JPH04506206A - ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヌクレオチド架橋試薬として使用するためのクマリン誘導体 本発明は、相補的核酸配列を架橋するために使用することができる光反応性核酸 類似体に関する。

ツ　Ｉ 試料、とりわけ臨床試料中の生物学的起源の分析物の存在を決定するための技術 開発には、かなりの興味が存在する。

ある技術は、ＤＮＡ及びＲＮＡのような核酸の相補鎖間で起こる、ハイブリダイ ゼーションとして知られる相補的結合を用いて、試料中のＤＮＡまたはＲＮＡを 含有する分析物の存在を同定する。

動物細胞中の遺伝的欠陥を検出することと同様に、生物学的試料中の特定のウィ ルス、細菌、または他の生物の存在を決定することのために、特異的ハイブリダ イゼーション技術が開発されてきた。最近開発された技術の中に、標的及び試薬 ポリヌクレオチド鎖の間に共有結合を形成させることによるものがある。このよ うな技術の一つでは、光活性化時に分析物と共有結合を形成することができる光 活性化可能な部分を共有結合で含有する核酸試薬（プローブ）が創製されている 。プローブ及び分析物をハイブリダイジング条件下で混合しそして結合基を光活 性化すると、２本の鎖を結合する共有結合が形成される。プローブがまた検出可 能Ｖ標識をも含有する場合には、１本及び２本鎖核酸を分離する厳密な技術を利 用して、架橋した核酸鎖の存在を決定することによって試料中の分析物の存在を 決定することが可能である。例えば、Ｙａｂｕｓａｋｉらの米国特許第４．５９ ９，３０３号には、標的配列に対して架橋可能であるプローブを用いたハイブリ ダイゼーション技術が記述されている。

これらの先行技術は典型的には、ポリヌクレオチドの塩基性残基に共有結合する 光活性化可能な基の使用に依存している。しかしながら、公知の光活性化可能な プローブの合成、とりわけ大量合成は困難である。

従って、より容易に利用できる光活性化可能な核酸類似体が望まれる。

Ｉ　の　ス 本発明は、ハイブリダイゼーション測定において光架橋性試薬として使用するこ とができる光活性化可能な化合物、並びにその最終製品を調製するために使用す ることができる中間体及び技術を提供する。本化合物は、クマリンまたはクマリ ン類似体のフェニル環（特に７−位で）をＤ−リポースまたはＤ−２−デオキシ リボース分子の１−位に結合することによって調製されたヌクレオシド類似体を 含んで成る。このヌクレオシド類似体を含有するプローブがハイブリダイゼーシ ョン測定に用いられた場合、クマリン環系の３−及び４−位の間の二重結合が、 相補鎖中のヌクレオシドに共有結合で架橋する光活性化可能な基である。大部分 、この光活性化可能な化合物は、以下の化学式、 日を　するだめの　のノビ 本発明は、ハイブリダイゼーション測定において二価の光活性化可能な架橋性基 として作用する各種クマリン誘導体の使用についての研究から部分的に生じた。

特に、プソラレンの二重結合の一つをヌクレオシドと反応させて、光活性化可能 な二重結合を（典型的には、遮断基の除去後に）保持した付加物を生産した。こ の付加物をオリゴヌクレオチド中に取り込み、そして相補的オリゴヌクレオチド とハイブリダイズさせると、光活性化時に架橋が起こる。このような分子は、同 時係属出願筒０７１０６３，２３９号に記述されている。この種の架橋性基は多 くの用途に対して満足なものであるが、架橋性基／ヌクレオシド付加物は、特に 大量に合成することが困難である。

より小さい架橋性基を検討している中で、本発明者は、隣接領域におけるハイブ リダイゼーションに悪影響を及ぼすことなく、ヌクレオシド塩基を完全に脱離さ せることが可能であることを決定した。本発明のヌクレオシド類似体は、塩基が 通常占有する位置において糖に結合した、光活性化可能なりマリンを含んで成る 。通常は核酸鎖間の認識にあずかる塩基がここでは欠失しているにもかかわらず 、比較的小さい光活性化可能な基を付与することによってハイブリダイゼーショ ンが効率よく起こる。クマリン部分は、ハイブリダイゼーション中に相補的オリ ゴヌクレオチド鎖に挿入し、そしてそれによって相補鎖のチミン残基に光架橋す るのに適当に位置する。さらに、光活性化を用いてプソラレン及びヌクレオシド 塩基間に付加物を形成させた先行技術によって可能であったものよりも、容易に 大量の架橋性プローブを調製することが可能である。

本発明の特定の光活性化可能な化合物は、クマリン部分のフェニル環を（好まし くは７−位で）Ｄ−リボースまたはＤ−２−リボース部分の１−位に結合するこ とよって調製される。クマリン部分は、（ＩＮへの必須結合を除いて）未置換で あるかまたは置換したものであることができる、クマリン中央の１，２−ベンゾ ピロン構造を最小限に含有する。置換基がフェニル環にまたはクマリン部分の３ ＝若しくは４−位に存在する場合には、典型的には、芳香族環上に及びビニル置 換基として通常見いだされる種類の１〜３個の安定な有機置換基が存在するが、 置換基が、立体障害を避けるように選択されそしてそれ以外は有機化学の標準に 従い適合するように選択される場合には、（可能な最大数以下の）より多くの置 換基が存在することが可能である。これらの置換基は一般に小さく、（水素を含 み）総数１５個以下の原子を含有する。

このような１換基は一般に、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボニル、カルボキ シ、ヒドロキシ、アミノ、及びアミド基；一つ以上の前記基で置換されたヒドロ カルビル基；並びに未置換ヒドロカルビル基から選択される。クマリン部分の３ −及び４−位の置換基は、典型的には低級ヒドロカルビル基、−１には低級アル キル基である。

本発明の化合物は、以下の化学式を有することが好ましい。

すなわち、 式中、ｎは０，１．’２、または３（好ましくは０，１，２；より好ましくは０ または１）であり；各Ｗは、独立的に、１５個以下の原子を含有する小さな安定 置換基（特に、低級ヒドロカルビル基；ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボニル 、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ、若しくはアミド基；またはへテロ原子を含 んで成る一つ以上の前記基を含有するヒドロカルビル置換基）であり；Ｙ及びＺ は、独立的に、Ｈまたは低級アルキル基を表し；Ｘは、（ａ）炭素原子１〜５個 、（ｂ）Ｏ，Ｓ、及びＮから成る群より選択されたベテロ原子０〜３個、（ｃ） 及びハロゲン原子０〜２ｍ個（ｍはＸ中の炭素原子数であり； のようなペテロ原子に対してα位にあるハロゲンは、安定性に関する問題のため 許さない）を含有する有機結合基であり、そしてＸは１〜４個の原子の結合鎖を 含んで成り；ＲはＨまたはＯＲ’であり；そしてＲ１，Ｒ１、及びＲ３は、独立 的に、Ｈまたはポリヌクレオチド自動合成中にヒドロキシル基とカップリング若 しくはヒドロキシル基を保護できる基を表わすか、或はＲ２またはＲ３は、３’ 、５’−リン酸ジエステル結合によって前記化合物に結合したヌクレオチドまた はポリヌクレオチドを表わす、好ましいカップリング基には、ボスファイト、ホ スホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａａ＋１ｄｉｔｅｓ）　、ホスフェート、Ｈ −ホスホネート、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ） 、及びメチルホスホネート類のような、リン含有結合基が含まれる。他の非リン カップリング基には、カルバメート及びアミド類が含まれる。低級ヒドロカルビ ル基には、直鎖及び分岐鎖両方の０１〜Ｃ６アルキル基（並びにＣ１〜Ｃ８環状 基と同様にＣ２〜Ｃｂアルケニル及びアルキニル基）が含まれ、そして好ましく はＣ，−Ｃ，アルキル基、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチ ル、イソブチル、Ｓ−ブチル、及びｔ−ブチル基、が含まれる。ヘテロ原子置換 基を有する典型的なヒドロカルビル基には、Ｃ０ＣＨｓ　、　ＣＨｚ　ＯＨ／　 ＣＦ３　、ＮＨＣＨ３。

−Ｃｏ、ＣＨ，ＣＨ，、及び−ＣＯＮ　（ＣＨ，）Ｚが含まれる。リボースまた は２−デオキシリボース糖部分の立体化学は、天然のヌクレオチドに存在するも のと同じもの（すなわち、Ｄ−ＩＮ）である。本明細書中における糖部分に関す るすべての参照は、特に断わらない限りＤ−糖を意味する。

本発明の化合物は、ハイブリダイゼーション測定における試薬（典型的に「プロ ーブ」として知られている）として使用される光活性化可能なポリヌクレオチド の、調製における中間体として、または成分として、どちらにも使用可能である 。目的はこれらの分子が最終的にポリヌクレオチドの一部を形成することである ので、この分子の一部を形成する糖部分はリボースまたはデオキシリボース分子 のどちらかに由来する。リボースまたはデオキシリボース分子は重合性糖主鎖に 取り込まれ、その中で個別のＩＮ基が３′−及び５′−ヒドロキシル基間でリン 酸ジエステル基によって結合される。本明細書中で用いた付番方式は、ヌクレオ チドで使用されるものと同じである。すなわち、「塩基」　（ここではクマリン 誘導体）の原子はアラビア数字で区別し、そして糖部分の原子位置はプライム符 号付アラビア数字で区別する。

本発明の化合物のクマリン部分は、クマリン自体またはすべてのいくつかの置換 クマリンから由来することができる。

糖が結び付くことになる位？ｌ！（本明細書中において結合位置と称される）の 基は、典型的には最終生成物においてクマリン部分を糖部分に結合する結合基の 前駆体として機能する。

しかしながら、最終生成物はしばしば別の合成経路によって調製されうるので、 すべての特定の最終生成物はおそらくいくつかの前駆体を有することが可能であ る。さらに、結合基の一部だけがクマリンの結合位置における置換基から調製さ れ、結合基の残りの部分が糖部分から由来することは可能である。実際に、共有 結合を形成させるために糖の１′〜位におけるヒドロキシ基または１′−位にお けるアミノ若しくはチオ基のような別の反応性置換基を、置換基上で脱離基（Ｉ ｅａｖｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）と反応させる場合が典型的である。

結合位置以外の位置では、クマリン環系は未置換または置換のどちらでもよい。

フェニル環上の典型的置換基は、有機化合物の芳香環上に通常見いだされる小さ な置換基である。

置換基を所望のとうりに選択して、クマリンの励起波長を変化させることが可能 である。３−及び４−位における置換基は、典型的には非極性であり、そしてた いかいは炭化水素置換基（メチル置換基が最も普通）である。置換基の位置は変 化させることができるが、多（は４−及び８−位において見いだされる。

ある好ましい実施態様において、糖部分と反応する前のクマリン部分は、化学式 、 （式中、Ｙ、Ｚ、ｎ、及びＷは先に定義した意味を持ち、そしてＸｌはＸ結合基 の全体的または部分的前駆体である）を典型的に有する。Ｘｌ基が糖部分の有機 官能基と反応して最終結合基Ｘ中の共有結合を形成するので、反応性官能基がＸ ｌ中に存在しなければならない。典型的な反応性官能基は請求核性または電子性 の置換または付加反応を経ることができる請求核性または電子性基である。官能 基は、（糖部分の脱離基との３８２反応に関与するヒドロキシ基のような）最終 生成物において完全に若しくは部分的に保持されるもの、または（ｔＪ！部分の ヒドロキシ基とのＳＮＩ反応若しくはＳ８２反応に関与するハロゲンのような） 最終生成物において存在しない脱離基、であることができる。特定の官能基の例 として、ヒドロキシ、アミノ、ハロゲン、チオール、カルボニル、及びカルボキ シ（エステル及びアミドを含む）基が挙げられる。これらの誘導体は、クマリン 自体または多くの市販されているクマリン誘導体から、標準的有機合成方法によ って合成することができる。例えば、生化学及び有機化合物のカタログ（シグマ ケミカル社、１９８８年４５２頁）、並びにファインケミカルのアルドリツヒカ タログノｈンドブ・ツク（１９８８−１９８９年、４０６及び４０７頁）を参照 できる。

Ｘｌ前駆体の残りの部分は、先述の寸法及び極性に関する条件、すなわち、最終 Ｘ基が、非極性から適度の極性（典型的には、先述の基の遊離ヒドロキシルまた はアミノ基を含有しない）であり、且つ１〜５個の炭素原子並びに０．Ｓ、及び Ｎから成る群より選択された０〜３個のへテロ原子を含有し、そして最終Ｘ基が 、糖の１′−位とクマリン誘導体の結合位置との間に１〜４個の原子の結合鎖を 含んで成ること、が存在する限り、特に限定されない。ハロゲンもまた、典型的 にはハロゲン化炭化水素架橋基中に（２ｍ個以下で、（ｍは架橋基中の炭素原子 数である））存在することができる。好ましくは、Ｘ結合基は化学式ｘ”　、ｏ ｘ”　、ｓｘｚ　、またはＮＨＸ”　（式中、Ｘ２はＣ９〜Ｃ，ヒドロカルビル 基または０１〜Ｃ，ヒドロカルボキシ基であり、そのどちらもケト若しくはエス テル官能価（または８４以物）状の０〜２個のカルボニル酸素で置換されている ）を有するが、但し、ｏ、Ｓ、またはＮＨがＸの一部として存在する場合、この Ｏ９Ｓ、若しくはＮＨ（または２個以上存在する場合、このような基の一つ）が 、複環の１′−位に結合し、そしてＸ２基が前記へテロ原子と結合して安定な共 有結合を形成する。特に好ましい結合基は、以下の化学式、 （式中ｍは２〜４の整数であり、そしてＸ３は０．Ｓ、またはＮＨである）を有 するものである。とりわけ好ましい結合基は、前文の最初の六つの基のように、 結合鎖中に原子を２個有する。

一般式中の糖部分上に示された基、すなわちＲ，Ｒ”、及びＲ３は、ヌクレオチ ド、ポリヌクレオチド、または合成化学的手段によるポリヌクレオチドの合成に おける前駆体、の糖部分に典型的に存在するもの、とりわけ固相合成において存 在する保護基及び活性化基である。ＲはＨまたはＯＲ’のどちらかであり、Ｒ１ は以下に定義する。ＲがＨである場合、糖はデオギシリボースであり、そしてこ のスフレオシド類似体はＤＮＡ分子に取り込まれるように予定される。Ｒが○Ｒ １である場合、糖はリボースまたはリポースＦＡ’４体であり、そしてこのヌク レオシド誘導体ｔ体はＲＮ　、６．分子に取り込まれるように予定される。

Ｒ１、ＲＺ、及びＲ３は、独立的に、Ｈまたはヒドロキシル保護基若しくはヒド ロキシルカップリング基を表し、そしてＲ２及びＲ３は、典型的に３’、５’− リン酸ジエステル結合によって分子の残り部分に結合したヌクレオチドまたはポ リヌクレオチドをさらに含んで成ることができる。より詳細には、ヒドロキシル 保護基及びヒドロキシルカップリング基は、ヌクレオチド化学において、とりわ けヌクレオシド、ヌクレオシド誘導体、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオ チドとの３′−または５′−ヒドロキシル基を介する化学結合が合成方法の目的 であるＤＮＡ及びＲＮＡ分子の固相化学合成において、通常用いられる基である 。ポリヌクレオチドの合成中に糖部分に典型的に存在する保護基及びカップリン グ基並びにこのような化学を回顧するためには、「オリゴヌクレオチド合成、実 用的方法Ｊ　（Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ、　ｅｄ、＋　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｔｄ、 、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｇｒｅａｔ　Ｂｒ１ｔａｉｎ　１９８４）　；Ｒｅｅｓｅ ＋　Ｇ、Ｂ、、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　（１９７８）　３４　；　３１４３　 ；及びＡ＋ｗａｒｎａｔｈ、　Ｖ、　ａｎｄ　Ａ、Ｄ、８ｒｏｏｍ、　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　（１９７７）　７７　；　１８３を参照できる。

特に好ましい化学物は、Ｒ’　、Ｒ”　、及びＲ３が、Ｈ；ベンゾイル；Ｃ１〜 Ｃ４アルキル、Ｃ０〜Ｃ４アルコキシ、シアノ、ニトロ、若しくはハロゲンで置 換されたベンゾイル；トリアリールメチル（アリールはフェニル及びナフチルか ら通常選択される）；またはＣＩ’＝　Ｃａアルキル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシル 、シアノ、ニトロ、若しくは他の小さな有機基で置換されたトリアリールメチル 、から独立的に選択された化合物である。トリチル及び置換トリチル（とりわけ ４．４′−ジメトキシトリチル）置換基は、Ｒ３に対して特に好ましい。何故な ら、これらの基はこの位置における固相合成にしばしば用いられるからである。

ピキシル（９−フェニルキサンテニル）基もまた通常使用される。トリチル及び 置換トリチル基を、Ｒ１及びＲ２として通常使用することはより少ない。Ｒ１に 対しては、４−メトキシテトラヒドロビラン−４−イル基が好ましい。

本発明の化合物は、本明細書において記述したガイドラインを用いる、合成有機 化学の標準的技法によって調製することができる。例えば、市販の出発原料に基 づく典型的合成方法を以下の反応機構に記述する。反応機構に用いられた略号は 以下のとうりである：ＮＢＳ＝Ｎ−ブロモスクシンイミド；ＤＭＥ＝１．２−ジ メトキシエタン；ｐｙｒ＝ピリジン；ＤＭＴ−ＣＩ　＝ジメトキシトリチルクロ リド；（ｉＰｒ）ｚＥｔＮ＝ジイソプロピルエチルアミン。示した反応に関する さらなる詳細は、以降の例中に記述する。糖の１−位における二つの可能なアノ マーの一つだけを示す。合成では、α−及びβ−アノマーが通常得られる。純粋 な単一アノマーを提供するためのアノマーの分離が、以下の例（例えば、例６） に示されるように、合成の各種段階において達成されうる。

反　応　機　構 先に示した反応機構における官能基を転換するために用いられる技法の改変、ま たは他の出発原料の選択、のどちらかによる本反応機構の多くの変法を用いて他 の分子を調製することが可能である。例えば７−ブロモメチル基は、より複雑な 結合基の前駆体として使用することができる、容易にアルキル化された基を提供 する。芳香族クマリン環に直接結合しした酸素または他のへテロ原子を有する分 子の前駆体として使用できる市販のクマリンには、７−ヒドロキシ−３−メチル クマリンが含まれる。７−ヒドロキシ基がクロロカルボニルメチレン基に転換さ れた前記分子の誘導体もまた利用可能である。他の有用な市販化合物には、６− メチルクマリン、７−メチルクマリン、７−ヒドロキシクマリン、７−ヒドロキ シ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４− トリフルオロメチルクマリン、７−カルポキシメチルー４−メチルクマリン、７ −メチルクマリン、４′−ヒドロキシメチル−４，５’、８−トリメチルブソラ レン、４′−アミノメチル−４，５’、８−１−リメチルプソラレン、及びアン ゲリシンが含まれる。プソラレン及びアンゲリシンにおいては、結合基はフラン 環の一部分を含んで成る；例えば、ＨＭＴ−プソラレンでは、結合鎖は４′炭素 及びヒドロキシメチル置換基、またはフラン酸素、５′及び４′炭素、並びにヒ ドロキシメチル置換基であると考えることができる。出発原料の糖には、リポー ス及びデオキシリボース自体と同様に、各種位置において既に遮断基を有してい る他の市販化合物が含まれる。例として、メチル−２−デオキシ−３，５−ジー ０−（ｐ−二トロベンゾイル）〜Ｄ−リポフラノース、トリー〇−ベンゾイルー １−アセチル−Ｄ−リボフラノース、及びテトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−リボフラ ノースが挙げられる。

上述の反応機構に示したように、得られた最初の生成物は、典型的にはＲ２及び Ｒ３が保護されたヒドロキシ基として存在する化合物である。このような化合物 は典型的には脱保護され、次いで本発明のヌクレオシド類似体を含有するポリヌ クレオチドを調製するために、特定の保護または活性化基を付加される。重合反 応が塩基類似体を含まず、糖部分だけなので、ポリヌクレオチド調製用の標準的 技法を少しだけ改変して用いることができる。はとんどの場合、必要な唯一の改 変は、新たに合成された樹脂オリゴヌクレオチドを、熱アンモニアで脱ブロツク 化する前に、１Ｍ炭酸ナトリウムを用いて５０゛Ｃで２時間処理することである 。この処理によってクマリン環が開環し、そしてクマリン環の２−位におけるア ンモニアの攻撃によるアミド生成が防止される。アミド生成は、続く緩酸条件下 でのクマリン環の再閉環を妨げるので、避けられるべきである。有用な技法が、 Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ＋　ｅｄ、　、並、　ｃｉＬ、に記述されている。

本発明のヌクレオシド類似体は、３′−末端、５′−末端、または内側位置のい ずれかにおいてポリヌクレオチドに取り込ませることが可能である。天然のポリ ヌクレオチドを本発明のヌクレオシド類似体で標識する場合、標識は典型的には 、ヌクレオチドの操作がより容易である制限部位または分子の一末端で起こる。

本発明のヌクレオシド類似体が、合成調製されたポリヌクレオチドに含まれる場 合には、前記類似体は合成中において分子内のすべての位置に容易に挿入されう る。

プローブは、それが本発明のヌクレオシドを含有することの例外を除いて、その 他は分析物ヌクレオチドの一部と相補的であるように選択され、これが分析物ポ リヌクレオチド中のヌクレオシドと誤対合する。本発明のヌクレオシド類似体は 、プローブが目的の分析物ポリヌクレオチドとハイブリダイズした場合に、本発 明のヌクレオシド類似体と誤対合した分析物ポリヌクレオチド中のヌクレオシド 残基の５′側に隣接してチミジンまたはウリジン残基が存在するように、プロー ブ中に位置させるべきである。この関係は、２本のハイブリダイズしたポリヌク レオチド鎖中の二つの隣接ヌクレオチドを示す化学式、すなわち、 （式中、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、Ｘはすべてのヌクレオチド、そしてＹ は本発明のヌクレオチド類似体であり、そして両鎖の５′端が示される）で理解 することができる。

本発明のヌクレオシド類似体は、ハイブリダイゼーション測定において相補鎖中 の対応する塩基と水素結合しないので、プローブ末端の一つに架橋剤を取り込ま せることによって、ある利点が得られる。例えば、ポリヌクレオチドプローブ１ ５塩基長中の中央位置に本発明の架橋剤を含むと、中央位置に中断が存在しうる ７塩基長の二つの相補配列が残るだろう。

結合親和力は連続する結合対数の増加に伴い対数的に増大するので、連続する７ 塩基の二つの群より、連続する１２または１３塩基が相補的であるように、架橋 剤が分子の一末端付近に存在する場合に、より大きな結合親和力が存在する。

プローブ末端から１または２塩基のところにヌクレオシド類似体を位置させるこ とは、非特異的架橋を低減し、そしてプローブ末端に類似体を位置させることよ りも好ましい。

プローブ末端の一つにまたはその付近に位置させる場合、ヌクレオシドは、架橋 効率にほとんどまたは全（影響を及ぼさないので、α−またはβ−アノマーのど ちらでもよい。プローブ中の中央位置に位置させる場合、ヌクレオシドは、架橋 効率を増大させるためにβ−アノマーであることが好ましい。

ここでは本発明を一般的に記述してきたが、例示目的で提供しそして本発明を限 定するものではない以下の詳細例を参照することによって、本発明はより良く理 解される。

１７−プロモメチルクマ１ンのｉ、＋１７−メチルクマリン（１０ｇ、６２．　 ４ｍｍｏｆ）及びＮ−ブロモスクシンイミド（１１，１ｇ、６２．　４ｍｍｏｌ ）を、クロロホルム５０ｍ１に加えた。次いでこの懸濁液を２４時間還流すると 、透明な溶液になった。還流を５日間継続した。この時点で、球状塊の結晶が生 成した。反応混合物を室温に冷却し、次いでＯ″Ｃの冷蔵庫内に２４時間入れて おいた。結晶を濾過して集め、そして少量の冷クロロホルムで洗浄した。簡単な 減圧排気によってクロロホルムを除去した後、結晶を最少量の沸騰アセトンに溶 解し、そして数日間かけて結晶化させた。結晶を濾過して集め、そして少量の冷 アセトンで洗浄した。減圧乾燥後の収量は７．１５ｇ（理論量の４８％）であっ た。融点は１７９．５〜１８１．５°Ｃであった。

２７−ヒドロキシメチルクマリンの８．ｎアセトン及び水の１：１混合物（５６ ０ｍ１）に７−ブロモメチルクマリン（７，０ｇ、２９．　３ｍｎ＋ｏｌ）を加 えた。生じた懸濁液を４８時間還流し、その時点で反応混合物は透明溶液になっ た。次いでこの溶液を冷却し、重炭酸ナトリウム（２，４ｇ、２９．　３ｍｍｏ ｌ）で中和し、そして減圧で濃縮して約６５ｍ１にした。厚い塊の結晶が得られ た。結晶を濾過して集めて、減圧乾燥すると生成物５．２７ｇが得られた（理論 量の１００％）。融点は１１６〜１１７℃であった。

減圧適用側管を有する直径２５ｍｍの試験管に、７−ヒドロキシメチルクマリン （３００ｍｇ、１．　７０ｉｍｏｌ）及び２−デオキシ−３，５−ジ−ｏ−ｐ− トルオイル−α−Ｄ−リボフラノシルクロリド（６００ｍｇ、１．　５４ｍｎ＋ ｏｌ）を入れた。試験管をきつく密栓し、そして側管を通して試験管に約１ｍｍ の減圧を適用した。次いで減圧排気した試験管を、１１０°Ｃの油浴中で５分間 加熱した。加熱当初の２分間は、ＨＣＩガスが激しく発生した。次いで反応混合 物を室温に冷却し、そして残留物を、アセトン及びヘキサンの１：１混合物３〜 ４ｍｌに吸収した。次いでこの溶液を、溶離液としてアセトン／へキサン１：１ を用いた５　０ｍｓ＋Ｘ　１５０ｍｍシリカゲルカラムのクロマトグラフィーに かけた。生成物を含有する画分をＴＬＣによって同定し、そしてプールしてガラ ス状に濃縮した。

このガラスを酢酸エチル１０ｍ１中に吸収した。５０ｍ１三角フラスコ中の酢酸 エチル溶液を、ペンタン２０ｍ１を含有するジャーに入れた。次いでジャーを封 止し、そして結晶化を進行させた。収量は白色結晶３３０ｍｇ（理論量の４１％ ）であり、融点は９２〜１０６°Ｃであった。アセトン／ヘキサン１：１中にお いてＲｆ＝０．４８であった。ＮＭＲ測定は、この物質がα−及びβ−アノマー のおよそ１：１の混合物であるこ７−ヒドロキシメチルクマリン（２，４９ｇ、 １４．１５ｍｍｏｌ）及び油中の５０％水素化ナトリウム（７４７ｍｇ、１５゜ ５７ｍｍｏ１）を、１，２−ジメトキシエタン１２５ｍ１に加えた。

懸濁液が生じた。次いで２−デオキシ−３，５−ジー０−ｐ−トルオイル−α− Ｄ−リボフラノシルクロリド（５，５０ｇ、１４．　１５ｍｍｏｌ）を、迅速に 攬はんした懸濁液にゆっくりと少しずつ加えた。５分後、氷酢酸１ｍｌを加えて 反応混合物を中和した。次いで反応混合物を濾過し、そして減圧濃縮して油にし た。次いでこの油を、溶離液として酢酸エチル／ヘキサン（ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ ）１　：　１を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製した。生成物 を含有する両分をＴＬＣにより同定し、そしてプールして減圧下で油に濃縮した 。生成物はＴＬＣにより均質であった。ＮＭＲ測定は、生成物がα−及びβ−ア ノマーをおよそ１：１の比率で含有する混合物であることを示した。収量：３． ７７ｇ（理論量の５０％） 例４由来の７−ヒドロキシメチルクマリンの３’、５’−ジー０−ｐ−）ルオイ ルー２′−デオキシリボシド（２，６ｇ＋　４．　９２ｍｍｏｌ）を、ピリジン ／メタノール／水（６５：３０：５）２５ｍｌに溶解し、そして氷水で簡単に冷 却した。

次いでピリジン／メタノール／水（６５：３０：５）中の２Ｍ　ＮａＯＨ２５ｍ １を水浴中で攬はんしながら加えた。２０分後、ＮＨ４Ｃ１３，２ｇを添加して 反応を停止させた。沈澱物を濾過して取り去り、次いで減圧で濃縮して乾燥させ た。

残留物をＥｔＯＡｃ／アセトン（９：　１．　１０＋ｎｌ）に吸収させ、そして その溶液を幅５０ｍｍ高さ１５２ｎｍのシリカゲルカラムに適用して、ＥｔＯＡ ｃ／アセトン（９：１）で溶出した。画分をＴＬＣによって同定した。溶出液中 の生成物のＲｒは約０．４２であった。生成物（α−及びβ−アノマー混合物） を含有する“画分を減圧で濃縮すると、生成物６００ｍｇ（収率４２％）が得ら れた。

例５由来の７−クマリニルーメチルーβ−Ｄ−２′−デオキシリボシド（５８０ ｍｇ、１．　９８ｍｍｏｌ）　、４−Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジン（１２ ｍｇ）、及びトリエチルアミン（３８５ｕ　ｌ、２．　７７ｍｍｏｌ）をピリジ ン２０ｍ１に加えた。

得られた溶液に、４，４′−ジメトキシトリチルクロリド（８１２Ｂ、２．　４ ０ｍｍｏｌ）を加えた。次いで反応混合物を３時間攬はんした。次いで混合物を 水２５ｍ１で処理し、そして得られた混合物をエチルエーテル２Ｘ１２０ａ＋１ で抽出した。

混合したエーテル抽出物を減圧で濃縮し、アセトン／塩化メチレン（０，５：　 ９．５）２．５ｍｌに溶解し、そして同じ溶剤（２％トリエチルアミン含有）を 用いたシリカゲルカラムのクロマトグラフィーによって精製した。二つの両分（ 同じ溶出系におけるシリカゲル薄層クロマトグラフィーによるｒｆｏ、３０及び ０．４０）が得られた。これらの百分は、分離されたα−及びβ−アノマーであ る。ｒｆｏ、４０画分の収量：３６５ｍｇ。

三塩化リン（２５７，４μｍ、２９．　５ｍ５ｏｌ）及びＮ−メチルモルフォリ ン（３，２４ｎ＋１．　２９．　５ｎ＋ｎ＋ｏｌ）を塩化メチレン３０ｎ＋１に 溶解した。次いでその溶液にトリアゾール（６７８ｍｇ、９．　８２ｍｍｏｌ） を加えた。３０分後、反応混合物を０°Ｃに冷却し、そして乾燥塩化メチレン８ ｍｌ中の例６のＤＭＴ誘導体（３５０ａ＋ｇ、０．　５８９ｉＩＩＩｏｌ　；　 ＣＨ３ＣＮから共蒸発により乾燥した）を攪はんしながら２０分間かけて滴下し て添加した。添加開始から３０分後、反応混合物をｐＨ８，５のＩＭ重炭酸トリ エチルアンモニウム２４ｍ１に注ぎ込み、そして分液漏斗中で振った。有機相を 分離した。水相を塩化メチレン８ｍｌで抽出し、そして混合した有機相を硫酸ナ トリウムで乾燥した。次いで乾燥した有機相を濃縮してフオーム（ｆｏａｍ）に し、塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン（５００：　４０　：　６） １．５ｍｌに溶解し、そして同じ溶剤のシリカゲルクロマトグラフィーによって 精製した。収量ニガラス状の５００ｍｇ。

８　本　Ｈのヌクレオシド　゛　を１　するオリゴ元り先ジヌクレオチドのしＩ ！ ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＨ−ホスホネート法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　（１９８６）　１４　：　５３９９）を用いて、以下のオリゴヌ クレオチドを作製した。

５’　−ＣＡＧＣＣＴＴＸＡ−３’ 上記式中、Ｘは（７−クマリニル）メチル−β−Ｄ−２’　−デオキシリボシド であり、そしてＡ、Ｃ，Ｇ、及びＴはヌクレオチドにおける通常の意味を有する 。

作製後、オリゴヌクレオチド（１０ｍｇ）を有する固体支持体をＬＭ　Ｎａ、　 ＣＯｓ　（２００ｍ１）を用いて５０′Ｃで２時間処理し、次いで濃アンモニア ２ｍｌを添加し、そして５５°Ｃで１８時間加熱した。次いでオリゴヌクレオチ ドをポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。

オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドとの特異的ハイブリダイジング及 び（光活性化後の）架橋において有効であることが示された。

例６の手順由来の乾燥ＤＭＴ誘導体（８２７μｇ、１．３９　ｍｎ＋ｏｌ　）を 、ジイソプロピルエチルアミン（１，２１ｍ１，５゜５６ｍｍｏｌ）及びジクロ ロメタン（３ｍｌ）で処理する。この懸濁液を、それが透明溶液になるまで攬は んする。次いでクロロ＝Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（４ ００ｕ　ｌ、２．　０９ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を１５分間攪はんし、 その後無水メタノール（２０１！ｌ）を添加して反応を停止させる。次いで反応 混合物を酢酸エチル（３０ｍｌ）及びトリエチルアミン（１，５ｍ１）で希釈し 、そして１０％炭酸ナトリウム水溶液（２Ｘ２０！ｌ’ｌ）、次いで飽和塩化ナ トリウム水溶液（２Ｘ２０ｍｌ）で抽出する。次いで有機相を減圧で濃縮する。

生成物を、展開溶剤として酢酸エチル／ジクロロメタン／トリエチルアミン（４ ５：４５：１０）を用いたシリカゲルのクロマトグラフィーによって精製する。

生成物を含有する画分を減圧濃縮すると、白色粉末が得られる。

収量は約１グラムである。メチルホスホラミダイトの代わりにシアノエチルホス ホラミダイトを作製するためには、クロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメト キシホスフィンの代わりにクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノシアノエトキ シホスフィン（４７９μｌ、２．　０９ｍｍｏｌ）を使用する。

本明細書中に述べたすべての文献及び特許出願は、本発明が関する当業者の技術 レベルを表示する。すべての文献及び特許出願は、あたかも各個別の文献または 特許出願が詳細にそして個別に参照として取り込まれていることが示されている かのように、同程度で参照としてここで取り込まれる。

本発明はここで完全に記述されており、添付の請求の範囲または精神から逸脱す ることなく、多くの変化または改変を行うことができることは、通常の当業者に は明らかである。

手続補正書 平成４年６月１０日

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．クマリン部分がリボースまたはデオキシリボース糖部分に、前記糖部分の１ ′−位及び前記クマリンのフェニル環の間の結合基により結合したヌクレオシド 類似体を含んで成る、光活性化可能な化合物。
2. ２．前記結合基が１〜４個の原子の結合鎖を含んで成る、請求の範囲１記載の化 合物。
3. ３．前記結合基が前記クマリン部分の７−位に結合した、請求の範囲１記載の化 合物。
4. ４．前記結合基が、炭素原子１〜５個；Ｏ，Ｓ、及びＮから成る群より選択され たヘテロ原子０〜３個；並びにハロゲン原子０〜２ｍ個（ｍは前記結合基中の炭 素原子数である）を含有する、請求の範囲１記載の化合物。
5. ５．前記クマリン部分が未置換クマリンである、請求の範囲１記載の化合物。
6. ６．前記クマリン部分が、前記クマリン部分のフェニル環上で１〜３個の安定な 有機置換基により置換されたクマリンである、請求の範囲１記載の化合物。
7. ７．前記置換基が、１５個以下の原子を含有する有機置換基から成る群より選択 されている、請求の範囲６記載の化合物。
8. ８．前記置換基が、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボニル、カルボキシ、ヒド ロキシ、アミノ、アミノ、及びアミド基；一つ以上の前記基によって置換された ヒドロカルビル基；並びに未置換ヒドロカルビル基から選択された、請求の範囲 ７記載の化合物。
9. ９．前記クマリン部分が、３−または４−位において低級アルキル基によって置 換された、請求の範囲１記載の化合物。
10. １０．前記化合物が、化学式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ｎは０，１，２、または３であり；各Ｗは、１５個以下の原子を含有す る安定な有機置換基であり； Ｙ及びＺは、独立的に、Ｈまたは低級アルキルを表わし；Ｘは、炭素原子１〜５ 個；Ｏ，Ｓ、及びＮから成る群より選択されたヘテロ原子０〜３個；及びハロゲ ン原子０〜２ｍ個（ｍはＸ中の炭素原子数である）を含有する有機結合基であり 、そしてＸは１〜４個の原子の結合鎖を含んで成り；ＲはＨまたはＯＲ１であり ； Ｒ１，Ｒ２、及びＲ３は、独立的に、Ｈまたはヒドロキシル保護若しくはヒドロ キシルカップリング有機基を表わし、そしてＲ２及びＲ３は、３′，５′−リン 酸ジエステル結合によって前記化合物に結合したヌクレオチドまたはポリヌクレ オチドをさらに含んで成ることができる）を有する、請求の範囲１記載の化合物 。
11. １１．前記化学式中Ｘが、Ｘ２，ＯＸ２，ＳＸ２、またはＮＨＸ２（式中、Ｘ２ はＣ１〜Ｃ５ヒドロカルビル基または０〜２個のカルボニル酸素で置換されたＣ １〜Ｃ５ヒドロカルビルオキシ基であり、但し、Ｏ，Ｓ、またはＮＨがＸの一部 として存在する場合、Ｘ２の炭素原子が前記Ｏ，Ｓ、若しくはＮＨと結合し、前 記Ｏ，Ｓ、若しくはＮＨが前記化学式のフラノース環の１′−位に結合している ）である、請求の範囲１０記載の化合物。
12. １２．前記ＸがＸ２またはＯＸ２である、請求の範囲１０記載の化合物。
13. １３．前記Ｘが、 −ＯＣＨ２−，−ＳＣＨ２−，−ＮＨＣＨ２，▲数式、化学式、表等があります ▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼， ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼，または−Ｘ３−（ＣＨ２）ｍ−，（式中、ｍは ２〜４の整数であり、そしてＸ３は−ＮＨ−，−Ｏ−、または−Ｓ−である）で ある、請求の範囲１０記載の化合物。
14. １４．前記Ｒ１がＨである、請求の範囲１０記載の化合物。
15. １５．前記Ｒ１が４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イルである、請求の範 囲１０記載の化合物。
16. １６．前記Ｒ２が、Ｈ；ベンゾイル；ベンゾイル（Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜 Ｃ４アルコキシル、シアノ、ニトロ、若しくはハロゲンで置換された）；トリチ ル；またはトリチル（Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはアルコキシル、シアノ、ニト ロ、またはハロゲンで置換された）である、請求の範囲１０記載の化合物。
17. １７．前記Ｒ３が、Ｈ；ベンゾイル；ベンゾイル（Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜 Ｃ４アルコキシル、シアノ、ニトロ、若しくはハロゲンで置換された）；トリチ ル；またはトリチル（Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはアルコキシル、シアノ、ニト ロ、またはハロゲンで置換された）である、請求の範囲１０記載の化合物。