JP7345156B2 - 二本鎖形成によって１９ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法 - Google Patents
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Description
本発明は、人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸を使用して、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法に関する。
核酸の塩基配列の検出は、生命工学のあらゆる分野で使用される基本的な技術である。核酸の相補性による塩基配列の検出に特に有用であり、生命工学のあらゆる分野で使用可能な基本的な技術に、核酸の架橋技術がある。
核酸の光架橋技術として、本発明者の研究グループによって、光応答性塩基が開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。この技術によれば、例えば、相補性による二本鎖の形成とそれに続く光架橋によって、所望の塩基配列の核酸を高感度に検出することができる。この検出には、例えば、蛍光標識、発色酵素標識などの手段が、適宜使用される。しかし、これらの手段は、生体内での計測には、必ずしも適したものではない。
生体内の様々な情報を得る手段の一つとして、ＮＭＲ、ＭＲＩなど、核磁気共鳴法を用いたイメージング技術が挙げられる。核磁気共鳴法のターゲットとなる原子（分子）は主に1Ｈであり、水が生体内に多く存在し高い強度が得られることに由来する。核磁気共鳴法のターゲットとなるその他の原子としては、19Ｆ（フッ素１９）が研究されている。フッ素１９は天然存在比がほぼ１００％であること、生体内にほとんど存在しないことなどが、利点として挙げられる。
このような事情のもとで、本発明者の研究グループによって、光応答性塩基によって形成される光架橋を19Ｆケミカルシフトの変化によって検出する技術が開発された（特許文献２）。この技術によれば、相補性による二本鎖の形成とそれに続く光架橋を、19Ｆケミカルシフトの変化によって検出することができる。
特許文献２に開示された検出技術は、光架橋形成を検出するために使用可能な優れた技術であるが、二本鎖形成を直接に検出する技術ではない。
したがって、本発明の目的は、二本鎖形成を検出するための、生体内での計測に適した、高感度な検出手段を、提供することにある。
したがって、本発明の目的は、二本鎖形成を検出するための、生体内での計測に適した、高感度な検出手段を、提供することにある。
本発明者は、鋭意研究の結果、フッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸を使用して、この修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させると、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な顕著な19Ｆケミカルシフトの変化が生じることを見いだして、本発明に到達した。
19Ｆをターゲットとした核磁気共鳴法は、従来から研究されていたが、イメージング可能なほどに大きなケミカルシフトの変化を得ることは困難であったところ、本発明者は、特定のフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸を使用すると、これが核酸と同様に二本鎖形成を行って、その二本鎖形成の結果として、大きな19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることを見いだして、本発明に到達したものである。
（１）
次の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシド：
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、又はアルカノールアミンである）
を使用することによって、
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させて、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。
（２）
形成された二本鎖へ光照射して、修飾核酸中の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドと、二本鎖形成した核酸中の光架橋可能な塩基とを光架橋させて、19Ｆケミカルシフトの変化を固定化する、（１）に記載の方法。
（３）
式ＩにおけるＹ基が、次の式Ｙａ又は式Ｙｂで表される基である、（１）～（２）のいずれかに記載の方法：
Ｙａ：
（ただし、式Ｙａにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基であり、
Ｒ１３は、水酸基である）； 又は、
Ｙｂ：
（ただし、式Ｙｂにおいて、
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、水素原子であり、
Ｑ2は、水素原子である）。
（４）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）
（１）～（５）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、二本鎖核酸を製造する方法。
（７）
（１）～（５）のいずれかに記載の方法によって生じた19Ｆケミカルシフトの変化を核磁気共鳴法によって検出することによって、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間の二本鎖形成を、検出する方法。
（８）
次の式Ｉの化合物：
（ただし、式Ｉにおいて、
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、アルカノールアミン、アミノ酸、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である）。
（９）
式ＩにおけるＹ基が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）に示される原子及び基からなる群から選択された基である、（８）に記載の化合物：
（ｉ）水素原子；
（ｉｉ）次の式Ｙａで表される基：
（ただし、式Ｙａにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、－Ｏ－Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、－Ｏ－Ｑ2基であり、
Ｑ1は、
水素原子；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ2は、
水素原子；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である）；
（ｉｉｉ）次の式Ｙｂで表される基：
（ただし、式Ｙｂにおいて、
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＹａのＱ1として記載された基であり、
Ｑ2は、式ＹａのＱ2として記載された基である）； 及び
（ｉｖ）次の式Ｙｃで表される基：
（ただし、式Ｙｃにおいて、
Ｒ３１は、アミノ基の保護基、水素原子、又は、Ｒ３１に結合するＮＨと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｒ３２は、水酸基、又は、Ｒ３２に結合するＣＯと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｌは、リンカー部、又は単結合である）。
（１０）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（８）～（９）のいずれかに記載の化合物。
（１１）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（８）～（９）のいずれかに記載の化合物。
（１２）
（８）～（１１）のいずれかに記載の式Ｉの化合物からなる、二本鎖形成検出剤。
（１３）
二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、（１２）に記載の二本鎖形成検出剤。
次の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシド：
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、又はアルカノールアミンである）
を使用することによって、
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させて、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。
（２）
形成された二本鎖へ光照射して、修飾核酸中の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドと、二本鎖形成した核酸中の光架橋可能な塩基とを光架橋させて、19Ｆケミカルシフトの変化を固定化する、（１）に記載の方法。
（３）
式ＩにおけるＹ基が、次の式Ｙａ又は式Ｙｂで表される基である、（１）～（２）のいずれかに記載の方法：
Ｙａ：
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基であり、
Ｒ１３は、水酸基である）； 又は、
Ｙｂ：
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、水素原子であり、
Ｑ2は、水素原子である）。
（４）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）
（１）～（５）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、二本鎖核酸を製造する方法。
（７）
（１）～（５）のいずれかに記載の方法によって生じた19Ｆケミカルシフトの変化を核磁気共鳴法によって検出することによって、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間の二本鎖形成を、検出する方法。
（８）
次の式Ｉの化合物：
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、アルカノールアミン、アミノ酸、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である）。
（９）
式ＩにおけるＹ基が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）に示される原子及び基からなる群から選択された基である、（８）に記載の化合物：
（ｉ）水素原子；
（ｉｉ）次の式Ｙａで表される基：
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、－Ｏ－Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、－Ｏ－Ｑ2基であり、
Ｑ1は、
水素原子；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ2は、
水素原子；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である）；
（ｉｉｉ）次の式Ｙｂで表される基：
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、式ＹａのＱ1として記載された基であり、
Ｑ2は、式ＹａのＱ2として記載された基である）； 及び
（ｉｖ）次の式Ｙｃで表される基：
Ｒ３１は、アミノ基の保護基、水素原子、又は、Ｒ３１に結合するＮＨと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｒ３２は、水酸基、又は、Ｒ３２に結合するＣＯと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｌは、リンカー部、又は単結合である）。
（１０）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（８）～（９）のいずれかに記載の化合物。
（１１）
Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（８）～（９）のいずれかに記載の化合物。
（１２）
（８）～（１１）のいずれかに記載の式Ｉの化合物からなる、二本鎖形成検出剤。
（１３）
二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、（１２）に記載の二本鎖形成検出剤。
本発明は、次の（２１）以下を含む。
（２１）
次の式Ｉによって表される化合物：
（ただし、式Ｉにおいて、Ｒ基、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、及びＹは、上記（８）の式Ｉについて記載された基である）
を製造する方法であって、
次の式ＩＩの化合物：
（ただし、式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式ＩのＲ１及びＲ２として記載された基である）
へ、次の式ＩＩＩの化合物：
（ただし、式ＩＩＩにおいて、Ｒは、式ＩのＲとして記載された基である）
を、有機溶媒と酸触媒の存在下でペヒマン縮合反応させて、次の式ＩＶの化合物：
（ただし、式ＩＶにおいて、
Ｒは、式ＩのＲとして記載された基であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式ＩのＲ１及びＲ２として記載された基である）
を得る工程、を含む製造方法。
（２１）
次の式Ｉによって表される化合物：
を製造する方法であって、
次の式ＩＩの化合物：
へ、次の式ＩＩＩの化合物：
を、有機溶媒と酸触媒の存在下でペヒマン縮合反応させて、次の式ＩＶの化合物：
Ｒは、式ＩのＲとして記載された基であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式ＩのＲ１及びＲ２として記載された基である）
を得る工程、を含む製造方法。
本発明によれば、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることができる。本発明によれば、19Ｆケミカルシフトの変化の測定によって、二本鎖形成を高感度に検出することができる。
具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施他の形態に限定されるものではない。
［19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法］
本発明の方法によれば、
次の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシド：
本発明の方法によれば、
次の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシド：
を使用することによって、
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させて、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることができる。
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させて、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることができる。
［式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ基］
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基とすることができる。
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基とすることができる。
好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基を使用することができる。このフルオロアルキル基としては、例えば、次の式：
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
で表される基である。
－ＣnＨ2n+1-mＦm
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
で表される基である。
好ましいフルオロアルキル基としては、例えば、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、－Ｃ（ＣＦ3）3を挙げることができ、特に－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3が好ましい。
好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基を使用することができる。このフルオロアリール基としては、例えば、１個以上の水素原子が、フッ素原子、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基を使用することができる。好ましいフルオロアリール基としては、３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル基をあげることができる。
［式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＸ基］
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｘ基は、酸素原子又は硫黄原子とすることができ、好ましくは酸素原子とすることができる。
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｘ基は、酸素原子又は硫黄原子とすることができ、好ましくは酸素原子とすることができる。
［式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ１及びＲ２］
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。
式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。
好適な実施の態様において、ハロゲン原子としては、例えばＢｒ、Ｃｌ、Ｆ、Ｉの原子をあげることができる。フッ化メチル基としては、例えば－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨＦ2、－ＣＦ3をあげることができる。フッ化エチル基としては、例えば－ＣＨ2－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨ2－ＣＨＦ2、－ＣＨ2－ＣＦ3、－ＣＨＦ－ＣＨ3、－ＣＨＦ－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨＦ－ＣＨＦ2、－ＣＨＦ－ＣＦ3、－ＣＦ2－ＣＨ3、－ＣＦ2－ＣＨ2Ｆ、－ＣＦ2－ＣＨＦ2、－ＣＦ2－ＣＦ3をあげることができる。Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基としては、例えば－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ3基、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ3基、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ2－ＣＨ3基をあげることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、－ＮＨ2基、－ＯＨ基、－ＣＨ3基とすることができ、好ましくは、水素原子とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｒ１を上述の基とすると同時にＲ２を水素原子とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、式Ｉの左端の六員環において、窒素原子の結合する炭素原子をＣ１位と付番して、六員環の炭素原子を時計回りに順にＣ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ６位と付番した場合に、Ｃ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位のいずれかの位置の炭素原子の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれＣ３位及びＣ４位の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１をＣ３位の置換基とすると同時に、Ｒ２をＣ４位の水素原子とすることができる。
［式Ｉ’のフッ素含有人工ヌクレオシド］
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドは、次の式Ｉ’で表されるフッ素含有人工ヌクレオシドとすることができる：
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドは、次の式Ｉ’で表されるフッ素含有人工ヌクレオシドとすることができる：
ただし、式Ｉ’において、Ｒ、Ｒ１、Ｘ、及びＹは、式Ｉにおいて述べた基を表す。
［式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＹ基］
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＹ基は、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、又はアルカノールアミンとすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＹ基は、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、又はアルカノールアミンとすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＹ基は、次の式Ｙａで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドは、次の式Ｖで表されるフッ素含有人工ヌクレオシドとなる：
Ｙａ：
ただし、上記の式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中の式Ｙａにおいて、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基であり、
Ｒ１３は、水酸基である。
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基であり、
Ｒ１３は、水酸基である。
好適な実施の態様において、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＹ基は、次の式Ｙｂで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシドは、次の式ＶＩで表されるフッ素含有人工ヌクレオシドとなる：
Ｙｂ：
ただし、上記の式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中の式Ｙｂにおいて、
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、水素原子であり、
Ｑ2は、水素原子である。
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、水素原子であり、
Ｑ2は、水素原子である。
好適な実施の態様において、式Ｙｂに含まれる次の式Ｙｂ１：
で表される骨格構造を、次の式：
で表されるＤ－トレオニノール構造；
次の式：
次の式：
で表されるＬ－トレオニノール構造； 又は、
次の式：
次の式：
で表されるセリノール構造とすることができる。
［二本鎖形成］
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させると、この構造変化が核磁気共鳴法により測定される19Ｆケミカルシフトの変化が現れる。二本鎖形成可能な核酸としては、例えば、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸に対して、相補的な塩基配列を有する核酸をあげることができるが、二本鎖形成可能であれば完全に相補的な塩基配列であることを要しない。式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドと二本鎖形成可能な核酸の配列中において、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドに対して相補的な位置に配置される塩基は、特に制約はなく、任意の塩基を配置することができる。好適な実施の態様において、二本鎖形成可能な核酸として、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドに対して相補的な位置に配置される塩基以外の全ての塩基が、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸に対して、相補的な塩基配列を有する核酸をあげることができる。
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させると、この構造変化が核磁気共鳴法により測定される19Ｆケミカルシフトの変化が現れる。二本鎖形成可能な核酸としては、例えば、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸に対して、相補的な塩基配列を有する核酸をあげることができるが、二本鎖形成可能であれば完全に相補的な塩基配列であることを要しない。式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドと二本鎖形成可能な核酸の配列中において、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドに対して相補的な位置に配置される塩基は、特に制約はなく、任意の塩基を配置することができる。好適な実施の態様において、二本鎖形成可能な核酸として、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドに対して相補的な位置に配置される塩基以外の全ての塩基が、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸に対して、相補的な塩基配列を有する核酸をあげることができる。
［19Ｆケミカルシフト］
生じた19Ｆケミカルシフトの変化は、核磁気共鳴法によって検出することができる。このために使用可能な手段、条件、装置等としては、公知の手段、条件、装置等を使用することができる。本発明によって生じる19Ｆケミカルシフトの変化は、従来技術による各種プローブでの19Ｆケミカルシフトの変化よりも、大きなものであるために、本発明は、高感度の19Ｆケミカルシフトイメージングを可能にするものとなっている。例えば、カリウムイオンを中心としてＧｕａｎｉｎｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）として知られるＤＮＡの高次構造をとらせることによって、ＤＮＡに結合させた19Ｆのケミカルシフトの変化を研究した報告があるが、従来のプローブによれば、この場合のΔｐｐｍは、０．１５ｐｐｍとされており、本発明の19Ｆケミカルシフトの変化はこの７７倍以上にあたる。本願の19Ｆケミカルシフトの変化は、例えば、２．０ｐｐｍ以上、３．０ｐｐｍ以上、４．０ｐｐｍ以上、５．０ｐｐｍ以上、６．０ｐｐｍ以上、７．０ｐｐｍ以上、８．０ｐｐｍ以上であり、例えば、５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下である。
生じた19Ｆケミカルシフトの変化は、核磁気共鳴法によって検出することができる。このために使用可能な手段、条件、装置等としては、公知の手段、条件、装置等を使用することができる。本発明によって生じる19Ｆケミカルシフトの変化は、従来技術による各種プローブでの19Ｆケミカルシフトの変化よりも、大きなものであるために、本発明は、高感度の19Ｆケミカルシフトイメージングを可能にするものとなっている。例えば、カリウムイオンを中心としてＧｕａｎｉｎｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）として知られるＤＮＡの高次構造をとらせることによって、ＤＮＡに結合させた19Ｆのケミカルシフトの変化を研究した報告があるが、従来のプローブによれば、この場合のΔｐｐｍは、０．１５ｐｐｍとされており、本発明の19Ｆケミカルシフトの変化はこの７７倍以上にあたる。本願の19Ｆケミカルシフトの変化は、例えば、２．０ｐｐｍ以上、３．０ｐｐｍ以上、４．０ｐｐｍ以上、５．０ｐｐｍ以上、６．０ｐｐｍ以上、７．０ｐｐｍ以上、８．０ｐｐｍ以上であり、例えば、５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下である。
［19Ｆケミカルシフトの可逆性］
上記二本鎖形成は、可逆的なものであり、この可逆的な二本鎖形成に伴って、19Ｆケミカルシフトもまた、可逆的に変化する。したがって、19Ｆケミカルシフトの変化による二本鎖形成の検出は、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（二本鎖形成検出剤）によって、繰り返し行うことができる。
上記二本鎖形成は、可逆的なものであり、この可逆的な二本鎖形成に伴って、19Ｆケミカルシフトもまた、可逆的に変化する。したがって、19Ｆケミカルシフトの変化による二本鎖形成の検出は、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（二本鎖形成検出剤）によって、繰り返し行うことができる。
［光架橋の形成］
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドは、その塩基アナログ部分として、ピラノカルバゾール構造を備える。このピラノカルバゾール構造が、光反応によって架橋を形成することができる。好適な実施の態様において、形成された二本鎖に光照射すると、修飾核酸と、これと二本鎖形成した核酸との間に、光架橋を形成することができ、形成された二本鎖の鎖間を光架橋（光クロスリンク）による共有結合によって固定することができる。これによって、19Ｆケミカルシフトの検出をより確実にすることができる。この光架橋の形成は、可逆的であるから、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（二本鎖形成検出剤）によって、繰り返し行うことができる。
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドは、その塩基アナログ部分として、ピラノカルバゾール構造を備える。このピラノカルバゾール構造が、光反応によって架橋を形成することができる。好適な実施の態様において、形成された二本鎖に光照射すると、修飾核酸と、これと二本鎖形成した核酸との間に、光架橋を形成することができ、形成された二本鎖の鎖間を光架橋（光クロスリンク）による共有結合によって固定することができる。これによって、19Ｆケミカルシフトの検出をより確実にすることができる。この光架橋の形成は、可逆的であるから、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（二本鎖形成検出剤）によって、繰り返し行うことができる。
この光架橋は、配列中でピラノカルバゾール構造部分が核酸塩基として位置する位置から配列中で１塩基分だけ５’末端側に位置する核酸塩基に対して、相補鎖中において塩基対を形成する位置にある核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。言い換えれば、この光架橋は、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基から、配列中で１塩基分だけ３’末端側に位置する核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。
［光架橋の塩基特異性］
ピラノカルバゾール構造が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、ピラノカルバゾール構造は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドのピラノカルバゾール構造は、天然の核酸塩基としては、シトシン、ウラシル、及びチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、特異性を有している。
ピラノカルバゾール構造が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、ピラノカルバゾール構造は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドのピラノカルバゾール構造は、天然の核酸塩基としては、シトシン、ウラシル、及びチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、特異性を有している。
［光照射の波長］
好適な実施の態様において、光架橋のために照射される光の波長は、例えば３５０～６００ｎｍの範囲、好ましくは４００～６００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲とすることができる。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。このように可視光域の波長の光照射によって、光架橋を形成することができる。従来の光反応性架橋剤では、これらの範囲よりも短波長の光照射を必要としていた。従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる点で、有利である。
好適な実施の態様において、光架橋のために照射される光の波長は、例えば３５０～６００ｎｍの範囲、好ましくは４００～６００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲とすることができる。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。このように可視光域の波長の光照射によって、光架橋を形成することができる。従来の光反応性架橋剤では、これらの範囲よりも短波長の光照射を必要としていた。従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる点で、有利である。
［光反応の温度］
好適な実施の態様において、光架橋反応を進行させるためには、一般に０～５０℃、好ましくは０～４０℃、さらに好ましくは０～３０℃、さらに好ましくは０～２０℃、さらに好ましくは０～１０℃、さらに好ましくは０～５℃の範囲の温度で光照射を行う。
好適な実施の態様において、光架橋反応を進行させるためには、一般に０～５０℃、好ましくは０～４０℃、さらに好ましくは０～３０℃、さらに好ましくは０～２０℃、さらに好ましくは０～１０℃、さらに好ましくは０～５℃の範囲の温度で光照射を行う。
［光反応の時間］
好適な実施の態様において、光架橋は、極めて迅速に進行する。例えば、光反応性の化合物として知られるソラレンであれば数時間を要する（３５０ｎｍ光照射）ような場合に、それよりもはるかに長波長の光照射によって、例えばわずか１００秒間～１５００秒間（４００ｎｍ光照射）で光反応が進行して光架橋する。
好適な実施の態様において、光架橋は、極めて迅速に進行する。例えば、光反応性の化合物として知られるソラレンであれば数時間を要する（３５０ｎｍ光照射）ような場合に、それよりもはるかに長波長の光照射によって、例えばわずか１００秒間～１５００秒間（４００ｎｍ光照射）で光反応が進行して光架橋する。
［光反応の条件］
好適な実施の態様において、光架橋は、光反応を利用しているために、ｐＨ、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。
好適な実施の態様において、光架橋は、光反応を利用しているために、ｐＨ、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。
［式Ｉの化合物］
本発明は、次の式Ｉで表される新規な化合物にもある：
本発明は、次の式Ｉで表される新規な化合物にもある：
［式Ｉの化合物中のＲ基］
式Ｉの化合物中のＲ基として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ基を使用することができる。
式Ｉの化合物中のＲ基として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ基を使用することができる。
［式Ｉの化合物中のＸ基］
式Ｉの化合物中のＸ基として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＸ基を使用することができる。
式Ｉの化合物中のＸ基として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＸ基を使用することができる。
［式Ｉの化合物中のＲ１及びＲ２］
式Ｉの化合物中のＲ１及びＲ２として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ１及びＲ２を使用することができる。
式Ｉの化合物中のＲ１及びＲ２として、式Ｉのフッ素含有人工ヌクレオシド中のＲ１及びＲ２を使用することができる。
［式Ｉ’の化合物］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ’で表される化合物とすることができる：
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ’で表される化合物とすることができる：
ただし、式Ｉ’において、Ｒ、Ｒ１、Ｘ、及びＹは、式Ｉにおいて述べた基を表す。
［式Ｉの化合物中のＹ基］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、アルカノールアミン、アミノ酸、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子とすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、アルカノールアミン、アミノ酸、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子とすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、水素原子とすることができる。
［式Ｉの化合物中のＹ基としての式Ｙａで表される基］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙａで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式Ｖで表される化合物となる：
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙａで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式Ｖで表される化合物となる：
Ｙａ：
ただし、上記の式Ｉの化合物中の式Ｙａにおいて、及び上記の式Ｖの化合物において、
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、－Ｏ－Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、－Ｏ－Ｑ2基である。
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、－Ｏ－Ｑ1基であり、
Ｒ１３は、－Ｏ－Ｑ2基である。
上記Ｑ1は、
水素原子；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基とすることができる。
水素原子；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基とすることができる。
上記Ｑ2は、
水素原子；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基とすることができる。
水素原子；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基とすることができる。
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基は、次の構造を有しており、
上記ジアルキル基となるＲ基とＲ’基は、それぞれＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。このような２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基として、例えば、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト基をあげることができる。
メチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
エチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
オキサザホスホリジン基は、次の構造を有しており、
上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
チオホスファイト基は、次の構造を有しており、
上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩は、それぞれのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の塩である。
－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩は、それぞれのジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）の塩である。
好適な実施の態様において、Ｑ1は、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｑ1は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基とすることができ、特に好ましくはジメトキシトリチル基とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｑ2は、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
好適な実施の態様において、Ｑ2は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基とすることができ、特に好ましくは２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト基とすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｙａにおいて、Ｒ１１を水素原子、Ｒ１２を水酸基、Ｒ１３を水酸基とすることができる。すなわち、Ｙは、デオキシリボースとすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｙａにおいて、Ｒ１１を水酸基、Ｒ１２を水酸基、Ｒ１３を水酸基とすることができる。すなわち、Ｙは、リボースとすることができる。
［式Ｉの化合物中のＹ基としての式Ｙｂで表される基］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙｂで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式ＶＩで表される化合物となる：
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙｂで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式ＶＩで表される化合物となる：
ただし、上記の式Ｉの化合物中の式Ｙｂにおいて、及び上記の式ＶＩの化合物において、
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、上記の式Ｉの化合物中の式ＹａのＱ1として記載された基であり、
Ｑ2は、上記の式Ｉの化合物中の式ＹａのＱ2として記載された基である。
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ1は、上記の式Ｉの化合物中の式ＹａのＱ1として記載された基であり、
Ｑ2は、上記の式Ｉの化合物中の式ＹａのＱ2として記載された基である。
［式Ｉの化合物中のＹ基としての式Ｙｃで表される基］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙｃで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩで表される化合物となる：
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物中のＹ基は、次の式Ｙｃで表される基とすることができる。この場合に、式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩで表される化合物となる：
ただし、上記の式Ｉの化合物中の式Ｙｃにおいて、及び上記の式ＶＩＩの化合物において、
Ｒ３１は、アミノ基の保護基、水素原子、又は、Ｒ３１に結合するＮＨと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｒ３２は、水酸基、又は、Ｒ３２に結合するＣＯと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｌは、リンカー部、又は単結合である。
Ｒ３１は、アミノ基の保護基、水素原子、又は、Ｒ３１に結合するＮＨと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｒ３２は、水酸基、又は、Ｒ３２に結合するＣＯと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｌは、リンカー部、又は単結合である。
好適な実施の態様において、Ｌのリンカー部として、アルカンジイル基を使用することができる。アルカンジイル基としては、例えばＣ１～Ｃ３、好ましくはＣ１～Ｃ２のものを使用でき、特に好ましくはメチレン基、エチレン基とすることができる。
好適な実施に態様において、Ｌは、メチレン基、エチレン基又は単結合とすることができる。Ｌが単結合である場合とは、Ｌと結合するＮとＣとが単結合で結合している状態を言う。
アミノ基の保護基としては、アミノ基の保護基として公知の保護基をあげることができる。好適な実施の態様において、アミノ基の保護基として、フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、及びアリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択された保護基を使用することができる。
好適な実施の態様において、式Ｙｃにおいて、Ｒ３１を水素原子、Ｒ３２を水酸基、Ｌを単結合とすることができる。すなわち、Ｙをアミノ酸とすることができる。
［二本鎖形成検出剤］
本発明は、上述した二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法を含み、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた二本鎖核酸を製造する方法を含み、二本鎖形成を19Ｆケミカルシフトの変化によって検出する方法を含み、光架橋形成によって二本鎖を安定化して19Ｆケミカルシフトの変化によって検出する方法を含み、これらの方法に使用される二本鎖形成検出剤を含み、二本鎖形成検出プローブを含み、19Ｆ－ＮＭＲ測定用二本鎖形成検出剤を含み、光架橋性19Ｆ－ＮＭＲ測定用二本鎖形成検出剤を含み、これらを製造するために使用される合成中間体、修飾核酸製造用試薬を含む。
本発明は、上述した二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法を含み、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた二本鎖核酸を製造する方法を含み、二本鎖形成を19Ｆケミカルシフトの変化によって検出する方法を含み、光架橋形成によって二本鎖を安定化して19Ｆケミカルシフトの変化によって検出する方法を含み、これらの方法に使用される二本鎖形成検出剤を含み、二本鎖形成検出プローブを含み、19Ｆ－ＮＭＲ測定用二本鎖形成検出剤を含み、光架橋性19Ｆ－ＮＭＲ測定用二本鎖形成検出剤を含み、これらを製造するために使用される合成中間体、修飾核酸製造用試薬を含む。
［修飾核酸製造用試薬］
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、リン酸ジエステル結合を介して核酸中に導入して、二本鎖形成検出剤として使用可能な修飾核酸を製造するために使用できる。すなわち、式Ｉの化合物は、修飾核酸製造用試薬とすることができる。修飾核酸製造用試薬とするためには、公知の核酸合成手段によって使用可能な試薬の形態とすればよく、例えばホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法によって使用可能な修飾核酸合成用試薬(修飾核酸合成用モノマー）とすることができる。
好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、リン酸ジエステル結合を介して核酸中に導入して、二本鎖形成検出剤として使用可能な修飾核酸を製造するために使用できる。すなわち、式Ｉの化合物は、修飾核酸製造用試薬とすることができる。修飾核酸製造用試薬とするためには、公知の核酸合成手段によって使用可能な試薬の形態とすればよく、例えばホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法によって使用可能な修飾核酸合成用試薬(修飾核酸合成用モノマー）とすることができる。
［式Ｉの化合物の製造方法］
式Ｉの化合物の製造は、次の式ＩＩの化合物：
式Ｉの化合物の製造は、次の式ＩＩの化合物：
（ただし、式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式Ｉの化合物のＲ１及びＲ２として記載された基である）
へ、次の式ＩＩＩの化合物：
（ただし、式ＩＩＩにおいて、Ｒ基は、式Ｉの化合物のＲ基として記載された基である）
を、有機溶媒と酸触媒の存在下でペヒマン縮合反応させて、次の式ＩＶの化合物：
（ただし、式ＩＶにおいて、
Ｒ基は、式Ｉの化合物のＲ基として記載された基であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式Ｉの化合物のＲ１及びＲ２として記載された基である）
を得る工程、を含む方法によって、製造することができる。
へ、次の式ＩＩＩの化合物：
を、有機溶媒と酸触媒の存在下でペヒマン縮合反応させて、次の式ＩＶの化合物：
Ｒ基は、式Ｉの化合物のＲ基として記載された基であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、式Ｉの化合物のＲ１及びＲ２として記載された基である）
を得る工程、を含む方法によって、製造することができる。
［ペヒマン縮合反応］
好適な実施の態様において、式ＩＩの化合物へ、式ＩＩＩの化合物を、ペヒマン縮合反応させて、式ＩＶの化合物が合成される。ペヒマン縮合反応によって、環が形成されて、３環構造から４環構造となっている。好適な実施の態様において、ペヒマン縮合反応は、有機溶媒と酸触媒の存在下で、加熱して行われる。有機溶媒としては、好ましくはＣ１～Ｃ３のアルコール、さらに好ましくはエタノールが使用できる。酸触媒としては、好ましくは硫酸触媒が使用される。加熱の温度としては、例えば７０℃以上、好ましくは８０℃以上、さらに好ましくは８５℃以上の温度へと加熱される。このペヒマン縮合反応によって、式ＩＶの化合物を、極めて高い収率で、極めて短時間で合成することができ、これによって式Ｉの化合物を飛躍的に効率よく合成することができるものとなっている。
好適な実施の態様において、式ＩＩの化合物へ、式ＩＩＩの化合物を、ペヒマン縮合反応させて、式ＩＶの化合物が合成される。ペヒマン縮合反応によって、環が形成されて、３環構造から４環構造となっている。好適な実施の態様において、ペヒマン縮合反応は、有機溶媒と酸触媒の存在下で、加熱して行われる。有機溶媒としては、好ましくはＣ１～Ｃ３のアルコール、さらに好ましくはエタノールが使用できる。酸触媒としては、好ましくは硫酸触媒が使用される。加熱の温度としては、例えば７０℃以上、好ましくは８０℃以上、さらに好ましくは８５℃以上の温度へと加熱される。このペヒマン縮合反応によって、式ＩＶの化合物を、極めて高い収率で、極めて短時間で合成することができ、これによって式Ｉの化合物を飛躍的に効率よく合成することができるものとなっている。
なお、式ＩＶの化合物は、式ＩにおけるＹが水素原子となっている。このＹの位置の水素原子を、公知の手段によって置換して、式ＩにおけるＹとして述べられた基とすることができる。すなわち、ペヒマン縮合反応させる工程の後に、式ＩＶの化合物のＮＨ基のＨを、Ｙへ置換して、式Ｉの化合物を調製する工程、を行うことができる。ただし、式ＩのＹが水素原子である場合には、このような置換の工程は当然に必要がない。
以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［ヌクレオシドアナログ（TFPＫ）の合成］
図１は、ヌクレオシドアナログ（TFPＫ）の合成のための合成経路（スキーム１）を示す。このスキーム１の合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）（TFPＫ）を合成し、さらに修飾核酸合成モノマーを合成し、これを導入した修飾ＤＮＡを合成した。各工程の詳細は後述して説明する。
図１は、ヌクレオシドアナログ（TFPＫ）の合成のための合成経路（スキーム１）を示す。このスキーム１の合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）（TFPＫ）を合成し、さらに修飾核酸合成モノマーを合成し、これを導入した修飾ＤＮＡを合成した。各工程の詳細は後述して説明する。
スキーム１の各合成ステップにおいて、（ｆ）～（ｊ）の条件はそれぞれ次の通りである。ｒ．ｔ．は室温を意味する。
（ｆ） Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ，Ｈ2ＳＯ4，ＥｔＯＨ，９０℃，２４ｈ，
（ｇ） ＫＯＨ，ＴＤＡ－１，Ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，８ｈ
（ｈ） ＮａＯＣＨ3，ＣＨ3ＯＨ，ＣＨＣｌ3，ｒ．ｔ．，１０ｈ．
（ｉ） ＤＭＴｒＣｌ，ＤＭＡＰ，Ｐｙｒｉｄｉｎｅ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｊ） （ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ，ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，４ｈ．
（ｆ） Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ，Ｈ2ＳＯ4，ＥｔＯＨ，９０℃，２４ｈ，
（ｇ） ＫＯＨ，ＴＤＡ－１，Ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，８ｈ
（ｈ） ＮａＯＣＨ3，ＣＨ3ＯＨ，ＣＨＣｌ3，ｒ．ｔ．，１０ｈ．
（ｉ） ＤＭＴｒＣｌ，ＤＭＡＰ，Ｐｙｒｉｄｉｎｅ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｊ） （ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ，ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，４ｈ．
［化合物７の合成］
ナスフラスコに化合物１（１．００ｇ，５．４６ｍｍｏｌ）、Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ（８７８μＬ，６．０１ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を入れ、氷上で攪拌した。そこに、ｃｏｎｃ．Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を滴下した。その後、９０℃で２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。冷水を攪拌し、そこに反応溶液を滴下し沈殿物を生成させた。沈殿物を濾過し残渣を得たところでアセトンに溶解しクロロホルムを加え、再結晶を行った。再結晶で得られた化合物を濾過しクロロホルムで洗浄後、乾燥させ化合物７（１６３ｍｇ，０．５４１ｍｍｏｌ，１０％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.83(s, 1H), 8.43(s, 1H), 8.32(d, 1H, J = 7.72 Hz), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.48(t, 1H, J = 7.54 Hz), 7.26(t, 1H, J = 7.42 Hz) SALDI-MS : Calc’d for C16H9F3NO2 [M + H]+ = 304.0580, Found 304.0584.
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.64(s, 1H), 8.53(s, 1H), 8.25(d, 1H, J = 7.68 Hz), 7.53 (d, 1H, 8.00 Hz), 7.44(t, 1H, J = 7.56 Hz), 7.40(s, 1H), 7.24(t, 1H, J = 7.36 Hz), 6.26(s, 1H), 2.59(s, 3H) SALDI-MS : Calc’d for C16H11NNaO2 [M + Na]+ = 272.0681, Found 272.0682.
ナスフラスコに化合物１（１．００ｇ，５．４６ｍｍｏｌ）、Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ（８７８μＬ，６．０１ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を入れ、氷上で攪拌した。そこに、ｃｏｎｃ．Ｈ2ＳＯ4（４ｍＬ）を滴下した。その後、９０℃で２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。冷水を攪拌し、そこに反応溶液を滴下し沈殿物を生成させた。沈殿物を濾過し残渣を得たところでアセトンに溶解しクロロホルムを加え、再結晶を行った。再結晶で得られた化合物を濾過しクロロホルムで洗浄後、乾燥させ化合物７（１６３ｍｇ，０．５４１ｍｍｏｌ，１０％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.83(s, 1H), 8.43(s, 1H), 8.32(d, 1H, J = 7.72 Hz), 7.56-7.53 (m, 2H), 7.48(t, 1H, J = 7.54 Hz), 7.26(t, 1H, J = 7.42 Hz) SALDI-MS : Calc’d for C16H9F3NO2 [M + H]+ = 304.0580, Found 304.0584.
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 11.64(s, 1H), 8.53(s, 1H), 8.25(d, 1H, J = 7.68 Hz), 7.53 (d, 1H, 8.00 Hz), 7.44(t, 1H, J = 7.56 Hz), 7.40(s, 1H), 7.24(t, 1H, J = 7.36 Hz), 6.26(s, 1H), 2.59(s, 3H) SALDI-MS : Calc’d for C16H11NNaO2 [M + Na]+ = 272.0681, Found 272.0682.
［化合物８の合成］
化合物７（１６３ｍｇ，０．５４１ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（１１７ｍｇ，４．８７ｍｍｏｌ）を加えＮ2置換した。ＣＨ3ＣＮ（２５ｍＬ）、ＴＤＡ－１（１２５μＬ）を加え攪拌した。３０分後、Ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ（５２５ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3）で確認し反応停止させた。吸引濾過で沈殿物を除き、濾液をエバポレーターによって溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）によって精製し、黄色粘性液体（３３３ｍｇ，０．５０９ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ ９４％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.72 Hz), 8.05(s, 1H), 8.02(d, 1H, 4.24 Hz), 7.96(d, 2H, J = 8.16 Hz), 7.92-7.89(m, 1H), 7.88-7.84(m, 1H), 7.79(dd, 2H, 5.28 Hz), 7.28(d, 1H, 8.00 Hz), 7.36(d, 3H, 8.12 Hz), 7.23(d, 1H, 8.16 Hz), 7.26-7.21(m, 1H), 6.95(s, 1H), 5.86-5.82(m, 1H), 4.81-4.78(m, 1H), 4.59-4.56(m, 1H), 4.50-4.43(m, 1H), 3.14-3.06(m, 1H), 2.39(s, 6H) SALDI-MS : Calc’d for C37H28F3NNaO7 [M + Na]+ = 678.1710, Found 678.179.
化合物７（１６３ｍｇ，０．５４１ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（１１７ｍｇ，４．８７ｍｍｏｌ）を加えＮ2置換した。ＣＨ3ＣＮ（２５ｍＬ）、ＴＤＡ－１（１２５μＬ）を加え攪拌した。３０分後、Ｃｈｌｏｒｏｓｕｇａｒ（５２５ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3）で確認し反応停止させた。吸引濾過で沈殿物を除き、濾液をエバポレーターによって溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）によって精製し、黄色粘性液体（３３３ｍｇ，０．５０９ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ ９４％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.49 (s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.72 Hz), 8.05(s, 1H), 8.02(d, 1H, 4.24 Hz), 7.96(d, 2H, J = 8.16 Hz), 7.92-7.89(m, 1H), 7.88-7.84(m, 1H), 7.79(dd, 2H, 5.28 Hz), 7.28(d, 1H, 8.00 Hz), 7.36(d, 3H, 8.12 Hz), 7.23(d, 1H, 8.16 Hz), 7.26-7.21(m, 1H), 6.95(s, 1H), 5.86-5.82(m, 1H), 4.81-4.78(m, 1H), 4.59-4.56(m, 1H), 4.50-4.43(m, 1H), 3.14-3.06(m, 1H), 2.39(s, 6H) SALDI-MS : Calc’d for C37H28F3NNaO7 [M + Na]+ = 678.1710, Found 678.179.
［化合物９の合成］
化合物８（３３３ｇ，０．５０９ｍｍｏｌ）が入ったナスフラスコにＭｅＯＨ（４０ｍＬ）、ＣＨＣｌ3（３０ｍＬ）を加えＮａＯＭｅ（１．００ｇ）添加し６時間室温で攪拌した。その後、エバポレーターによって溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製した。精製後、乾燥し化合物９（２７８ｍｇ，０．６６３ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ～１００％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.60 Hz), 8.08(s, 1H), 7.85(d, 1H, 8.32 Hz), 7.52(t, 1H, J = 7.70 Hz), 7.33(t, 1H, J = 7.36 Hz), 6.93(s, 1H), 6.73(dd, 1H, J = 7.46 Hz), 5.43(d, 1H, 4.48 Hz), 5.20(t, 1H, 5.02 Hz), 4.53-4.50(m, 1H), 3.91(dd, 1H, J = 5.38 Hz), 3.78(dd, 1H, J = 6.88 Hz), 3.74(s, 1H), 2.65-2.58(m, 1H), 1.06(t, 1H, J = 6.98 Hz) SALDI-MS : Calc’d for C21H16F3NNaO5 [M + Na]+ = 442..0873, Found 442.0878.
化合物８（３３３ｇ，０．５０９ｍｍｏｌ）が入ったナスフラスコにＭｅＯＨ（４０ｍＬ）、ＣＨＣｌ3（３０ｍＬ）を加えＮａＯＭｅ（１．００ｇ）添加し６時間室温で攪拌した。その後、エバポレーターによって溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で精製した。精製後、乾燥し化合物９（２７８ｍｇ，０．６６３ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ～１００％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.47 (s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.60 Hz), 8.08(s, 1H), 7.85(d, 1H, 8.32 Hz), 7.52(t, 1H, J = 7.70 Hz), 7.33(t, 1H, J = 7.36 Hz), 6.93(s, 1H), 6.73(dd, 1H, J = 7.46 Hz), 5.43(d, 1H, 4.48 Hz), 5.20(t, 1H, 5.02 Hz), 4.53-4.50(m, 1H), 3.91(dd, 1H, J = 5.38 Hz), 3.78(dd, 1H, J = 6.88 Hz), 3.74(s, 1H), 2.65-2.58(m, 1H), 1.06(t, 1H, J = 6.98 Hz) SALDI-MS : Calc’d for C21H16F3NNaO5 [M + Na]+ = 442..0873, Found 442.0878.
［化合物１０の合成］
ナスフラスコに化合物９（２７８ｍｇ，０．６６３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１０．０ｍｇ，０．０６６３ｍｍｏｌ）を加えＮ2置換後、Ｄｒｙ Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（８ｍｌ）を氷浴上で加えた。ＤＭＴｒＣｌ（２７０ｍｇ，０．７９６ｍｍｏｌ）を入れた。その後、室温で２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認後、反応溶液をエバポレーターで濃縮した。Ｔｏｌｕｅｎｅで数回共沸させた。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１９：１）により精製し白色粉末（１７８ｍｇ，０．２４７ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ ３７％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.50 (s, 1H), 8.41(d, 1H, 7.32 Hz), 8.32(s, 1H), 7.86(d, 1H, 87.92 Hz), 7.81(s, 1H), 7.41(t, 2H, J = 9.48 Hz), 7.34-7.20(m, 10H), 6.95(s, 1H), 6.92(d, 2H, J = 8.80 Hz), 6.83(t, 3H, 8.88 Hz), 5.50(t, 1H, 4.80 Hz), 4.56-4.52(m, 1H), 4.03(dd, 1H, J = 8.10 Hz), 3.74(s, 6H), 2.75-2.68(m, 1H), 2.28-2.21(m, 1H) SALDI-MS : Calc’d for C42H34F3NNaO7 [M + Na]+ = 744.218, Found 744.2191.
ナスフラスコに化合物９（２７８ｍｇ，０．６６３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１０．０ｍｇ，０．０６６３ｍｍｏｌ）を加えＮ2置換後、Ｄｒｙ Ｐｙｒｉｄｉｎｅ（８ｍｌ）を氷浴上で加えた。ＤＭＴｒＣｌ（２７０ｍｇ，０．７９６ｍｍｏｌ）を入れた。その後、室温で２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認後、反応溶液をエバポレーターで濃縮した。Ｔｏｌｕｅｎｅで数回共沸させた。その後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝１９：１）により精製し白色粉末（１７８ｍｇ，０．２４７ｍｍｏｌ，ｙｉｅｌｄ ３７％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.50 (s, 1H), 8.41(d, 1H, 7.32 Hz), 8.32(s, 1H), 7.86(d, 1H, 87.92 Hz), 7.81(s, 1H), 7.41(t, 2H, J = 9.48 Hz), 7.34-7.20(m, 10H), 6.95(s, 1H), 6.92(d, 2H, J = 8.80 Hz), 6.83(t, 3H, 8.88 Hz), 5.50(t, 1H, 4.80 Hz), 4.56-4.52(m, 1H), 4.03(dd, 1H, J = 8.10 Hz), 3.74(s, 6H), 2.75-2.68(m, 1H), 2.28-2.21(m, 1H) SALDI-MS : Calc’d for C42H34F3NNaO7 [M + Na]+ = 744.218, Found 744.2191.
［化合物１１の合成］
ナスフラスコ中の化合物１０（５０．０ｍｇ，０．０６９３ｍｍｏｌ）にＣＨ2Ｃｌ2（１．５０ｍＬ）をＮ2下で加えた。その後、０．２５Ｍ Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ（２７８μＬ，０．０７６２ｍｍｏｌ）、（ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ（４３．９μＬ，０．１３４ｍｍｏｌ）を滴下し室温１時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で反応を確認し、攪拌を停止させた。反応溶液を分析漏斗に移し、ＮａＣｌａｑで数回洗浄した。そしてＮａ2ＳＯ4で有機層を乾燥させ、エバポレーターによって溶媒を除去し化合物１１（２１ｍｇ，０．０２３２ｍｍｏｌ，３３．５％）を得た。
ナスフラスコ中の化合物１０（５０．０ｍｇ，０．０６９３ｍｍｏｌ）にＣＨ2Ｃｌ2（１．５０ｍＬ）をＮ2下で加えた。その後、０．２５Ｍ Ｔｅｔｒａｚｏｌｅ（２７８μＬ，０．０７６２ｍｍｏｌ）、（ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ（４３．９μＬ，０．１３４ｍｍｏｌ）を滴下し室温１時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で反応を確認し、攪拌を停止させた。反応溶液を分析漏斗に移し、ＮａＣｌａｑで数回洗浄した。そしてＮａ2ＳＯ4で有機層を乾燥させ、エバポレーターによって溶媒を除去し化合物１１（２１ｍｇ，０．０２３２ｍｍｏｌ，３３．５％）を得た。
［TFPＫを含むオリゴ核酸の合成］
オリゴ合成機を用いて次の配列（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’，Ｘ＝TFPＫ）を合成した。反応終了後、２８％アンモニア水（１ｍＬ）を用いて、３０ｍｉｎ切り出しを行い（２回）、その後６５℃で４ｈ脱保護を行った。その後、スピードバックで溶媒を留去し、精製水１００μＬに溶かし、ＨＰＬＣによって精製を行った。その後ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析を行い目的物の同定を行った。図２にTFPＫを含むオリゴ核酸のＭＳスペクトルを示す。
Calc’d for [M + H]+ = 2866.500, Found 2866.252.
オリゴ合成機を用いて次の配列（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’，Ｘ＝TFPＫ）を合成した。反応終了後、２８％アンモニア水（１ｍＬ）を用いて、３０ｍｉｎ切り出しを行い（２回）、その後６５℃で４ｈ脱保護を行った。その後、スピードバックで溶媒を留去し、精製水１００μＬに溶かし、ＨＰＬＣによって精製を行った。その後ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析を行い目的物の同定を行った。図２にTFPＫを含むオリゴ核酸のＭＳスペクトルを示す。
Calc’d for [M + H]+ = 2866.500, Found 2866.252.
［TFPＫを含むオリゴ核酸の光架橋の検討］
［光架橋反応］
１００μＭ ＯＤＮ１（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’，Ｘ＝TFPＫ）、１００μＭ ＯＤＮ２（５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’）、５０μＭ ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）をアニーリングし、４℃で静置した。その後、ＵＶ－ＬＥＤ（ＯｍｎｉＣｕｒｅ，ＬＸ４０５－Ｓ）を用いて４００ｎｍの光照射を４℃で１２００ｓｅｃ行った。
［光架橋反応］
１００μＭ ＯＤＮ１（５’－ＴＧＣＡＸＣＣＧＴ－３’，Ｘ＝TFPＫ）、１００μＭ ＯＤＮ２（５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’）、５０μＭ ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）をアニーリングし、４℃で静置した。その後、ＵＶ－ＬＥＤ（ＯｍｎｉＣｕｒｅ，ＬＸ４０５－Ｓ）を用いて４００ｎｍの光照射を４℃で１２００ｓｅｃ行った。
［ＨＰＬＣ解析］
架橋サンプル５０μＬをＨＰＬＣで解析した。解析には５０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルを用い、分析開始時ギ酸アンモニウム９８％、３０分時点でギ酸アンモニウム７０％、アセトニトリル３０％になるように直線的に溶媒比率を変化させた。流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度６０℃、検出波長は２６０ｎｍで分析を行った。この結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは光照射前（光照射時間０ｓｅｃ）におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図３Ｂは光照射後（光照射時間１２００ｓｅｃ）におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図４に、光架橋産物のＭＳスペクトルを示す。
架橋サンプル５０μＬをＨＰＬＣで解析した。解析には５０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルを用い、分析開始時ギ酸アンモニウム９８％、３０分時点でギ酸アンモニウム７０％、アセトニトリル３０％になるように直線的に溶媒比率を変化させた。流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度６０℃、検出波長は２６０ｎｍで分析を行った。この結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは光照射前（光照射時間０ｓｅｃ）におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図３Ｂは光照射後（光照射時間１２００ｓｅｃ）におけるＨＰＬＣクロマトグラムである。図４に、光架橋産物のＭＳスペクトルを示す。
図３Ａ及び図３Ｂに示される通り、光照射１２００ｓｅｃ後、リテンションタイム１５分に新たにピークが現れた。このピークを分取し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析を行い目的物の同定を行った。
Calc’d for [M + H]+ = 5629.008, Found = 5633.398
Calc’d for [M + H]+ = 5629.008, Found = 5633.398
［19Ｆ－ＮＭＲ測定（１）］
TFPＫを含むオリゴ核酸が、一本鎖状態から二本鎖状態へと変化した場合の19Ｆ－ＮＭＲシグナルの変化を検討するために、19Ｆ－ＮＭＲ測定を行った。
４８．４μＭTFPＫ－ＯＤＮ（５’－ＴＧＣＡTFPＫＣＣＧＴ－３’）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。その際に一本鎖状態であるTFPＫ由来の１９Ｆ ＭＲシグナルが－６３．７ｐｐｍに検出された。一方、TFPＫ－ＯＤＮとその相補鎖（５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’）を混合し、二本鎖を形成させた際には－７５．３ｐｐｍにシグナルが検出された。
この結果より、TFPＫ－ＯＤＮが一本鎖状態と二本鎖状態で１９Ｆ ＭＲシグナルが１１．６ｐｐｍという、これまで報告されている例よりも圧倒的に大きな変化を示すことが明らかとなった。また、４００ｎｍの光照射を１２００秒行い、光架橋反応させた際にも－７５．３ｐｐｍ付近に確認された。
図５に、ＤＮＡ鎖状態の変化に伴うTFPＫ由来の19Ｆ－ＭＲシグナルの変化を示す。
TFPＫを含むオリゴ核酸が、一本鎖状態から二本鎖状態へと変化した場合の19Ｆ－ＮＭＲシグナルの変化を検討するために、19Ｆ－ＮＭＲ測定を行った。
４８．４μＭTFPＫ－ＯＤＮ（５’－ＴＧＣＡTFPＫＣＣＧＴ－３’）を含む１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。その際に一本鎖状態であるTFPＫ由来の１９Ｆ ＭＲシグナルが－６３．７ｐｐｍに検出された。一方、TFPＫ－ＯＤＮとその相補鎖（５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’）を混合し、二本鎖を形成させた際には－７５．３ｐｐｍにシグナルが検出された。
この結果より、TFPＫ－ＯＤＮが一本鎖状態と二本鎖状態で１９Ｆ ＭＲシグナルが１１．６ｐｐｍという、これまで報告されている例よりも圧倒的に大きな変化を示すことが明らかとなった。また、４００ｎｍの光照射を１２００秒行い、光架橋反応させた際にも－７５．３ｐｐｍ付近に確認された。
図５に、ＤＮＡ鎖状態の変化に伴うTFPＫ由来の19Ｆ－ＭＲシグナルの変化を示す。
図５に示されるように、TFPＫが導入された修飾オリゴ核酸は、二本鎖形成することによって、大きくケミカルシフトが変化した。二本鎖形成により生じるケミカルシフトは、これまでの報告によればΔ０．１ｐｐｍ～Δ０．７ｐｐｍ程度の分子が知られているが、これらと比較してΔ１１．６ｐｐｍという大きなケミカルシフトは極めて大きい。
［19Ｆ－ＮＭＲ測定（２）］
上記の19Ｆ－ＮＭＲ測定（１）の結果から確認された－６３．７ｐｐｍから－７５．３ｐｐｍへの大きな変化が、一本鎖から二本鎖への変化によるものかどうかをさらに検証するために、TFPＫ－ＯＤＮに対し、相補鎖の等量比を変化させた際の19Ｆ－ＮＭＲ測定を行った。
TFPＫ－ＯＤＮを９３２μＭ含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。一本鎖状態由来の－６３．７ｐｐｍにシグナルが確認された。
次に相補鎖の等量比を０．２５、０．５、１と変化させた際に、－７５．３ｐｐｍにシグナルが確認でき、相補鎖の等量比が上がるに従い、－６３．７ｐｐｍのシグナル強度が減少し、－７５．３ｐｐｍのシグナルが増加していった。二本鎖を形成しているＤＮＡの割合が増加するに従い、－７５．３ｐｐｍのシグナル強度が増加していることから、二本鎖形成により、19Ｆ－ＮＭＲシグナルが変化していることが確認された。また、TFPＫ－ＯＤＮに対して相補鎖が０．５等量のサンプルでは、一本鎖と二本鎖の形成の割合はおおよそ等しいにも関わらず、19Ｆ－ＭＲシグナルの強度は－７５．３ｐｐｍの方が、強く検出された。この結果より、一本鎖状態と二本鎖状態での検出感度が大きく異なり、二本鎖形成時により強く19Ｆ－ＮＭＲシグナルが検出されることがわかった。
図６に、ＤＮＡ等量比を変化させた際の19Ｆ－ＮＭＲ測定結果を示す。
上記の19Ｆ－ＮＭＲ測定（１）の結果から確認された－６３．７ｐｐｍから－７５．３ｐｐｍへの大きな変化が、一本鎖から二本鎖への変化によるものかどうかをさらに検証するために、TFPＫ－ＯＤＮに対し、相補鎖の等量比を変化させた際の19Ｆ－ＮＭＲ測定を行った。
TFPＫ－ＯＤＮを９３２μＭ含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。一本鎖状態由来の－６３．７ｐｐｍにシグナルが確認された。
次に相補鎖の等量比を０．２５、０．５、１と変化させた際に、－７５．３ｐｐｍにシグナルが確認でき、相補鎖の等量比が上がるに従い、－６３．７ｐｐｍのシグナル強度が減少し、－７５．３ｐｐｍのシグナルが増加していった。二本鎖を形成しているＤＮＡの割合が増加するに従い、－７５．３ｐｐｍのシグナル強度が増加していることから、二本鎖形成により、19Ｆ－ＮＭＲシグナルが変化していることが確認された。また、TFPＫ－ＯＤＮに対して相補鎖が０．５等量のサンプルでは、一本鎖と二本鎖の形成の割合はおおよそ等しいにも関わらず、19Ｆ－ＭＲシグナルの強度は－７５．３ｐｐｍの方が、強く検出された。この結果より、一本鎖状態と二本鎖状態での検出感度が大きく異なり、二本鎖形成時により強く19Ｆ－ＮＭＲシグナルが検出されることがわかった。
図６に、ＤＮＡ等量比を変化させた際の19Ｆ－ＮＭＲ測定結果を示す。
図６に示されるように、二本鎖形成により大きなケミカルシフトを呈すると同時に、その検出感度も大きく増大していた。すなわち、ピークの面積値の増大から計算すると、一本鎖状態で検出される信号の強度（面積値）と比較すると、二本鎖状態で検出される信号の強度（面積値）は、約４０倍に増加しており、TFPＫが導入された修飾オリゴ核酸極めて高い感度で二本鎖状態を検出できるものとなっていた。
［19Ｆ－ＮＭＲ測定（３）］
温度を変化させた際のＤＮＡ状態の変化を19Ｆ－ＮＭＲ測定により調べた。
５０μＭ ｄｓＯＤＮ（TTPＫ－ＯＤＮと相補鎖）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。２５℃条件下ではＤＮＡは二本鎖を形成しており、－７５．３ｐｐｍに強いピークが確認された。一方、８０℃に加熱した際にはＤＮＡが解離しており、－６３．１ｐｐｍのピーク強度が増加していることが確認された。－７５．３ｐｐｍと－６３．１ｐｐｍのピークの面積比と比較したところ、２５℃条件下では、４８：１だったのに対し、２５℃では１６：１と変化しており、加熱に伴うＤＮＡの解離により－６３．１ｐｐｍのピークが増加していることが確認された。
図７に、加熱によるＤＮＡ二本鎖状態変化時の19Ｆ－ＮＭＲ測定結果を示す。
温度を変化させた際のＤＮＡ状態の変化を19Ｆ－ＮＭＲ測定により調べた。
５０μＭ ｄｓＯＤＮ（TTPＫ－ＯＤＮと相補鎖）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液を調整し（１０％Ｄ2Ｏ）、ＮＭＲ測定を行った。２５℃条件下ではＤＮＡは二本鎖を形成しており、－７５．３ｐｐｍに強いピークが確認された。一方、８０℃に加熱した際にはＤＮＡが解離しており、－６３．１ｐｐｍのピーク強度が増加していることが確認された。－７５．３ｐｐｍと－６３．１ｐｐｍのピークの面積比と比較したところ、２５℃条件下では、４８：１だったのに対し、２５℃では１６：１と変化しており、加熱に伴うＤＮＡの解離により－６３．１ｐｐｍのピークが増加していることが確認された。
図７に、加熱によるＤＮＡ二本鎖状態変化時の19Ｆ－ＮＭＲ測定結果を示す。
図７に示されるように、加熱することによって、二本鎖が一本鎖へと解離したことに伴って、一本鎖を示すピーク（－６３．１ｐｐｍ）の強度が大きく増加し、二本鎖を示すピーク（－７５．３ｐｐｍ）の強度が大きく減少していることから、TFPＫが、これが導入された修飾オリゴ核酸の一本鎖状態と二本鎖状態を検出するための19Ｆ－ＮＭＲ測定によるケミカルシフト検出用のプローブとして、使用できることがわかった。
［ヌクレオシドアナログ（TFPＤ）の合成］
図８は、ヌクレオシドアナログ（TFPＤ）の合成のための合成経路（スキーム２）を示す。このスキーム１の合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）（TFPＤ）を合成し、さらに修飾核酸合成モノマーを合成し、これを導入した修飾ＤＮＡを合成した。各工程の詳細は後述して説明する。
図８は、ヌクレオシドアナログ（TFPＤ）の合成のための合成経路（スキーム２）を示す。このスキーム１の合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）（TFPＤ）を合成し、さらに修飾核酸合成モノマーを合成し、これを導入した修飾ＤＮＡを合成した。各工程の詳細は後述して説明する。
スキーム２の各合成ステップにおいて、（ｐ）～（ｙ）の条件はそれぞれ次の通りである。ｒ．ｔ．は室温を意味する。
（ｐ） Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ，Ｈ2ＳＯ4，ＥｔＯＨ，９０℃，２４ｈ．
（ｑ） ＮａＨ，ＮａＩ，Ｅｔｈｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ，ＤＭＦ，ｒ．ｔ．，８ｈ
（ｒ） ［１］．ＮａＯＨ，ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ，ｒ．ｔ．，５ｈ．
［２］．Ｄ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ，ＥＤＣＩ，ＨＯＢｔ，ＤＭＦ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｘ） ＤＭＴｒＣｌ，ＤＭＡＰ，Ｐｙｒｉｄｉｎｅ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｙ） （ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ，ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，４ｈ．
（ｐ） Ｅｔｈｙｌ ４，４，４－Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏａｃｅｔａｔｅ，Ｈ2ＳＯ4，ＥｔＯＨ，９０℃，２４ｈ．
（ｑ） ＮａＨ，ＮａＩ，Ｅｔｈｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ，ＤＭＦ，ｒ．ｔ．，８ｈ
（ｒ） ［１］．ＮａＯＨ，ＴＨＦ／ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ，ｒ．ｔ．，５ｈ．
［２］．Ｄ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ，ＥＤＣＩ，ＨＯＢｔ，ＤＭＦ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｘ） ＤＭＴｒＣｌ，ＤＭＡＰ，Ｐｙｒｉｄｉｎｅ，ｒ．ｔ．，２４ｈ．
（ｙ） （ｉＰｒ2Ｎ）2ＰＯ（ＣＨ2）2ＣＮ，ｔｅｔｒａｚｏｌｅ，ＣＨ3ＣＮ，ｒ．ｔ．，４ｈ．
［化合物１６の合成］
氷上に置いたナスフラスコに化合物７（３００ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（４４２ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（１２２ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）を入れ、真空後Ｎ2置換した。そこに、ＤＭＦを１０ｍＬをゆっくり滴下し加えた。２０分の攪拌後、Ｅｔｈｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ（２６６μＬ，２．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。ＭｅＯＨを少量加え反応を停止させた後、エバポレーターで溶媒を除去した。溶媒を除去後、ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去した。除去後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）によって精製を行なった。分取した化合物を乾燥させ化合物１６（１２６ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ，３２％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51(s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.68 Hz), 7.84(s, 1H), 7.55 (d, 1H, 7.24 Hz), 7.34(t, 1H, J = 7.78 Hz), 6.91(s, 1H), 5.47(s, 2H), 4.17-4.14(m, 2H), 2.58(s, 3H) ESI-FT-ICR MS : Calc’d for C20H15F3NO4 [M + H]+ = 390.0948, Found 390.0944.
氷上に置いたナスフラスコに化合物７（３００ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）、ＮａＩ（４４２ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）、ＮａＨ（１２２ｍｇ，２．００ｍｍｏｌ）を入れ、真空後Ｎ2置換した。そこに、ＤＭＦを１０ｍＬをゆっくり滴下し加えた。２０分の攪拌後、Ｅｔｈｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ（２６６μＬ，２．４０ｍｍｏｌ）を加え、室温８時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。ＭｅＯＨを少量加え反応を停止させた後、エバポレーターで溶媒を除去した。溶媒を除去後、ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去した。除去後、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ3）によって精製を行なった。分取した化合物を乾燥させ化合物１６（１２６ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ，３２％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.51(s, 1H), 8.40(d, 1H, 7.68 Hz), 7.84(s, 1H), 7.55 (d, 1H, 7.24 Hz), 7.34(t, 1H, J = 7.78 Hz), 6.91(s, 1H), 5.47(s, 2H), 4.17-4.14(m, 2H), 2.58(s, 3H) ESI-FT-ICR MS : Calc’d for C20H15F3NO4 [M + H]+ = 390.0948, Found 390.0944.
［化合物１７の合成］
ナスフラスコに化合物１６（１２６ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（９ｍＬ）／ＭｅＯＨ（６ｍＬ）／Ｈ2Ｏ（３ｍＬ）混合溶媒を加えた。そこに、ＮａＯＨ（３８．０ｍｇ，０．９６９ｍｍｏｌ）加え、室温５時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。０．１Ｍに調整したＨＣｌａｑを反応溶液中に加えｐＨ２になるようにした。ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去し真空乾燥した。真空乾燥後の化合物（１０６ｍｇ）にＤＭＦ（１０ｍＬ）、Ｄ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ（６１．６ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７９．２ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）を加えＮ2下で室温２０分攪拌した。その後、ＥＤＣＩ（１１２ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）を加え室温２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。ＭｅＯＨを少量加え反応を停止させた後、エバポレーターで溶媒を除去した。溶媒を除去後、ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去した。真空乾燥させ、化合物１７（８２ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ，５７％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48(s, 1H), 8.39(d, 1H, 7.72 Hz), 8.03(d, 1H, 8.88 Hz), 7.77 (s, 1H), 7.61(d, 1H, J = 8.16 Hz), 7.53(t, 1H, J = 7.30 Hz) 7.30(t, 1H, 7.42 Hz), 6.89(s, 1H), 5.21(d, 2H, 3.92 Hz), 4.73(d, 1H, 4.60 Hz), 4.65(t, 1H, 5.48 Hz), 3.93-3.40(m, 1H), 3.66-3.62(m, 1H), 3.54-3.49(m, 1H), 3.42-3.38(m, 1H), 1.03(d, 3H, 6.40 Hz) SALDI-FT-ICR MS : Calc’d for C22H19F3N2NaO5 [M + H]+ = 471.1138, Found 471.1135.
ナスフラスコに化合物１６（１２６ｍｇ，０．３２３ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（９ｍＬ）／ＭｅＯＨ（６ｍＬ）／Ｈ2Ｏ（３ｍＬ）混合溶媒を加えた。そこに、ＮａＯＨ（３８．０ｍｇ，０．９６９ｍｍｏｌ）加え、室温５時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。０．１Ｍに調整したＨＣｌａｑを反応溶液中に加えｐＨ２になるようにした。ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去し真空乾燥した。真空乾燥後の化合物（１０６ｍｇ）にＤＭＦ（１０ｍＬ）、Ｄ－Ｔｈｒｅｏｎｉｎｏｌ（６１．６ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（７９．２ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）を加えＮ2下で室温２０分攪拌した。その後、ＥＤＣＩ（１１２ｍｇ，０．５８６ｍｍｏｌ）を加え室温２４時間攪拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で原料の消失を確認した。ＭｅＯＨを少量加え反応を停止させた後、エバポレーターで溶媒を除去した。溶媒を除去後、ＡｃＯＥｔを入れ、分液を行なった。有機層をＮａ2ＳＯ4によって脱水後、エバポレーターによって溶媒を除去した。真空乾燥させ、化合物１７（８２ｍｇ，０．１８３ｍｍｏｌ，５７％）を得た。
1H-NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ 8.48(s, 1H), 8.39(d, 1H, 7.72 Hz), 8.03(d, 1H, 8.88 Hz), 7.77 (s, 1H), 7.61(d, 1H, J = 8.16 Hz), 7.53(t, 1H, J = 7.30 Hz) 7.30(t, 1H, 7.42 Hz), 6.89(s, 1H), 5.21(d, 2H, 3.92 Hz), 4.73(d, 1H, 4.60 Hz), 4.65(t, 1H, 5.48 Hz), 3.93-3.40(m, 1H), 3.66-3.62(m, 1H), 3.54-3.49(m, 1H), 3.42-3.38(m, 1H), 1.03(d, 3H, 6.40 Hz) SALDI-FT-ICR MS : Calc’d for C22H19F3N2NaO5 [M + H]+ = 471.1138, Found 471.1135.
［TFPＤを含む修飾核酸］
TFPＤを含む修飾核酸を合成して、TFPＤを含む修飾核酸と同様に予備的な実験を行って19Ｆ－ＮＭＲ測定したところ、二本鎖形成によるケミカルシフトが確認された。
TFPＤを含む修飾核酸を合成して、TFPＤを含む修飾核酸と同様に予備的な実験を行って19Ｆ－ＮＭＲ測定したところ、二本鎖形成によるケミカルシフトが確認された。
本発明は、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる技術を提供する。本発明は産業上有用な発明である。
Claims (12)
- 次の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシド：
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、又はアルカノールアミンである）
を使用することによって、
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間に、二本鎖を形成させて、二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な１９Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。 - 形成された二本鎖へ光照射して、修飾核酸中の式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドと、二本鎖形成した核酸中の光架橋可能な塩基とを光架橋させて、１９Ｆケミカルシフトの変化を固定化する、請求項１に記載の方法。
- 式ＩにおけるＹ基が、次の式Ｙａ又は式Ｙｂで表される基である、請求項１～２のいずれかに記載の方法：
Ｙａ：
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、水酸基であり、
Ｒ１３は、水酸基である）； 又は、
Ｙｂ：
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ１は、水素原子であり、
Ｑ２は、水素原子である）。 - Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣｎＨ２ｎ＋１－ｍＦｍ
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。 - Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ３、－ＣＨ２－ＣＦ３、又は－Ｃ（ＣＦ３）３である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。 - 請求項１～５のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な１９Ｆケミカルシフトの変化を生じた、二本鎖核酸を製造する方法。
- 請求項１～５のいずれかに記載の方法によって生じた１９Ｆケミカルシフトの変化を核磁気共鳴法によって検出することによって、式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間の二本鎖形成を、検出する方法。
- 次の式Ｉの化合物：
Ｒ基は、
フッ素原子；
１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基；
又は、
１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、アルカノールアミン、アミノ酸、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である）
からなる、二本鎖形成検出剤であって、
二本鎖形成を検出される二本鎖が、
式Ｉによって表されるフッ素含有人工ヌクレオシドを塩基配列中に導入した修飾核酸と、該修飾核酸と二本鎖形成可能な核酸との間において形成される二本鎖である、二本鎖形成検出剤。 - 二本鎖形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な１９Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、請求項８に記載の二本鎖形成検出剤。
- 式ＩにおけるＹ基が、以下の（ｉ）～（ｉｖ）に示される原子及び基からなる群から選択された基である、請求項８～９のいずれかに記載の二本鎖形成検出剤：
（ｉ）水素原子；
（ｉｉ）次の式Ｙａで表される基：
Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
Ｒ１２は、－Ｏ－Ｑ１基であり、
Ｒ１３は、－Ｏ－Ｑ２基であり、
Ｑ１は、
水素原子；
Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ１に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
からなる群から選択される基であり、
Ｑ２は、
水素原子；
Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
Ｑ２に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸； 及び
以下から選択される保護基：
２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
からなる群から選択される基である）；
（ｉｉｉ）次の式Ｙｂで表される基：
Ｒ２１は、水素原子、メチル基、又はエチル基を表し、
Ｑ１は、式ＹａのＱ１として記載された基であり、
Ｑ２は、式ＹａのＱ２として記載された基である）； 及び
（ｉｖ）次の式Ｙｃで表される基：
Ｒ３１は、アミノ基の保護基、水素原子、又は、Ｒ３１に結合するＮＨと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｒ３２は、水酸基、又は、Ｒ３２に結合するＣＯと一体となって形成されたペプチド結合によって結合されたポリペプチドを表し、
Ｌは、リンカー部、又は単結合である）。 - Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣｎＨ２ｎ＋１－ｍＦｍ
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、請求項８～１０のいずれかに記載の二本鎖形成検出剤。 - Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
－ＣＦ３、－ＣＨ２－ＣＦ３、又は－Ｃ（ＣＦ３）３である、請求項８～１０のいずれかに記載の二本鎖形成検出剤。
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