CN110914278A - 在可见光区能进行光交联的光响应性核苷酸类似物 - Google Patents

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Abstract

提供能用于核酸的光反应技术的式I所示的化合物及包含该化合物的光反应性交联剂。

Description

在可见光区能进行光交联的光响应性核苷酸类似物
技术领域
本发明涉及通过可见光区的光而具有光交联(photocrosslinking)能力的光响应性核苷酸类似物(photoresponsive nucleotide analogue)。
背景技术
分子生物学领域的基本技术中包括核酸的连接和核酸的交联。核酸的连接、交联例如与杂交组合而用于基因的导入、碱基序列的检测；或者例如用于基因表达的抑制。因此，核酸的连接技术和交联技术不仅在分子生物学的基础研究中是重要的技术，例如，在医疗领域中的诊断、治疗或治疗药、诊断药等的开发、制造、工业和农业领域中的酶、微生物等的开发、制造中的使用也是极其重要的技术。
作为核酸的光反应技术，有如下技术：使用了5-氰基乙烯基脱氧尿苷的光耦合技术(专利文献1：日本专利第3753938号、专利文献2：日本专利第3753942号)、使用了在碱基位点具有3-乙烯基咔唑结构的修饰核苷的光交联技术(专利文献3：日本专利第4814904号、专利文献4：日本专利第4940311号)。
进而，最近能够构建出利用了核酸的双链形成能力的各种纳米结构体，核酸的连接和交联技术在纳米技术领域也是重要的技术。例如，非专利文献1公开了通过核酸的光交联对由寡聚DNA构成的纳米片赋予耐热性的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3753938号公报
专利文献2：日本专利第3753942号公报
专利文献3：日本专利第4814904号公报
专利文献4：日本专利第4940311号公报
非专利文献
非专利文献1：J.Photopoly.S.Tech.,2014,27,485
发明内容
发明要解决的问题
由于核酸的光反应技术的重要性，而进一步需求能用于核酸的光反应技术的新型的化合物。本发明的目的在于提供能用于核酸的光反应技术的新型的光反应性化合物、和使用了该光反应性化合物的光反应性交联剂。
用于解决问题的方案
本发明人对成为能用于核酸的光反应技术的光反应性交联剂的光反应性化合物进行了深入研究，结果发现：具备吡喃并咔唑骨架结构来代替核酸碱基的碱基部分而成的化合物成为这种能用于核酸的光反应技术的光反应性交联剂，并完成了本发明。
本发明的化合物具有特征性的吡喃并咔唑结构，由相对较小的结构而发挥光交联性，能够进行各种修饰而用于各种用途中。进而，本发明的化合物的该特征性结构具有与核酸的碱基类似的结构，因此能作为人工碱基(人工核酸碱基)使用。即，能够导入本发明的化合物的特征性结构作为人工碱基来制造人工核苷(核苷类似物)及人工核苷酸(核苷酸类似物)，能够制造在序列中包含这样的人工核苷酸的人工核酸(修饰核酸)。这样的人工核酸通过光反应而形成交联时，它成为双螺旋的一条链向另一条链所形成的光交联(photocrosslinking)，因此光反应性的核酸类可以用作能够与期望的序列特异性反应的双螺旋的光交联剂。
基于本发明的光反应性交联剂具备如下特征：其源自特征性的吡喃并咔唑结构，且通过比以往更长的长波长的光照射、例如通过可见光区的光照射而能够进行光交联反应。为此，在希望尽可能避免DNA、细胞的损伤的情况下，基于本发明的光反应性交联剂能通过长波长的光照射进行光交联，因此是特别有利的。
需要说明的是，虽然本发明的光反应性化合物通过光照射而开始进行光反应，但要强调的意思是：至照射为止一直稳定的化合物响应光照射这样的信号而开始进行反应，有时将光反应性称为光响应性。
因此，本发明包含以下的(1)。
(1)一种下式I所示的化合物：
Figure BDA0002367884210000031
(其中，式I中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
Y为氢原子、糖(糖包含核糖及脱氧核糖)、多糖类(多糖类包含核酸的多核糖链及多脱氧核糖链)、聚醚、多元醇、多肽链(多肽链包含肽核酸的多肽链)或水溶性合成高分子。)。
(2)根据(1)所述的化合物，其中，Y为下式II所示的基团，
Figure BDA0002367884210000032
(其中，式II中，
R11为氢原子或羟基，
R12为羟基或-O-Q1基，
R13为羟基或-O-Q2基，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。)。
(3)根据(1)所述的化合物，其中，Y为氢原子、下式III所示的基团或式IV所示的基团，
Figure BDA0002367884210000051
(4)根据(1)所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核苷，
Figure BDA0002367884210000052
(其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。)。
(5)根据(1)所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核苷酸，
Figure BDA0002367884210000053
(其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。)。
(6)根据(1)所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团的碱基部分的核酸或肽核酸，
Figure BDA0002367884210000061
(其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。)。
(7)一种光反应性交联剂，其包含(1)～(6)中任一项所述的化合物。
(8)一种形成光交联的方法，其使用(1)～(6)中任一项所述的化合物，在与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
发明的效果
本发明提供成为能用于核酸的光反应技术的光反应性交联剂的新型的化合物。该化合物是基于不具备天然碱基结构的、新型的化学结构的化合物。此外，根据本发明的化合物，由于能够通过比以往的光反应性交联剂波长更长的光照射来形成光交联，因此可以使由光照射导致的对核酸、细胞的不良影响最小化。
附图说明
图1a是示出光交联反应的流程的说明图。
图1b是将光照射时间变为0～15秒时的UPLC解析的谱图。
图1c是计算出将光照射时间变为0～15秒时的各光照射时间下的光交联率而制作的图。
图2a是示出光交联反应的流程的说明图。
图2b是将照射的光波长变为450～550nm时的UPLC解析的谱图。
图3a是示出光裂解反应的流程的说明图。
图3b是将照射的光波长变为320～340nm时的UPLC解析的谱图。
图3c是示出通过各波长的光照射而裂解的光交联体的比例(转化率％)的图。
图4是将在各波长下的光照射时间(秒)与细胞存活率(％)进行对比的图。
图5是示出基于SPCX的光交联反应的流程的说明图。
图6是基于SPCX的光交联试验的UPLC的解析的谱图。
具体实施方式
列举具体的实施方式，以下对本发明进行详细地说明。本发明不限定于以下所列举的具体的实施方式。
[化合物的结构]
本发明的化合物包含下式I所示的化合物：
(I)
Figure BDA0002367884210000071
式I中，X为氧原子或硫原子。
式I中，R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。作为卤素原子，例如可以列举出Br、Cl、F、I的原子。作为氟代甲基，例如可以列举出-CH2F、-CHF2、-CF3。作为氟代乙基，例如可以列举出-CH2-CH2F、-CH2-CHF2、-CH2-CF3、-CHF-CH3、-CHF-CH2F、-CHF-CHF2、-CHF-CF3、-CF2-CH3、-CF2-CH2F、-CF2-CHF2、-CF2-CF3。作为C1～C3的烷基巯基，例如可以列举出-CH2-SH基、-CH2-CH2-SH基、-CH(SH)-CH3基、-CH2-CH2-CH2-SH基、-CH2-CH(SH)-CH3基、-CH(SH)-CH2-CH3基。在适合的实施方式中，R1和R2可以分别独立地为氢原子、卤素原子、-NH2基、-OH基、-CH3基，优选为氢原子。
在适合的实施方式中，可以将R1设为上述的基团的同时将R2设为氢原子。
在适合的实施方式中，在式I左端的六元环中，将氮原子所结合的碳原子编号为C1位，将六元环的碳原子按顺时针编号为C2位、C3位、C4位、C5位、C6位时，R1和R2可以分别独立地为C2位、C3位、C4位、C5位中的任意位置的碳原子的取代基。在适合的实施方式中，R1和R2可以分别是C3位和C4位的取代基。在适合的实施方式中，可以将R1设为C3位的取代基的同时将R2设为C4位的氢原子。
式I中，Y可以是氢原子、糖(糖包含核糖及脱氧核糖)、多糖类(多糖类包含核酸的多核糖链及多脱氧核糖链)、聚醚、多元醇、多肽链(多肽链包含肽核酸的多肽链)或水溶性合成高分子。
在适合的实施方式中，式I的化合物可以是下式I’所示的化合物：
(式I’)
Figure BDA0002367884210000081
式I’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团，Y为式I中记载的基团。
在适合的实施方式中，式I的化合物可以是下式I”所示的化合物：
(式I”)
Figure BDA0002367884210000091
式I”中，R1为式I中记载的基团，Y为式I中记载的基团。
在适合的实施方式中，式I的化合物可以是下式I”’所示的化合物：
(式I”’)
Figure BDA0002367884210000092
式I”’中，R1为式I中记载的基团，Y为式I中记载的基团。
在适合的实施方式中，Y可以是氢原子，在此情况下，式I的化合物为下式VI所示的化合物：
(VI)
Figure BDA0002367884210000093
式VI中，X为式I中记载的基团，R1和R2为式I中记载的基团，且位于式I中记载的位置。
在适合的实施方式中，Y可以是氢原子，在此情况下，式I’的化合物为下式VI’所示的化合物：
(VI’)
Figure BDA0002367884210000101
式VI’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团。
在适合的实施方式中，Y可以是下式II所示的基团，在此情况下，式I的化合物为下式V所示的化合物：
(II)
Figure BDA0002367884210000102
(V)
Figure BDA0002367884210000103
式V中，X为式I中记载的基团，R1和R2为式I中记载的基团，且位于式I中记载的位置，R11、R12、R13是针对式II所记载的基团。
在适合的实施方式中，Y可以是上述的式II所示的基团，在此情况下，式I’的化合物为下式V’所示的化合物：
(V’)
Figure BDA0002367884210000111
式V’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团，R11、R12、R13是针对式II所记载的基团。
式II中，R11为氢原子或羟基，R12为羟基或-O-Q1基，R13为羟基或-O-Q2基。
上述Q1可以是选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基。
上述Q2可以是选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基具有以下的结构，
Figure BDA0002367884210000121
成为上述二烷基的R基和R’基可以分别为C1～C4的烷基。作为这样的2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基，例如可以列举出2-氰基乙基-N,N-二甲基亚磷酰胺基、2-氰基乙基-N,N-二乙基亚磷酰胺基、2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基。
甲基亚膦酰胺基具有以下的结构，
Figure BDA0002367884210000122
上述R基和R’基可以分别为氢原子或C1～C4的烷基。
乙基亚膦酰胺基具有以下的结构，
Figure BDA0002367884210000123
上述R基和R’基可以分别为氢原子或C1～C4的烷基。
氧氮磷杂环戊烷基具有以下的结构，
Figure BDA0002367884210000124
上述的结构中，还包含氢原子被C1～C4的烷基取代的取代物。
硫代亚磷酸酯基具有以下的结构，
Figure BDA0002367884210000125
上述的结构中，还包含氢原子被C1～C4的烷基取代的取代物。
-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的TEA盐为各自的三乙胺(TEA)的盐。
-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的DBU盐为各自的二氮杂双环十一碳烯(DBU)的盐。
在适合的实施方式中，Q1可以是通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
在适合的实施方式中，Q1可以是上述的保护基，可以优选为二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基，可以特别优选为二甲氧基三苯甲基。
在适合的实施方式中，Q2可以是通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
在适合的实施方式中，Q2可以是上述的保护基，可以优选为2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基，可以特别优选为2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基。
[核苷类似物]
在适合的实施方式中，Y可以是脱氧核糖，即，可以是下式III所示的基团，在此情况下，式I的化合物为下式VII所示的核苷(脱氧核糖核苷)类似物：
(III)
Figure BDA0002367884210000131
(VII)
Figure BDA0002367884210000132
式VII中，X为式I中记载的基团，R1和R2为式I中记载的基团，且位于式I中记载的位置。
在适合的实施方式中，Y可以是脱氧核糖，即，可以是上述的式III所示的基团，在此情况下，式I’的化合物为下式VII’所示的核苷(脱氧核糖核苷)类似物：
(VII’)
Figure BDA0002367884210000141
式VII’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团。
在适合的实施方式中，Y可以是核糖，即，可以是下式IV所示的基团，在此情况下，式I的化合物为下式VIII所示的核苷(核糖核苷)类似物：
(IV)
Figure BDA0002367884210000142
(VIII)
Figure BDA0002367884210000151
式VIII中，X为式I中记载的基团，R1和R2为式I中记载的基团，且位于式I中记载的位置。
在适合的实施方式中，Y可以是核糖，即，可以是上述的式IV所示的基团，在此情况下，式I’的化合物为下式VIII’所示的核苷(核糖核苷)类似物：
(VIII’)
Figure BDA0002367884210000152
式VIII’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团。
对于上述的式VII和式VIII所示的核苷(核糖核苷)类似物，可以是具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核苷(核苷类似物)，
Figure BDA0002367884210000153
(其中，式Ib中，X为式I中记载的基团，R1和R2为式I中记载的基团，且位于式I中记载的位置。)。
对于上述的式VII’和式VIII’所示的核苷(核糖核苷)类似物，可以是具有下式Ib’所示的基团作为碱基部分的核苷(核苷类似物)，
Figure BDA0002367884210000161
(其中，式Ib’中，X为式I中记载的基团，R1为式I中记载的基团。)。
进而，本发明中，还可以是具有上述的式Ib或式Ib’所示的基团作为碱基部分的核苷酸(核苷酸类似物)。进而，本发明中，碱基部分还可以是具有上述的式Ib或式Ib’所示的基团的核酸(修饰核酸)或肽核酸(修饰肽核酸)。
[核苷酸类似物]
在适合的实施方式中，Q1可以是与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基，Q2可以是氢原子。即，上述式I所示的化合物可以是具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物分子。
[修饰核酸]
在适合的实施方式中，可以将Q1设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，可以将Q2设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。即，上述式I所示的化合物可以是具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物被嵌入序列中而得到的修饰核酸或修饰寡核苷酸。本发明中，有时将如此制备的光响应性修饰核酸和光响应性修饰寡核苷酸统称为光响应性修饰核酸。本发明的修饰核酸中，具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物可以位于序列中的末端，在此情况下成为通过磷酸二酯键而连接的修饰核苷酸或修饰核酸，所述磷酸二酯键是由仅Q1或Q2中任一侧与结合于Q1或Q2的O成为一体所形成的磷酸基而形成的。另外，使用肽核酸代替上述的核酸，而成为具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物被嵌入序列中而得到的光响应性修饰肽核酸。
[化合物的结构]
本发明的化合物不具有式I等中基于天然的核苷和核苷酸应具有的嘌呤碱基或嘧啶碱基的碱基结构。尽管如此，在以单链的修饰核酸的形式形成本发明的化合物时，能够和与其互补的单链核酸形成双螺旋。此外，吡喃并咔唑部分可以通过光反应而形成交联。
[修饰核酸制造用试剂]
在适合的实施方式中，可以将Q1设为上述的保护基，可以将Q2设为与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸或上述的保护基，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。即，上述式I、式I’、式I”及式I”’所示的化合物可以是光反应性修饰核酸的制造用试剂(合成用试剂)。
在适合的实施方式中，可以将Q1设为上述的保护基，可以将Q2设为与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基或上述的保护基。众所周知，具备这种结构的化合物可以以核酸合成用的单体的形式使用，可以是能通过公知的DNA合成装置而使用的试剂，例如可以是能够通过亚磷酰胺法和H-膦酸盐法而使用的修饰核酸合成用试剂(修饰核酸合成用单体)。
另外，将Q1设为上述的保护基且将Q2设为通过由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基所形成的磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸而得到的结构是不可称为所谓的单体的结构的、可称为修饰核酸的结构。在此情况下，可以作为用于由此合成并延长链长的制造用试剂(合成用试剂)来使用。
作为光反应性修饰核酸制造用试剂(光反应性修饰核酸合成用试剂)，例如可以列举出作为后述的方案1的化合物5、化合物6记载的单体及后述的方案2记载的单体。
[光反应性交联剂]
本发明的化合物中，可以通过使吡喃并咔唑部分进行光反应而形成交联。以单链的修饰核酸的形式形成本发明的化合物时，可以和与其互补的单链核酸形成双螺旋，可以通过使吡喃并咔唑部分进行光反应而形成交联，作为结果，可以形成由双螺旋的一条链向另一条链所形成的链之间的光交联(photocrosslinking)。即，本发明的化合物能够作为光反应性交联剂使用。
[光交联的形成]
对于本发明的修饰核酸，在将其以单链核酸的形式使用时，可以和与其互补的单链核酸杂交而形成双螺旋。在形成双螺旋时，对于位于相对于吡喃并咔唑结构部分而在互补链中应形成碱基对的位置的核酸碱基，可以没有特别限制地自由选择。对所形成的双螺旋进行光照射时，可以在形成双螺旋的核酸链之间通过光反应而形成交联。该光交联在位于如下位置的核酸碱基与吡喃并咔唑结构之间形成，所述位置是：相对于从序列中吡喃并咔唑结构部分作为核酸碱基所在的位置起、在序列中距5’末端侧仅1个碱基处的核酸碱基而在互补链中形成碱基对的位置。换言之，该光交联是在从相对于吡喃并咔唑结构部分而在互补链中应形成碱基对的位置的核酸碱基起、在序列中距3’末端侧仅1个碱基处的核酸碱基与吡喃并咔唑结构之间形成的。
[光交联的碱基特异性]
本发明中，作为吡喃并咔唑结构能形成光交联的对象方的碱基为具有嘧啶环的碱基。另一方面，吡喃并咔唑结构与具有嘌呤环的碱基不形成光交联。即，本发明的光交联性的化合物作为天然的核酸碱基具有如下特异性：与胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶形成光交联，另一方面与鸟嘌呤和腺嘌呤不形成光交联。
[光反应性交联剂的序列选择性]
本发明的光反应性修饰核酸(光交联性修饰核酸)可以在和具有与修饰核酸互补的碱基序列的序列杂交而形成双螺旋后进行光交联。由此，可以仅对成为目标的特定序列进行光交联反应(Photocrosslinking reaction)。即，本发明的光反应性交联剂可以根据期望进行序列设计而赋予非常高的碱基序列选择性。
[光照射的波长]
为了进行光交联而照射的光的波长例如可以是350～600nm的范围、优选为400～600nm的范围、进一步优选为400～550nm的范围、进一步优选为400～500nm的范围、进一步优选为400～450nm的范围、特别优选包含400nm的波长的光。在适合的实施方式中，可以使用处于这种范围的波长的单波长的激光。如此本发明中，通过可见光区的波长的光照射而能够形成光交联。以往的光反应性交联剂中，需要比这些范围更短的短波长的光照射。根据本发明，由于能够通过与以往的光反应性交联剂相比更长的长波长的光照射而形成光交联，因此能将由光照射导致的对核酸、细胞的不良影响最小化，在这方面是有利的。
[光交联的裂解]
根据本发明的化合物，在形成光交联后，进而通过光照射而能进行光裂解。即，本发明的光反应性的化合物能够实现可逆的光交联，能够作为可逆的光交联剂来使用。
如从该光交联的可逆性中所想到的那样，若使用基于本发明的化合物的可逆性光交联剂，则能够在生理的条件下对具有特定的碱基序列的核酸进行分离、回收或检测。因此本发明还在于如下方法：使用可逆性光交联剂，对具有期望的碱基序列的核酸进行分离、回收或检测。
为了光裂解而照射的光的波长例如可以是300～350nm的范围、优选为300～340nm的范围、特别优选包含312nm的波长的光。在适合的实施方式中，可以使用处于这种范围的波长的单波长的激光。
[光反应的温度]
在适合的实施方式中，为了进行光交联反应，通常在0～50℃、优选在0～40℃、进一步优选在0～30℃、进一步优选在0～20℃、进一步优选在0～10℃、进一步优选在0～5℃的范围的温度下进行光照射。为了进行光裂解反应，通常在55～100℃、优选为60～100℃、进一步优选为60～90℃、进一步优选在60～80℃的范围的温度下进行光照射。
[光反应的条件]
由于基于本发明的光交联和光裂解利用了光反应，因此可以对pH、盐浓度等没有特别限制地、在核酸类等生物体高分子能稳定存在的pH、盐浓度的溶液中通过光照射来进行。
[光反应的时间]
基于本发明的光交联和光裂解极其迅速地进行。例如，若是作为光反应性的化合物已知的补骨脂素需要数小时(350nm光照射)那样的情况下，通过远超过其的长波长的光照射，例如在仅仅10秒～60秒(400nm光照射)内进行光反应而形成光交联。即，若使用本发明的光交联剂，例如可以通过1～120秒或1～60秒的光照射，进行光反应而形成光交联。进而，基于本发明的光交联可以采用上述的波长和温度，例如通过1～120秒或1～60秒的光照射进行光反应而使光交联裂解。
[修饰核酸合成用单体和修饰核酸的合成]
使用后述的方案1或方案2所述的方法或本领域技术人员公知的方法，基于具有吡喃并咔唑结构的化合物(例如后述的方案1的化合物2)，可以得到用于获得本发明的修饰核酸的合成用单体(制造用试剂)(例如后述的方案1的化合物3、化合物4、化合物5、化合物6或方案2中对应的化合物)。本发明的修饰核酸的合成用单体的结构如上所述，若用作亚磷酰胺法和H-膦酸盐法等公知的方法中的核酸合成试剂，则可以得到光响应性人工核苷类似物分子(式VII的化合物、式VIII的化合物)被嵌入序列中而成的核酸或寡核苷酸(本发明的修饰核酸)或肽核酸。由此，本发明的修饰核酸合成单体在亚磷酰胺法和H-膦酸盐法等公知的方法中能用作核酸合成试剂，在这点上是优异的。
实施例
以下列举实施例对本发明进行详细地说明。本发明不限定于以下示例的实施例。
[核苷类似物(光反应性元素)的合成]
按照以下的方案1所示的合成路径，合成光响应性人工核苷类似物分子(有时称为核苷类似物或光反应性元素或光交联元素)，进而进行修饰核酸合成单体的合成。
方案1：
Figure BDA0002367884210000211
[化合物2的合成]
向二口茄形烧瓶中加入2-羟基咔唑(2.0g、11mmol)、InCl3(260mg、1.18mmol)，安装回流管，进行氮气置换。将油浴设置成90℃，向二口茄形烧瓶中加入丙炔酸乙酯(4ml)并在90℃下搅拌24小时。在TLC中确认反应的进行后，加入水2mL而使反应猝灭。溶解于乙酸乙酯中，进行萃取。使用硫酸钠进行脱水，利用蒸发器去除溶剂。然后，通过柱(己烷：乙酸乙酯＝8：1)进行纯化，得到化合物2。(收量：503mg、2.75mmol、收率：25％)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ11.67(s，1H)，8,47(s，1H)，8,17(dt，2H，J＝11.4Hz)，7.50-7.43(m，2H)，7.25(dt，1H，J＝8.54Hz)，6.33(d，1H，J＝4.75Hz)
[化合物4的合成]
向二口茄形烧瓶中加入化合物2(324mg、1.38mmol)、KOH(224mg，4.00mmol)，进行氮气置换。加入脱水乙腈36mL和TDA-1 24μL并搅拌30分钟。然后，加入氯糖(674mg、1.94mmol)搅拌一夜。将反应液过滤后，利用蒸发器去除溶剂。将去除后的混合液溶解于甲醇40mL中后，加入甲醇钠54mg和氯仿5mL，搅拌4小时。然后，进行通过过滤、蒸发器的溶剂去除。然后，进行通过柱(氯仿)的纯化，得到化合物4。(收量：80mg、0.23mmol、收率：17％)
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ8.50(s，1H)，8.18(m，2H)，7.50(dd，2H，J＝8.28,8.0)，7.31(dt，1H，J＝7.17)，6.71(dt，1H，J＝6.2)，6.38(d，1H，4.6Hz)，5.40(d，1H，J＝5.4Hz)，5.10(dt，1H，J＝5.07Hz)，3.95-3.87(m，3H)，2.74(dt，1H，J＝14.0,8.2Hz)，2.26(ddd，1H，J＝14.0,6.9,3.3Hz)
[化合物5、化合物6的合成]
之后的合成按照常规方法，进行二甲氧基三苯甲基化、亚酰胺化。
[含有光响应性核酸的DNA的合成]
使用DNA自动合成机(ABI3400)，进行修饰DNA的合成。然后，通过28％氨水溶液进行去除后，在65℃下加热4小时，进行脱保护。通过SpeedVac去除氨，进行通过HPLC的纯化。然后，通过MALDI-TOF-MS进行解析，并进行目标物的鉴定。
Calcd.For[M+H]+2798.40，Found 2798.72
[光交联反应]
将包含10μM修饰ODN、10μM互补链ODN、50μM脱氧尿苷、100mM NaCl的50mM二甲胂酸缓冲液(pH7.4)在90℃下加热1分钟，在4℃下静置。然后，使用UV-LED(OmniCure，LX405-S)在4℃下进行400nm的光照射。图1a是示出该光交联反应的流程的说明图。
[UPLC解析]
将DNA样品50μL移至UPLC用小瓶中，进行UPLC(超高效液相色谱)解析。解析使用50mM甲酸铵和乙腈，以分析开始时甲酸铵100％、在10分钟的时间点为甲酸铵90％、乙腈10％的线性改变了溶剂比率。以流速0.2mL/分钟、检测波长260nm进行分析。将这些结果一并示于图1b和图1c。
[结果]
图1b是将光照射时间变为0～15秒时的UPLC解析的谱图。图1b的横轴为保留时间[分钟]。图1b分别示出互补链ODN、修饰ODN、经光交联的ODN的峰的位置。图1c是将光照射时间变为0～15秒时的计算出各光照射时间下的光交联率而制作的图。图1c的横轴表示光照射时间[秒]，纵轴表示交联率[％]。
[能进行光交联的光波长的研究]
对于上述的光响应性人工核苷类似物分子(具有吡喃并咔唑结构的光交联元素)(PyranoCarbazolePhoto-Cross-linker)(PCX)，如下研究了能进行光交联的波长。
将包含10μM ODN(X)、10μM cODN、100mM NaCl的50mM二甲胂酸钠缓冲液退火后，在4℃下进行光照射并通过UPLC进行解析。图2a是示出该光交联反应的流程的说明图。将该结果一并示于图2b。
[结果]
图2b是将照射的光波长变为450～550nm时的UPLC解析的谱图。图2b的横轴为保留时间[分钟]。图2b分别示出互补链ODN(cODN)、修饰ODN(ODN(PCX))、经光交联的ODN(*)的峰的位置。如此，可知通过从450nm开始至至少550nm为止的波长的光照射，而能够进行光交联。
[能进行光裂解的光波长的研究]
对于上述的光响应性人工核苷类似物分子(PCX)的光交联体，如下研究了能进行光裂解的波长。
针对10μM的光交联体，在37℃下进行320nm、330nm、340nm的光照射。然后，同样地进行解析。图3a是示出该光裂解反应的流程的说明图。图3b和图3c一并示出该结果。
图3b是将照射的光波长变为320～340nm时的UPLC解析的谱图。图3b的横轴为保留时间[分钟]。图3b分别示出互补链ODN(cODN)、修饰ODN(ODN(PCX))的峰的位置。经光交联的ODN的峰是位于保留时间4.5～5分钟之间的峰。图3c是示出通过各波长的光照射而裂解的光交联体的比例(光裂解率％或转化率％)的图。如此可知，通过至少320～340nm为止的波长的光照射而能进行光裂解，在该范围内330nm的光照射的光裂解率最高。
[照射光波长对细胞的影响的研究]
为了研究与短波长的光照射相比、长波长的光照射对细胞的损伤少，而进行了以下的实验。
在96孔板中分注5×105细胞/ml的细胞(GFP-HeLa细胞、源自人宫颈癌的细胞株)100μL，在CO2孵化器中培养48小时。然后，以366nm、400nm或450nm的波长的光进行光照射后，各加入10μL细胞计数试剂盒，在CO2孵化器中显色4小时后，使用微孔板读取器，测定450nm的吸光度，计算出细胞存活率。将该结果汇总示于图4。
[结果]
图4是将各波长下的光照射时间(秒)和细胞存活率(％)进行对比的图。由该结果，在366nm的光照射时即使进行数秒的光照射，细胞存活率也大幅降低，相反在400nm、450nm下即使进行数十秒光照射，细胞存活率也几乎未降低。即，由该结果也明确了，吡喃并咔唑可以在细胞毒性少的长波长的光下进行操作。
[核苷类似物(光反应性元素)(SPCX)的合成]
作为光响应性人工核苷类似物分子，按照方案2进行具有以下的结构的吡喃并咔唑衍生物(SPCX)的合成。
SPCX：
Figure BDA0002367884210000241
[方案2]
Figure BDA0002367884210000251
如方案2所示，与上述的方案1同样地，将2-羟基咔唑作为起始物质来进行合成。方案2中，除了框内描述的部分以外，通过与方案1同样的步骤进行合成。对于框内记载的部分，以下进行进一步详细地说明。
[吡喃并咔唑衍生物(S-吡喃酮)的合成]
如下进行方案2的框内的合成。
如下所述进行以下的反应。
Figure BDA0002367884210000261
向50mL茄形烧瓶中加入吡喃并咔唑核苷(800mg，2.28mmol)和乙酸酐(20mL)、DMAP(50mg)，在室温下搅拌2小时。然后确认在TLC(CHCl3：MeOH＝9：1)中反应的进行后，利用蒸发器去除溶剂后，通过TLC(CHCl3：MeOH＝9：1)进行柱纯化。得到黄色粘性液体(7.99mg，1.77mmol，78％)。通过1H-NMR鉴定为目标物。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
Figure BDA0002367884210000263
8.50(s，1H)，8.21(s，1H)，8.19(d，1H)，7.90(s，1H)，7.93(d，1H)，7.50(t，1H)，7.31(t，1H)，6.70(t，1H)，6.34(d，1H)，5.41(d，1H)，5.16(t，1H)，4.50(d，1H)，3.78(q，2H)，2.60-2.68(m，1H)，2.14-2.18(m，1H)，1.18(s，6H).
如下所述进行以下的反应。
Figure BDA0002367884210000262
向50mL茄形烧瓶中对3’,5’-乙酰吡喃并咔唑核苷(7.99mg，1.77mmol)加入劳森试剂(1,00g，2.48mmol)，进行氮气置换，并在100℃下搅拌3小时。在TLC(CHCl3：MeOH＝9：1)中确认出现新的光斑，将反应停止。然后，溶解于AcOEt中后，与NaCl水溶液进行分液，回收有机相，利用蒸发器去除溶剂。然后，加入氨水溶液，在室温下搅拌60小时后，进行氨的去除、通过冷冻干燥去除水后，通过柱纯化(CHCl3：MeOH＝9：1)回收目标物。通过1H-NMR进行目标物的鉴定。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)
Figure BDA0002367884210000271
8.56(s，1H)，8.23(s，1H)，8.20(d，1H)，7.90(s，1H)，7.36(d，1H)，7.51(t，1H)，7.35(t，1H)，6.72(t，1H)，6.21(d，1H)，5.41(d，1H)，5.16(t，1H)，4.51(d，1H)，3.90(q，1H)，3.90(q，2H)，2.48-2.65(m，1H)，2.12-2.16(m，1H).
[基于SPCX的光交联试验]
使用通过方案2而得到的修饰核酸合成单体，进行含有光响应性核酸的DNA的合成，确认进行了光交联反应。
实验使用下述ODN(SPCX)和cODN，如下所述进行。
ODN(SPCX)5’-TGCASPCXCCGT-3’
cODN 5’-ACGGGTGCA-3’
将10μM的ODN(SPCX)和10μM的cODN溶解于包含100mM的NaCl的50mM二甲胂酸缓冲液(pH7.4)中后，在90℃下加热1分钟后，在4℃下进行冷却。然后在4℃条件下进行450nm(LED)的光照射。然后，进行UPLC的解析。通过UPLC进行的解析条件如下。使用测定波长260nm、流速0.2mL/分钟、甲酸铵和乙腈混合溶液，在初期条件为甲酸铵99％、乙腈15％；分析结束(10分钟)的时间点为甲酸铵85％、乙腈15％的条件下进行分析。
图5示出该光交联反应的流程的说明图。
[结果]
将光交联试验的UPLC的解析结果示于图6。
通过UPLC进行解析的结果，在光照射前得到确认的cODN和ODN(SPCX)的峰光照射时间依赖性地减少，确认到新的峰，确认到光交联反应的进行。通过进行10秒450nm的光照射而进行了光交联，因此与吡喃并咔唑(PCX)相比，S-吡喃并咔唑(SPCX)具有更高的光反应性。
产业上的可利用性
本发明提供成为能用于核酸的光反应技术的光反应性交联剂的新型的化合物。本发明是产业上具有可利用性的发明。

Claims (8)

1.一种下式I所示的化合物：
Figure FDA0002367884200000011
其中，式I中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
Y为氢原子、糖、多糖类、聚醚、多元醇、多肽链或水溶性合成高分子，其中，糖包含核糖及脱氧核糖，多糖类包含核酸的多核糖链及多脱氧核糖链，多肽链包含肽核酸的多肽链。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，Y为下式II所示的基团，
Figure FDA0002367884200000012
其中，式II中，
R11为氢原子或羟基，
R12为羟基或-O-Q1基，
R13为羟基或-O-Q2基，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中，Y为氢原子、下式III所示的基团或式IV所示的基团，
Figure FDA0002367884200000021
4.根据权利要求1所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核苷，
Figure FDA0002367884200000031
其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。
5.根据权利要求1所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核苷酸，
Figure FDA0002367884200000032
其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。
6.根据权利要求1所述的化合物，其为具有下式Ib所示的基团作为碱基部分的核酸或肽核酸，
Figure FDA0002367884200000033
其中，式Ib中，
X为氧原子或硫原子，
R1和R2分别独立地为选自由氢原子、卤素原子、-OH基、氨基、硝基、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基及C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。
7.一种光反应性交联剂，其包含权利要求1～6中任一项所述的化合物。
8.一种形成光交联的方法，其使用权利要求1～6中任一项所述的化合物，在与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
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