏｌ)をＴＨＦ６ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(２９７μｌ、１．３４ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、黄色オイル状の残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して無色オイルの標題化合物(２３６ｍｇ、０．１９０ｍｍｏｌ)を３５％の収率で得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：１２６５．６［Ｍ＋Ｎａ＋］；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝７．２７−７．１４(ｍ，２７Ｈ)，６．７２−６．６８(ｍ，１２Ｈ)，４．１１(ｑ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，３．７５(ｓ，１８Ｈ)，３．３９−３．２３(ｍ，８Ｈ)，２．２３(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ)，２．０３(ｓ，２Ｈ)，１．３１−１．２２(ｍ，４Ｈ)，１．０９(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，０．９５(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５７．７，１４４．７，１３５．８，１２９．７，１２７．８，１２７．１，１２６．０，１１２．５，８５．１，６２．３，５７．７，５４．７，４２．５，２４．１，２４．０，１３．７；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝１４８．９；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ(ｍ／ｚ)：Ｃ７７Ｈ８３Ｎ２Ｏ１１Ｐ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：１２４３．５８５２；実測値：１２４３．５８０７。
［実施例６］：ｂＤＮＡの合成に用いられる式(IVｂ)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１)Ｏ−Ｄｉ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１３)の製造
上記実施例５の段階１で得た化合物１１(５０６ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ)、ＥＤＣ(２８８ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(１８４ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２溶液１４ｍｌに溶かした後、ルブリン酸(７７μｌ、０．７５ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ ２０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)で精製して黄色固体である標題化合物(３１９．７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ)を５５％の収率で得た。
(段階１)Ｏ−Ｄｉ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１３)の製造
上記実施例５の段階１で得た化合物１１(５０６ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ)、ＥＤＣ(２８８ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(１８４ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２溶液１４ｍｌに溶かした後、ルブリン酸(７７μｌ、０．７５ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ ２０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)で精製して黄色固体である標題化合物(３１９．７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ)を５５％の収率で得た。
ｍ．ｐ．５５．４−５６．１℃；ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：８６１．３(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３５２２．７，３０５５．８，３０３５．１，３０００．１，２９５５．５，２９３２．７，２８３６．１，１７３３．６，１７１７．２，１５０６．３，１３０１．６，１２５１．３，１１７７．６，１１５４．９，１０７２．５，１０３３．９ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，アセトン−ｄ６)δ＝７．４１−７．３８(ｍ，４Ｈ)，７．２９−７．１８(ｍ，１４Ｈ)，６．８５−６．８２(ｍ，８Ｈ)，４．１５(ｓ，２Ｈ)，３．７７(ｓ，１２Ｈ)，３．７７(ｓ，１２Ｈ)，３．６９−３．６７(ｍ，２Ｈ)，３．５０(ｍ，１Ｈ)，３．２９(ｓ，４Ｈ)，２．６３(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，２．３５(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，２．０７(ｓ，３Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)：δ＝２０５．７，１７２．４，１５９．０，１４５．９，１３６．４，１３０．６，１２８．０，１２６．９，１２６．３，１１３．３，８６．２，６４．０，６１．９，５５．０，４５．５，３７．７，２８．０；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ５２Ｈ５４Ｏ１０Ｎａに対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：８６１．３６１５；実測値：８６１．３６１７。
(段階２)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール(式(IVｂ)の化合物)の製造
上記段階１で得たＯ−Ｄｉ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(３１９．７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(２６０μｌ、１．４８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１６６μｌ、０．７４ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１．５時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝３：２)で精製して黄色オイル状の標題化合物(３０２．８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ)を７７％の収率で得た。
上記段階１で得たＯ−Ｄｉ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(３１９．７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(２６０μｌ、１．４８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１６６μｌ、０．７４ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１．５時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留した。残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液：ＣＨ２Ｃｌ２／ヘキサン＝３：２)で精製して黄色オイル状の標題化合物(３０２．８ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ)を７７％の収率で得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：１０４０(Ｍ＋Ｈ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝２９６４，２９３１，２９３２，１７３６，１７２０，１６０７，１５８１，１５０８，１４６３，１４４４，１２５０，１１７７，１０３２ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．２４(ｄ，４Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ)，７．１７−７．０９(ｍ，１４Ｈ)，６．６７(ｄ，８Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ)，４．０２(ｑ，２Ｈ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ)，３．６８(ｓ，１２Ｈ)，３．６６−３．３７(ｍ，６Ｈ)，３．１６(ｍ，４Ｈ)，２．５０(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ)，２．３５(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ)，２．２８(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．７ｚ)，２．０５(ｓ，３Ｈ)，１．２１(ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．７Ｈｚ)，１．０５(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，０．９４(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５，５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１７２．５，１５８．８，１４５．２，１３６．２，１３０．５，１２８．４，１２７．９，１２６．８，１１７．９，１１３．２，８６．０，６１．６，６０．６，５５．４，４３．３，４３．１，３８．０，３０．０，２８．０，２４．８，２４．７，１４．４，１５８．０，１４４．２，１３５．３，１３５．０，１２９．７，１２７．７，１２７．４，１２７．３，１２６．３，１１７．２，１１２．６，１１２．５，８５．８，８５．５，６２．６，６１．６，６１．４，６０．２，５７．９，５７．７，５４．７，４６．９，４３．５，４２．７，４２．５，３７．３，３０．４７，２９．３，２７．３，２４．２，２４．１，２２．１，２０．７，１９．９，１９．８；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５０．２；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ６１Ｈ７２Ｎ２Ｏ１１Ｐ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｈ］＋計算値：１０３９．４８７４；実測値：１０３９．４８７７。
［実施例７］：ｂＤＮＡの合成に用いられる式(IVｃ)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１４)及びＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１５)の製造
上記実施例５の段階１で得られた化合物１２(４８４．３ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ)、ＥＤＣ(２５３ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(１６２ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌに溶かした後、ルブリン酸(１３５ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ ２０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２と酢酸エチル：ヘキサン＝１：１に溶出)で精製して黄色液体状の標題化合物(化合物１４：１４１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２０％；化合物１５：２８５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、４８％)をそれぞれ得た。
(段階１)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１４)及びＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１５)の製造
上記実施例５の段階１で得られた化合物１２(４８４．３ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ)、ＥＤＣ(２５３ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)及びＤＭＡＰ(１６２ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)をＣＨ２Ｃｌ２ １０ｍｌに溶かした後、ルブリン酸(１３５ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ ２０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２ １５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２と酢酸エチル：ヘキサン＝１：１に溶出)で精製して黄色液体状の標題化合物(化合物１４：１４１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、２０％；化合物１５：２８５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ、４８％)をそれぞれ得た。
化合物１４：ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ６５７．２(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３３９０，１７９２，１７７２，１６９９，１６８４，１６５３，１５５８，１５４０，１５２１ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．４１−７．３８(ｍ，２Ｈ)，７．２８−７．２０(ｍ，７Ｈ)，６．８５−６．８１(ｍ，４Ｈ)，４．１６−４．１０(ｍ，４Ｈ)，３．７８(ｓ，６Ｈ)，３．５４(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ)，３．１４(ｓ，２Ｈ)，２．６９(ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ)，２．５０−２．４４(ｍ，４Ｈ)，２．１５(ｓ，６Ｈ)，１．２５(ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．１４Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ−ＤＥＰＴ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣ１３)：５＝１３０．７(ＣＨ１)，１２８．７(ＣＨ１)，１２８．５(ＣＨ１)，１２８．５(ＣＨ１)，１１３．８(ＣＨ１)，６３．６(ＣＨ２)，６２．６(ＣＨ２)，６１．８(ＣＨ２)，５５．９(ＣＨ３)，３８．６(ＣＨ２)，３０．４(ＣＨ３)，２８．５(ＣＨ２)；ＨＲＭＳ−ＥＳＩ(ｍ／ｚ)：Ｃ３６Ｈ４２Ｏ１０Ｎａに対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：６５７．２６７６；実測値：６５７．２６７３。
化合物１５：ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ５５９．２(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３４００，３１７９，３０８４，３０５６，３００１，２９２９．７，２８３５．８，１７１６．９，１６０６．４，１５０８．５，１４４５．２，１３８０．３，１３０１．３，１２５０．３，１２２８．２，１１７７．６，１０３３．９，９９６．５，９４９．８，８３０．４，８０７．２，７５４．７ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．３８−７．３５(ｍ，２Ｈ)，７．２６−７．１１(ｍ，７Ｈ)，６．７５(ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ)，４．３５(ｓ，２Ｈ)，４．２２(ｓ，２Ｈ)，３．６８(ｓ，６Ｈ)，３．６４(ｓ，４Ｈ)，３．０８(ｓ，２Ｈ)，２．５７(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ)，２．３７(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ)，２．０５(ｓ，３Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝２０６．２，１７２．４，１５７．９，１５３．８，１４４．４，１３５．４，１２９．６，１２７．６，１２７．３，１２６．２，１１２．６，８５．５，６３．４，６３．２，６１．７，５４．６，４４．３，２９．３，２７．４；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ３１Ｈ３６Ｏ８Ｎａに対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：５５９．２３０８；実測値：５５９．２３０８。
(段階２)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール(式(IVｃ)の化合物)の製造
段階１で得たＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１４)(１４１ｍｇ、０．２２２ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(７７μｌ、０．４４５ｍｍｏｌ)をＴＨＦ６ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(７４μｌ、０．３３ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で３０分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して黄色オイル状の標題化合物(１１４．２ｍｇ、０．１３５４ｍｍｏｌ)を６１％の収率で製造した。
段階１で得たＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１４)(１４１ｍｇ、０．２２２ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(７７μｌ、０．４４５ｍｍｏｌ)をＴＨＦ６ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(７４μｌ、０．３３ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で３０分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して黄色オイル状の標題化合物(１１４．２ｍｇ、０．１３５４ｍｍｏｌ)を６１％の収率で製造した。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝２９６６，２９３３，１７３８，１７１７，１６０７，１５０８，１４６３，１３６２，１３０１，１２５０，１２０２，１１７８，１１５４，１０７６，１０３２ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．４０−７．３８(ｍ，２Ｈ)，７．２９−７．２６(ｍ，７Ｈ)，６．８２(ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ)，４．１７−４．１２(ｍ，４Ｈ)，３．７８(ｓ，６Ｈ)，３．７３−３．６５(ｍ，２Ｈ)，３．６１−３．５１(ｍ，２Ｈ)，３．１５(ｓ，２Ｈ)，２．６８(ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ)，２．５６(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ)，２．４８(ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ)，２．１６(ｓ，６Ｈ)，１．２５(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，１．１６(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)，１．１０(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５，５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝２０５．８，１７１．８，１５８．０，１５８．０，１４４．２，１３５．３，１３５．０，１２９．７，１２７．７，１２７．４，１２７．３，１２６．３，１１７．２，１１２．６，１１２．５，８５．８，８５．５，６２．６，６１．６，６１．４，６０．２，５７．９，５７．７，５４．７，４６．９，４３．５，４２．７，４２．５，３７．３，３０．４７，２９．３，２７．３，２４．２，２４．１，２２．１，２０．７，１９．９，１９．８；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５０．７
［実施例８］：ｂＤＮＡの合成に用いられる式(IVｄ)のフォスフォアミダイト化合物の製造
(段階１)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ペンタエリスリトール(化合物１５)の製造
上記実施例７の段階１で得られたＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１５)(２１３ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ)とＤＭＡＰ(１６４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４ｍｌに溶かした後、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド(６５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２２０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)で精製して黄色オイル状の標題化合物(１１９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、４６％；Ｄｉ−保護された産物：７２．８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、２５％)を得た。
(段階１)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ペンタエリスリトール(化合物１５)の製造
上記実施例７の段階１で得られたＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−ペンタエリスリトール(化合物１５)(２１３ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ)とＤＭＡＰ(１６４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４ｍｌに溶かした後、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド(６５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ)を加え、室温で３時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、ＣＨ２Ｃｌ２２０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：２)で精製して黄色オイル状の標題化合物(１１９ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、４６％；Ｄｉ−保護された産物：７２．８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、２５％)を得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ６７３．３(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝３５００．５，２９５３．９，２９３０．１，２８５５．９，１７２０．０，１６０８．１，１５０９．０，１４６３．７，１４４４．９，１３５９．５，１３０１．４，１２５１．４，１１７７．４，１１５７．６，１０７１．９，１０３５．４，９１１．９，８３６．１ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．４３−７．４１(ｍ，２Ｈ)，７．３２−７．２６(ｍ，７Ｈ)，６．８５−６．８２(ｍ，４Ｈ)，４．２０(ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０Ｈｚ)，３．７９(ｓ，６Ｈ)，３．６６−３．６４(ｍ，４Ｈ)，３．１５(ｓ，２Ｈ)，２．７０(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ)，２．５０(ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ)，２．１７(ｓ，３Ｈ)，０．８４(ｓ，９Ｈ)，０．０３(ｓ，３Ｈ)，０．０２(ｓ，３Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝２０６．６，１７３．０，１５８．９，１４５．１，１３６．２，１３０，５，１２８．５，１２８．２，１２７．２，１１３．５，８６．６，６４．８，６４．０，６３．９，６２．６，５５．６，４５．５，３８．３，３０．１，２８．３，２６．２，１８．５，−５．３；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：６７３．３１７３；実測値：６７３．３１７３。
(段階２)Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール(式(IVｄ)の化合物)の製造
段階１で得たＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ＴＢＤＭＳ−ペンタエリスリトール(化合物１６)(１３４．８ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(１４４μｌ、０．８２８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４．２ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１１４μｌ、０．５１８ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１．５時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して黄色オイル状の標題化合物(８６．２ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ)を５０％の収率で得た。
段階１で得たＯ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−ＴＢＤＭＳ−ペンタエリスリトール(化合物１６)(１３４．８ｍｇ、０．２０７ｍｍｏｌ)とＤＩＰＥＡ(１４４μｌ、０．８２８ｍｍｏｌ)をＴＨＦ４．２ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１１４μｌ、０．５１８ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で１．５時間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３１０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１０ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して黄色オイル状の標題化合物(８６．２ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ)を５０％の収率で得た。
ＭＳ(ＦＡＢ)：ｍ／ｚ：８７３．３３(Ｍ＋Ｎａ＋)；ＩＲ(ニート)：ｖ＝２９６１．８，２９３０．２，２８８１．８，２８５６．３，１７３８．０，１７２１．９，１６０７．７，１５０８．９，１４６３．６，１４４５．３，１３６２．９，１２７９．９，１２５１．５，１１７８．０ｃｍ−１；１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．４１−７．３８(ｍ，２Ｈ)，７．２９−７．１７(ｍ，７Ｈ)，６．７９(ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．９Ｈｚ)，４．１１−４．０９(ｍ，２Ｈ)，３．７６(ｓ，６Ｈ)，３．７０−３．５２(ｍ，８Ｈ)，３．１２(ｓ，２Ｈ)，２．６６−２．６４(ｍ，２Ｈ)，２．５３−２．４５(ｍ，４Ｈ)，２．１５(ｓ，３Ｈ)，１．１４(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ)，１．０８(ｄｄ，６Ｈ，Ｊ１＝６．７Ｈｚ，Ｊ２＝１．４Ｈｚ)，０．０８(ｄ，９Ｈ，Ｊ＝１．１Ｈｚ)，−０．０３(ｄ，６Ｈ，Ｊ＝２．４Ｈｚ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝２０５．９，１７１．９，１５７．９，１４４．６，１３５．７，１２９．７，１２７．２，１２６．１，１１７．２，１１２．５，８５．３，６３．２，６１．０，６０．４，５７．７，５４，７，４５．０，４２．６，４２．５，３７．４，２９．４，２７．３，２５．３，２４．２，２４．１，１９．９，１９．８，１７．７，−６．１２；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２１．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５０．３，１５０．１；ＨＲＭＳ−ＦＡＢ(ｍ／ｚ)：Ｃ４６Ｈ６７Ｎ２Ｏ９Ｐ１Ｓｉ１Ｎａ１に対する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値：８７３．４２５１；実測値：８７３．４２５２。
［実施例９］：デントリマーを用いた式(V)のフォスフォアミダイト化合物の製造
化合物１７であるデントリマー化合物(８４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、入手先：Hawker,C.J.;Frkchet,J.M.J.J.Am.Chem.SOC.112,7638-7647(1990))とＮ−メチルモルホリン(２６０μｌ、２．３６ｍｍｏｌ)をＣＨ３ＣＮ ４ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１４０μｌ、０．６２ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で５分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して薄黄色オイル状の標題化合物(９６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ)を９２％の収率で得た。
化合物１７であるデントリマー化合物(８４ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ、入手先：Hawker,C.J.;Frkchet,J.M.J.J.Am.Chem.SOC.112,7638-7647(1990))とＮ−メチルモルホリン(２６０μｌ、２．３６ｍｍｏｌ)をＣＨ３ＣＮ ４ｍｌに溶かした後、クロロ−(２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスフィン(１４０μｌ、０．６２ｍｍｏｌ)を滴下し、室温で５分間攪拌した。これに５％ＮａＨＣＯ３ １０ｍｌを加えた後、酢酸エチル１５ｍｌで抽出した。得られた有機層をＭｇＳＯ４で乾燥した後、減圧蒸留し、残留物をフラッシュクロマトグラフィー(溶離液−酢酸エチル：ヘキサン＝１：３)で精製して薄黄色オイル状の標題化合物(９６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ)を９２％の収率で得た。
１Ｈ−ＮＭＲ(３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝７．３２−７．２３(ｍ，２０Ｈ)，６．６１(ｓ，４Ｈ)，６．５０(ｂｒ，４Ｈ)，６．４７(ｓ，１Ｈ)，４．９４(ｓ，８Ｈ)，４．８８(ｓ，４Ｈ)，４．４９(ｓ，２Ｈ)，４．１１(ｑ，２Ｈ)，３．９２(ｔ，２Ｈ)，２．２８(ｔ，２Ｈ)，１．０４(ｄ，６Ｈ)，０．９３(ｄ，６Ｈ)；１３Ｃ−ＮＭＲ(７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１６０．９，１６０．８，１４０．０，１３７．５，１２９．３，１２８．７，１２８．３，１０７．２，１０６．５，１０２．４，７０．９，７０．７，５３．０，４４．９，４４．８，４３．０，２２．５，２２．４．；３１Ｐ−ＮＭＲ(１２７ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３)δ＝１５０．９。
本発明を上記の具体的な実施例と関連して記述したが、添付された特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内で当該分野の熟練者が本発明を多様に変形及び変化させ得ることを理解しなければならない。
Claims (2)
- 下記式(II)〜(V)から選択されるフォスフォアミダイト化合物:
- 次の化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の化合物：
Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ベンジルグリコレート；
Ｏ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−リトコールアルコール；
Ｏ−トリ−ＤＭＴｒ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−ｄｉ−Ｌｅｖ−Ｏ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール；及び
Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｏ−Ｌｅｖ−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−((２−シアノエチル)−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−フォスフォアミダイト)−ペンタエリスリトール。
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