WO2019022158A1 - 可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ - Google Patents

可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ Download PDF

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WO2019022158A1
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group
formula
nucleic acid
ethyl
atom
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健造 藤本
中村　重孝
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国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
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    • C07H19/23—Heterocyclic radicals containing two or more heterocyclic rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, not provided for in groups C07H19/14 - C07H19/22
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    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a photoresponsive nucleotide analogue (photoresponsive nucleotide analog compound) having photocrosslinking (photocrosslinking) ability by light in the visible light range.
  • the basic techniques in the field of molecular biology include nucleic acid ligation and nucleic acid crosslinking.
  • the linking and crosslinking of nucleic acids are used, for example, for introducing a gene, detecting a base sequence in combination with hybridization, or, for example, for inhibiting gene expression. Therefore, techniques for linking and crosslinking nucleic acids are not limited to basic research in molecular biology but, for example, diagnostics and therapeutics in the medical field, or development and manufacture of therapeutic agents and diagnostic agents, enzymes in the industrial and agricultural fields It is an extremely important technology used for the development and production of microorganisms.
  • Patent Document 1 Photoligation technology using 5-cyanovinyl deoxyuridine as nucleic acid photoreaction technology
  • Patent Document 2 Patent No. 3753942
  • Patent Document 3 Patent No. 4814904
  • Patent Document 4 Patent No. 494031
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique for imparting heat resistance to a nanosheet consisting of oligo DNA by photocrosslinking of nucleic acid.
  • An object of the present invention is to provide a new photoreactive compound which can be used for the photoreaction technology of nucleic acid, and a photoreactive crosslinking agent using the photoreactive compound.
  • the present inventor has been keenly searching for a photoreactive compound that can be used as a photoreactive crosslinking agent for nucleic acid photoreaction technology, and a compound having a pyranocarbazole skeleton structure instead of the base portion of the nucleic acid base
  • the present invention has been achieved by finding that it becomes a photoreactive crosslinker that can be used for such a photoreaction technology of nucleic acid.
  • the compound according to the present invention has a characteristic pyranocarbazole structure and exhibits photocrosslinkability by this relatively small structure, so that it can be variously modified and used in various applications. Can. Furthermore, this characteristic structure of the compound according to the present invention can be used as an artificial base (artificial nucleobase) because it has a structure similar to that of a nucleic acid base. That is, the characteristic structure of the compound according to the present invention can be introduced as an artificial base to produce an artificial nucleoside (nucleoside analog) and an artificial nucleotide (nucleotide analog), and such an artificial nucleotide in the sequence Artificial nucleic acids (modified nucleic acids) can be produced.
  • a class can be used as a double helix optical crosslinker capable of specifically reacting to the desired sequence.
  • the photoreactive crosslinking agent according to the present invention is characterized in that it can be photocrosslinked by light irradiation with a longer wavelength than conventional, for example, light irradiation in the visible light region, derived from the characteristic pyranocarbazole structure Equipped with Therefore, the photoreactive crosslinker according to the present invention is particularly advantageous because it is photocrosslinkable by long wavelength light irradiation when it is desired to avoid damage to DNA and cells as much as possible.
  • the photoreactive compound of the present invention is to initiate a photoreaction upon irradiation with light, it emphasizes the meaning that a compound which has been stable up to that point starts a reaction in response to a signal of light irradiation. Photoreactivity is sometimes referred to as photoresponsiveness.
  • the present invention includes the following (1): (1) The compounds of the following formula I: (However, in Formula I, X is an oxygen atom or a sulfur atom, Each of R 1 and R 2 independently represents a hydrogen atom, a halogen atom, an —OH group, an amino group, a nitro group, a methyl group, a methyl fluoride group, an ethyl group, an ethyl fluoride group, and a C1 to C3 alkylsulfanyl group A group selected from the group consisting of Y is a hydrogen atom, a sugar (sugars include ribose and deoxyribose), a polysaccharide (polysaccharides include polyribose chain of nucleic acid and polydeoxyribose chain), polyether, polyol, polypeptide chain ( The polypeptide chain is a polypeptide chain of peptide nucleic acid) or a water-soluble synthetic polymer.
  • Y is a group represented by the following formula II: (However, in Formula II, R11 is a hydrogen atom or a hydroxyl group, R12 is a hydroxyl group or a -O-Q 1 group, R13 is a hydroxyl group or a -O-Q 2 group, Q 1 is A phosphate group formed integrally with O bonded to Q 1 ; A nucleotide, nucleic acid or peptide nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with O bound to Q 1 ; Protecting groups selected from: Trityl group, monomethoxytrityl group, dimethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, acetyl group, benzoyl group; A group selected from the group consisting of Q 2 is A phosphate
  • the present invention provides novel compounds that become photoreactive crosslinkers that can be used in the photoreaction technology of nucleic acids. This is due to the novel chemical structure which does not have a natural base structure. And, according to the compound of the present invention, since the photocrosslinking can be formed by the irradiation of light having a longer wavelength than the conventional photoreactive crosslinking agent, the adverse effect on the nucleic acid and cells by the irradiation of light can be minimized.
  • FIG. 1a is an explanatory view showing the flow of the photocrosslinking reaction.
  • FIG. 1 b is a chart of UPLC analysis when the light irradiation time is changed to 0 to 15 seconds.
  • FIG. 1 c is a graph created by calculating the photocrosslinking rate in each light irradiation time when the light irradiation time is changed to 0 to 15 seconds.
  • FIG. 2a is an explanatory view showing the flow of the photocrosslinking reaction.
  • FIG. 2 b is a chart of UPLC analysis when the light wavelength to be irradiated is changed to 450 to 550 nm.
  • FIG. 3a is an explanatory view showing the flow of the photocleavage reaction.
  • FIG. 1a is an explanatory view showing the flow of the photocrosslinking reaction.
  • FIG. 1 b is a chart of UPLC analysis when the light irradiation time is changed to 0 to 15 seconds.
  • FIG. 1 c is
  • FIG. 3 b is a chart of UPLC analysis when the light wavelength to be irradiated is changed to 320 to 340 nm.
  • FIG. 3 c is a graph showing the proportion (conversion rate%) of the photocrosslinker cleaved by light irradiation of each wavelength.
  • FIG. 4 is a graph comparing light irradiation time (seconds) at each wavelength with cell viability (%).
  • FIG. 5 is an explanatory view showing a flow of photocrosslinking reaction by SPC X.
  • FIG. 6 is a chart of analysis by UPLC of the photocrosslinking test by SPC X.
  • Compounds of the present invention include compounds represented by the following Formula I: (I)
  • X is an oxygen atom or a sulfur atom.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom, a halogen atom, an —OH group, an amino group, a nitro group, a methyl group, a methyl fluoride group, an ethyl group, an ethyl fluoride group, and C 1 to C 3 It is a group selected from the group consisting of an alkylsulfanyl group.
  • the halogen atom for example, atoms of Br, Cl, F and I can be mentioned.
  • the methyl fluoride group include -CH 2 F, -CHF 2 and -CF 3 .
  • fluorinated ethyl group for example, -CH 2 -CH 2 F, -CH 2 -CHF 2 , -CH 2 -CF 3 , -CHF-CH 3 , -CHF-CH 2 F, -CHF-CHF 2 ,- CHF-CF 3, -CF 2 -CH 3, -CF 2 -CH 2 F, -CF 2 -CHF 2, can be mentioned -CF 2 -CF 3.
  • C1 ⁇ C3 alkylsulfanyl group for example -CH 2 -SH group, -CH 2 -CH 2 -SH group, -CH (SH) -CH 3 group, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SH group And -CH 2 -CH (SH) -CH 3 group and -CH (SH) -CH 2 -CH 3 group.
  • R 1 and R 2 can each independently be a hydrogen atom, a halogen atom, an —NH 2 group, an —OH group, a —CH 3 group, preferably a hydrogen atom it can.
  • R1 can be a group as described above and R2 can be a hydrogen atom.
  • R 1 and R 2 are each independently, in the leftmost six-membered ring of formula I, the carbon atom to which the nitrogen atom is attached is numbered C1 and the carbon atom of the six-membered ring is clocked When C2 position, C3 position, C4 position, C4 position, C5 position and C6 position are sequentially numbered, it is to be a substituent of carbon atom at any position of C2 position, C3 position, C4 position and C5 position it can.
  • R1 and R2 can be substituents at the C3 and C4 positions, respectively.
  • R2 can be a hydrogen atom at C4 position while R1 is a substituent at C3 position.
  • Y is a hydrogen atom
  • a sugar include ribose and deoxyribose
  • a polysaccharide include polyribose chains of nucleic acids and polydeoxyribose chains
  • polyethers include polyols
  • the polypeptide chain (the polypeptide chain includes the polypeptide chain of peptide nucleic acid) or it can be a water soluble synthetic polymer.
  • the compound of formula I can be a compound of formula I ′ (Formula I ')
  • X is a group as described in formula I
  • R 1 is a group as described in formula I
  • Y is a group as described in formula I.
  • the compound of formula I can be a compound of formula I ′ ′ (Formula I ′ ′)
  • R 1 is the group described in formula I and Y is the group described in formula I.
  • the compound of formula I can be a compound of the following formula I ′ ′ ′: (Formula I ''')
  • R 1 is the group described in formula I and Y is the group described in formula I.
  • Y can be a hydrogen atom, in which case the compound of formula I is a compound of formula VI (VI)
  • X is a group as described in Formula I
  • R 1 and R 2 are groups as described in Formula I and are located at the positions as described in Formula I.
  • Y can be a hydrogen atom, in which case the compound of formula I ′ is a compound of the following formula VI ′: (VI ')
  • X is a group as described in formula I and R1 is a group as described in formula I.
  • Y can be a group represented by the following Formula II, wherein the compound of Formula I is a compound represented by the following Formula V: (II)
  • X is a group as described in formula I
  • R 1 and R 2 are groups as described in formula I and are located at the positions as described in formula I
  • R 11, R 12, R 13 are Are the groups described for
  • Y can be a group represented by Formula II above, wherein the compound of Formula I 'will be a compound represented by the following Formula V': (V ')
  • X is a group as described in formula I
  • R1 is a group as described in formula I
  • R11, R12, R13 are groups as described for formula II.
  • R 11 is a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 12 is a hydroxyl group or a —O—Q 1 group
  • R 13 is a hydroxyl group or a —O—Q 2 group.
  • the above Q 1 is A phosphate group formed integrally with O bonded to Q 1 ;
  • Protecting groups selected from: Trityl group, monomethoxytrityl group, dimethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, trimethylsilyl group, triethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, acetyl group, benzoyl group;
  • the above Q 2 is A phosphate group formed integrally with O bonded to Q 2 ;
  • the 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoramidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group to be the above-mentioned dialkyl groups can be C1 to C4 alkyl groups, respectively.
  • 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoroamidite group for example, 2-cyanoethyl-N, N-dimethyl phosphoroamidite group, 2-cyanoethyl-N, N-diethyl phosphoro group Mention may be made of an amidite group and 2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl phosphoramidite group.
  • the methyl phosphonic amidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group can each be a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group.
  • the ethyl phosphonamidite group has the following structure:
  • the R group and the R ′ group can each be a hydrogen atom or a C1-C4 alkyl group.
  • the oxazaphosphoridin group has the following structure:
  • the above structures also include substituents in which a hydrogen atom is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • the thiophosphite group has the following structure:
  • the above structures also include substituents in which a hydrogen atom is substituted by a C1-C4 alkyl group.
  • Q 1 can be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O attached to Q 1 .
  • Q 1 can be the above-mentioned protecting group, preferably dimethoxytrityl group, trityl group, monomethoxytrityl group, trimethoxytrityl group, and particularly preferably dimethoxytrityl group. It can be a trityl group.
  • Q 2 can be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O attached to Q 2 .
  • Q 2 can be a protecting group as described above, preferably 2-cyanoethyl-N, N-dialkyl (C1-C4) phosphoroamidite group, oxazaphosphoridine group, thio It can be a phosphite group, particularly preferably a 2-cyanoethyl-N, N-diisopropyl phosphoramidite group.
  • Y can be deoxyribose, ie it can be a group represented by the following formula III, wherein a compound of formula I is a compound of formula VII Nucleoside (deoxyribonucleoside) analogs that are
  • X is a group as described in Formula I
  • R 1 and R 2 are groups as described in Formula I and are located at the positions as described in Formula I.
  • Y can be deoxyribose, ie it can be a group represented by formula III above, wherein the compound of formula I ′ is a compound of formula VII ′
  • X is a group described in Formula I and R 1 is a group described in Formula I.
  • Y can be ribose, ie a group represented by the following formula IV, wherein a compound of formula I is represented by the following formula VIII Are nucleoside (ribonucleoside) analogs:
  • X is a group as described in Formula I
  • R 1 and R 2 are groups as described in Formula I and are located at the positions as described in Formula I.
  • Y can be ribose, ie, a group represented by formula IV above, wherein the compound of formula I ′ is a compound of formula VIII ′ Nucleoside (ribonucleoside) analogs that are represented:
  • X is a group as described in formula I and R1 is a group as described in formula I.
  • nucleoside (ribonucleoside) analogs represented by the above-mentioned Formula VII and Formula VIII have the following Formula Ib as a base moiety:
  • nucleoside analog is a group described in the formula I, and R 1 and R 2 are groups described in the formula I and located at the position described in the formula I.
  • Nucleoside (ribonucleoside) analogs represented by the above-mentioned Formula VII 'and Formula VIII' have the following Formula Ib ':
  • nucleoside analog (However, in Formula Ib ′, X is a group described in Formula I, and R 1 is a group described in Formula I.) It can be said that a nucleoside having a group represented by (nucleoside analog).
  • the present invention is also a nucleotide (nucleotide analog) having a group represented by the above-mentioned Formula Ib or Formula Ib 'as a base moiety. Furthermore, the present invention is also a nucleic acid (modified nucleic acid) or a peptide nucleic acid (modified peptide nucleic acid) having a group represented by the above-mentioned Formula Ib or Formula Ib 'as a base moiety.
  • Q 1 can be a phosphate group formed integrally with O bound to Q 1 and Q 2 can be a hydrogen atom. That is, the compound represented by the above formula I can be a photoresponsive artificial nucleotide analogue molecule having a characteristic structure.
  • Q 1 is a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed in conjunction with O attached to Q 1 , Q 2 being , A nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with O which binds Q 2 .
  • the compound represented by the above-mentioned formula I can be a modified nucleic acid or a modified oligonucleotide in which a photoresponsive artificial nucleotide analogue having a characteristic structure is incorporated into the sequence.
  • the photoresponsive modified nucleic acid and the photoresponsive modified oligonucleotide thus prepared may be collectively referred to as a photoresponsive modified nucleic acid.
  • a photoresponsive artificial nucleotide analogue having a characteristic structure may be located at the end of the sequence, in which case only one side of Q 1 or Q 2 It results in a modified nucleotide or modified nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together with O which binds Q 1 or Q 2 .
  • a peptide nucleic acid may be used in place of the above-described nucleic acid to form a light responsive modified peptide nucleic acid in which a light responsive artificial nucleotide analog having a characteristic structure is incorporated into the sequence.
  • the compounds according to the present invention do not have a base structure based on purine bases or pyrimidine bases which should be possessed by natural nucleosides and nucleotides in the formula I and the like. Nevertheless, the compounds according to the invention, when formed as single stranded modified nucleic acid, can form a double helix with the complementary single stranded nucleic acid. And, the pyranocarbazole moiety can form a crosslink by a photoreaction.
  • the Q 1 may be a protective group described above, the Q 2, phosphate groups are formed in an O integral to bind to Q 2, and O that binds to Q 2 It may be a nucleotide or nucleic acid linked via a phosphodiester bond formed by a phosphate group formed together, or the above-mentioned protecting group. That is, the compounds represented by the above-mentioned formula I, formula I ′, formula I ′ ′ and formula I ′ ′ ′ can be used as reagents for producing photoreactive modified nucleic acids (reagents for synthesis).
  • Q 1 can be a protecting group as described above
  • Q 2 can be a phosphate group formed integrally with O attached to Q 2 , or a protecting group as described above can do.
  • compounds having such a structure can be used as monomers for nucleic acid synthesis and can be reagents that can be used by known DNA synthesizers, for example, phosphoramidites
  • the method can be used as a modified nucleic acid synthesis reagent (modified nucleic acid synthesis monomer) that can be used by the method and the H-phosphonate method.
  • the Q 1, as a protecting group as described above, nucleotide or nucleic acid Q 2 are linked via a phosphodiester bond to be formed by a phosphate group which is formed by a O integral to bind to Q 2
  • the structure is not a so-called monomer, and is a structure that can be said to be a modified nucleic acid. In such a case, it can be synthesized therefrom to be used as a manufacturing reagent (reagent for synthesis) for extending the chain length.
  • Examples of the reagent for producing a photoreactive modified nucleic acid include, for example, a monomer described as Compound 5 and a Compound 6 described in Scheme 1 described later, and a monomer described in Scheme 2 described later be able to.
  • the pyranocarbazole moiety can form a crosslink by photoreaction.
  • the compound according to the present invention can form a double helix with a complementary single-stranded nucleic acid, and the pyranocarbazole moiety forms a crosslink by photoreaction.
  • photocrosslinks photocrosslinks
  • the compound according to the present invention can be used as a photoreactive crosslinking agent.
  • the modified nucleic acid according to the present invention when used as a single stranded nucleic acid, it can be hybridized with a complementary single stranded nucleic acid to form a double helix.
  • nucleobases at positions where base pairing is to be formed in the complementary strand with respect to the pyranocarbazole structural moiety are freely selected without particular limitation.
  • crosslinks can be formed by photoreaction between the nucleic acid strands forming the double helix.
  • This photocrosslinking forms a base pair in a complementary strand to a nucleic acid base located at the 5 'end side by one base in the sequence from the position where the pyranocarbazole structural moiety is located as a nucleic acid base in the sequence It is formed between the nucleobase at the position and the pyranocarbazole structure.
  • this photocrosslink is a nucleic acid base located on the 3 'end side by one base in the sequence from the nucleobase in the position to form a base pair in the complementary strand with respect to the pyranocarbazole structural moiety And the pyranocarbazole structure.
  • the counterpart base whose pyranocarbazole structure can form a photocrosslink is a base having a pyrimidine ring.
  • the pyranocarbazole structure does not form a photocrosslink with a base having a purine ring. That is, the photocrosslinkable compounds according to the present invention form photocrosslinks to cytosine, uracil and thymine as natural nucleic acid bases, while they do not form photocrosslinks to guanine and adenine It has the specificity.
  • the photoreactive modified nucleic acid (photocrosslinkable modified nucleic acid) according to the present invention can be photocrosslinked after being hybridized with a sequence having a base sequence complementary to the modified nucleic acid to form a double helix.
  • the photocrosslinking reaction photocrosslinking reaction
  • the photoreactive crosslinking agent according to the present invention can be provided with very high base sequence selectivity, if desired, by sequence design.
  • the wavelength of light irradiated for photocrosslinking is, for example, in the range of 350 to 600 nm, preferably in the range of 400 to 600 nm, more preferably in the range of 400 to 550 nm, still more preferably in the range of 400 to 500 nm, still more preferably 400.
  • the wavelength can be in the range of ⁇ 450 nm, and light including a wavelength of 400 nm is particularly preferable.
  • single wavelength laser light in the wavelength range of these ranges can be used.
  • photocrosslinking can be formed by light irradiation of a wavelength in the visible light range.
  • photoreactive crosslinkers have required irradiation with light having a wavelength shorter than these ranges.
  • photocrosslinking can be formed by light irradiation with a longer wavelength than conventional photoreactive crosslinking agents, it is advantageous in that adverse effects on nucleic acid and cells by light irradiation can be minimized. is there.
  • photocleavage of photocrosslinking According to the compound of the present invention, after photocrosslinking is formed, photocleavage can be further performed by light irradiation. That is, the photoreactive compound according to the present invention enables reversible photocrosslinking and can be used as a reversible photocrosslinking agent.
  • the present invention is also a method of separating, recovering or detecting a nucleic acid having a desired base sequence using a reversible photocrosslinking agent.
  • the wavelength of light irradiated for photocleavage can be, for example, in the range of 300 to 350 nm, preferably in the range of 300 to 340 nm, and light including a wavelength of 312 nm is particularly preferable.
  • single wavelength laser light in the wavelength range of these ranges can be used.
  • 0 to 50 ° C. preferably 0 to 40 ° C., more preferably 0 to 30 ° C., more preferably 0 to 20 ° C., more preferably 0 to promote the photocrosslinking reaction.
  • the light irradiation is carried out at a temperature in the range of -10.degree. C., more preferably 0-5.degree.
  • light irradiation is generally performed at a temperature in the range of 55 to 100 ° C., preferably 60 to 100 ° C., more preferably 60 to 90 ° C., still more preferably 60 to 80 ° C.
  • the photocrosslinking and photocleaving according to the present invention utilize the photoreaction, so there is no particular limitation in pH, salt concentration, etc., and pH, salt concentration, etc. where biopolymers such as nucleic acids can stably exist. It can be carried out by light irradiation in the solution.
  • Photocrosslinking and photocleavage according to the invention proceed very rapidly. For example, if it is necessary to take several hours (350 nm light irradiation) for a psoralen known as a photoreactive compound, for example, only 10 seconds to 60 seconds (400 nm light) can be emitted by light irradiation with a longer wavelength than that. In the irradiation), the photoreaction proceeds to photocrosslink. That is, when the photocrosslinking agent according to the present invention is used, the photoreaction can be advanced to form photocrosslinking by light irradiation, for example, for 1 to 120 seconds or 1 to 60 seconds.
  • the photocrosslinking according to the present invention can make the photoreaction proceed and cleave photocrosslinking by light irradiation, for example, for 1 to 120 seconds, or 1 to 60 seconds, employing the above-mentioned wavelength and temperature.
  • the modified nucleic acid according to the present invention can be prepared from a compound having a pyranocarbazole structure (for example, compound 2 of scheme 1 described later) using the method described in scheme 1 or scheme 2 described below or a method known to those skilled in the art Monomers for synthesis (reagents for production) (for example, compound 3, compound 4, compound 5, compound 6 or the corresponding compound in scheme 2 in scheme 1 described later) can be obtained.
  • the structure of the monomer for synthesis of the modified nucleic acid according to the present invention is as described above, and when it is used as a nucleic acid synthesis reagent in known methods such as the phosphoroamidite method and the H-phosphonate method, photoresponsive artificial A nucleic acid or oligonucleotide (modified nucleic acid according to the present invention) or a peptide nucleic acid in which a nucleoside analog molecule (compound of formula VII, compound of formula VIII) is incorporated into the sequence can be obtained.
  • the modified nucleic acid synthesis monomer according to the present invention is excellent in that it can be used as a nucleic acid synthesis reagent in known methods such as the phosphoroamidite method and the H-phosphonate method.
  • nucleoside analogue (photoreactive element)
  • synthesis of a photoresponsive artificial nucleoside analog molecule also referred to as a nucleoside analog, or a photoreactive element or a photocrosslinking element
  • a modified nucleic acid synthesis monomer were performed.
  • FIG. 1a is an explanatory view showing the flow of this photocrosslinking reaction.
  • UPLC analysis 50 ⁇ L of the DNA sample was transferred to a UPLC vial, and UPLC (ultra high performance liquid chromatograph) analysis was performed. For analysis, 50 mM ammonium formate and acetonitrile were used, and the solvent ratio was changed linearly so that ammonium formate 100% at the start of analysis, ammonium formate 90%, and acetonitrile 10% at 10 minutes. The analysis was performed at a flow rate of 0.2 mL / min and a detection wavelength of 260 nm. These results are summarized in FIGS. 1b and 1c.
  • FIG. 1 b is a chart of UPLC analysis when the light irradiation time is changed to 0 to 15 seconds.
  • the horizontal axis in FIG. 1 b is the holding time [minutes].
  • the positions of the peaks of the complementary strand ODN, modified ODN, and photocrosslinked ODN are shown in FIG. 1b, respectively.
  • FIG. 1 c is a graph created by calculating the photocrosslinking rate in each light irradiation time when the light irradiation time is changed to 0 to 15 seconds.
  • the horizontal axis of FIG. 1 c indicates the light irradiation time [seconds], and the vertical axis indicates the crosslinking rate [%].
  • FIG. 2a is an explanatory view showing the flow of this photocrosslinking reaction. The results are summarized in FIG. 2b.
  • FIG. 2 b is a chart of UPLC analysis when the light wavelength to be irradiated is changed to 450 to 550 nm.
  • the horizontal axis in FIG. 2b is the holding time [minutes].
  • the positions of the peaks of the complementary strand ODN (cODN), modified ODN (ODN ( PC X)), and photocrosslinked ODN (*) are shown in FIG. 2b, respectively.
  • FIG. 3a is an explanatory view showing the flow of this photocleavage reaction. The results are summarized in FIGS. 3b and 3c.
  • FIG. 3 b is a chart of UPLC analysis when the light wavelength to be irradiated is changed to 320 to 340 nm.
  • the horizontal axis in FIG. 3 b is the holding time [minutes].
  • the positions of the peaks of the complementary strand ODN (cODN) and modified ODN (ODN ( PC X)) are shown in FIG. 3b, respectively.
  • the photocrosslinked ODN peak is a peak located between retention times of 4.5-5 minutes.
  • FIG. 3 c is a graph showing the proportion (photocleavage rate% or conversion rate%) of the photocrosslinker cleaved by light irradiation of each wavelength.
  • FIG. 4 is a graph comparing light irradiation time (seconds) at each wavelength with cell viability (%). From this result, while the cell survival rate greatly decreases even with light irradiation for several seconds with light irradiation at 366 nm, the cell survival rate almost decreases even with light irradiation for several tens of seconds at 400 nm and 450 nm. Absent. That is, this also revealed that pyranocarbazole can be manipulated with long-wavelength light with low cytotoxicity.
  • ODN SPC X
  • cODN ODN ( SPC X) 5'-TGCA SPC XCCGT-3 ' cODN 5'-ACGGGTGCA-3 '
  • Measurement wavelength 260 nm, flow rate 0.2 mL / min, using mixed solution of ammonium formate and acetonitrile, initial condition: ammonium formate 99%, acetonitrile 15%, ammonium formate 85%, acetonitrile 15% at the end of analysis (10 minutes)
  • the analysis was done in An explanatory view showing the flow of the photocrosslinking reaction is shown in FIG.
  • the present invention provides novel compounds that become photoreactive crosslinkers that can be used in the photoreaction technology of nucleic acids.
  • the present invention is an industrially useful invention.

Abstract

核酸の光反応技術に使用可能な 式Ｉ：で表される化合物、及び該化合物からなる光反応性架橋剤を提供する。

Description

可視光域で光架橋可能な光応答性ヌクレオチドアナログ
　本発明は、可視光域の光による光架橋（光クロスリンク）能を有する光応答性ヌクレオチドアナログ（光応答性ヌクレオチド類似化合物）に関する。
　分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結及び核酸の架橋がある。核酸の連結や架橋は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用され、あるいは、例えば、遺伝子発現の阻害に使用される。そのために、核酸の連結及び架橋の技術は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。
　核酸の光反応技術として、５－シアノビニルデオキシウリジンを使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号、特許文献２：特許第３７５３９４２号）、３－ビニルカルバゾール構造を塩基部位に持つ修飾ヌクレオシドを使用した光架橋技術（特許文献３：特許第４８１４９０４号、特許文献４：特許第４９４０３１１号）がある。
　さらに、最近、核酸の二重鎖形成能を利用した様々なナノ構造体の構築が可能となってきており、ナノテクノロジーの分野においても核酸の連結及び架橋の技術が重要となってきている。例えば、非特許文献１は、核酸の光架橋によってオリゴＤＮＡからなるナノシートに耐熱性を付与する技術を開示している。
特許第３７５３９３８号公報 特許第３７５３９４２号公報 特許第４８１４９０４号公報 特許第４９４０３１１号公報
Ｊ．Ｐｈｏｔｏｐｄｙ．Ｓ．Ｔｅｃｈ．，２０１４，２７，４８５
　核酸の光反応技術の重要性から、核酸の光反応技術に使用可能な新しい化合物が、さらに求められている。本発明の目的は、核酸の光反応技術に使用可能な新しい光反応性化合物、及び該光反応性化合物を使用した光反応性架橋剤を提供することにある。
　本発明者は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる光反応性化合物を鋭意探索してきたところ、核酸塩基の塩基部分に代えてピラノカルバゾール骨格構造を備えた化合物が、このような核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となることを見いだして、本発明に到達した。
　本発明に係る化合物は、特徴的なピラノカルバゾール構造を有しており、比較的に小さなこの構造によって光架橋性を発揮しているために、様々に修飾して多様な用途で使用することができる。さらに、本発明に係る化合物のこの特徴的な構造は、核酸の塩基に類似した構造を有しているために、人工塩基（人工核酸塩基）として使用することができる。すなわち、本発明に係る化合物の特徴的な構造を人工塩基として導入して、人工ヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）、及び人工ヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）を製造することができ、このような人工ヌクレオチドを配列中に含んだ人工核酸（修飾核酸）を製造することができる。このような人工核酸が、光反応によって架橋を形成すると、それは、二重らせんの一方の鎖からもう一方の鎖へと形成された光架橋（光クロスリンク）となるので、光反応性の核酸類は、所望の配列に特異的に反応可能な二重らせんの光クロスリンク剤として使用することができる。
　本発明による光反応性架橋剤は、特徴的なピラノカルバゾール構造に由来して、従来よりも長波長の光照射によって、例えば可視光域の光照射によって、光架橋反応させることができるという特徴を備える。そのために、ＤＮＡや細胞の損傷をできるだけ回避したいという場合に、本発明による光反応性架橋剤は、長波長の光照射によって光架橋可能であるので、特に有利である。
　なお、本発明の光反応性化合物は、光照射によって光反応を開始するものであるが、それまで安定していた化合物が、光照射というシグナルに応答して反応を開始するという意味を強調して、光反応性を光応答性ということがある。
　したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
　次の式Ｉで表される化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（ただし、式Ｉにおいて、
　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
　Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である。）。
（２）
　Ｙが、次の式ＩＩで表される基である、（１）に記載の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
（ただし、式ＩＩにおいて、
　Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
　Ｒ１２は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ1基であり、
　Ｒ１３は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ2基であり、
　Ｑ1は、
　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基であり、
　Ｑ2は、
　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基である。）。
（３）
　Ｙが、水素原子、次の式ＩＩＩで表される基、又は式ＩＶで表される基である、（１）に記載の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
（４）
　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
（ただし、式Ｉｂにおいて、
　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオシドである、（１）に記載の化合物。
（５）
　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
（ただし、式Ｉｂにおいて、
　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有するヌクレオチドである、（１）に記載の化合物。
（６）
　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
（ただし、式Ｉｂにおいて、
　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
で表される基を有する核酸又はペプチド核酸である、（１）に記載の化合物。
（７）
　（１）～（６）のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
（８）
　（１）～（６）のいずれかに記載の化合物を使用して、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に光架橋を形成する方法。
　本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。これは、天然の塩基構造を備えていない、新規な化学構造によるものである。そして、本発明の化合物によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる。
図１ａは光架橋反応の流れを示す説明図である。 図１ｂは光照射時間を０～１５秒と変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。 図１ｃは光照射時間を０～１５秒と変化させた場合の各光照射時間における光架橋率を算出して作成したグラフである。 図２ａは光架橋反応の流れを示す説明図である。 図２ｂは照射する光波長を４５０～５５０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。 図３ａは光開裂反応の流れを示す説明図である。 図３ｂは照射する光波長を３２０～３４０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。 図３ｃは各波長の光照射によって開裂した光架橋体の割合（転化率％）を示すグラフである。 図４は各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。 図５はSPCXによる光架橋反応の流れを示す説明図である。 図６はSPCXによる光架橋試験のＵＰＬＣによる解析のチャートである。
　具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。
［化合物の構造］
　本発明の化合物は、次の式Ｉで表される化合物を含む：
（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
　式Ｉにおいて、Ｘは、酸素原子又は硫黄原子である。
　式Ｉにおいて、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。ハロゲン原子としては、例えばＢｒ、Ｃｌ、Ｆ、Ｉの原子をあげることができる。フッ化メチル基としては、例えば－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨＦ2、－ＣＦ3をあげることができる。フッ化エチル基としては、例えば－ＣＨ2－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨ2－ＣＨＦ2、－ＣＨ2－ＣＦ3、－ＣＨＦ－ＣＨ3、－ＣＨＦ－ＣＨ2Ｆ、－ＣＨＦ－ＣＨＦ2、－ＣＨＦ－ＣＦ3、－ＣＦ2－ＣＨ3、－ＣＦ2－ＣＨ2Ｆ、－ＣＦ2－ＣＨＦ2、－ＣＦ2－ＣＦ3をあげることができる。Ｃ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基としては、例えば－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ3基、－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＳＨ基、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ3基、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ2－ＣＨ3基をあげることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、－ＮＨ2基、－ＯＨ基、－ＣＨ3基とすることができ、好ましくは、水素原子とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｒ１を上述の基とすると同時にＲ２を水素原子とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、式Ｉの左端の六員環において、窒素原子の結合する炭素原子をＣ１位と付番して、六員環の炭素原子を時計回りに順にＣ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位、Ｃ６位と付番した場合に、Ｃ２位、Ｃ３位、Ｃ４位、Ｃ５位のいずれかの位置の炭素原子の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１及びＲ２は、それぞれＣ３位及びＣ４位の置換基とすることができる。好適な実施の態様において、Ｒ１をＣ３位の置換基とすると同時に、Ｒ２をＣ４位の水素原子とすることができる。
　式Ｉにおいて、Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子とすることができる。
　好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ’で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
　式Ｉ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
　好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ”で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ”）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
　式Ｉ”において、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
　好適な実施の態様において、式Ｉの化合物は、次の式Ｉ'''で表される化合物とすることができる：
（式Ｉ'''）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　式Ｉ'''において、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｙは、式Ｉにおいて記載した基である。
　好適な実施の態様において、Ｙは、水素原子とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩで表される化合物である：
（ＶＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
　式ＶＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
　好適な実施の態様において、Ｙは、水素原子とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩ’で表される化合物である：
（ＶＩ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
　式ＶＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
　好適な実施の態様において、Ｙは、次の式ＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式Ｖで表される化合物となる：
（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
（Ｖ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
　式Ｖにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置し、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、式ＩＩについて記載した基である。
　好適な実施の態様において、Ｙは、上記の式ＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式Ｖ’で表される化合物となる：
（Ｖ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
　式Ｖ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３は、式ＩＩについて記載した基である。
　式ＩＩにおいて、Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、Ｒ１２は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ1基であり、Ｒ１３は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ2基である。
　上記Ｑ1は、
　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
　からなる群から選択される基とすることができる。
　上記Ｑ2は、
　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
　　以下から選択される保護基：
　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
　からなる群から選択される基とすることができる。
　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
上記ジアルキル基となるＲ基とＲ’基は、それぞれＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。このような２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基として、例えば、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジメチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジエチルホスホロアミダイト基、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト基をあげることができる。
　メチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
　エチルホスホンアミダイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
上記Ｒ基とＲ’基は、それぞれ水素原子又はＣ１～Ｃ４のアルキル基とすることができる。
　オキサザホスホリジン基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027

上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
　チオホスファイト基は、次の構造を有しており、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028

上記の構造において、水素原子がＣ１～Ｃ４のアルキル基によって置換された置換体も含む。
　－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩は、それぞれのトリエチルアミン（ＴＥＡ）の塩である。
　－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩は、それぞれのジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）の塩である。
　好適な実施の態様において、Ｑ1は、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ1は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、ジメトキシトリチル基、トリチル基、モノメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基とすることができ、特に好ましくはジメトキシトリチル基とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ2は、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ2は、上述の保護基とすることができ、好ましくは、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基とすることができ、特に好ましくは２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト基とすることができる。
［ヌクレオシドアナログ］
　好適な実施の態様において、Ｙは、デオキシリボースとすることができ、すなわち、次の式ＩＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩで表されるヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）アナログである：
（ＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
（ＶＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
　式ＶＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
　好適な実施の態様において、Ｙは、デオキシリボースとすることができ、すなわち、上記の式ＩＩＩで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩＩ’で表されるヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）アナログである：
（ＶＩＩ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
　式ＶＩＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
　好適な実施の態様において、Ｙは、リボースとすることができ、すなわち、次の式ＩＶで表される基とすることができ、この場合に式Ｉの化合物は、次の式ＶＩＩＩで表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログである：
（ＩＶ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
（ＶＩＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
　式ＶＩＩＩにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。
　好適な実施の態様において、Ｙは、リボースとすることができ、すなわち、上記の式ＩＶで表される基とすることができ、この場合に式Ｉ’の化合物は、次の式ＶＩＩＩ’で表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログである：
（ＶＩＩＩ’）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
　式ＶＩＩＩ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。
　上記の式ＶＩＩ及び式ＶＩＩＩで表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログは、塩基部分として、次の式Ｉｂ：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
（ただし、式Ｉｂにおいて、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１及びＲ２は、式Ｉにおいて記載した基であって、式Ｉにおいて記載した位置に位置する。）
で表される基を有するヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）ということができる。
　上記の式ＶＩＩ’及び式ＶＩＩＩ’で表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）アナログは、塩基部分として、次の式Ｉｂ’：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
（ただし、式Ｉｂ’において、Ｘは、式Ｉにおいて記載した基であり、Ｒ１は、式Ｉにおいて記載した基である。）
で表される基を有するヌクレオシド（ヌクレオシドアナログ）ということができる。
　さらに、本発明は、塩基部分として、上記の式Ｉｂ又は式Ｉｂ’で表される基を有するヌクレオチド（ヌクレオチドアナログ）にもある。さらに、本発明は、塩基部分として、上記の式Ｉｂ又は式Ｉｂ’で表される基を有する核酸（修飾核酸）又はペプチド核酸（修飾ペプチド核酸）にもある。
［ヌクレオチドアナログ］
　好適な実施の態様において、Ｑ1を、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基とすることができ、Ｑ2を、水素原子とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログ分子とすることができる。
［修飾核酸］
　好適な実施の態様において、Ｑ1を、Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸として、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とすることができる。すなわち、上記式Ｉで表される化合物は、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた修飾核酸又は修飾オリゴヌクレオチドとすることができる。本発明において、このように調整された光応答性修飾核酸と光応答性修飾オリゴヌクレオチドをまとめて光応答性修飾核酸ということがある。本発明に係る修飾核酸において、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中の末端に位置していてもよく、この場合にはＱ1又はＱ2のいずれかの側のみがＱ1又はＱ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結される修飾ヌクレオチド又は修飾核酸となる。また、上記の核酸に代えてペプチド核酸を用いて、特徴的な構造を備えた光応答性人工ヌクレオチドアナログが配列中に取り込まれた光応答性修飾ペプチド核酸とすることができる。
［化合物の構造］
　本発明に係る化合物は、式Ｉ等において、天然のヌクレオシド及びヌクレオチドが備えているべきプリン塩基あるいはピリミジン塩基による塩基構造を備えていない。それにもかかわらず、本発明に係る化合物は、１本鎖の修飾核酸として形成されると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができる。そして、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。
［修飾核酸製造用試薬］
　好適な実施の態様において、Ｑ1を、上述の保護基とすることができ、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸、あるいは上述の保護基、とすることができる。すなわち、上記式Ｉ、式Ｉ’、式Ｉ”、及び式Ｉ'''で表される化合物は、光反応性修飾核酸の製造用試薬（合成用試薬）とすることができる。
　好適な実施の態様において、Ｑ1を、上述の保護基とすることができ、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基、あるいは上述の保護基、とすることができる。よく知られているように、このような構造を備えた化合物は、核酸合成用のモノマーとして使用することができ、公知のＤＮＡ合成装置によって使用可能な試薬とすることができ、例えばホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法によって使用可能な修飾核酸合成用試薬(修飾核酸合成用モノマー）とすることができる。
　また、Ｑ1を、上述の保護基として、Ｑ2を、Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド又は核酸とした構造はいわゆるモノマーとは言えない構造となっており、修飾核酸と言える構造となっている。このような場合には、そこから合成して鎖長を伸長するための製造用試薬（合成用試薬）として使用することができる。
　光反応性修飾核酸製造用試薬（光反応性修飾核酸合成用試薬）として、例えば、後述するスキーム１の化合物５、化合物６として記載されたモノマー、及び後述するスキーム２に記載されたモノマーをあげることができる。
［光反応性架橋剤］
　本発明に係る化合物は、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができる。本発明に係る化合物を、１本鎖の修飾核酸として形成すると、これと相補的な１本鎖の核酸と二重らせんを形成することができ、ピラノカルバゾール部分が光反応によって架橋を形成することができ、結果として、二重らせんの一方の鎖からもう一方の鎖へと形成された鎖間の光架橋（光クロスリンク）を形成することができる。すなわち、本発明に係る化合物は、光反応性架橋剤として使用することができる。
［光架橋の形成］
　本発明に係る修飾核酸は、これを１本鎖核酸として使用すると、これと相補的な１本鎖核酸とハイブリダイズして二重らせんを形成することができる。二重らせんの形成にあたって、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基については、特段の制約がなく、自由に選択できる。形成された二重らせんに光照射を行うと、二重らせんを形成する核酸鎖の間に、光反応によって架橋を形成することができる。この光架橋は、配列中でピラノカルバゾール構造部分が核酸塩基として位置する位置から配列中で１塩基分だけ５’末端側に位置する核酸塩基に対して、相補鎖中において塩基対を形成する位置にある核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。言い換えれば、この光架橋は、ピラノカルバゾール構造部分に対して、相補鎖中において塩基対を形成すべき位置にある核酸塩基から、配列中で１塩基分だけ３’末端側に位置する核酸塩基と、ピラノカルバゾール構造との間に形成される。
［光架橋の塩基特異性］
　本発明において、ピラノカルバゾール構造が光架橋を形成可能である相手方の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。一方で、ピラノカルバゾール構造は、プリン環を有する塩基とは光架橋を形成しない。すなわち、本発明に係る光架橋性の化合物は、天然の核酸塩基としては、シトシン、ウラシル、及びチミンに対して光架橋を形成し、一方で、グアニン及びアデニンに対しては光架橋を形成しないという、特異性を有している。
［光反応性架橋剤の配列選択性］
　本発明に係る光反応性修飾核酸（光架橋性修飾核酸）は、修飾核酸と相補的な塩基配列を有する配列とハイブリダイズさせて二重らせんを形成させた後に、光架橋させることができる。これによって、目的とする特定の配列に対してのみ光クロスリンク反応（光架橋反応）を行わせることができる。すなわち、本発明に係る光反応性架橋剤は、非常に高い塩基配列選択性を、所望に応じて配列設計して、付与することができる。
［光照射の波長］
　光架橋のために照射される光の波長は、例えば３５０～６００ｎｍの範囲、好ましくは４００～６００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５５０ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～５００ｎｍの範囲、さらに好ましくは４００～４５０ｎｍの範囲とすることができ、特に４００ｎｍの波長を含む光が好ましい。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。このように本発明では、可視光域の波長の光照射によって、光架橋を形成することができる。従来の光反応性架橋剤では、これらの範囲よりも短波長の光照射を必要としていた。本発明によれば、従来の光反応性架橋剤よりも長波長の光照射によって光架橋を形成できることから、光照射による核酸や細胞への悪影響を最小限とすることができる点で、有利である。
［光架橋の開裂］
　本発明の化合物によれば、光架橋を形成した後に、さらに光照射によって光開裂をすることができる。すなわち、本発明に係る光反応性の化合物は、可逆的な光架橋を可能とするものであり、可逆的な光架橋剤として使用することができる。
　この光架橋の可逆性から想起されるように、本発明の化合物による可逆性光架橋剤を使用すれば、特定の塩基配列を有する核酸を、生理的条件下で、分離し、回収し、又は検出することができる。したがって本発明は可逆性光架橋剤を使用して、所望の塩基配列を有する核酸を、分離し、回収し、又は検出する方法にもある。
　光開裂のために照射される光の波長は、例えば３００～３５０ｎｍの範囲、好ましくは３００～３４０ｎｍの範囲とすることができ、特に３１２ｎｍの波長を含む光が好ましい。好適な実施の態様において、これらの範囲の波長にある単波長のレーザー光を使用することができる。
［光反応の温度］
　好適な実施の態様において、光架橋反応を進行させるためには、一般に０～５０℃、好ましくは０～４０℃、さらに好ましくは０～３０℃、さらに好ましくは０～２０℃、さらに好ましくは０～１０℃、さらに好ましくは０～５℃の範囲の温度で光照射を行う。光開裂反応を進行させるためには、一般に５５～１００℃、好ましくは６０～１００℃、さらに好ましくは６０～９０℃、さらに好ましくは６０～８０℃の範囲の温度で光照射を行う。
［光反応の条件］
　本発明による光架橋及び光開裂は、光反応を利用しているために、ｐＨ、塩濃度などに特段の制約がなく、核酸類等の生体高分子が安定に存在可能なｐＨ、塩濃度とした溶液中で、光照射によって行うことができる。
［光反応の時間］
　本発明による光架橋及び光開裂は、極めて迅速に進行する。例えば、光反応性の化合物として知られるソラレンであれば数時間を要する（３５０ｎｍ光照射）ような場合に、それよりもはるかに長波長の光照射によって、例えばわずか１０秒間～６０秒間（４００ｎｍ光照射）で光反応が進行して光架橋する。すなわち、本発明に係る光架橋剤を使用すれば、例えば１～１２０秒間、又は１～６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を形成させることができる。さらに、本発明による光架橋は、上記の波長及び温度を採用して、例えば１～１２０秒間、又は１～６０秒間の光照射によって、光反応を進行させて光架橋を開裂させることができる。
［修飾核酸合成用モノマー及び修飾核酸の合成］
　後述するスキーム１又はスキーム２に記載の手法、あるいは当業者に公知の手法を使用して、ピラノカルバゾール構造を有する化合物（例えば後述するスキーム１の化合物２）から、本発明に係る修飾核酸を得るための合成用モノマー（製造用試薬）（例えば後述するスキーム１の化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、あるいはスキーム２において対応する化合物）を得ることができる。本発明に係る修飾核酸の合成用モノマーの構造は上述した通りであり、これを、ホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法等の公知の手法における核酸合成試薬として使用すれば、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（式ＶＩＩの化合物、式ＶＩＩＩの化合物）が配列中に取り込まれた核酸又はオリゴヌクレオチド（本発明に係る修飾核酸）あるいはペプチド核酸を得ることができる。このように、本発明に係る修飾核酸合成モノマーは、ホスホロアミダイト法、及びＨ－ホスホネート法等の公知の手法において核酸合成試薬として使用できる点で、優れたものである。
　以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。
［ヌクレオシドアナログ（光反応性素子）の合成］
　次のスキーム１に示す合成経路に沿って、光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ヌクレオシドアナログ、あるいは光反応性素子又は光架橋素子ということがある）、さらに修飾核酸合成モノマーの合成を行った。
スキーム１：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
［化合物２の合成］
　二口ナスフラスコに２－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｒｂａｚｏｌｅ（２．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）、ＩｎＣｌ3（２６０ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を入れ、還流管をつけ、窒素置換を行った。オイルバスを９０℃にセットし、二口ナスフラスコにＥｔｈｙｌ　ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅ（４ｍｌ）を加え９０℃，２４ｈ撹拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認した後、水２ｍＬを加え反応をクエンチした。酢酸エチルに溶かし、抽出を行った。硫酸ナトリウムを用い、脱水を行い、エバポレータにより溶媒を除去した。その後、カラム（ヘキサン：酢酸エチル＝８：１）により精製を行い、化合物２を得た。（収量：５０３ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ、収率：２５％）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）　δ　１１．６７（ｓ，１Ｈ），８，４７（ｓ，１Ｈ），８，１７（ｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１１．４Ｈｚ），７．５０－７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２５（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．５４Ｈｚ），６．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７５Ｈｚ）
［化合物４の合成］
　二口ナスフラスコに化合物２（３２４ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、ＫＯＨ（２２４ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）を入れ、窒素置換を行った。脱水アセトニトリルを３６ｍＬとＴＤＡ－１を２４μＬ入れて３０分撹拌した。その後、クロロシュガー（６７４ｍｇ、１．９４ｍｍｏｌ）を加え一晩撹拌した。反応液を濾過した後、エバポレータにより溶媒を除去した。除去後の混合液にメタノール４０ｍＬに溶解させた後、ナトリウムメトキシド５４ｍｇとクロロホルム５ｍＬを加え、４時間撹拌した。その後、濾過、エバポレータによる溶媒の除去を行った。その後、カラム（クロロホルム）による精製を行い、化合物４を得た。（収量：８０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ、収率：１７％）
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ6）　δ　８．５０（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２８，８．０），７．３１（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．１７），６．７１（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２），６．３８（ｄ，１Ｈ，４．６Ｈｚ），５．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），５．１０（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．０７Ｈｚ），３．９５－３．８７（ｍ，３Ｈ），２．７４（ｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，８．２Ｈｚ），２．２６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１４．０，６．９，３．３Ｈｚ）
［化合物５、化合物６の合成］
　以降の合成は常法に従い、ジメトキシトリチル化、アミダイト化を行った。
［光応答性核酸含有ＤＮＡの合成］
　ＤＮＡ自動合成機（ＡＢＩ３４００）を用い、修飾ＤＮＡの合成を行った。その後、２８％アンモニア水溶液による切り出しを行った後、６５℃で４時間加熱し、脱保護を行った。ＳｐｅｅｄＶａｃによりアンモニアを除去、ＨＰＬＣによる精製を行った。その後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析を行い目的物の同定を行った。
Ｃａｌｃｄ．ｆｏｒ　［Ｍ＋Ｈ］+　２７９８．４０，Ｆｏｕｎｄ　２７９８．７２
［光架橋反応］
　１０μＭ修飾ＯＤＮ、１０μＭ相補鎖ＯＤＮ、５０μＭ　ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）を９０℃で１分間加熱し、４℃で静置した。その後、ＵＶ－ＬＥＤ（ＯｍｎｉＣｕｒｅ，ＬＸ４０５－Ｓ）を用いて４００ｎｍの光照射を４℃で行った。図１ａはこの光架橋反応の流れを示す説明図である。
［ＵＰＬＣ解析］
　ＤＮＡサンプル５０μＬをＵＰＬＣ用バイアル瓶に移し、ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフ）解析を行った。解析には５０ｍＭギ酸アンモニウムとアセトニトリルを用い、分析開始時ギ酸アンモニウム１００％、１０分時点でギ酸アンモニウム９０％、アセトニトリル１０％になるように直線的に溶媒比率を変化させた。流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長は２６０ｎｍで分析を行った。図１ｂ及び図１ｃにこれらの結果をまとめて示す。
［結果］
　図１ｂは、光照射時間を０～１５秒と変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図１ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ、修飾ＯＤＮ、光架橋されたＯＤＮのピークの位置をそれぞれ図１ｂ中に示す。図１ｃは、光照射時間を０～１５秒と変化させた場合の各光照射時間における光架橋率を算出して作成したグラフである。図１ｃの横軸は光照射時間［秒］、縦軸は架橋率［％］を示す。
［光架橋可能な光波長の検討］
　上記の光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（ピラノカルバゾール構造を有する光架橋素子）（ＰｙｒａｎｏＣａｒｂａｚｏｌｅ　Ｐｈｏｔｏ－Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｒ）（PCＸ）について、光架橋可能な波長を以下のように検討した。
　１０μＭ　ＯＤＮ（Ｘ）、１０μＭ　ｃＯＤＮ、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒをアニーリング後４℃で光照射を行いＵＰＬＣにより解析した。図２ａはこの光架橋反応の流れを示す説明図である。図２ｂにこの結果をまとめて示す。
［結果］
　図２ｂは、照射する光波長を４５０～５５０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図２ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ（ｃＯＤＮ）、修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ（PCＸ））、光架橋されたＯＤＮ（＊）のピークの位置をそれぞれ図２ｂ中に示す。このように、４５０ｎｍから開始して少なくとも５５０ｎｍまでの波長の光照射によって、光架橋可能であることがわかった。
［光開裂可能な光波長の検討］
　上記の光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子（PCＸ）の光架橋体に対して、光開裂可能な波長を以下のように検討した。
　１０μＭの光架橋体に対して３７℃で３２０ｎｍ、３３０ｎｍ、３４０ｎｍに対して光照射を行った。その後、同様に解析を行った。図３ａはこの光開裂反応の流れを示す説明図である。図３ｂ及び図３ｃにこの結果をまとめて示す。
　図３ｂは、照射する光波長を３２０～３４０ｎｍと変化させた場合のＵＰＬＣ解析のチャートである。図３ｂの横軸は保持時間［分］である。相補鎖ＯＤＮ（ｃＯＤＮ）、修飾ＯＤＮ（ＯＤＮ（PCＸ））のピークの位置をそれぞれ図３ｂ中に示す。光架橋されたＯＤＮのピークは、保持時間４．５～５分の間に位置するピークである。図３ｃは、各波長の光照射によって開裂した光架橋体の割合（光開裂率％又は転化率％）を示すグラフである。このように、少なくとも３２０～３４０ｎｍまでの波長の光照射によって光開裂可能であること、この範囲内において３３０ｎｍの光照射が最も光開裂率が高いことがわかった。
［照射光波長の細胞への影響の検討］
　長波長の光照射が、短波長の光照射と比較して、細胞へのダメージが少ないことを検討するために、以下の実験を行った。
　９６穴プレートに５×１０5ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞（ＧＦＰ－ＨｅＬａ細胞、ヒト子宮頸癌由来株）を１００μＬ分注し、ＣＯ2インキュベータで４８時間培養した。その後、３６６ｎｍ、４００ｎｍ、又は４５０ｎｍの波長の光で光照射を行った後、Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔを１０μＬずつ入れ、ＣＯ2インキュベータで４時間呈色した後、マイクロプレートリーダを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。この結果を、図４にまとめて示す。
［結果］
　図４は、各波長での光照射時間（秒）と細胞生存率（％）を対比したグラフである。この結果から、３６６ｎｍの光照射では数秒の光照射でも細胞生存率が大きく低下しているのに対して、４００ｎｍ、４５０ｎｍでは、数十秒光照射を行ってもほとんど細胞生存率が低下していない。すなわち、このことからもピラノカルバゾールが細胞毒性の少ない長波長の光で操作可能であることが明らかとなった。
［ヌクレオシドアナログ（光反応性素子）（SPCX）の合成］
　光応答性人工ヌクレオシドアナログ分子として、次の構造を有するピラノカルバゾール誘導体（SPCX）の合成を、スキーム２に従って行った。
　SPCX：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
［スキーム２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　合成は、スキーム２に示すように、上述したスキーム１と同様に、２－ヒドロキシカルバゾールを出発物質として行った。スキーム２において、枠内に記載された箇所以外は、スキーム１と同様の手順によって合成を行った。枠内に記載された箇所については、以下にさらに詳細に説明する。
［ピラノカルバゾール誘導体(S-ピラノ)の合成］
　スキーム２の枠内の合成について以下のように行った。
　次の反応を後述のように行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
　５０ｍＬナスフラスコにピラノカルバゾールヌクレオシド（８００ｍｇ，２．２８ｍｍｏｌ）と無水酢酸（２０ｍＬ）、ＤＭＡＰ（５０ｍｇ）を加え、室温で２時間撹拌した。その後ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で反応の進行を確認後、エバポレータにより溶媒を除去した後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）によるカラム精製を行った。黄色粘性液体（７．９９ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ，７８％）を得た。1Ｈ－ＮＭＲにより目的物と同定した。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）　∂　８．５０（ｓ，１Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．９３（ｄ，１Ｈ），７．５０（ｔ，１Ｈ），７．３１（ｔ，１Ｈ），６．７０（ｔ，１Ｈ），６．３４（ｄ，１Ｈ），５．４１（ｄ，１Ｈ），５．１６（ｔ，１Ｈ），４．５０（ｄ，１Ｈ），３．７８（ｑ，２Ｈ），２．６０－２．６８（ｍ，１Ｈ），２．１４－２．１８（ｍ，１Ｈ），１．１８（ｓ，６Ｈ）．
　次の反応を後述のように行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
　５０ｍＬナスフラスコに３’，５’－アセチルピラノカルバゾールヌクレオシド（７．９９ｍｇ，１．７７ｍｍｏｌ）にたいし、ローソン試薬（１，００ｇ，２．４８ｍｍｏｌ）を加え、窒素置換、１００℃で３時間撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）で新たなスポットの出現を確認し、反応を停止した。その後、ＡｃＯＥｔに溶解させた後、ＮａＣｌ水溶液と分液を行い、有機相を回収し、エバポレータで溶媒を除去した。その後、アンモニア水溶液を加え、室温で６０時間撹拌した後、アンモニアの除去、凍結乾燥による水の除去を行った後、カラム精製（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）により目的物を回収した。1Ｈ－ＮＭＲにより目的物の同定を行った。
1Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）　∂　８．５６（ｓ，１Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ），８．２０（ｄ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），７．３６（ｄ，１Ｈ），７．５１（ｔ，１Ｈ），７．３５（ｔ，１Ｈ），６．７２（ｔ，１Ｈ），６．２１（ｄ，１Ｈ），５．４１（ｄ，１Ｈ），５．１６（ｔ，１Ｈ），４．５１（ｄ，１Ｈ），３．９０（ｑ，１Ｈ），３．９０（ｑ，２Ｈ），２．４８－２．６５（ｍ，１Ｈ），２．１２－２．１６（ｍ，１Ｈ）．
［SPCXによる光架橋試験］
　スキーム２によって得られた修飾核酸合成モノマーを用いて、光応答性核酸含有ＤＮＡの合成を行って、光架橋反応することを確認した。
　実験には下記ＯＤＮ（SPCＸ）とｃＯＤＮを使用して、後述のように行った。
　ＯＤＮ（SPCＸ）　　５’－ＴＧＣＡSPCＸＣＣＧＴ－３’
　ｃＯＤＮ　　　　　　５’－ＡＣＧＧＧＴＧＣＡ－３’
　１０μＭのＯＤＮ（SPCＸ）と１０μＭのｃＯＤＮを１００ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭカコジル酸ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）に溶解させた後、９０℃で１分間加熱した後、４℃で冷却した。その後４℃条件下で４５０ｎｍ（ＬＥＤ）の光照射を行った。その後、ＵＰＬＣによる解析を行った。ＵＰＬＣでの解析条件は下記の通りである。測定波長２６０ｎｍ、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ、ギ酸アンモニウムとアセトニトリル混合溶液を用い、初期条件はギ酸アンモニウム９９％、アセトニトリル１５％、分析終了（１０分）時点でギ酸アンモニウム８５％、アセトニトリル１５％の条件で分析を行った。
　この光架橋反応の流れを示す説明図を、図５に示す。
［結果］
　光架橋試験のＵＰＬＣによる解析結果を図６に示す。
　ＵＰＬＣで解析を行った結果、光照射前に確認できたｃＯＤＮとＯＤＮ（SPCＸ）のピークが光照射時間依存的に減少し、新たなピークが確認でき、光架橋反応の進行が確認された。４５０ｎｍの光照射を１０秒行うことにより光架橋していることから、ピラノカルバゾール（PCＸ）よりもＳ－ピラノカルバゾール（SPCＸ）はさらに高い光反応性を有するものであった。
　本発明は、核酸の光反応技術に使用可能な光反応性架橋剤となる新規な化合物を提供する。本発明は産業上有用な発明である。

Claims (8)

  1. 　次の式Ｉで表される化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （ただし、式Ｉにおいて、
    　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基であり、
    　Ｙは、水素原子、糖（糖は、リボース、及びデオキシリボースを含む）、多糖類（多糖類は、核酸のポリリボース鎖、及びポリデオキシリボース鎖を含む）、ポリエーテル、ポリオール、ポリペプチド鎖（ポリペプチド鎖は、ペプチド核酸のポリペプチド鎖を含む）、又は水溶性合成高分子である。）。
  2. 　Ｙが、次の式ＩＩで表される基である、請求項１に記載の化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （ただし、式ＩＩにおいて、
    　Ｒ１１は、水素原子又は水酸基であり、
    　Ｒ１２は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ1基であり、
    　Ｒ１３は、水酸基、又は－Ｏ－Ｑ2基であり、
    　Ｑ1は、
    　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ1に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基、トリメトキシトリチル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、アセチル基、ベンゾイル基；
    　からなる群から選択される基であり、
    　Ｑ2は、
    　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基；
    　　Ｑ2に結合するＯと一体となって形成されるリン酸基によって形成されるリン酸ジエステル結合を介して連結されるヌクレオチド、核酸又はペプチド核酸；　及び　
    　　以下から選択される保護基：
    　　２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジアルキル（Ｃ１～Ｃ４）ホスホロアミダイト基、メチルホスホンアミダイト基、エチルホスホンアミダイト基、オキサザホスホリジン基、チオホスファイト基、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｏ）ＯＨのＤＢＵ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＴＥＡ塩、－ＰＨ（＝Ｓ）ＯＨのＤＢＵ塩；
    　からなる群から選択される基である。）。
  3. 　Ｙが、水素原子、次の式ＩＩＩで表される基、又は式ＩＶで表される基である、請求項１に記載の化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003

    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
  4. 　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （ただし、式Ｉｂにおいて、
    　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
    で表される基を有するヌクレオシドである、請求項１に記載の化合物。
  5. 　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （ただし、式Ｉｂにおいて、
    　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
    で表される基を有するヌクレオチドである、請求項１に記載の化合物。
  6. 　塩基部分として、次の式Ｉｂ：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （ただし、式Ｉｂにおいて、
    　Ｘは、酸素原子又は硫黄原子であり、
    　Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、－ＯＨ基、アミノ基、ニトロ基、メチル基、フッ化メチル基、エチル基、フッ化エチル基、及びＣ１～Ｃ３のアルキルスルファニル基からなる群から選択された基である。）
    で表される基を有する核酸又はペプチド核酸である、請求項１に記載の化合物。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の化合物からなる、光反応性架橋剤。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の化合物を使用して、ピリミジン環を有する核酸塩基との間に光架橋を形成する方法。
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