CN112424213A - 寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段、其制造方法、使用其的寡核苷酸合成方法。式中,B为保护/未保护核苷碱基,R1为保护基,R2、R3、R4为OCH2CH2CN、OCH2CH=CH2等,R5为取代/未取代的脂肪族基团/芳香族基团;X为未共用电子对、O、S;Y为NHR6、卤素、CN等或被酰基类、醚类、硅烷基类保护基保护的羟基,R6为H、脂肪族基团、芳香族基团;Z为H、烷基、O‑或N‑烷基、卤素,或者在与Y之间形成Z‑Y键;(m+n)为2以上且23以下的整数。
Description
技术领域
本发明涉及寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法。
背景技术
近年来,对于以天然型或非天然型寡核苷酸为基本骨架的核酸药物的关注度不断提高。为了获得为实现目标作用而设计的核酸药物,使用采用化学合成法的制造方法。
采用以往方法的寡核苷酸合成中,主要采用以单体亚磷酰胺为原料,每次1个碱基逐步进行偶联反应,逐渐伸长核苷酸的长度的方法(参照非专利文献1)。寡核苷酸合成中的每次1个的伸长时,除了使单体亚磷酰胺与核苷的5'-羟基反应的偶联反应之外,还需要氧化或硫化3价磷的工序和以备后续的偶联反应而对核苷的5'羟基的保护基进行脱保护的工序。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Caruthers等,Bioactive Molecules,3,第3-21页(1987)
发明内容
发明所要解决的技术问题
然而,使用以往方法中所用的原料的情况下,上述寡核苷酸合成中的各偶联反应的收率并不一定达到100%。因此,难以高效地合成具有一定程度的长度的寡核苷酸。
偶联反应之后的氧化/硫化工序、脱保护工序也不一定以100%进行。因此,作为目标的寡核苷酸的长度越长,则具有作为目标的长度的寡核苷酸的收率越低。
另外,在最终获得具有目标长度的寡核苷酸的阶段,需要进行除去如上所述的各工序中生成的副产物和试剂残渣的纯化工序。作为合成寡核苷酸N聚体的情况下生成的每次伸长1个碱基的合成方法中的代表性的副产物,有偶联工序中生成的短1个碱基的(N-1)聚体、短2个碱基的(N-2)聚体等。这样的(N-1)聚体、(N-2)聚体的结构和物性与作为目标的N聚体非常类似。因此,在使用色谱法等纯化N聚体的阶段,作为目标的N聚体的迁移率与作为副产物的(N-1)聚体、(N-2)聚体等的迁移率的差小。由此,存在用于将N聚体与其他物质准确分离的纯化负荷大的问题。
此外,广泛采用的寡核苷酸合成中,使用对于将3'-末端固定于固相载体的核苷沿5'-方向进行链伸长的固相合成法。该方法中,需要购入用于固相合成的单体亚磷酰胺的市售品,或者实验者自行制备。一般来说,市售的单体亚磷酰胺价格昂贵,成为大量合成作为目标的核苷酸的障碍。此外,实验者自行制备的情况下,需要预先高纯度且高收量地准备作为目标的单体亚磷酰胺。这是因为如果单体核苷酸不是高纯度,则很可能会对寡核苷酸合成中的偶联反应造成影响。
本发明鉴于这样的情况而进行,其目的在于提供可更简便地纯化且能够大量供给的寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法。
解决技术问题所采用的技术方案
为了解决上述课题,本发明的寡核苷酸合成用片段及其制造方法、以及使用其的寡核苷酸的合成方法采用以下的手段。
本发明的第一种形态为以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段。
[化1]
所述式(I)中,B独立为保护或未保护核苷碱基,R1为保护基,R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH3CN、OCH2CH=CH2、OCH3,R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团;X独立为未共用电子对、=O或=S,Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基,R6为H、脂肪族基团、芳香族基团,Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素,或者在与所述Y之间形成Z-Y键,(m+n)为2以上且23以下的整数。
上述第一种形态中,所述式(I)中的B为被保护基保护的核苷碱基时,该保护基可以是酰基类保护基。
上述第一种形态中,所述式(I)中,可以是所述R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基,所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基,所述Z较好是H,所述R5为异丙基。
本发明的第二种形态为以下述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的制造方法。
[化2]
所述式(I)中,B独立为保护或未保护核苷碱基,R1为保护基,R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH3CN、OCH2CH=CH2、OCH3,R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团;X独立为未共用电子对、=O或=S,Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基,R6为H、脂肪族基团、芳香族基团,Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素,或者在与所述Y之间形成Z-Y键,(m+n)为2以上且23以下的整数。
所述制造方法包括:
(a)使以下述式(II):
[化3]
表示的核苷与具有R2P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有下述式(I II):
[化4]
的结构的核苷反应,制备具有下述式(IV):
[化5]
的结构的化合物的工序;
(b)使具有所述式(IV)的结构的化合物与具有R3P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有上述式(III)的结构的核苷或具有下述式(V):
[化6]
[化7]
[化8]
的结构的化合物的工序;
(c)根据需要重复所述工序(b)至少1次的工序;
(d)使所得的中间体与具有R4P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物反应,制备具有所述式(I)的结构的片段的工序。
上述第二种形态中,所述式(I)中的B为被保护基保护的核苷时,该保护基可以是酰基类保护基。
所述第二种形态中,所述式(I)中,可以是所述R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基,所述Y较好是H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基,所述Z较好是H,所述R5为异丙基。
所述第二种形态中,可包括:根据需要使氧化剂或硫化剂与所述工序(a)中得到的以式(IV)表示的化合物或所述工序(b)中得到的以式(VII)表示的化合物反应的工序。
本发明的第三种形态为一种使用以上述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的寡核苷酸的合成方法。
所述合成方法包括:(a)所述以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的亚磷酰胺部分与核苷或核苷酸的羟基的缩合工序、(b)所述缩合工序中得到的亚磷酸键部分的氧化工序、(c)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合而得的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。
上述第三种形态中,可在溶液中实施所述各工序。
上述第三种形态中,可在固相载体上实施所述各工序。
发明的效果
如果采用本发明的寡核苷酸合成用片段,与使用广泛采用的单体的亚磷酰胺来分步合成寡核苷酸的情况相比,可减少工序数。因此,可使作为目标的长度的寡核苷酸的收率与以往方法中的收率相比提高。
另外,使用本发明的寡核苷酸合成用片段合成N聚体的寡核苷酸的情况下,不会产生具有N-1~N-3的长度的副产物。因此,可减小作为目标的N聚体的寡核苷酸的纯化负荷,因而发挥可更简便地纯化且能够更大量地供给目标物的效果。
附图说明
图1为表示实施例1中得到的作为寡核苷酸合成用片段的dT三聚体亚磷酰胺的ESI-MS谱的图。
图2为表示实施例1中得到的作为寡核苷酸合成用片段的dT三聚体亚磷酰胺的31PNMR谱的图。
图3为表示使用实施例1中得到的作为寡核苷酸合成用片段合成的寡核苷酸十八聚体的LC谱的图。
具体实施方式
以下,对用于获得本发明所述的寡核苷酸合成用片段的一种实施方式进行说明。
本实施方式中的寡核苷酸合成用片段具有以下述式(I)表示的结构。
[化9]
所述式(I)中,B独立为保护或未保护核苷碱基,R1为保护基,R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH3CN、OCH2CH=CH2、OCH3,R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团;X独立为未共用电子对、=O或=S,Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基,R6为H、脂肪族基团、芳香族基团,Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素,或者在与所述Y之间形成Z-Y键,(m+n)为2以上且23以下的整数。
本实施方式中的寡核苷酸合成用片段如下获得:(1)将用保护基对5'-羟基进行保护并根据需要用保护基对核苷碱基部分进行保护、3'-羟基无保护的核苷(以下称为“5'-保护·3'-无保护核苷”)作为起始物质,对3'-羟基进行磷酸化而在反应体系中作为中间体获得3'-亚磷酰胺,(2)进行所得的中间体与根据需要用保护基对核苷碱基部分进行保护、同时用3'-羟基和5'-羟基均无保护的核苷(以下称为“3',5'-无保护核苷”)的5'-羟基的反应,使残存于3'-末端的无保护的3'-羟基与3价的磷酸化剂反应,进行亚磷酰胺化。通过对(2)重复所需次数(n次),可合成(n+1)聚体核苷酸亚磷酰胺。
与之相对,通过以往方法合成核苷酸二聚体或三聚体的情况下,需要预先制备好如下核苷,即对于5'-保护·3'-无保护核苷,进行保护3'-羟基的反应,然后进行仅除去5'-羟基的保护基的反应,用保护基对3'-羟基进行保护并根据需要用保护基对核苷碱基部分进行保护、并5'-羟基无保护的核苷(以下称为“5'-无保护·3'-保护核苷”)。与之相对,本实施方式中,可将比以往方法少一个保护基的5-羟基和3'-羟基均无保护的核苷用于片段合成。因此,可通过与以往方法少的工序数制备作为片段合成的主要原料之一的3',5'-无保护核苷,能够以低成本、短时间更大量地合成。
本实施方式中的核苷碱基包括腺嘌呤基、鸟嘌呤基、胞嘧啶基、胸腺嘧啶基、尿嘧啶基等天然型碱基,5-甲基胞嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、7-甲基鸟嘌呤基、7-脱氮腺嘌呤基等修饰碱基。这些核苷碱基中的氨基包括苄基类保护基、烯丙基类保护基、氨基甲酸酯类保护基、酰基类保护基。较好是使用乙酰基、苯甲酰基、苯氧基乙酰基、异丙基羰基等酰基类保护基。
本实施方式中的脂肪族基团包括饱和或不饱和的直链状或分支的C1-C18烃、饱和或不饱和的环状C3-C18烃。较好是饱和或不饱和的C1-C8烃或C3-C8环状烃。本实施方式中的芳香族基团包括苯基等碳环类芳香环、萘基等碳环类芳香环或与非碳类芳香环缩合的碳环类芳香环。本实施方式中的脂肪族基团、芳香族基团可被饱和或不饱和的C1-C8烃或C3-C8环状烃、卤素、氰基、硝基、芳香环等取代基取代。
本实施方式中的5'-、3'-或2'-羟基的保护基包括可在酸性条件下除去的保护基、酰基类保护基、硅烷基类保护基。可在酸性条件下除去的保护基包括取代或未取代的含三苯甲基的醚类保护基、9-(9-苯基)咕吨基(pixyl)、取代或未取代的四氢吡喃(THP)基,代表性的保护基有4,4'-二甲氧基三苯甲基。硅烷基类保护基包括三甲基硅烷基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅烷基、三苯基硅烷基。酰基类保护基包括乙酰基、苯甲酰基。此外,还可使用以5'-位与2'-位交联的方式结合的核苷作为原料。该情况下,5'-位与2'-位可形成(5'-位)-L-O-(2'-位)的键,作为L的例子,有C1-C6亚烷基(中途的碳原子可替换为结合了氧原子、烷基的氮原子)。
上述工序(1)中,使5'-保护·3'-无保护核苷的3'-羟基与3价的磷酸化剂反应而在体系中生成3'-亚磷酰胺后,在对所得的3'-亚磷酰胺未进行分离纯化的情况下,添加对亚磷酰胺部分进行活化的活化剂后,使其与3',5'-无保护核苷反应,从而进行1个碱基的伸长。进一步使其与3价磷酸化剂反应而生成3'-亚磷酰胺。作为代表性的3价磷酸化剂,有NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2、CH2=CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2,但并不仅限于这些。作为代表性的活化剂,有1H-四唑、S-乙硫基-1H-四唑、二氰基咪唑、或者磺酸与唑或叔胺形成的盐,但并不仅限于这些。反应在经干燥的二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、DMF、甲苯等溶剂中进行。
上述工序(1)中,向5'-保护·3'-无保护核苷的溶液(0.2~0.4M)中加入3价的磷酸化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的1.05~1.2当量)和活化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的0.4~0.7当量),于室温下搅拌2~5小时。将所得的3'-亚磷酰胺进行硅胶纯化后,进行后续的工序(2)。
上述工序(2)中,向上述工序(1)中得到的3'-亚磷酰胺中,加入3',5'-无保护核苷(5'-保护·3'-无保护核苷的1.3~2.0当量)和活化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的2~3当量),于室温下使其反应0.5~1.5小时,经硅胶过滤和滤液的浓缩,获得伸长了1碱基的3'-末端具有无保护羟基的核苷酸中间体。收率为约60~95%。对于该核苷酸中间体的溶液(0.05~0.4M),使3价的磷酸化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的1.2~2.0当量)和活化剂(5'-保护·3'-无保护核苷的0.5~1.0当量)与其反应,可获得三聚体核苷酸3'-亚磷酰胺。根据需要,通过进一步实施工序(2),可获得四聚体以上的核苷酸。合成四聚体以上的片段的情况下,作为每次伸长1个的另一方法,可通过使已呈二聚体以上的片段相互缩合,使其一次伸长2个以上的碱基。
使用以上述式(I)表示的立体控制寡核苷酸合成用片段的寡核苷酸的合成可在溶液中进行(以下称为“液相合成法”),也可在固相载体上进行(以下称为“固相合成法”)。通过液相合成法进行合成的情况下,为了提高对于反应溶剂的溶解性,使用在3'-末端侧的核苷的3'-羟基引入了硅烷基类的保护基或含脂肪族的保护基的试剂,对其反复实施(a)与所述以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的缩合工序、(b)所述缩合工序中得到的亚磷酸键部分的氧化或硫化工序、(c)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。通过固相合成法进行合成的情况下,反复实施(a)与所述以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的缩合工序、(b)固相载体上的核苷或核苷酸的未反应的5'-羟基的封端工序、(c)所述缩合工序中得到的亚磷酸键部分的氧化工序、(d)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合而得的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。两类方法均可通过其后的碱性条件下的处理,获得目标的寡核苷酸。
具体来说,不论液相合成法、固相合成法中的任一种的情况下,作为寡核苷酸合成的第1阶段,进行用活化剂活化以上述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的3'-末端亚磷酰胺,进行使其与5'-羟基无保护的核苷或核苷酸缩合的反应。作为活化剂,可使用广泛采用的使3价磷活化的活化剂,例如有1H-四唑、S-乙硫基-1H-四唑、二氰基咪唑、或者磺酸与唑或叔胺形成的盐,但并不仅限于这些。本缩合反应所需的时间一般为1分钟~30分钟左右,由进行反应的规模决定。
接着,作为寡核苷酸合成的第2阶段,进行使上述缩合反应中得到的中间体与氧化剂或硫化剂反应,获得5价的磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸。
然后,作为寡核苷酸合成的第3阶段,进行使上述氧化或硫化反应中得到的中间体与无水的酸性溶液反应,获得5'-羟基无保护核苷酸。
使用本实施方式中的寡核苷酸合成用片段合成的寡核苷酸中的核苷碱基的保护基、5'-、3'-或2'-羟基的保护基、磷酸键中的磷酸的保护基在与所用的保护基对应的脱保护条件下脱保护。
以下的实施例是本发明的一种实施方式进行说明而示例的例子。按照实施例1和实施例2所示的步骤,合成了作为以上述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段之一的四聚体亚磷酰胺。此外,按照实施例3所示的步骤,合成了作为以上述式(I)表示的寡核苷酸合成用片段之一的五聚体亚磷酰胺。另外,按照实施例4所示的步骤,使用作为以上述式(I)表示的化合物的一例的三聚体亚磷酰胺合成了寡核苷酸十八聚体。
〔实施例1〕四聚体亚磷酰胺(3)的合成
(步骤1:DMTr-Tp(OCH2CH2CN)T(OCH2CH2CN)(N(i-C3H7)2)(1)的合成)
[化10]
向5'-O-DMTr胸苷(16.3g,30.0mmol)的二氯甲烷溶液(90mL)中,在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(10.5mL,33.0mmol)、二异丙胺(2.12mL,15.0mmol)、1H-四唑(1.05g,15.0mmol)。在室温下搅拌3小时后,将反应液加入胸苷(10.9g,45.0mmol)和1H-四唑(5.25g,75.0mmol)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液(90mL)中,在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入180mL的二氯甲烷后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将所得的滤液在减压下浓缩,从而获得中间体。将中间体溶解于二氯甲烷(180mL)后,在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(12.4mL,39.0mmol)、1H-四唑(1.05g,15.0mmol)。在室温下搅拌3小时后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的亚磷酰胺1(24.2g,收率74.4%)。
MS:1108.4(MNa+)
(步骤2:DMTr-Tp(OCH2CH2CN)Tp(OCH2CH2CN)T(OCH2CH2CN)(N(i-C3H7)2)(2)的合成)
[化11]
将上述亚磷酰胺1(10.0g,9.21mmol)的二氯甲烷溶液(23mL)滴加至胸苷(2.90g,12.0mmol)和1H-四唑(1.94g,27.6mmol)的DMF溶液(30m L)中,在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入二氯甲烷(46mL)后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将滤液浓缩后,溶解于二氯甲烷溶液(81m L),在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(3.19mL,10.6mmol)、1H-四唑(0.4g,5.70mmol)。在室温下搅拌3小时后,溶解于二氯甲烷(163mL)后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的亚磷酰胺2(9.65g,收率73.4%)。所得的亚磷酰胺2的ESI-MS谱示于图1,31P NMR谱示于图2。
MS:1448.5(MNa+)
(步骤3:DMTr-Tp(OCH2CH2CN)Tp(OCH2CH2CN)Tp(OCH2CH2CN)Tp(OCH2CH2CN)(N(i-C3H7)2)(3)的合成)
[化12]
将上述亚磷酰胺2(10.0g,7.01mmol)的二氯甲烷溶液(70mL)加入胸苷(2.21g,9.11mmol)和1H-四唑(1.47g,21.2mmol)的DMF溶液(90mL)中,在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入二氯甲烷(140mL)后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将滤液浓缩后,溶解于二氯甲烷溶液(70m L),在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(2.89mL,9.11mmol)、1H-四唑(0.340g,4.90mmol)。在室温下搅拌3小时后,溶解于二氯甲烷(140mL)后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的四聚体亚磷酰胺3(9.40g,收率75.9%)。
MS:1791.6(MNa+)
〔实施例2〕四聚体亚磷酰胺(6)的合成
(步骤4:DMTr-Tp(OCH2CH2CN)C(OCH2CH2CN)(N(i-C3H7)2)(4)的合成)
[化13]
向5'-O-DMTr胸苷(16.3g,30.0mmol)的二氯甲烷溶液(90mL)中,在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(10.5mL,33.0mmol)、二异丙胺(2.12mL,15.0mmol)、1H-四唑(1.05g,15.0mmol)。在室温下搅拌3小时后,将反应液加入N4-苯甲酰胞苷(12.9g,39.0mmol)和1H-四唑(6.31g,90.0mmol)的DMF溶液(90mL)中,在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入180mL的二氯甲烷后,在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(12.4mL,39.0mmol)、1H-四唑(1.05g,15.0mmol)。在室温下搅拌3小时后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将所得的滤液在减压下浓缩,从而获得中间体(收率70~90%)。将中间体溶解于二氯甲烷(180mL)后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的亚磷酰胺4(27.1g,收率77.0%)。
MS:1197.4(MNa+)
(步骤5:dGp(OCH2CH2CN)T(5)的合成)
[化14]
向2-氰基乙基-5'-O-DMTr-N2-异丁酰基尿苷-3'-(N,N'-二异丙基)亚磷酰胺(30.0g,35.7mmol)和胸苷(11.2g,46.4mmol)的二氯甲烷溶液(180mL)中加入1H-四唑(7.50g,107mmol),在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入苯基乙酰基二硫醚(32.4g,107mmol),再搅拌1小时。加入180mL的二氯甲烷后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将所得的滤液在减压下浓缩,从而获得生成物(收率70~90%)。溶解于二氯甲烷(180mL)后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得中间体(收率70~90%)。在0℃下向中间体(15g,15.3mmol)中加入1000mL的3%二氯乙酸的二氯甲烷溶液,在室温下搅拌30分钟。将反应液供于1500g的硅胶,用乙酸乙酯清洗。然后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的二聚体5(22.1g,收率87.3%)。
MS:723.2(MNa+)
(步骤6:DMTr-Tp(OCH2CH2CN)C(OCH2CH2CN)Gp(OCH2CH2CN)T(OCH2CH2CN)(N(i-C3H7)2)(6)的合成)
[化15]
将所述化合物4(10.0g,8.51mmol)的二氯甲烷溶液(50mL)滴加至所述化合物5(7.26g,10.2mmol)和1H-四唑(1.79g,25.5mmol)的DMF溶液(45mL)中,在室温下搅拌1小时。向反应溶液中加入二氯甲烷(90mL)后,供于340g的硅胶,用二氯甲烷清洗。将滤液浓缩后,溶解于二氯甲烷溶液(85mL),在室温下依次加入亚磷酰胺化试剂NCCH2CH2OP[N(i-C3H7)2]2(3.19mL,10.6mmol)、1H-四唑(0.420g,5.96mmol)。在室温下搅拌3小时后,溶解于二氯甲烷(170mL)后,通过以二氯甲烷-IPA为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的亚磷酰胺6(9.42g,收率63.1%)。
MS:1974.6(MNa+)
〔实施例3〕五聚体亚磷酰胺(15)的合成
(步骤7:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)(8)的合成)
[化16]
向5'-O-DMTr-N-5-苯甲酰-2'-脱氧腺苷(7)(3.3g,5.0mmol)的二氯甲烷-乙腈(1:1)溶液(20mL)中,在0℃下分2次加入亚磷酰胺化试剂CH2=CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2(2.3mL,7.5mmol)、1H-四唑(0.25g,3.5mmol)。在室温下搅拌12小时后,加入二氯甲烷(60mL),通过以己烷-乙酸乙酯为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的亚磷酰胺8(4.0g,收率94%)。
(步骤8:3'-TBS-T(9)的合成)
[化17]
向胸苷(10g,41mmol)的DMF溶液(200mL)中分2次加入了咪唑(33,500mmol)、叔丁基二甲基氯硅烷(25g,170mmol)。在室温下搅拌3小时后,向反应液中加入5mL甲醇,滴加至蒸馏水(1000mL)中。过滤分离残渣后,溶解于THF。在0℃下加入三氟乙酸(40mL)和蒸馏水(40mL),搅拌1小时。将反应液滴加至蒸馏水(500mL),用二氯甲烷(500mL)萃取。将所得的粗生成物通过以己烷-乙酸乙酯为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的3'-保护胸苷9(13g,收率88%)。
(步骤9:Tp(OCH2CH=CH2)TOTBS(10)的合成)
[化18]
向亚磷酰胺单体8(1.3g,1.0mmol)和3'-保护胸苷9(0.36g,1.0mmo l)的二氯甲烷-乙腈溶液(1:1,10mL)中加入5-乙硫基-1H-四唑(0.62g,4.0mmol)。在室温下搅拌30分钟后,加入TBHP(叔丁基过氧化氢)的癸烷溶液(0.60mL,3.0mmol),再在室温下搅拌30分钟。将反应液浓缩后,将所得的粗生成物用3%二氯乙酸的二氯甲烷溶液(20mL)在室温下处理15分钟后,将反应液通过以二氯甲烷-甲醇为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的5'-无保护dAT二聚体10(0.65g,收率58%)。
(步骤10:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)TOTBS(11)的合成)
[化19]
向亚磷酰胺单体8(0.83g,0.99mmol)和5'-无保护dAT二聚体10(0.62g,0.76mmol)的二氯甲烷-乙腈溶液(10mL)中加入5-乙硫基-1H-四唑(0.47g,3.0mmol)。在室温下搅拌30分钟后,加入TBHP的癸烷溶液(0.46mL,2.3mmol),再在室温下搅拌30分钟。将反应液浓缩后,将粗生成物通过以二氯甲烷-甲醇为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的5'-DMTr-dA AT三聚体11(0.65g,收率58%)。
(步骤11:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)T(OCH2CH=CH2)(N(i-C3H7)2)(12)的合成)
[化20]
在0℃下向5'-DMTr-dAAT三聚体11(0.94g,0.60mmol)中加入四丁基氟化铵的THF溶液(1.2mL,1.2mmol)。搅拌4小时后,浓缩反应液,将所得的粗生成物通过以二氯甲烷-甲醇为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,在真空下干燥一晚。使用该中间体的一部分(0.71g,0.49mmol),制成二氯甲烷-乙腈溶液(5.0mL)后,在0℃下分2次加入亚磷酰胺化试剂CH2=CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2(0.21mL,0.74mmol)、1H-四唑(0.024g,0.34mmol)。在室温下搅拌12小时后,加入二氯甲烷(5.0mL),通过以己烷-乙酸乙酯为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的5'-DMTr保护三聚体亚磷酰胺12(0.39g,总计收率66%)。
(步骤12:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)TOTBS(13)的合成)
[化21]
向5'-DMTr保护亚磷酰胺三聚体12(0.54g,0.33mmol)和5'-无保护二聚体10(0.24g,0.30mmol)的二氯甲烷-乙腈溶液(6mL)中加入5-乙硫基-1H-四唑(0.19g,1.2mmol)。在室温下搅拌90分钟后,加入TBHP的癸烷溶液(0.20mL,0.9mmol),再在室温下搅拌30分钟。将反应液浓缩后,将粗生成物通过以二氯甲烷-甲醇为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的5',3'-保护dAATAT五聚体13(0.67g,收率94%)。
(步骤13:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)TOH(14)的合成)
[化22]
在0℃下向5',3'-保护dAATAT五聚体13(0.67g,0.28mmol)中加入四丁基氟化铵的THF溶液(0.56mL,0.56mmol)。搅拌4小时后,浓缩反应液,将所得的粗生成物通过以二氯甲烷-甲醇为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的5'-保护·3'-无保护五聚体14(0.51g,总计收率80%)。
(步骤14:DMTr-ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)ABz p(OCH2CH=CH2)T(OCH2CH=CH2)(N(i-C3H7)2)(15)的合成)
[化23]
向5'-保护·3'-无保护dAATAT五聚体14(0.46g,0.21mmol)的二氯甲烷-乙腈溶液(2.0mL)中,在0℃下分2次加入亚磷酰胺化试剂CH2=CHCH2OP[N(i-C3H7)2]2(0.87μL,0.31mmol)、1H-四唑(0.010g,0.14mmol)。在室温下搅拌12小时后,加入二氯甲烷(5.0mL),通过以己烷-乙酸乙酯为溶出溶剂的硅胶柱色谱纯化,获得作为目标的五聚体亚磷酰胺15(0.41g,总计收率81%)。
〔实施例4〕
(dT18的固相合成)
在日本技术服务株式会社(NIHON TECHNO SERVICE CO.,LTD.)的M-2-MX寡核苷酸固相合成装置中,使用实施例1中得到的合成片段(四聚体亚磷酰胺)3,以吉凯基因(ChemGene)公司的通用接头CPG(1.0μmol)为起始物质按照下述的实验方案合成了寡核苷酸(dT十八聚体)。
合成循环:
(缩合)0.1M四聚体亚磷酰胺3/乙腈溶液(14.4μL)
0.25M 5-苄基硫代四唑/乙腈溶液(24.8μL)
反应时间:2分钟
(封端)10%乙酸酐/THF溶液(320μL)
0.2M N-甲基咪唑/乙腈溶液
反应时间:1分钟
(氧化)0.05M碘/水/吡啶溶液(320μL)
(脱三苯甲基化)10%二氯乙酸/甲苯溶液(765μL)
反应时间:2分钟
(切出·脱保护)浓氨水
反应时间:60分钟,室温
所得的dT十八聚体的LC谱示于图3。
根据以上的结果,如果采用本实施方式的寡核苷酸合成用片段,寡核苷酸合成中,可使用核苷三聚体以上的长度的亚磷酰胺。因此,合成作为目标的长度为N聚体的寡核苷酸的情况下,不会产生广泛采用的寡核苷酸合成的单体亚磷酰胺的偶联工序中生成的短1个碱基的(N-1)聚体、短2个碱基的(N-2)聚体等。因此,在寡核苷酸合成的最终阶段,使用色谱法等纯化N聚体时,作为目标的N聚体的迁移率与(N-3)聚体以下的长度的副产物的迁移率的差大,所以可减小用于将N聚体与除此以外分离的纯化负荷。
此外,如果采用本实施方式的寡核苷酸合成用片段,合成同样N聚体的寡核苷酸时,与作为以往方法的每次伸长1个碱基的方法相比,可减少所需的工序数。因此,可使作为目标的长度的寡核苷酸的收率提高。
此外,本实施方式的寡核苷酸合成用片段的制造时,可在片段的阶段预先形成部分氧化/硫化的5价的磷酸键部分。因此,即使是仅使寡核苷酸中的部分磷酸键呈与其他部分的磷酸键不同的氧化/硫化状态的情况下,也可不改变寡核苷酸合成的步骤,更简便地合成作为目标的含经修饰的磷酸键部分的寡核苷酸。
另外,本实施方式的寡核苷酸合成用片段的制造方法中,可使仅保护了5'-羟基的核苷或者5'-羟基、3'-羟基均未保护的核苷与亚磷酰胺制备用磷酸化剂直接反应。因此,不需要购入单体的3'-亚磷酰胺的市售品或者预先制备。因此,与以往方法相比,可大量制造所期望的寡核苷酸合成用片段。
此外,本实施方式的寡核苷酸合成用片段不仅可用于通过液相合成法大量合成较短链的寡核苷酸的情况,还可用于采用固相合成法的长链的寡核苷酸合成。因此,不会生成具有N-1和N-2的长度的副产物,所以可减小特别是合成长链的N聚体寡核苷酸后的纯化负荷,能够通过更简便的纯化获得作为目标的N聚体寡核苷酸。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸合成用片段,其中,所述式(I)中,所述B为被保护基保护的核苷碱基时,该保护基为酰基类保护基。
3.根据权利要求1所述的寡核苷酸合成用片段,其中,
所述式(I)中,
R1为在酸性条件下可除去的保护基或三烷基硅烷基,
所述Y为H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基,
所述Z为H,
所述R5为异丙基。
4.一种以下述式(I):
[化2]
表示的立体控制寡核苷酸合成用光学活性片段的制造方法,其中,
式中,
B独立为被保护基保护的核苷碱基或未保护核苷碱基;
R1为保护基;
R2、R3、R4独立为OCH2CH2CN、SCH2CH2CN、OCH2CH=CH2、OCH3;
R5为取代或未取代的脂肪族基团、取代或未取代的芳香族基团;
X独立为未共用电子对、=O或=S;
Y独立为H、NHR6、卤素、CN、CF3或被酰基类保护基、醚类保护基、硅烷基类保护基保护的羟基;
R6为H、脂肪族基团、芳香族基团;
Z独立为H、烷基、O-烷基、N-烷基、卤素,或者在与所述Y之间形成Z-Y键;
(m+n)为2以上且23以下的整数,
该制造方法包括:
(a)使以下述式(II):
[化3]
表示的核苷与具有R2P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有下述式(III):
[化4]
的结构的核苷反应,制备具有下述式(IV):
[化5]
的结构的化合物的工序;
(b)使具有所述式(IV)的结构的化合物与具有R3P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物和具有所述式(III)的结构的核苷或具有下述式(V):
[化6]
的结构的化合物或具有下述式(VI):
[化7]
的结构的化合物反应,制备具有下述式(VII):
[化8]
的结构的化合物的工序;
(c)根据需要重复所述工序(b)至少1次的工序;
(d)使所得的中间体与具有R4P{N(R5)2}2的结构的三价磷化合物反应,制备具有所述式(I)的结构的片段的工序。
5.根据权利要求4所述的制造方法,其中,所述式(I)中,所述B为被保护基保护的核苷时,该保护基为酰基类保护基。
6.根据权利要求4所述的制造方法,其中,
所述式(I)中,
所述R1为在酸性条件下可除去的保护基,
所述Y为H或被叔丁基二甲基硅烷基保护的羟基,
所述Z为H,
所述R5为异丙基。
7.根据权利要求4所述的制造方法,其中,包括:根据需要使氧化剂或硫化剂与所述工序(a)中得到的以式(IV)表示的化合物或所述工序(b)中得到的以式(VII)表示的化合物反应的工序。
8.一种使用权利要求1所述的以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的寡核苷酸的合成方法,其中,包括:
(a)所述以式(I)表示的寡核苷酸合成用片段的亚磷酰胺部分与核苷或核苷酸的羟基的缩合工序、
(b)所述缩合工序中得到的亚磷酸键部分的氧化或硫化工序、
(c)所述缩合工序中与核苷或核苷酸缩合而得的所述寡核苷酸合成用片段的末端保护基的脱保护工序。
9.根据权利要求8所述的合成方法,其中,在溶液中实施所述各工序。
10.根据权利要求8所述的合成方法,其中,在固体载体上实施所述各工序。
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