WO2015093485A1 - 光架橋形成によって１９ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法 - Google Patents

光架橋形成によって１９ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法 Download PDF

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photocrosslinking
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photoresponsive
fluorine
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健造 藤本
中村　重孝
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国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
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    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/088—Assessment or manipulation of a chemical or biochemical reaction, e.g. verification whether a chemical reaction occurred or whether a ligand binds to a receptor in drug screening or assessing reaction kinetics
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to a nuclear magnetic resonance method in which photocrosslinking is formed between a photoresponsive base having a photocrosslinkable vinyl structure and a fluorine-containing modified pyrimidine base capable of photocrosslinking before and after photocrosslinking. To a change in 19 F chemical shift detectable by.
  • Nucleic acid base sequence detection is a basic technique used in all fields of biotechnology.
  • a basic technique that is particularly useful for detection of nucleotide sequences by complementation of nucleic acids and that can be used in all fields of biotechnology is a nucleic acid crosslinking technique.
  • a photoresponsive base As a photocrosslinking technique for nucleic acids, a photoresponsive base has been developed and a patent application has been filed by the inventor's research group (Patent Document 1). According to this technique, a nucleic acid having a desired base sequence can be detected with high sensitivity by, for example, formation of a duplex by complementation and subsequent photocrosslinking. For this detection, for example, means such as a fluorescent label and a chromogenic enzyme label are appropriately used. However, these means are not necessarily suitable for in vivo measurement.
  • a nuclear magnetic resonance method such as NMR or MRI.
  • the atoms (molecules) that are the targets of the nuclear magnetic resonance method are mainly 1 H, which is derived from the fact that a large amount of water is present in the living body and high strength is obtained.
  • 19 F fluorine 19
  • Fluorine 19 has been studied as another atom to be a target of the nuclear magnetic resonance method. Fluorine 19 has a natural abundance ratio of almost 100% and is hardly present in the living body.
  • an object of the present invention is to provide a highly sensitive detection means suitable for in vivo measurement for detecting photocrosslinking formed by a photoresponsive base.
  • the present inventor has substituted 19 F (19 fluorine atoms) at the 5-position of the pyrimidine ring of a base of thymine (T) or uracil (U) that can be photocrosslinked to a photoresponsive base. It was found that when a fluorine-containing modified pyrimidine base substituted on a group was used to form a photocrosslink by photoirradiation with a photoresponsive base, a significant 19 F chemical shift change occurred. Reached.
  • the present invention includes the following (1) to (1).
  • (1) The 5-position of the pyrimidine ring of the base of thymine (T) or uracil (U) that can be photocrosslinked to a photoresponsive base having a photocrosslinkable vinyl structure is substituted with an R group (provided that the R group is a fluorine atom) , A C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms, Or Monocyclic, bicyclic or tricyclic substituted with one or more hydrogen atoms by fluorine atoms or C1-C4 fluoroalkyl groups in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms A fluoroaryl group)
  • a fluorine-containing modified pyrimidine base substituted with A photo-crosslinking is formed between a photo-responsive base having a photo-crosslinkable vinyl structure and a fluorine-containing modified pyrimidine base capable of photo-crosslinking, and
  • the fluorine-containing modified pyrimidine base is The following formula (I): (However, in the formula (I), R is a fluorine atom, A C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms, or Monocyclic, bicyclic or tricyclic substituted with one or more hydrogen atoms by fluorine atoms or C1-C4 fluoroalkyl groups in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms A fluoroaryl group, R1 represents a phosphate group formed integrally with O bonded to R1 in the formula (I); R2 represents a hydroxyl group, R3 is hydrogen or a hydroxyl group) Is a base portion of a modified pyrimidine nucleotide represented by: Photocrosslinking The fluorine-containing modified pyrimidine base in the photocrosslinkable nucleic acid into which the modified pyr
  • a photoresponsive base having a photocrosslinkable vinyl structure is The following formula (II): (In the formula (II), R11 is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen; R12 and R13 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen; R1 represents a phosphate group formed integrally with O bonded to R1 in the formula (I); R2 represents a hydroxyl group, R3 is hydrogen or a hydroxyl group) Is a base portion of the photoresponsive modified nucleotide represented by: Photocrosslinking The photoresponsive base in a photoresponsive nucleic acid into which the photoresponsive modified nucleotide is introduced by phosphodiester linkage; and The method according to (2), which is a photocrosslinking formed with a fluorine-containing modified pyrimidine base in a photocrosslinkable
  • a C1-C4 fluoroalkyl group is -C n H 2n + 1-m F m (Where n is an integer from 1 to 4, m is an integer from 1 and 2n + 1-m is an integer from 0 to 0)
  • the method according to any one of (1) to (3), wherein (5) A C1-C4 fluoroalkyl group is The method according to any one of (1) to (3), which is —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , or —C (CF 3 ) 3 .
  • a monocyclic, bicyclic or tricyclic fluoroaryl group is (1) to (1) in which one or more hydrogen atoms are a fluorophenyl group or a fluoronaphthyl group substituted with a fluorine atom, —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , or —C (CF 3 ) 3 The method according to any one of 3).
  • a monocyclic, bicyclic or tricyclic fluoroaryl group is The method according to any one of (1) to (3), which is a 3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl group.
  • the present invention includes the following (11) to (11).
  • (11) A method for producing a photocrosslink in which a change in 19 F chemical shift detectable by a nuclear magnetic resonance method is caused by the method according to any one of (7) to (7).
  • (12) A method for producing a photocrosslinked nucleic acid that has a change in 19 F chemical shift detectable by a nuclear magnetic resonance method by the method according to any one of (7) to (7).
  • (13) (1) A method for detecting a photocrosslink formed by the method according to any one of (7) by a change in 19 F chemical shift in a nuclear magnetic resonance method.
  • Photocrosslinking The method according to any one of (3) to (7), wherein the method is photocrosslinking formed so as to be photocrosslinkable by forming a duplex between the photoresponsive nucleic acid and the photocrosslinkable nucleic acid.
  • the method is photocrosslinking formed so as to be photocrosslinkable by forming a duplex between the photoresponsive nucleic acid and the photocrosslinkable nucleic acid.
  • the present invention includes the following (21) to (21).
  • (21) The following formula (I): (However, in the formula (I), R is a fluorine atom, A C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms, or Monocyclic, bicyclic or tricyclic substituted with one or more hydrogen atoms by fluorine atoms or C1-C4 fluoroalkyl groups in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms A fluoroaryl group, R1 represents a phosphate group formed integrally with O bonded to R1 in the formula (I); R2 represents a hydroxyl group, R3 is hydrogen or a hydroxyl group)
  • the photocrosslinking formation detection agent which consists of a photocrosslinkable nucleic acid in which the modified pyrimidine nucleotide represented by this formula is introduced by phosphodiester bonding.
  • a C1-C4 fluoroalkyl group is -C n H 2n + 1-m F m (Where n is an integer from 1 to 4, m is an integer from 1 and 2n + 1-m is an integer from 0 to 0)
  • a C1-C4 fluoroalkyl group is The photocrosslinking formation detection agent according to any one of (21) to (23), which is —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , or —C (CF 3 ) 3 .
  • a monocyclic, bicyclic or tricyclic fluoroaryl group is (21) to (21) in which one or more hydrogen atoms are a fluorophenyl group or a fluoronaphthyl group substituted with a fluorine atom, —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , or —C (CF 3 ) 3
  • a monocyclic, bicyclic or tricyclic fluoroaryl group is The photocrosslinking formation detection agent according to any one of (21) to (24), which is a 3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl group.
  • the present invention includes the following (31) to (31).
  • (31) A photocrosslinkable nucleic acid obtained by introducing a modified pyrimidine nucleotide represented by the formula (I) through a phosphodiester bond;
  • a method for producing a photocrosslinked nucleic acid A photocrosslinkable nucleic acid obtained by introducing a modified pyrimidine nucleotide represented by the formula (I) through a phosphodiester bond.
  • the formation of a photocrosslink by a photoresponsive base can be detected by 19 F chemical shift by a nuclear magnetic resonance method.
  • This detection by nuclear magnetic resonance is particularly suitable for in-vivo three-dimensional imaging, and is also particularly suitable for taking snapshots at a certain point in time, so that a desired response using a photoresponsive nucleic acid can be obtained. It is intended to realize a new medically valuable application in which detection of complementary nucleic acid sequences is performed using in-vivo three-dimensional real-time snapshot images.
  • FIG. 1 is a diagram showing a modified PAGE result comparing the photoreactivity of T and TFT .
  • Figure 2 is a graph showing comparison of photoreactive a (B) of HPLC analysis of the cross-linking reaction of CNV K and TF T (A), and ODN2 (T) and ODN3 (TF T).
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a change in chemical shift associated with photocrosslinking.
  • FIG. 4 is a graph showing the correlation between the ratio of the peak shifted by NMR and the photocrosslinking rate determined from the amount of decrease in peak by HPLC.
  • FIG. 5 is a diagram showing a modified PAGE result in which cleavage by 312 nm light irradiation was confirmed.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of reversible F-NMR chemical shift changes associated with the photocrosslinking reaction.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing sensing of potassium ions by a thrombin aptamer.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes in NMR peaks due to the addition of potassium ions.
  • the 5-position of the pyrimidine ring of a thymine (T) or uracil (U) base capable of photocrosslinking to a photoresponsive base having a photocrosslinkable vinyl structure is substituted with an R group (provided that The R group is a fluorine-containing modified pyrimidine base substituted with a fluorine atom or a C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are substituted with a fluorine atom.
  • the photoresponsive base having a structure and a fluorine-containing modified pyrimidine base capable of photocrosslinking are subjected to photocrosslinking, and a 19 F chemical shift detectable by a nuclear magnetic resonance method in comparison before and after the photocrosslinking is formed. Changes can be made.
  • the fluorine-containing modified pyrimidine base of the present invention has the following formula (I): (However, in the formula (I), R is a fluorine atom, A C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms, or Monocyclic, bicyclic or tricyclic substituted with one or more hydrogen atoms by fluorine atoms or C1-C4 fluoroalkyl groups in which one or more hydrogen atoms are replaced by fluorine atoms A fluoroaryl group, R1 represents a phosphate group formed integrally with O bonded to R1 in the formula (I); R2 represents a hydroxyl group, R3 is hydrogen or a hydroxyl group) Is a base moiety of a modified pyrimidine nucleotide represented by the following formula (III): (However, in the formula (III), R is a fluorine atom,
  • a C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are substituted with a fluorine atom can be used as the R group.
  • this fluoroalkyl group for example, the following formula: -C n H 2n + 1-m F m (Where n is an integer from 1 to 4, m is an integer from 1 and 2n + 1-m is an integer from 0 to 0) It is group represented by these.
  • fluoroalkyl group examples include —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , and —C (CF 3 ) 3. Particularly preferred is —CF 3 or —C (CF 3 ) 3 .
  • R group one or more hydrogen atoms are substituted with a fluorine atom, or a C1-C4 fluoroalkyl group in which one or more hydrogen atoms are substituted with a fluorine atom
  • Monocyclic, bicyclic or tricyclic fluoroaryl groups can be used.
  • the fluoroaryl group include a fluorophenyl group or fluoronaphthyl in which one or more hydrogen atoms are substituted with a fluorine atom, —CF 3 , —CH 2 —CF 3 , or —C (CF 3 ) 3.
  • Groups can be used.
  • 3,5-bis (trifluoromethyl) phenyl group (However, the dotted line in the above structural formula represents the position of the free radical) Can be used.
  • [Photoresponsive base] As the photoresponsive base having a photocrosslinkable vinyl structure, the following formula (II): (In the formula (II), R11 is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen; R12 and R13 are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, a C2-C7 alkoxycarbonyl group, or hydrogen; R1 represents a phosphate group formed integrally with O bonded to R1 in the formula (I); R2 represents a hydroxyl group, R3 is hydrogen or a hydroxyl group)
  • Patent Document 1 International Publication No. 2009/066447.
  • R11 in formula (II) is a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, preferably a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or Hydrogen, and more preferably a cyano group, an amide group, a carboxyl group, or an alkoxycarbonyl group.
  • the alkoxycarbonyl group is preferably C2 to C7, more preferably C2 to C6, more preferably C2 to C5, more preferably C2 to C4, still more preferably C2 to C3, and particularly preferably C2. it can.
  • R12 and R13 in formula (II) are each independently a cyano group, an amide group, a carboxyl group, an alkoxycarbonyl group, or hydrogen, preferably a cyano group, an amide group, a carboxyl group.
  • the alkoxycarbonyl group is preferably C2 to C7, more preferably C2 to C6, more preferably C2 to C5, more preferably C2 to C4, still more preferably C2 to C3, and particularly preferably C2. it can.
  • Photocrosslinking can be formed between the photoresponsive base having the photocrosslinkable vinyl structure and the fluorine-containing modified pyrimidine base. That is, the fluorine-containing modified pyrimidine base and the photoresponsive modified nucleotide in a photocrosslinkable nucleic acid into which the modified pyrimidine nucleotide has been introduced by phosphodiester linkage are introduced by phosphodiester linkage.
  • a photocrosslink can be formed between the photoresponsive base in the photoresponsive nucleic acid. According to the present invention, this structural change can be detected as a change in 19 F chemical shift by the nuclear magnetic resonance method.
  • the photocrosslinking between the photoresponsive base and the fluorine-containing modified pyrimidine base is performed by complementation of the base sequence containing the photoresponsive base and the base sequence containing the fluorine-containing modified pyrimidine base prior to light irradiation.
  • the photocrosslinking reaction is arranged so as to be able to proceed, and by receiving light irradiation in that state, the photoreaction suitably proceeds to form.
  • conditions for duplex formation conditions and means known to those skilled in the art can be used as conditions and means for nucleic acid duplex formation.
  • the base sequence containing the photoresponsive base in the base sequence of the photoresponsive nucleic acid containing the photoresponsive base is a complementary base sequence.
  • the photoresponsive base sequence and the complementary base sequence are complementary so that a double-stranded region can be formed, provided that they are complementary to the photoresponsive base.
  • the base since the artificial base having a vinylcarbazole structure does not form a complementary hydrogen bond, various bases can be selected without particular limitation.
  • the photoresponsive nucleic acid containing a photoresponsive base and the photocrosslinkable nucleic acid containing a fluorine-containing modified pyrimidine base may be the same nucleic acid molecule, in which case the photoresponsive Self-crosslinking can be formed by taking a double-stranded structure in the self molecule by a base sequence containing a functional base and a base sequence containing a fluorine-containing modified pyrimidine base, and this structural change is determined by nuclear magnetic resonance. It can be detected as a change in 19 F chemical shift.
  • the photoreaction for photocrosslinking conventionally known photocrosslinking formation conditions for the photoresponsive base can be used.
  • the light irradiated for photocrosslinking is preferably light having a wavelength of generally 350 to 380 nm, preferably 360 to 370 nm, more preferably 366 nm, particularly preferably a single wavelength laser of 366 nm.
  • the light irradiation time may be several seconds, for example, 1 to 9 seconds, 1 to 7 seconds, 1 to 5 seconds, or 1 to 3 seconds. it can.
  • various conditions can be widely used also about a solvent etc. including use of aqueous solution, a buffer solution, physiological pH, and salt concentration.
  • photocrosslinks are reversible. That is, after photocrosslinking by light irradiation, photocleavage can be further performed by light irradiation.
  • the light irradiated for photocleavage for example, light including a wavelength in the range of 330 to 370 nm can be used, for example, a single wavelength laser beam of 366 nm can be used, or, for example, Light including a wavelength in the range of 300 to 330 nm can be used, for example, light having a wavelength of 312 nm can be used.
  • ⁇ ppm in this case is 0.15 ppm
  • the change in 19 F chemical shift of this application is 50 times or more.
  • the change of 19 F chemical shift of this application is 2.0 ppm or more, 3.0 ppm or more, 4.0 ppm or more, 5.0 ppm or more, 6.0 ppm or more, 7.0 ppm or more, 8.0 ppm or more, for example, 50 ppm or less, 40 ppm or less, 30 ppm or less, 20 ppm or less, 15 ppm or less.
  • FIG. 1 is a diagram showing a modified PAGE result comparing the photoreactivity of T and TFT .
  • lane M 10DNA ladder marker
  • lanes 1-5 If the target base is T, then Lane 6 to 10: if the target base is CN T, respectively the light irradiation time 0 s (seconds), 0. 1s, 0.5s, 1s, 2s.
  • FIG. 2 (A) is an HPLC analysis of the cross-linking reaction between CNV K and TFT .
  • the horizontal axis represents retention time (minutes), and shows charts for light irradiation times of 0 s (seconds), 0.1 s, 0.5 s, 1 s, 2 s, and 5 s.
  • FIG. 2 (B) is a comparison of the photoreactive of ODN2 (T) and ODN3 (TF T).
  • the horizontal axis represents the light irradiation time (seconds), and the vertical axis represents the photocrosslinking rate (%).
  • the upper curve of the graph represents the case where the target base is T
  • the lower curve of the graph represents the case where the target base is TFT .
  • Photo-crosslinking reaction results TF T and CNV K in HPLC analysis lower than T, that photocrosslinking reaction proceeds was confirmed in 1 of a rate of about 4 minutes.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating a change in chemical shift associated with photocrosslinking.
  • FIG. 3A shows the change in 19 F-NMR spectrum with the light irradiation time. The chart is shown for each of the light irradiation times of 0 s (seconds), 1 s, 2 s, 5 s, 10 s, and 20 s.
  • FIG. 3B shows an HPLC chart corresponding to each NMR sample. The horizontal axis represents retention time (minutes), and shows charts for light irradiation times of 0 s (seconds), 1 s, 2 s, 5 s, 10 s, and 20 s.
  • the peak of fluorine can be confirmed around -63.2 ppm.
  • a peak around ⁇ 71.2 ppm appears.
  • the peak around -63.2 ppm disappears and only the peak at -71.2 ppm is obtained.
  • HPLC HPLC
  • FIG. 4 is a graph showing the correlation between the ratio of the peak shifted by NMR and the photocrosslinking rate determined from the amount of decrease in peak by HPLC. From the fact that the photocrosslinking rates determined from the NMR analysis and the HPLC analysis are consistent, the change in chemical shift that can be confirmed is considered to be due to the change in the environment around CF 3 due to photocrosslinking.
  • FIG. 5 is a diagram showing a modified PAGE result in which cleavage by 312 nm light irradiation was confirmed. Result of modified PAGE, by light irradiation 312nm in the heating conditions, cleavage of the photocrosslinking of TF T and CNV K was confirmed. Although the cleaving speed is a little slower than T, the gel results confirmed that the cleaving was performed by light irradiation for 30 minutes.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of reversible F-NMR chemical shift changes associated with the photocrosslinking reaction. It was confirmed that the chemical shift was changed to -71.2 ppm by irradiation with light of 366 nm at 4 ° C. and changed to -63.2 ppm by irradiation with light of 312 nm at 60 ° C. Furthermore, the chemical shift was changed to ⁇ 71.2 ppm by irradiation with light of 366 nm at 4 ° C. From these results, it was shown that the chemical shift can be reversibly manipulated by irradiation with light at 366 nm and 312 nm, and imaging can be performed using this.
  • Nucleic acids have not only a normal B-type double helix, but also a higher-order structure formed under conditions where a specific sequence exists. They can also be used as aptamers of small molecules. Conformation for structural changes greatly compared to conventional double helix, experiments were conducted thought that is capable of imaging by chemical shift with TF T.
  • the targeting is an array that has been reported as a thrombin aptamer, an experiment was conducted using sequence ODN4 obtained by replacing T in TF T. It takes a G-quadruplex structure in the presence of potassium ions. This change will be described with reference to FIG.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram showing sensing of potassium ions by a thrombin aptamer. 20 ⁇ M ODN was measured by 19F-NMR in 10 mM Tris-HCl. The internal standard was 10 ⁇ M TFA, 10% D 2 O. The NMR measurement results are shown in FIG.
  • FIG. 8 is a diagram showing changes in NMR peaks due to the addition of potassium ions.
  • a peak was confirmed at -63.1 ppm before adding potassium ions. This is a peak in a single-stranded state.
  • 50 mM of KCl was added, a new peak was confirmed at -64.0 ppm. This peak is considered to be a peak derived from G-quadruplex only in the presence of potassium ions.
  • the concentration of KCl is sufficiently increased, all ODNs form a G-quadruplex structure and only have a peak of ⁇ 64.0 ppm. From this result, sensing of potassium ions by introducing TF T to the aptamer sequence can be read from a change in the chemical shift.
  • Sensing structures according to the chemical shift with TF T is a technique for realizing a sensing potassium ions, it does not involve photocrosslinking.
  • This technique can be grasped as the following invention (1).
  • a modified pyrimidine nucleotide represented by formula I is introduced into a nucleic acid aptamer and used to bind the nucleic acid aptamer and a ligand, resulting in a 19 F chemical shift detectable by nuclear magnetic resonance in comparison before and after binding. How to make.
  • the nucleic acid aptamer has an aptamer sequence capable of binding potassium ions and a modified pyrimidine nucleotide represented by formula I in the sequence, The method according to any one of (1) to (2), wherein the ligand is potassium ion.
  • the method according to (3) which is a method for detecting potassium ions by 19 F chemical shift in a nuclear magnetic resonance method.
  • the formation of a photocrosslink by a photoresponsive base can be detected by 19 F chemical shift by a nuclear magnetic resonance method.
  • the present invention is industrially useful.

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Abstract

　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基である）に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法によって、　光応答性塩基によって形成される光架橋を検出するための、生体内での計測に適した、高感度な検出手段を提供する。

Description

光架橋形成によって１９Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法
　本発明は、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法に関する。
　核酸の塩基配列の検出は、生命工学のあらゆる分野で使用される基本的な技術である。核酸の相補性による塩基配列の検出に特に有用であり、生命工学のあらゆる分野で使用可能な基本的な技術に、核酸の架橋技術がある。
　核酸の光架橋技術として、本発明者の研究グループによって、光応答性塩基が開発され、特許出願が行われている（特許文献１）。この技術によれば、例えば、相補性による二重鎖の形成とそれに続く光架橋によって、所望の塩基配列の核酸を高感度に検出することができる。この検出には、例えば、蛍光標識、発色酵素標識などの手段が、適宜使用される。しかし、これらの手段は、生体内での計測には、必ずしも適したものではない。
　生体内の様々な情報を得る手段の一つとして、ＮＭＲ、ＭＲＩなど、核磁気共鳴法を用いたイメージング技術が挙げられる。核磁気共鳴法のターゲットとなる原子（分子）は主に1Ｈであり、水が生体内に多く存在し高い強度が得られることに由来する。核磁気共鳴法のターゲットとなるその他の原子としては、19Ｆ（フッ素１９）が研究されている。フッ素１９は天然存在比がほぼ１００％であること、生体内にほとんど存在しないことなどが、利点として挙げられる。
国際公開第２００９／０６６４４７号
　したがって、本発明の目的は、光応答性塩基によって形成される光架橋を検出するための、生体内での計測に適した、高感度な検出手段を、提供することにある。
　本発明者は、鋭意研究の結果、光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、19Ｆ（フッ素１９原子）含有置換基に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用して、光応答性塩基との光架橋を光照射によって光架橋を形成させると、顕著な19Ｆケミカルシフトの変化が生じることを見いだして、本発明に到達した。
　19Ｆをターゲットとした核磁気共鳴法は、従来から研究されていたが、イメージング可能なほどに十分なケミカルシフトの変化を得ることは困難であったところ、本発明者は、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用すると、これが通常のＴ又はＵと同様に光架橋可能であること、そして、光架橋の結果として、大きな19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることを見いだして、本発明に到達したものである。
　したがって、本発明は、次の（１）～にある。
（１）
　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基
（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、
　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、
　又は、
　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、
　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。
（２）
　フッ素含有修飾ピリミジン塩基が、
　次の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （ただし、式（Ｉ）において、
　Ｒは、フッ素原子、
　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
　Ｒ２は、水酸基を表し、
　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、
　光架橋が、
　上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、
　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基との間に形成される光架橋である、（１）に記載の方法。
（３）
　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、
　次の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
　Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
　Ｒ２は、水酸基を表し、
　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分であり、
　光架橋が、
　上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基と、
　被光架橋性核酸中のフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に形成される光架橋である、（２）に記載の方法。
（４）
　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
　－ＣnＨ2n+1-mＦm　
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
　－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（６）
　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
　１個以上の水素原子が、フッ素原子、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（７）
　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
　３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
　さらに、本発明は、次の（１１）～にある。
（１１）
　（１）～（７）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋を製造する方法。
（１２）
　（１）～（７）のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋された核酸を製造する方法。
（１３）
　（１）～（７）のいずれかに記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって、検出する方法。
（１４）
　光架橋が、
　光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成によって、光架橋可能に配置されて形成された光架橋である、（３）～（７）のいずれかに記載の方法。
（１５）
　（１４）に記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって検出することによって、
　光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成を検出する方法。
　さらに、本発明は、次の（２１）～にある。
（２１）
　次の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （ただし、式（Ｉ）において、
　Ｒは、フッ素原子、
　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
　Ｒ２は、水酸基を表し、
　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸からなる、光架橋形成検出剤。
（２２）
　光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、（２１）に記載の光架橋形成検出剤。
（２３）
　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
　－ＣnＨ2n+1-mＦm　
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
である、（２１）～（２２）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２４）
　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
　－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、（２１）～（２３）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２５）
　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
　１個以上の水素原子が、フッ素原子、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、（２１）～（２４）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
（２６）
　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
　３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、（２１）～（２４）のいずれかに記載の光架橋形成検出剤。
　さらに、本発明は、次の（３１）～にある。
（３１）
　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
　式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とを、
　ハイブリダイズさせる工程、
　ハイブリダイズさせた被光架橋性核酸と光応答性核酸に、光照射する工程、
を含む、光架橋された核酸を製造する方法。
（３２）
　（３１）に記載の方法によって製造された、
　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
　式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とが、
　光架橋されてなる、光架橋された核酸。
　本発明によれば、光応答性塩基による光架橋の形成を、核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトによって、検出することができる。この核磁気共鳴法による検出は、生体内の三次元イメージングに特に適しており、時間的にある時点のスナップショットを撮影することにも特に適しているので、光応答性核酸を使用した所望の相補的核酸配列の検出を、生体内の三次元リアルタイムスナップショット映像によって行うという、医療的に価値の高い新しい応用を実現するものである。
図１は、ＴとTFＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。 図２は、CNVＫとTFＴのクロスリンク反応のＨＰＬＣ解析（Ａ）、及びＯＤＮ２（Ｔ）とＯＤＮ３（TFＴ）の光反応性の比較（Ｂ）を示すグラフである。 図３は、光架橋に伴うケミカルシフトの変化を表す図である。 図４は、ＮＭＲのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのピークの減少量から求めた光架橋率の相関を示すグラフである。 図５は、３１２ｎｍの光照射による開裂を確認した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。 図６は、光架橋反応に伴う可逆的なＦ－ＮＭＲケミカルシフトの変化の結果を示す図である。 図７は、トロンビンアプタマーによるカリウムイオンのセンシングを示す説明図である。 図８は、カリウムイオンの添加によるＮＭＲピークの変化を示す図である。
　具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［光架橋形成によるケミカルシフトの変化］
　本発明によれば、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基（ただし、Ｒ基は、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基である）に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせることができる。
［フッ素含有修飾ピリミジン塩基］
　本発明のフッ素含有修飾ピリミジン塩基は、次の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （ただし、式（Ｉ）において、
　Ｒは、フッ素原子、
　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
　Ｒ２は、水酸基を表し、
　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、次の式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （ただし、式（ＩＩＩ）において、
　Ｒは、フッ素原子、
　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
で表されるチミン誘導体である。
［フルオロアルキル基］
　好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基を使用することができる。このフルオロアルキル基としては、例えば、次の式：
　　－ＣnＨ2n+1-mＦm　
（ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
で表される基である。
　好ましいフルオロアルキル基としては、例えば、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、－Ｃ（ＣＦ3）3を挙げることができ、特に－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3が好ましい。
［フルオロアリール基］
　好適な実施の態様において、上記Ｒ基として、１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基を使用することができる。このフルオロアリール基としては、例えば、１個以上の水素原子が、フッ素原子、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基を使用することができる。
　好ましいフルオロアリール基としては、３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル基：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （ただし、上記構造式中の点線は、遊離基の位置を表す）
を使用することができる。
［光応答性塩基］
　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基としては、次の式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
　Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
　Ｒ２は、水酸基を表し、
　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分を挙げることができ、このビニルカルバゾール構造を有する人工塩基は、特許文献１（国際公開第２００９／０６６４４７号）に開示されているものである。
　好適な実施の態様において、式（ＩＩ）のＲ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２～Ｃ７、さらに好ましくはＣ２～Ｃ６、さらに好ましくはＣ２～Ｃ５、さらに好ましくはＣ２～Ｃ４、さらに好ましくはＣ２～Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
　好適な実施の態様において、式（ＩＩ）のＲ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２～Ｃ７、さらに好ましくはＣ２～Ｃ６、さらに好ましくはＣ２～Ｃ５、さらに好ましくはＣ２～Ｃ４、さらに好ましくはＣ２～Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
［光架橋の形成］
　上記の光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基との間には、光架橋を形成することができる。すなわち、上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基との間には、光架橋を形成することができる。本発明によれば、この構造変化を核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトの変化として検出することができる。
［光架橋形成のための二重鎖形成］
　光応答性塩基と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基との間の光架橋は、光照射に先立って、光応答性塩基を含む塩基配列と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む塩基配列とが、その相補性によって二重鎖を形成して、光架橋反応が進行可能に配置されて、その状態で光照射を受けることによって、光反応が好適に進行して、形成される。二重鎖形成の条件としては、核酸の二重鎖形成の条件及び手段として、当業者に公知の条件及び手段を使用することができる。そこで、好適な実施の態様において、光応答性塩基を含む光応答性核酸の塩基配列中の光応答性塩基を含む塩基配列に対して、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む被光架橋性核酸中の塩基配列は、相補的な塩基配列である。好適な実施の態様において、光応答性塩基配列と、相補的塩基配列とは、二重鎖の領域を形成できるよう相補性を有しており、ただし、光応答性塩基と相補的位置にある塩基については、ビニルカルバゾール構造を有する人工塩基が相補的な水素結合を形成しない構造であることから、特に制限なく、種々の塩基を選択することができる。
　好適な実施の対応において、光応答性塩基を含む光応答性核酸と、フッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む被光架橋性核酸とが、同じ核酸分子であってもよく、この場合には、光応答性塩基を含む塩基配列とフッ素含有修飾ピリミジン塩基を含む塩基配列とによって、自己の分子中に二重鎖構造をとって、自己架橋を形成させることができ、この構造変化を核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトの変化として検出することができる。
［光反応の条件］
　光架橋のための光反応には、上記光応答性塩基について従来から知られている光架橋形成の条件を使用することができる。例えば、光架橋のために照射される光は、一般に３５０～３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６０～３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。光照射時間は、数秒間、例えば、１～９秒間、１～７秒間、１～５秒間、又は１～３秒間の時間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を形成することができる。そして、光反応であることから、溶媒等についても、水溶液、緩衝液、生理的ｐＨや塩濃度の使用を含めて、種々の条件を広く使用することができる。
　また、上記の光架橋の形成は、可逆的なものである。すなわち、光照射によって光架橋した後に、さらに光照射によって光開裂をすることができる。光開裂のために照射される光は、例えば、３３０～３７０ｎｍの範囲の波長を含む光を使用することができ、例えば、３６６ｎｍの単波長のレーザー光を使用することができ、あるいは、例えば、３００～３３０ｎｍの範囲の波長を含む光を使用することができ、例えば、３１２ｎｍの波長の光を使用することができる。
［19Ｆケミカルシフト］
　光架橋によって生じた19Ｆケミカルシフトの変化は、核磁気共鳴法によって検出することができる。このために使用可能な手段、条件、装置等としては、公知の手段、条件、装置等を使用することができる。本発明によって生じる19Ｆケミカルシフトの変化は、従来技術による各種プローブでの19Ｆケミカルシフトの変化よりも、大きなものであるために、本発明は、高感度の19Ｆケミカルシフトイメージングを可能にするものとなっている。例えば、カリウムイオンを中心としてＧｕａｎｉｎｅ　Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ（グアニン四重鎖構造）として知られるＤＮＡの高次構造をとらせることによって、ＤＮＡに結合させた19Ｆのケミカルシフトの変化を研究した報告があるが、従来のプローブによれば、この場合のΔｐｐｍは、０．１５ｐｐｍとされており、本願の19Ｆケミカルシフトの変化はこの５０倍以上にあたる。本願の19Ｆケミカルシフトの変化は、例えば、２．０ｐｐｍ以上、３．０ｐｐｍ以上、４．０ｐｐｍ以上、５．０ｐｐｍ以上、６．０ｐｐｍ以上、７．０ｐｐｍ以上、８．０ｐｐｍ以上であり、例えば、５０ｐｐｍ以下、４０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、２０ｐｐｍ以下、１５ｐｐｍ以下である。
［19Ｆケミカルシフトの可逆性］
　上記光架橋の形成は、可逆的なものであり、この可逆的な光架橋の形成に伴って、19Ｆケミカルシフトもまた、可逆的に変化する。したがって、19Ｆケミカルシフトの変化による光架橋の検出と、これを利用した二重鎖形成の検出は、その可逆性を利用して、同じプローブ分子（被光架橋性核酸）によって、繰り返し行うことができる。
　実施例をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる実施例に限定されるものではない。
［CNVＫ含有ＯＤＮとTFＴ含有ＯＤＮの合成］
研究室で合成した光応答性人工核酸３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（CNVＫ）のアミダイト体、Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（TFＴ）（5-trifluoromethyl-2’-deoxyuridine）のアミダイト体をアセトニトリルで１００ｍＭに調整し、ＡＢＩ３４００にてＯＤＮを合成した。合成したＯＤＮ配列は下記表１に示す。合成後、CNVＫ含有ＯＤＮは２８％アンモニア水を用いて５５℃で８時間脱保護を行った。TFＴ含有ＯＤＮは５０ｍＭ　Ｋ2ＣＯ3　メタノール溶液を用いて室温で４時間脱保護を行った。その後、ＨＰＬＣにて精製を行い、質量分析により目的配列であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［CNVＫとCNＴの光反応性の解析］
　２０μＭ　ＯＤＮ１と２０μＭ　ＯＤＮ２もしくは２０μＭ　ＯＤＮ３をｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　カコジル酸ナトリウム）中で９０℃で５分間加熱した後、ゆっくり４℃までアニーリングを行った。その後、ＵＶ－ＬＥＤ照射機を用い、３６６ｎｍのＵＶ照射を４℃で行い、光照射による光架橋体の確認を変性ＰＡＧＥにより解析した。この結果を図１に示す。
　図１は、ＴとTFＴの光反応性を比較した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。図１において、レーンＭ：１０ＤＮＡラダーマーカー、レーン１～５：ターゲット塩基がＴの場合、レーン６～１０：ターゲット塩基がCNＴの場合であり、光照射時間はそれぞれ０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓである。
　ターゲット塩基がＴの場合には、１秒の光照射で原料となる９ｍｅｒのバンドがほぼ消失している。一方、ターゲットがTFＴの場合には２秒の光照射で原料のバンドが消失していた。この結果よりTFＴはCNVＫとの光架橋反応が、ほぼＴと同様に進行することがわかった。質量分析の結果からもＯＤＮ１とＯＤＮ３の架橋体のピークが得られている。
［TFＴとCNVＫの光架橋反応速度の解析］
　次にTFＴとCNVＫの光架橋反応がどれくらいの速度で進行するのかをＨＰＬＣ解析より求めた。この結果を、図２に示す。
　図２の（Ａ）は、CNVＫとTFＴのクロスリンク反応のＨＰＬＣ解析である。横軸はリテンション時間（分）を表し、光照射時間０ｓ（秒）、０．１ｓ、０．５ｓ、１ｓ、２ｓ、５ｓのそれぞれについてのチャートを示している。図２の（Ｂ）はＯＤＮ２（Ｔ）とＯＤＮ３（TFＴ）の光反応性の比較である。横軸は光照射時間（秒）を表し、縦軸は光架橋率（％）を表す。グラフの上側の曲線がターゲット塩基がＴの場合を表し、グラフの下側の曲線がターゲット塩基がTFＴの場合を表す。
　ＨＰＬＣ解析の結果TFＴとCNVＫの光架橋反応はＴよりも遅く、約４分の１の速度で光架橋反応が進行していることが確認された。
［19Ｆ－ＮＭＲ測定］
　次に光架橋前後での１９Ｆ－ＮＭＲ測定を行い、光架橋による［２＋２］光環化反応に伴うＣＦ3基の周辺環境の変化によるケミカルシフトの変化の確認を行った。
　19Ｆ－ＮＭＲ測定は２０μＭ　ＯＤＮを１００ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ中で測定を行った。内部標準として１０μＭ　ＴＦＡ、１０％　Ｄ2Ｏとした。光照射時間を延ばしていき、その変化をＮＭＲとＨＰＬＣにより解析した。この結果を、図３に示す。
　図３は、光架橋に伴うケミカルシフトの変化を表す図である。図３の（Ａ）は、光照射時間による19Ｆ－ＮＭＲスペクトルの変化を表す。光照射時間０ｓ（秒）、１ｓ、２ｓ、５ｓ、１０ｓ、２０ｓのそれぞれについてのチャートを示している。図３の（Ｂ）は、各ＮＭＲサンプルに対応したＨＰＬＣチャートを表す。横軸はリテンション時間（分）を表し、光照射時間０ｓ（秒）、１ｓ、２ｓ、５ｓ、１０ｓ、２０ｓのそれぞれについてのチャートを示している。
　まず、光架橋を行っていないサンプルではフッ素のピークが－６３．２ｐｐｍ付近に確認できる。その状態から光照射時間を延ばしていくに従って－７１．２ｐｐｍ付近のピークが現れる。最終的には－６３．２ｐｐｍ付近のピークが消え、－７１．２ｐｐｍのピークのみになる。この変化をＨＰＬＣで解析するとTFＴ含有のピークが減少し、クロスリンク体のピークが増加していることが確認された。ＮＭＲでのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのTFＴ含有ＯＤＮの減少率から求めた光架橋率をプロットしたところ、図４の様になった。
　図４は、ＮＭＲのシフトしたピークの割合とＨＰＬＣでのピークの減少量から求めた光架橋率の相関を示すグラフである。ＮＭＲ解析、ＨＰＬＣ解析から求めた光架橋率が一致していることより、確認できているケミカルシフトの変化は光架橋によるＣＦ3周辺の環境が変化したためだと考えられる。
［光照射による開裂（変性ＰＡＧＥ）］
　次に３１２ｎｍの光照射による開裂実験を行った。３１２ｎｍの各光照射時間でサンプリングし、変性ＰＡＧＥによる解析を行った。この結果を、次の図５に示す。
　図５は、３１２ｎｍの光照射による開裂を確認した変性ＰＡＧＥ結果を示す図である。変性ＰＡＧＥの結果、加熱条件下での３１２ｎｍの光照射によって、TFＴとCNVＫの光架橋体の開裂が確認された。Ｔと比較すると開裂のスピードは少し遅いものの、ゲル結果から、３０分の光照射で開裂していることが確認された。
［光照射による開裂（19Ｆ－ＮＭＲ測定）］
　CNVＫとTFＴの光架橋もＴの場合と同様に３６６ｎｍで架橋、３１２ｎｍで開裂という操作が可能であるため、それを１９Ｆ－ＮＭＲのケミカルシフトにより読み取ることが可能かどうかを１９Ｆ－ＮＭＲにより確認した。この結果を、次の図６に示す。
　図６は、光架橋反応に伴う可逆的なＦ－ＮＭＲケミカルシフトの変化の結果を示す図である。
４℃で３６６ｎｍの光照射によりケミカルシフトは－７１．２ｐｐｍに変化し、６０℃で３１２ｎｍの光照射により－６３．２ｐｐｍに変化していることが確認できた。さらに４℃で３６６ｎｍの光照射によりケミカルシフトは－７１．２ｐｐｍに変化した。これらの結果より、３６６ｎｍと３１２ｎｍの光照射によりケミカルシフトの変化が可逆的に操作可能であること、これを利用してイメージングが可能であることが示された。
［TFＴを用いたケミカルシフトによる構造のセンシング技術］
　核酸には通常のＢ型の二重螺旋だけでなく、特定の配列が存在する条件下での形成する高次構造が存在する。それらは小分子のアプタマーなどとしても利用可能である。高次構造は通常の二重螺旋と比較して構造が大きく変化するために、TFＴを用いたケミカルシフトによるイメージングが可能ではないかと考え実験を行った。
　ターゲットとしたのはトロンビンアプタマーとして報告されている配列であり、ＴをTFＴに置換した配列ＯＤＮ４を用いて実験を行った。カリウムイオン存在下でＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を取るというものである。この変化を、次の図７で説明する。
　図７は、トロンビンアプタマーによるカリウムイオンのセンシングを示す説明図である。２０μＭ　ＯＤＮを１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中で１９Ｆ－ＮＭＲで測定を行った。内部標準として１０μＭ　ＴＦＡ、１０％Ｄ2Ｏとした。ＮＭＲ測定結果を図８に示す。
　図８は、カリウムイオンの添加によるＮＭＲピークの変化を示す図である。１９－ＮＭＲ測定の結果、カリウムイオンを加える前では、－６３．１ｐｐｍにピークが確認できた。これが１本鎖状態のピークである。次にＫＣｌを５０ｍＭ加えた際に－６４．０ｐｐｍに新たなピークが確認できた。このピークがカリウムイオン存在下でのみとるＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ由来のピークだと考えられる。最終的にＫＣｌの濃度を十分に挙げるとすべてのＯＤＮがＧ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を形成し、－６４．０ｐｐｍのピークのみとなる。この結果から、TFＴをアプタマー配列に導入することによってカリウムイオンのセンシングがケミカルシフトの変化から読み取ることが可能である。
　TFＴを用いたケミカルシフトによる構造のセンシング技術は、カリウムイオンのセンシングを実現する技術であり、光架橋を伴うものではない。この技術は、次の（１）以下のような発明として、把握することができる。
（１）
　核酸アプタマーに、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを導入して使用し、核酸アプタマーとリガンドとを結合させて、結合の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトを生じさせる方法。
（２）
　核酸アプタマーに、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを導入して使用し、核酸アプタマーとリガンドとの結合を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトによって検出する方法。
（３）
　核酸アプタマーが、カリウムイオン結合可能なアプタマー配列と、式Ｉで表される修飾ピリミジンヌクレオチドを配列中に有し、
　リガンドがカリウムイオンである、（１）～（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
　核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトによって、カリウムイオンを検出する方法である、（３）に記載の方法。
（５）
　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが導入された核酸アプタマー。
（６）
　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが核酸アプタマーに導入されてなる、アプタマーリガンド検出剤。
（７）
　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドが、カリウムイオン結合可能なアプタマー配列を有する核酸アプタマーに導入されてなる、カリウムイオン検出剤。
　本発明によれば、光応答性塩基による光架橋の形成を、核磁気共鳴法による19Ｆケミカルシフトによって、検出することができる。本発明は産業上有用な発明である。

Claims (15)

  1. 　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基に対して光架橋可能なチミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）の塩基の、ピリミジン環の５位を、Ｒ基
    （ただし、Ｒ基は、フッ素原子、
    　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、
    　又は、
    　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基である）
    に置換したフッ素含有修飾ピリミジン塩基を使用することによって、
    　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基と、光架橋可能なフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に光架橋を形成させて、光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる方法。
  2. 　フッ素含有修飾ピリミジン塩基が、
    　次の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ただし、式（Ｉ）において、
    　Ｒは、フッ素原子、
    　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
    　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
    　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
    　Ｒ２は、水酸基を表し、
    　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
    で表される修飾ピリミジンヌクレオチドの塩基部分であり、
    　光架橋が、
    　上記修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸中の、上記フッ素含有修飾ピリミジン塩基と、
    　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基との間に形成される光架橋である、請求項１に記載の方法。
  3. 　光架橋性のビニル構造を有する光応答性塩基が、
    　次の式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ただし、式（ＩＩ）中、Ｒ１１は、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
    　Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２～Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
    　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
    　Ｒ２は、水酸基を表し、
    　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
    で表される光応答性修飾ヌクレオチドの塩基部分であり、
    　光架橋が、
    　上記光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸中の、上記光応答性塩基と、
    　被光架橋性核酸中のフッ素含有修飾ピリミジン塩基との間に形成される光架橋である、請求項２に記載の方法。
  4. 　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
    　－ＣnＨ2n+1-mＦm　
    （ただし、ｎは１以上４以下の整数、ｍは１以上の整数、２ｎ＋１－ｍは０以上の整数である）
    である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　Ｃ１～Ｃ４のフルオロアルキル基が、
    　－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  6. 　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
    　１個以上の水素原子が、フッ素原子、－ＣＦ3、－ＣＨ2－ＣＦ3、又は－Ｃ（ＣＦ3）3で置換された、フルオロフェニル基又はフルオロナフチル基である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  7. 　単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基が、
    　３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル基である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法によって、核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じた、光架橋を製造する方法。
  9. 　請求項１～７のいずれかに記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって、検出する方法。
  10. 　光架橋が、
    　光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成によって、光架橋可能に配置されて形成された光架橋である、請求項３～７のいずれかに記載の方法。
  11. 　請求項１０に記載の方法によって形成された光架橋を、核磁気共鳴法における19Ｆケミカルシフトの変化によって検出することによって、
    　光応答性核酸と被光架橋性核酸との間の二重鎖形成を検出する方法。
  12. 　次の式（Ｉ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （ただし、式（Ｉ）において、
    　Ｒは、フッ素原子、
    　　　　１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、又は、
    　　　　１個以上の水素原子が、フッ素原子、又は１個以上の水素原子がフッ素原子で置換されたＣ１～Ｃ４のフルオロアルキル基、で置換された、単環式、二環式又は三環式のフルオロアリール基であり、
    　Ｒ１は、式（Ｉ）でＲ１に結合しているＯと一体となって形成されたリン酸基を表し、
    　Ｒ２は、水酸基を表し、
    　Ｒ３は、水素又は水酸基である）
    で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸からなる、光架橋形成検出剤。
  13. 　光架橋形成の前後の比較において核磁気共鳴法によって検出可能な19Ｆケミカルシフトの変化を生じさせる、請求項１２に記載の光架橋形成検出剤。
  14. 　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
    　式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とを、
    　ハイブリダイズさせる工程、
    　ハイブリダイズさせた被光架橋性核酸と光応答性核酸に、光照射する工程、
    を含む、光架橋された核酸を製造する方法。
  15. 　請求項１４に記載の方法によって製造された、
    　式（Ｉ）で表される修飾ピリミジンヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる被光架橋性核酸と、
    　式（ＩＩ）で表される光応答性修飾ヌクレオチドがリン酸ジエステル結合して導入されてなる光応答性核酸とが、
    　光架橋されてなる、光架橋された核酸。
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