JPH01500353A - ２′‐デオキシアデノシン誘導体を含む核酸検出用プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

２“−デオキシアデノシン誘導体を　む　用プローブ本発明は２′−デオキシア デノシン誘導体を含む核酸検用出プローブに係る。 ＤＮＡ又はＲＮ＾配列を検出及び単離するために、プローブとして使用されるヌ クレオチドの決定配列と、核酸を含む組成物中に場合によって含まれるプローブ のヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列とをハイブリダイズする方法を使用 することは、当業者に周知である。 従来、相補的ＤＮ＾（ｃＤＮ＾）又はメツセンジャーＲＮ＾（ｍＲＮ＾）のフラ グメントを検出するには、これらのフラグメントを放射性同位体、主にリンの同 位体（３２ｐ）で標識したオリゴデオキシヌクレオチドとハイブリダイズする方 法が利用されている。 一般にホットプローブと呼称される放射性同位体で標識したこのようなプローブ は検出感度が高い。しかしながら、放射性マーカーの使用は種々の欠点により制 限されている。 まず使用される放射性元素の寿命は一般に短いので、プローブを常に交換しなけ ればならず、原価が高くつく。 また、放射性物質を使用するには特殊な設備と公的な許可が必要であり、このよ うな許可を得るのは容易でない。 更に、このようなホットプローブを使用する定量の自動化を達成するのは困難で あることが認められている。 最近になって、放射性元素を含まないプローブを酵素的手段により構成する方法 が開発された。一般にコールドプローブと呼称されるこのようなプローブは、酵 素反応又は免疫酵素反応によりＤＮＡ又はＲＮＡを検出することができる。 例えばＮｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９８２，１０．６７８７頁に所 収のＶＩＮ−ＣＥＮＴ　Ｃ，他の論文は、抗原−モツクローナル抗体系（１，２ ）、又はペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はガラクトシダーゼ（ ３，４，５）のような酵素と結合したビオチン−アビジン系（３）に基づくコー ルドプローブについて記載している。 １９８５年以来、酵素的な組み込み及び検出を目的として修飾されたヌクレオチ ドが提案されている。これらのヌクレオチドとしては、５°位をビオチニル化さ れたホスホラミダイト誘導体（６，７＞、フォトビオチンとの誘導体（８）、及 び５゛−アミノヌクレオチド（９，１０＞が挙げられ、これらのヌクレオチドは コールドプローブに組み込まれると共にＤＮへの配列決定に役立つ。 本出願人名義の１９８４年８月２２日付は仏国特許出願第赫すゴヌクレオチドフ ラグメントから構成されるプローブが記載されている。 本発明者らは当該分野で研究を続けた結果、酵素的手段によりオリゴヌクレオチ ド配列に組み込まれ得る誘導体を生成することができた。 これらの２′−デオキシアデノシン誘導体は、改良された特性を有する生成物を 使用しながら既に調製されている修飾塩基の利点を利用することができる。 また、該誘導体の取得方法についても記載する。 本発明は、オリゴヌクレオチド配列を酵素合成するためにこれらの誘導体を使用 すること、及び特に、容易に使用できる非放射性方法により検出できる経時的に 安定な高精度１０−ブを作成するためにこれらめ配列を生物学概に利用すること を目的とする。 ２°−デオキシアデノシン誘導体は８位にアミノアルキル鎖を有しており、下式 （１）に対応する。 なお式中、Ｒ５は−０１（、−０ＰＯＪ２．−０ＰｚＯＪ＊、−０ＰｓＯｓＨ− 基、又はオリゴヌクレオチドから選択され、Ｒ２は水素原子、−０１１基、又は オリゴもしくはポリヌクレオチドから選択され、Ｒはアミノアルキル鎖を表す。 この鎖Ｒはより特定的には構造−（Ｃ）１２）、、−ＨＨＸに対応し、ここでｎ は４〜１２の整数、Ｘは水素原子、又は分子のマーカーとして機能し得る基を表 す。 適当なマーカー基はローダミン、フルオレセイン又はダンシルのような着色又は 蛍光基である。 他のＸ基はハプテンから成る。 更に他のＸ基はホスファターゼ又はペルオキシダーゼのような酵素により形成さ れる。 ペプチドもマーカー基Ｘとして使用できる。 より有利にはＸはビオチンを表す。 上記誘導体は高い安定性及び感度を有するプローブを生成することができる。該 誘導体は免疫酵素法により検出できるという利点もある。 別の非常に有利な態様によると、これらのヌクレオチドを酵素（例えばポリメラ ーゼ、ターミナルヌクレオチジルトランスフェラーゼ、リガーゼ）によりＤＮＡ 又はＲＮ＾フラグメント中に組み込むことができる。 アミノアルキル置換鎖のＸ基が水素原子を表す誘導体は、ヌクレオチド配列への 組み込み以前でも以後でもマーカー基に結合できるという利点がある。 Ｘ基がマーカー基である誘導体は、オリゴヌクレオチドの相補体を含むオリゴヌ クレオチドとのハイブリダイゼーション実験において、放射活性標識せずに配列 を検出することが可能である。 有利にはＸは着色又は蛍光基、特にローダミン、フルオレセイン、ダンシルから 選択される。 変形例としてＸはハプテン、例えばジニトロフェニルである。 他の有利な誘導体において、Ｘは酵素、特にペルオキシダーゼ、ホスファターゼ を表す。 別の具体例においてＸはビオチンを表す。 上記アデノシン誘導体はＲ４及び糖残基の３゛位の一〇Ｈ基を介して酵素的にヌ クレオチド鎖に組み込まれ得る。 形成されるオリゴ又はポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。 上記アデノシン誘導体は有利に、プリン塩基の８位が活性化された２゛−デオキ シアデノシン誘導体を式（■）：ＮＯ，−（ＣＩｌ、）１１−Ｎ）ＩＸ　（Ｉ［ ＞（式中、ｎ及びＸは上記と同義である）のジアミンと反応させる方法を使用す る合成経路により得られる。 ８位が活性化されたアデノシン誘導体としては、ハロゲン化物を使用すると有利 である。より特定的には臭化物又は塩化物を使用する。 式（ＩＩ）のジアミンとの反応は有機溶媒の存在下で実施される。適当な溶媒は メタノール、エタノール、プロパツール、ピリジンである。 糖残基の５“位がリン酸基を含むアデノシン誘導体は好ましくは、Ｘが水素原子 を表す場合にはヌクレオチド上で直接、あるいは遊離アミノ基のブロッキング後 にシアノエチルリン酸のような試薬でリン酸化することにより得られる。 適当なブロッキングはベンジルオキシカルボニル基で実施される。 対応するジ及びトリリン酸誘導体は５゛−モルホリゾート誘導体とリン酸塩又は ピロリン酸塩との作用により得られる。 上記ヌクレオチドは酵素的にオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。 有利にはこの組み込みは「ニックトランスレーション」なる方法により実施され る。 この手順によると、ＤＮＡ又はＲＮ＾フラグメント中の規則的な間隔で並んだ部 位にヌクレオチドを均一に組み込むことができる。そのためには、３゛末端に遊 離の−ＯＨを生じる酵素、特に大腸菌のＤＮ＾アーゼＩでＤＮＡ又はＲＮ＾フラ グメントを処理する０次いで、ＤＮＡポリメラーゼＩと反応させることによって ＤＮＡ又はＲＮ＾フラグメント中に所望のヌクレオチルデオキシトランスフェラ ーゼを一重又は二重鎖ＤＮＡフラグメントと共に使用することにより実施され得 る。 Ｒが−（ＣＨｚ）。８１２基を表し、ｎが上記と同義である上記の好適な誘導体 を使用する別の具体例によると、アデノシン誘導体をヌクレオチド配列に酵素的 に組み込み、次にビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをヌクレオ チド配列に作用させることによりビオチンを化学的に導入する。 同様の反応により種々のＸ基を導入することができる。 上記アデノシン誘導体は、例えば生物液体混合物又は細胞溶解物中に存在してい る核酸配列を検出及び単離するためのプローブとして使用可能なヌクレオチド配 列を作成するために非常に有利な合成中間体を精成する。 これらのヌクレオチド配列はアデニン基にもたらされた修飾により、高感度で相 補的配列とハイブリダイズして高安定性のハイブリッドを形成することが可能で ある。 本発明の誘導体を含むヌクレオチド配列から得られる１０−ブは、更に経時的に 高い安定性を有しており、数年間保存できる。 プローブ中に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズする相補的ヌクレオチ ド配列の検出は、Ｘ基に基づく非放射活性方法により実施され得る。 非放射活性法とは、例えば着色（発色）又は蛍光（発光）生成物を使用する光化 学的検出反応を意味する。 変形例として、検出は酵素又は抗体を使用する免疫酵素反応により実施され得る 。 ヌクレオチドがビオチン分子の導入により修飾されているような本発明の好適具 体例によると、ビオチンと酵素を結合させる。 有利には、ビオチンと共に安定複合体を形成するアビジンを使用する。この結合 はハイブリダイゼーション反応後に実施され得る。 変形例によると、アビジンそれ自体は検出用生成物、例えばローダミン又はフル オレセインのような着色又は蛍光性化合物と結合される。 他の変形例によると、アビジンは反応後に容易に検出できる不溶性生成物を形成 する酵素と結合される。 有利には、この第２の酵素はアルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼであ る。 ビオチンの検出は抗ビオチン抗体を使用しても実施できる。 当然のことながらこの化学的修飾は、後でプローブが所望のＤＮＡ配列又はフラ グメントとハイブリダイズする際の妨げとならないように実施しなければならな い。 本発明のプローブは、有利には怒染性の細菌及びウィルスで相補的ＤＮＡ配列を 検出するために使用される。このような細菌及びウィルスとしてはＣｈｌａ−ｙ ｄｉａ、　Ｃａｍｐｙｌｏｂａｅｔｅｒ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｐａｒｖｏｖｉｒ ｕｓ、ビートの根茎病（ｒｂｉｚｏｍａｎｉｅ）に関与するウィルス、Ｂ型肝炎 ウィルスが挙げられる。 これらのプローブは細菌の抗生物質耐性を検出するためにも使用できる。 本発明の他の特徴及び利点は２°−デオキシアデノシン誘導体の合成及びプロー ブ作成のためのその使用に関する以下の実施例から明らかになろう。 ８１　ビ　ニル　゛　れｔ・ブｌン　のム８−Ｎ−［１−アミノ−１０−デカニ ルト２“−デオキシアデノシン（化合物Ｌ） １５．１７ｇ、４７ｍｍｏｌｅの８−ブロモ−２゛−デオキシアデノシン（３） と３２ｆＩ、１８６ｍｍｏｌｅの１．１０−ジアミノデカンとを３５０ｍ１のエ タノールに混合し、２４時間還流した０次に溶液を濃縮乾個し、得られた残渣を エチルエーテルで数回洗い、過剰のジアミンを抽出しな、溶媒としてイソプロパ ノ−ルーＮ）１．０Ｂ−Ｈ２０（６−１−１）の３元混合物を使用して低圧下で 残渣のフラクションをシリカカラムで精製した。 Ｆ（沸点）：１９０℃ ＣａｏＨ３ｓＮｙ０３（４２１）の 理論値　Ｃ５６，９８；　ｔ１８．３７．　Ｎ２３．２５実測値　Ｃ５６，８３ ；　Ｈ８，５９；　Ｎ２３．６５゜８−Ｎ−［１−Ｎ−ベンジルオキシカルボニ ルアミノ−１０−デカニルツー２′−デオキシアデノシン（化合物ζ）３．７ｇ （８，５ｍｍｏｌｅ）の化合物りを３０１１の水と４０ｍ１のエタノールの混合 物に加熱下に溶解させた。溶液の温度を室温にし、４．５ｇ、１７．７ｍｍｏｌ ｅのＮ−ベンジルオキシカｌレボニル−Ｎ゛−メチルイミダゾリウムクロリドを 加え、２４時間磁気撹拌下においた。溶液を濃縮乾個し、得られたシロップをシ リカクロマトグラフ４　（ＣＬＣｌｚ−ＭｅＯＨ）（ＭｅＯＨ＝メタノール）に より精製した。 ７２％の収率に対応する３、ｓｓｙのベンジルオキシカルボニル化物が得られた 。 ６−Ｎ−ベンゾイル−８−Ｎ−［１−Ｎ−ベンジルオキシカルボニルアミノ−１ ０−デカニル］−２゛−デオキシアデノシン（化合Ｎ５）２．３８ｇ＜４．２８ ＋＊ｍｏｌｅ＞の化合物ζをピリジン（Ｍｅｒｅｋ）で２回共蒸発させることに より乾燥した後、同一の無水溶媒１５Ｍ１に溶解させた。０℃（浴：氷水）で３ ．７ｚｌの塩化ベンゾイルを滴下添加し、混合物を室温にした。２４時間後、５ ｚｌのメタノールを加えることにより過剰の反応物を除去し、溶液を乾燥濃縮し た。残渣を１００１１のＣ［１，ＣＩ□に溶解させ、まずＮｌＨＣＯ３の飽和溶 液、次に水で洗った。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、真空蒸発させ た。 １２．６ｚ１のピリジンと６．４ｚｌのエタノールの混合物（氷水浴中で冷却） にシロップを溶解させ、ここに８Ｎのソーダ９．５ｚＮを加えた。３０分後、溶 液をＨ９形のＤｏ＠ｅｘ　５０１１Ｘ８樹脂で中和した。樹脂を一過してメタノ ールで濯ぎ、溶媒を乾燥するまで濃縮した。モノベンゾイル化誘導体がエタノー ル中に結晶した。 Ｆ：　８７−８８℃（エタノール） ＮＮＲ’Ｂ　４００ＭＨ２：　（ＣＤＣＩ３＋ＴＭＳ）：　δ＝　１．２０＜（ １６Ｂ、ＣＨｚ（３，８））；　１．３８（ｍ、２８．　ＣＥＩ−（９））；　 １．５５（ｍ、２１．　ＣＬ　（Ｚ））；２．２２（ｍ、ＩＨ，Ｈ”２）；　２ ．６７（ｓ、１Ｂ、Ｈ’２）：　３．１０（論、２１１．　Ｃ１１２（１０）） ；　３．３５（＋＊、　２Ｈ，ＣＨ２（１））；　３．８７（ＩＩ、　２１１． 　Ｈ５“５″）；４．０８（ｓ＋、　ＩＩＩ、　Ｂ’４）：　４，６９（ｍ、　 ＩＩ（、［ｌ’３）；　４．７６（ｓ、　１８．　Ｎｕ）；５．０６（ｓ、　３ Ｈ，ＣＨ２φ十ＮＨ）；　６．５０（ｑ、　ＩＨ，＋ｌ’り；　７．３７（ｓ、 　５Ｂ。 φ）；　７．４Ｌ−７，４９（ｊ　３Ｂ、Ｂφ’ｐ、Ｈφ’ａｎ’）；　７．９ ８−８．００（Ｓ＋ｓ、　２Ｈ，［１φ’ｏｏ’）；　８．４（ｓ、ＩＨ，８２ ）。 ６−＠−ベンゾイルー３°−ベンゾイル−８−Ｎ−［１−Ｎ−ベンジルオキシカ ルボニルアミノ−１０−デカニルツー２′−デオキシアデノシン（化合＄Ａ４） ２ｇ（３ｍｍｏｌｅ）の化合物亀を６．５ｚ１のピリジンに溶解させ、１．１３ ｙ（３，３ｍｍｏｌｅ）の塩化ジメトキシトリチルを加えた。室温で２時間半後 、メタノールを数滴加えることにより過剰の反応物を除去し、乾燥濃縮し、残渣 をＣＨ２Ｃｌ、に溶解させ、まず炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、次に水で洗っ た。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥した。濾過及び真空蒸発後、沈澱物を石油エ ーテルで洗った。 トリチル化誘導体（１，８５ｇ、１．９ｍｍｏｌｅ＞を２５１１のピリジン（Ｍ ｅｒｃｋ）に溶解させ、２．６ｇ（１１，４ｍｍｏｌｅ）の塩化ベンゾイル及び １１５■のＤＭ＾Ｐを加えた。室温で１時間半後、真空濃縮し、ＣＨ２Ｃｌ２で 希釈し、まず炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、次に水で洗い、石油エーテルで沈 澱させた。 ２％のＯＳ八を含有するＣ［１ｚＣＩｚ−ＭｅＯＨ（７−３）混合物３０ｚ１に 沈澱物を溶解させ、室温で１０分後、溶液を洗い（ＮａＨＣＯ＊及びＨ２Ｏ）、 乾燥し、真空濃縮した。残渣をシリカクロマトグラフィ（溶媒Ｃ［ＩｚＣｌｚ− ＭｅＯＨ）により精製シタ。 ＮＭＲ’１１４００８Ｈｚ：　（ＣＤＣＩｓ＋ＴＭＳ）：　δ＝　１．２５（Ｉ Ｉ、　１６Ｈ，ＣＬ（３−８））：　１．４６６、２Ｂ、　Ｃｕｔ　（９））； 　１．６３（ｍ、　２ｔｌ、　ＣＨ２（２））；２．４７（ｄｄ、ＩＩ！、［１ ″２）；　２．９７（−、ｉｌｌ、Ｈ’２）；　３．１７（ｑ、２Ｈ，Ｃｕｔ（ １０））、　３．４７（ｑ、　２Ｈ，ＣＨｚ　（１））；　４．０３（ｄ、　１ Ｂ、　Ｈ″５）；　４．１６（ｄ。 １Ｂ、Ｈ’５）；　４．３１（ｍ、１０．　Ｈ’　４）；　５．０Ｂ（ｓ、２Ｈ ，ＣＨｚφ）；５．７１（ｄ、　１Ｂ、　Ｉｔ’３）；　６．６６（ｑ、　ｉｌ ｌ、　Ｈ’ｌ）；　７．３３（ｓ、　５Ｂ、φ）；７．４５−７．６５（輸、２ １（、Ｈφ’＋１１１’）：　７．８２（ｄ、ＩＨ，Ｈφ’ｐ）；８゜００−８ ．１２（２ｄ、　２Ｂ、　Ｈφ’ｏｏ’）；　８．５７（ｓ、　ｌｆｌ、　Ｈ２ ）：　９．１０（ｓ、　ｌｔｌ。 ＮＨＣＯφ′）。 ８−Ｎ−［１−アミノ−１０−デカニルト２−デオキシアデノシン５゛−トリリ ン酸（化合物り ３Ｚ７ｙｇ（０，４２８ｍｍｏ　ｌｅ）の化合物乞、１−ｓｏｌｅのピリジニウ ムのシアノエチルリン酸塩（１ｍ−ｏ１ｅ／＋＋＋４の貯蔵溶液ＩＭ１）を５１ １１のピリジンに溶解して成る溶液を３０℃で真空濃縮した。得られたシロップ を１０１１のピリジンに２回溶解させた後、蒸発乾個した。無水ピリジンで同一 の操作を繰り返した。 乾燥残渣を５ｘｉの無水とリジンに溶解させ、約０．５ｇ（６当量）のＮ、Ｎ’ −ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を加え、混合物を室温で４８時間 磁気撹拌下においた。３Ｍ１の水を加え、１時間撹拌し、ピリジンを加熱乾燥し 、１０Ｍ１の水に残渣をとった。形成されたジシクロへキシルウレアを濾過し、 １ｏ１１１ノ水で濯いだ、涙液を濃縮し、残渣を３０ｍ１ノロＮ　Ｎ［１，０［ １にとり、６０℃で２４時間インキュベートした。アンモニア溶液を濃縮し、得 られたシロップを、溶媒としてエタノール−水混合物（ＥｔＯ［１−ＨｚＯ）　 （１−２）を使用してセファデックスＣ１０で精製した。紫外線及びリン定量に 陽性のフラクションを凍結乾燥後、１７８１ｆＩ（収率４９％）のモノリン酸塩 を得た。 ２００ｍｇのモノリン酸塩を水−メタノール混合物（１−１＞に溶解させた後、 モルホリニウム形態のＤｏｗｅｘ　５０　ＷＸ８樹脂のカラム（３％１ｃｍ）に 溶液を通した。溶出液が紫外線を吸収しなくなるまでカラムをこの混合物で洗っ た。 溶液を濃縮し、残渣を３ｘ１のｔ−ブチルアルコール及び３ｚｆのＨ２Ｏにとり 、ｔｏｓ、＋１の蒸留モルホリン（４当ｌ）を加え、４．５ａｌｌのｔ−ブチル アルコールに溶解した２５９ｉｙ（１，２５ｍｍｏｌｅ）のＤＣＣを滴下添加し た。４時間還流した。溶媒としてイン１０パノール−ＮＨ，０Ｈ−Ｈ，Ｏ混合物 （７−１−２）を使用してシリカ薄層クロマトグラフィで分析した処、反応は終 了していた。 溶液を室温まで冷却し、形成された沈澱物を濾過し、ｔ−ブチルアルコールで洗 った。Ｐ液を蒸発乾個した。残渣を水に溶解させ、水相をエーテル（１５ｖ＆） で３回抽出した。水相を濃縮して収率７５％でモルホリゾートを得た。 ５ｚｌの水に溶解した１７８ｚｙ（ｉｎｓｏｌｅ＞のピロリン酸に、１０ｍ１の ピリジン（Ｍｅｒｃｋ）及び１．Ｏｚｊ！（４，２ｍｍｏｌｅ＞の蒸留トリー１ −ブチルアミンを加えた。シロップが得られるまでこの均質溶液を蒸発させ、１ ０ｚｌの無水ピリジンで４回連続的に共蒸発することにより脱水した。 次に、別に蒸留したトルエン（５＊ｆ＞で２回共蒸発させることにより残留ピリ ジンを除去し、４人のモレキュラーシーブで回収した。 次にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　（５ｚＮ、無水）に溶解したモルホリ ゾートにトリーｎ−ブチルアミンのピロリン酸塩を加えた。 溶液を室温に維持し、２４時間後に上記のよう調製したトリーｎ−ブチルアミン のピロリン酸塩０．５−−ｏｌｅを加えた。室温で３時間後、モルホリゾートが 消失したので５Ｎの水を加え、炭酸水素塩形態のＤＥＡＥセルロースカラム（２ ，５Ｘ　３０ｃ１１）に溶液を通した。溶出液が紫外線を吸収しなくなるまでカ ラムを水洗した後、重炭酸トリエチルアンモニウムの０−０．３５Ｍの直線勾配 で溶離した。 （紫外線−リンで）同定されたトリリン酸塩を含むフラクション（３ｚ１）を合 わせて蒸発乾溜（浴３０−３５℃）した、メタノールと共に数回蒸発させ、水に 数回溶解させてから凍結乾燥し、ＴＥＡＢを除去した。 ２００１ｇのモノリン酸塩から３６肩２のトリリン酸塩が得られ、収率は２３％ であった。 １また１ Ｃ２６Ｂ３１Ｎ７０１２Ｐ３の理論値　Ｍ＝６６１．１６実測値　［Ｍ＋　Ｈ］ ”＝　６６２．１６ＨＭＲ’Ｈ４００ＭＨｚ：　（ＤｚＯ）：δ＝　１．８（ｍ 、　１４Ｈ，デシルプロトン）：　１．４９（ｔ、　２８．デシルプロトン）； 　１．６１（ｍ、　２１’１．デシルプロトン）；　２．１８（ｄｄ、　２［１ ，Ｂ”２）；　２．６８（ｍ、　ｔＨ，Ｈ’２）；　２．８４ｃｔ、　２８．デ シルプロトン）；　３．３８（＠、　２ｔ（、Ｈ５’５″）：　４．１４＜ｄｄ 。 ＩＨ，Ｈ’４）；　４．３０（ｔ、　１Ｂ、　Ｈ’３）；　４．６５（ＨＤＯ） ；　６．３５（ｑ、　ＩＨ。 ｔｌ’ｌ）：　７．９８（ｓ、　１８．０２）。 ＮＭＲ”Ｐ　１６２ＭＨ２：　（０２０）：　ＰＯ，）１．＝−８，２０９（ｄ 、　ＩＰ、　Ｐ、。 ’Ｐ、−Ｐ、＝１９．４５８Ｚ）；　−９，８６６（ｄ、　ＩＰ、　Ｐ、、　Ｊ ｐ、Ｐ、、　ＪＰ、Ｐ、＝１９．４５Ｈｚ、　Ｊｐａ−Ｐ＊＝ＯＨｚ）；　２０ ．９８７（ｔ、　ＩＰ、　Ｐａ、　Ｊｐａ−Ｐ、＝Ｊｐｓ−Ｐｖ　＋　１９．４ ５［１ｚ）。 ８−Ｎ−［１−Ｎ−ビオチニル−１０−デカニル］−２゛−デオキシアデノシン ５°−トリリン＊＜化合物」） 別に蒸留したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞（１００ｕｌ）にＩＨの炭酸水素 ナトリウム（２００ｕ１）及びビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ル（５■）を溶解してなる溶液をトリリン酸塩５（９瀧ｇ）に加えた。 ４℃で２４時間後にンヒドリン試験：陰性）、反応媒体に水（ｌｚｌ）を加えた 後、セファデックスＧ１０のクロマトグラフィカラムにおいた。水で溶離すると 紫外線を吸収する主なピークが２つ現れ、その一方のみが糖試験で陽性、アミン 試験で陰性応答を示した。この溶離液のフラクション（３ｍｌりを合わせて蒸発 乾個後、高性能液相クロマトグラフィ（ＩＩＰＬｃ）　（ヌクレオジｌしＮｕｃ ｌ＆ｏｓｉｌカラム５Ｃ１８４，６Ｘ２５０ｍｍ）で精製し、凍結乾燥した。収 率は１６％であった。 １また１ Ｃ３゜ＨｓＪｓＯ＋　４ＳＰ３の理論値　Ｍ＝８８７実測値　しＮ＋　）Ｉ］” ＝　８８８．６３次に、本発明の好適な誘導体で実施されるＤＮＡ配列の検出例 を説明する。 Ｂ　；ウィルスの　ツムの−　を　むＯＮへのヌ　レオ丘

【１へ１此 ■、材料及び方法 化合物」を「ニックトランスレーション」法によりＢ型肝炎ウィルスのゲノムの 一部分を２回含むプラスミドｐｃＰ１０（１２）に酵素的に組み込んだ。 酵素による組み込みは、置換率に間接的に従い得るようにトリチウム置換したｄ ＣＴＰの存在下で実施した。 化合物乞は大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩに対して使用可能な基質である。 ０．２Ｊの化合物」の存在下で１４％のアデノシンを３００＋＋ｇのプラスミド ｐｃＰ１０に置換した。 このビオチニル化プローブの検出限界の決定は、以下の方法を使用して計算した 。 種々の濃度のビオチニル化プローブ１ｕ１をニトロセルロース股上においた１次 にこの膜を２時間真空で８０℃に加熱し、ウシアルブミン（１％）の塩化ナトリ ウム（０，１５Ｍ）及びＴｗｅｅｎ（０，１％）を含む緩衝液ｔｒｉｓ−１’Ｉ Ｃ１１０ｍＭ、　ｐＨ８の存在下で飽和させ、非特異的吸着を減少させた。膜に 固定化したプローブを検出するには、アビジン、ストレプトアビジン又はアルカ リホスフェートで標識した抗ビオチン抗体と共に１時間インキュベートした後、 適当な基質中で３０分間インキュベートした。検出系の種類（アビジン、ストレ プトアビジン又は抗体）及び使用される条件に関係なく　１．５ｐｙまでの１０ −ブを検出することが可能であった。 相同ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡを検出するためにこのビオチニル化プローブを 使用した処、検出限界は８９ｇであった（７５Ｈｇ／ｚｌに濃縮したプローブを 使用して６８℃で１６時間行う従来の一重鎖ハイブリダイゼーション１０トコー ル（１３）による）。 ビオチニル化１０−ブは５０％のホルムアミドと共に４２℃で使用することもで きる。該プローブはこの条件で完全に安定であった。 既述したように、本発明は上記実施例限定されずあらゆる変形を包含するもので ある。 炙Ｊ】Ｊ【 １．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｙｎｏｌｏｇｙ、　９２．４７２、Ｃ， ＶＩＮＣＥＮＴ、Ｐ。ＴＣＨＥＮ、Ｍ、　Ｃ０ＨＥＮ−５ＯＬＡＬ　ｅｔ　Ｆ’ 、　ＫＯＵＲＩＬＳＫＹ。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８２）、　ｔｏ、　６７８７３、 Ｄ、Ｃ，ＷＡＲＤ　ｅｔ　ｃｏｉｌ。 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８１）、　７ Ｂ、　６６３３；　（１９８３）、　８０４、Ｍ、ＲＥＮＺ　ｅｔ　Ｃ，ＫＵＲ ＴＺ。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８４）、　１２．３４３５５、Ａ 、ＭＵＲＡ５ＵＧ工ｅｔ　Ｒ，Ｂ、ＷＡＬＬＡＣＥＤＮＡ　（１９８４）、　３ （３）、　２６９６、Ａ、ＣＨｏＴＬｙ：ｒ　ｅｔ　Ｅ、Ｈ，ＫＡＷＡＳＩ［Ｍ ＡＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−　（１９８５）、　１３．１５２９７ 、　Ｔ、　ＫＥＭＰＥ、　Ｗ、工、　５ＵＮＤＱＵＩＳＴ、　Ｆ、　ＣＨＯＷ　 ｅｔ　Ｓ、Ｌ、　ＨＵ。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８５）、　１３．４８、　Ａ、Ｃ ，ＦＯ５ＴＥＲ，Ｊ、Ｌ、Ｍｅ　工ＮＶＥＳ、Ｄ、Ｃ，５ＫＩＮＧＬＥ　ｅｔ　 Ｒ，Ｈ。 ＳＹＭＯＮＳ。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８５）、　１３．７４５９、　Ｌ 、Ｍ、　ＳＭＩＴＨ，Ｓ、　ＦＵＮＧ、　Ｍ、Ｎ、　ＨＵＮＫＡＭｕ、　Ｔ、、 ７．　ＨＵＮＫＡＩ’工ＬＬＥＲａｔ　Ｌ、Ｅ、ＨＯＯＤ。 Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、（１９８５）、　１３．２３９９１０、 　ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｑＹ（１９８５）、　３．３９５１１、Ｍ、工ＫＥＨ ＡＲＡ　ｅｔ　Ｍ、ＫＡＮＥ工０゜Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、（１ ９７０）、　１Ｂ、　２４４１゜１２、　ＤＵＢＯＩＳ　Ｍ、Ｆ、、ＰＯＵＲＣ ＥＬＬ　Ｃ，、ＲＯＵＳＳＥＴ　Ｓ、、ＣＨＡＮＹ　Ｃ，。 Ｔ肛０口：ａｘｓ　ｐ、。 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８０）、　７ ７、４５−５３１３、　ＭＡＮ工ＡＴ正Ｔ、、　ｆｆ１ＴｓαＦ、、　Ｓ諷Ｒ■ ＫＪ、。 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｌａｂ、Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　（１９８２）、　ｐ。 国際調査報告 Ａｉ’ｊＮＥＸ　τ口τＦＥＩＮτＥＲＮＡＴ！０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰ ＯＲＴ　０ＮＺＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＡＰｆＬＪＣＡＴ！ＯＮ　Ｎｏ、　 ＰＣＴ／ＴＲ８７１００２９１（ＳＡ　１１３０６９）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．式（Ｉ） ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）（式中、Ｒ１は−ＯＨ、−ＯＰＯ３Ｈ ２、−ＯＰ２Ｏ６Ｈ３、−ＯＰ３Ｏ９Ｈ４基、又はオリゴヌクレオチドから選択 され、Ｒ２は水素原子、−ＯＨ基、又はオリゴもしくはポリヌクレオチドから選 択され、Ｒはアミノアルキル鎖を表す）に対応する２′−デオキシアデノシン誘 導体から生成されることを特徴とする核酸検出用プローブ。
2. ２．Ｒ鎖が構造−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＸ（ｎは４〜１２の整数、Ｘは水素原子又 は分子マーカーとして機能することが可能な基を表す）に対応することを特徴と する請求項１に記載のプローブ。
3. ３．マーカー基がローダミン、フルオレセインもしくはダンシルのような着色も しくは蛍光基、ハプテン、ホスファターゼもしくはペルオキシダーゼのような酵 素、ペプチド又はビオチンから選択されることを特徴とする請求項２に記載のプ ローブ。
4. ４．アデノシン残基が酵素的手段によりヌクレオチド鎖に組み込まれていること を特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のプローブ。