WO2005014610A1

WO2005014610A1 - 酸化により機能性ユニットを放出するヌクレオシドおよびそれを含むオリゴヌクレオチドの製造法

Info

Publication number: WO2005014610A1
Application number: PCT/JP2004/011039
Authority: WO
Inventors: Isao Saito; Akimitsu Okamoto; Kazuo Tanaka
Original assignee: Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2003-08-08
Filing date: 2004-08-02
Publication date: 2005-02-17
Also published as: US20070270582A1; JP2005058039A; EP1652852A4; EP1652852B1; EP1652852A1; US7563886B2; JP3929949B2; DE602004032032D1

Abstract

　本発明は、オリゴヌクレオチドに結合している有用な物質を、標的の核酸を損傷させることなく、容易に放出させる方法、及びそのための新規な塩基を提供する。　本発明は、次式（Ｉ）【化１】（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ独立して−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｎ（アルキル）−、−Ｓ−を示し、Ｒは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基、ヌクレオチドを示し、ｎは１から１０の数字を示す。）で表される、ヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチド、並びに前記した本発明のヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドを用いて、当該塩基部分におけるＲ基部分を放出させる方法に関する。

Description

明細書

酸化により機能性ユニットを放出するヌクレオシドおよびそれを含むオリゴヌクレオチドの製造法

技術分野

[0001] 本発明は、酸化により塩基部分に結合している機能性ユニット、レポーターユニット

、または生体機能分子を放出させる方法、及びそのためのヌクレオシド、又はヌクレォチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチドに関する。

背景技術

[0002] DNAバイオセンサーは、標的遺伝子から必要な情報を引き出すための便利で早い手法を提供してきた。例えば、分子ビーコンのような配列特異的なシグナルを与える DNAプローブなどのような、いろいろな DNAプローブ力このために用いられてきた (非特許文献 1一 3参照）。しかし、有用な機能性の分子を放出することができる D NAプローブはほとんどなかった（非特許文献 4一 6参照）。

また、核酸からの薬剤放出手段としての従来法では、ニトロペンジル基やフエナシル基の光分解が利用されてきた。しかしながら、機能性分子をポスト合成法で導入する方法を使うための分子設計が容易ではなぐまた、薬剤放出時にニトロソ基などの核酸にとって有害な反応種を生じる。

また、蛍光修飾した核酸から蛍光部位を除去する手法は、これまでに報告されていない。

[0003] 非特許文献 l : Tyagi,S.， et al" Nat. Biotechnol., 1996, 14, 303-308

非特許文献 2 : Tyagi,S.， et al" Nat. Biotechnol., 1998, 16, 49-53

非特許文献 3 : Piatek,A.S.， et al., Nat. Biotechnol., 1998, 16, 359-363

非特許文献 4 : Ma,Z.， et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97， 11159-11163 非特許文献 5 : Ma,Z.， et al., Med. Chem., 2001, 9， 2501-2510

非特許文献6 : 01¾1110 0，八.， et al. , Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 2502-2504 発明の開示

発明が解決しょうとする課題 [0004] 酸化や光の照射などの外的刺激により特定の分子を放出させることができるシステムは、遺伝子の解析や各種の疾患に治療や診断に極めて有用な手法となる。

本発明は、オリゴヌクレオチドに結合している色素や薬剤などの有用な物質を、標的の核酸を損傷させることなぐ容易に放出させ、また当該放出により標的部分に当該物質を導入することができる方法、及びそのための新規な塩基を提供する。

課題を解決するための手段

[0005] 上記のようなヌクレオシドとそれを含むオリゴヌクレオチドを用いることにより、光照射 •酸化剤処理などの外部刺激により機能性ユニットを核酸から放出できるようになる。従って、特定の核酸配列での薬剤'リポーター分子の放出や核酸上の標識の着脱が可能になり、つまり以下に示すようなことが期待できる。 1)蛍光性色素や放射性物質で標識された核駿の使用後の標識の分解と遺伝子などへの核酸の再生、 2)ジーンセンサーとして目的塩基配列や一塩基多型の検出、 3) DNAの複製、 RNAへの転写、タンパクの認識など遺伝子発現制御のためのドラッグデリバリー DNA、 4) DNA ナノワイヤー（分子論理回路、バイオセンサーなど）の出力シグナルへの利用等が可肯になる。

[0006] 本発明者らは、ホールの発生によってグァニンが分解してレ、く機構に基づいて薬剤放出性のヌクレオシドを設計してきた。そして、グァニンの 8位を修飾する方法を検討してきたが、放出されるべき分子とグァニンの間を、ヘテロ原子を介して連結させることにより、天然のグァニンよりもホールを生じやすレ、、即ち酸化されやすいヌクレオチドの塩基部分を得ることができることを見出した。

[0007] 即ち、本発明は、次式 (I)

[0008] [化 3]

[0009] (式中、 X及び Yはそれぞれ独立して _〇 —NH― -N (アルキル) —S—を示し、 Rは機能性ユニット、レポーターユニット、または生体機能分子を示し、

R²はそれぞれ独立して、水素原子、リン酸結合基、ホスホロアミダイド基、ヌクレオチドを示し、 n は 1から 10の数字を示す。 )

で表される、ヌクレオシド、又はヌクレオチドもしくはそれを含むオリゴヌクレオチドに関する。

また、本発明は、前記した本発明のヌクレオチドを含有してなるオリゴヌクレオチドを用いて、当該塩基部分における R基部分を放出させる方法に関する。

[0010] 本発明者らは、このためにグァニンの 8位がヘテロ原子で置換されたグァニン誘導体を製造した。 8位に導入すべきヘテロ原子を有する基としてエチレンジァミンを採用してみた。その製造例を次に示す。

8—グロモグァニンの 5 '位を 4， 4 '—ジメトキシトリチル（DMTr)基で保護した化合物 (1)をエチレンジァミンで処理して、 8位にエチレンジァミノ基が導入されたグァニン誘導体（2)とする。これをトリフルォロ酢酸でトリフルォロアセチルイ匕して末端のァミノ基を保護した化合物（3)とし、次いで 2位のアミノ基をジメチルアミノメチリデン基で保護した化合物（4)とした後に、シァノホスホロアミダイド法 (例えば化合物（5) )などにより他のヌクレオチドに結合させてオリゴヌクレオチドとして、 8位の末端のアミノ基及び 2位のアミノ基の保護基をはずすことにより 8位にエチレンジァミノ基を有するグァニン誘導体（以下、 ^edaGと略す。）を含有するオリゴヌクレオチド（6)を得ることができたこのエチレンジァミンで修飾されたグァニン誘導体の末端のァミノ基に各種の分子を導入して N—修飾一 ^edaGとした。前記の反応式では R— CO—のアシノレ基で修飾したオリゴヌクレオチド（7)を示している。例えば、オリゴヌクレオチド（6)を安息香酸スクシ ' 、、; ^し丁_ス千,しァ、ソ,し化することにより、ベンゾィル _^edaGを得ることができる。

edaハ /Bz— eda

[0013] 本発明者らは、 G ^^eaaG)を含有するオリゴヌクレオチド（7)、例えば、 5，_d (TATAAT GTAATAT) _3，：

を用いて光酸化反応を行った。 1本鎖のこのオリゴヌクレオチド（〇DN)に、リボフラビンの存在下に 366nmの光を照射したところ、このオリゴヌクレオチド（〇DN)は速やかに分解した (t = 6. 2分)。この反応の分解生成物を質量分析機で分析した結

1/2

果、この光酸化反応は次に示す反応式、

[0014] [化 5]

Benzoy 9

[0015] により進行したものであることがわかった。即ち、 ^Bz— ^edaGの箇所で光分解反応が進行し、この部分でプリン環部分及びその糖鎖が解裂したもので、その結果 5 '側の分解生成物（8)と、 3 '側の分解生成物（9)、及びべンズアミド誘導体（10)が生成した。このような分解は、既に報告されているグァニンのカチオンラジカルを経由した分解と考えられ、その結果べンズアミド誘導体（10)が放出されたものと考えられる。

図 1に酸化による 1本鎖のこのオリゴヌクレオチド（ODN)に HPLCの結果を示す。図 1の（a)は原料の 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)の HPLCであり、図 1の（b)は、光の照射による分解生成物の HPLCの結果を示す。図 1の（c)は後述するイリジゥムによる酸化の分解生成物の HPLCの結果を示すものである。

図 2に光の照射による分解生成物の MALDI— TOFの結果を示す。図 2中の 2370 . 61のピークは、内部標準として用いた原料のオリゴヌクレオチドのピークである。 19 67. 68のピークは 5 '側の分解生成物（8)を示し、 1870. 11のピークは 3 '側の分解生成物（9)を示す。図 3は、光を照射した 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)の LC— ESI/MSZMSによる分析結果を示すものである。図 3の上段は、 MS207を含むの溶出物のものであり、中段は MS207のフラグメンテーションを示したものであり、下段は、インタック C— 18カラム（2. O X 50mm)を用いた液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。

この ^{Bz eda}Gの酸化電位（E )は、0. 59V (VS NHE)であった。この酸化電位は、

1/2

8_ォキソ一グァニンの酸化電位である 0. 58-0. 75V (Hickerson,R.P., et al.， J. Am. Chem. Soc, 1999， 121, 9423-9428)に近い値であった。

また、 8—ォキソーグァニンや 8—ォキソアデニンが部位特異的にイリジウム（IV)で酸化されることが報告されている（MullerJ.G., et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 2247-2249)。そこで、 5， _d (TATAATXTAATAT)— 3，（Xは、 ^{Bz eda}G、又はテトラメチルローダミン (TAMRA)_^edaGを示す。）を、ナトリウム—へキサクロ口イリデート（IV )を用いて酸化してみた。その結果、いずれのオリゴヌクレオチドも、修飾された ^edaG の部分 (Xの部分）で速やかに分解されて、 15分間でそれぞれ 57%及び 89%が分解した。

次に本発明者らは、ロングレンジのホールの移動について検討した。そのためにテトラメチルローダミン (TAMRA)— ^edaGを含有するオリゴヌクレオチド

5'_ (³²P) -d ( ATTTATAGTGTGGGTTGTTXTTTATTAT)-3 '：

(Xは、テトラメチルローダミン (TAMRA)— ^edaGを示す。以下、このオリゴヌクレオチドを「〇DN1」という。）を用いた。この相補鎖として、

3， -d (TAAATATCACACCCAACAACAAATAATA) -5，：

(以下、このオリゴヌクレオチドを「〇DN2 (T)」という。）、及びホールを注入するためのシァノベンゾフエノン一修飾ゥリジン (U*)を 7番目のチミン (T)の変わりに導入したオリゴヌクレオチドである、

3， -d (TAAATAU * CACACCCAACAACAAATAATA)—5，：

(以下、このオリゴヌクレオチドを「〇DN2 (U*)」という。）を製造した。これらのオリゴヌクレオチドを図 4に示す。

2本鎖の DNAである、 ODNl/ODN2 (T)及び ODNl/ODN2 (U* )にそれぞれ 312nmの光を照射した。オリゴヌクレオチドからの光分解物を遠心分離フィルター (ミクロン YM— 3)で分離し、 576nmの蛍光を測定した。〇DN lZ〇DN2 (U * )のろ液から、強い蛍光を測定することができた。光照射から 60分後には、〇DN lZ〇DN 2 (U* )のろ液からは、対照の ODN1/ODN2 (T)のろ液の約 7倍の蛍光が観測された。結果を図 5の（A)に示す。図 5の（A)は黒丸印（秦）は ODN1/ODN2 (U * ) の場合を示し、黒四角印（國）は〇DN lZ〇DN2 (T)の場合を示す。図 5の (A)の縦軸は蛍光強度（a. u. )を示し、横軸は光照射からの時間（分)を示す。

また、 ODN1/ODN2 (U* )の ^edaGサイトでの分解率を PAGEでの分析により調べた。結果を図 5の（B)に示す。図 5の（B)の縦軸は分解率（％)を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。また、図 6に 2本鎖の DNAである〇DN1/〇DN2 (U * )に 312nmの光を照射した結果の蛍光強度の変化を示す。図 6の縦軸は蛍光強度（a. u. )を示し、横軸は波長 (nm)を示す。

このこと力ら、蛍光強度の変化は、オリゴヌクレオチドの ^edaGサイトでの分解率と非常にょい相関があることがわかった。カロえて、 5 '側の GGGの部分が光の照射により障害を受けていることが PAGE分析により判明した。

図 7は、 2本鎖の DNAである〇DN 1/〇DN2 (U * )に 312nmの光を照射したときの分解生成物の PAGE分析の結果を示す。光照射後の〇DNを 10%ピぺリジン (V /v) 50 μ L中で 90°Cで 20分間加熱処理した。図 7中の Xは TAMRA— ^edaGを示す。図 7のレーン 1はマキサム—ギルバート法による G +A配列の場合を示し、レーン 2は全長の ODN 1を示し、レーン 3は光照射直後のものを示し、レーン 4は光照射 30分のものを示し、レーン 5は光照射 60分のものを示す。

これは、光の照射により、 2本鎖の U *の部分に発生したホール力 S、 2本鎖を通して ^ed ^aGのサイトまで伝達されていることを示すものである。これらのことから、初期の段階における試料のろ液の蛍光は、ロングレンジのホールの移動により、 ^edaGの分解により誘発されたものと考えられる。

[0018] 光を照射した試料の蛍光は、目視によっても確認できる。この結果を図 8に図面に変わる写真で示す。図 8の左側は〇DNl/ODN2 (T)からの試料によるものであり、右側は〇DNlZ〇DN2 (U*)力もの試料によるものである。図 8の右側の ODN1/ ODN2 (U*)力、らのものには強い蛍光が観察された力図 8の左側の〇DNlZ〇D N2 (T)力の試料にはほとんど蛍光を観察することはできなかった。

このように、 2本鎖 DNAの中に TAMRA_^edaGのような分解してレポーターユニットとなる蛍光発光分子を有するグァニン誘導体を導入しておくことにより、 PAGE分析を行うことなく DNA中のホールの移動を検出することができることになる。

[0019] 以上のように、本発明の 8位がヘテロ原子で結合された分子を有するグァニン誘導体は、酸化、即ち電子の供与により結合された分子種を放出することが判明した。本発明はこのようなグァニン誘導体、及びそれを含有するオリゴヌクレオチドを提供するものである。本発明のグァニン誘導体における分子種の放出は比較的温和な酸化により誘発されるものであり、このような分子種の放出は蛍光タグの放出による遺伝子の解析だけでなぐ生体内における特定の部位で薬物を放出させるベクターとしても極めて有用なものである。

[0020] 本発明の 8位がヘテロ原子で結合された分子を有するグァニン誘導体は、放出分子種一へテロ原子又は原子団一プリン環の構造を有するものであり、好ましくは前記一般式 (I)で表されるものである。

一般式 (I)中の一 X— (CH ) 一 Y—の部分がプリン環と放出分子種を結合させるリン

2 n

カー部分に相当し、ヘテロ原子の存在によりグァニンの分解が生起し、結合していた分子種が放出される。したがって、当該リンカ一部分は、グァニンの分解が可能なへテロ原子を含有し放出分子種を固定させることができるものであれば特に制限はないが、好ましいリンカ一部分としては、前記した一般式 (I)で表されるものが挙げられる。ここで、 X及び Yはそれぞれ独立して同一又は異なるヘテロ原子であり、例えば、 _〇一、—NH―、—N (アルキル）—、—S—などが挙げられる。—N (アルキル）—におけるアルキル基としては、炭素数 1一 10、好ましくは 1一 5の直鎖又は分枝状のアルキル基、例えば、メチル基、ェチル基、 n—プロピル基などのアルキル基が挙げられる。また、 n は 1から 10、好ましくは 1一 5の整数を示す力 S、一 (CH )一は必ずしも直鎖のアルキレ

2 n

ン基でなくてもよぐ分枝状のアルキレン基であってもよい。また、当該アルキレン基のなかの 1個又は 2個以上のメチレン基が酸素原子、窒素原子などのへテロ原子で置換されたアルキレン基であってもよい。

一般式 (I)における一 X— (CH ) 一 Y—の部分の例としては、前記してきた一 NH—（C

2 n

H ) _NH_基などが挙げられる。

2 2

[0021] 一般式 (I)における R基は、酸化により放出される分子種の部分を示し、放出されて当該分子種が有する機能を発現することができるものであればよい。このような機能を発現することができる分子種を本明細書では「機能性ユニット」と称する。このような「機能性ユニット」としては、蛍光発色するユニットやアビジンのような結合性の分子や、抗原や抗体などのレポーターとして機能するレポーターユニット、医薬品や抗体などの生体内で生体機能を調節する生体機能分子などが挙げられる。例えば、当該「機能性ユニット」として医薬品を用いた場合には、使用するオリゴヌクレオチドが特定の遺伝子とハイブリダィズすることから、特定の mRNAなどが発現している細胞に当該オリゴヌクレオチドが局在することになり、酸化剤や光の照射により当該部位におレ、て当該医薬品が選択的に放出されることになり、部位選択的な DDS製剤とすることも可能となる。

[0022] 一般式 (I)における R¹ R²は、ヌクレオシドの糖部分における連結用の基であることを示し、

R²は、それぞれ水素原子である力ヌクレオチドを形成するためのリン酸結合基であってもよいし、そのための中間体として使用される保護基やホスホロアミダイド基などであってもよい。

また、本発明の一般式 (I)で表される化合物は、オリゴヌクレオチドであってもよぐ当該オリゴヌクレオチドは、前記したような放出される分子種を有する修飾されたグァニン誘導体を含有するオリゴヌクレオチドであるということができる。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドは、放出される分子種を有する修飾されたグァニン誘導体を少なくとも 1個有するものであり、必要に応じて 2個以上有しているものであってもよい。このような場合には前記一般式 (I)における、 R²は、各種のヌクレオチド示すことになる。このようなヌクレオチドは、 1個又は 2個以上の塩基を有するものであってよい。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドは、非常に長いものであってもよぐ特に長さに制限はないが、好ましくは 10— 100塩基、 10— 50塩基からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。

[0023] 本発明のオリゴヌクレオチドには、格別の電子供与基は必要ではないが、少なくとも

1個の塩基が、電子供与基として機能する塩基であるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、前記してきたように本発明の修飾グァニンはロングレンジのホールの移動によつても分解することができるので、相補鎖中の少なくとも 1個の塩基力電子供与基を含むオリゴヌクレオチドなる 2本鎖のオリゴヌクレオチドも本発明の好ましいオリゴヌクレオチドとして挙げることができる。

また、本発明は、前記した本発明のオリゴヌクレオチドを酸化して、一般式 (I)で表されるヌクレオチド部分における R基部分を放出させる方法を提供する。

本発明の R基部分の放出の概要を図 9に示す。図 9では、 X部分に機能性ユニットが結合されており、 1電子の放出によりホールが発生し、これがロングレンジで移動して X部分に伝達され、 X部分の機能性ユニットがオリゴヌクレオチドから放出される様子を模式的に示したものである。

また、図 10は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットとして染料分子が放出される様子を模式的に示したものである。

本発明のこの方法における酸化としては、比較的温和な酸化であればよぐ例えば、 1電子の供与による方法や、光の照射による酸化、イリジウム（IV)や Os (III)による酸化などが挙げられる。

発明の効果

[0024] 本発明のヌクレオシドでは、オリゴヌクレオチドに組み込んだ後、アミドゃエステル結合生成による機能性ユニットの導入、光照射を含む穏和な酸化反応によるオリゴヌクレオチドの分解'機能性ユニットの放出が容易である。従って、核酸合成条件にとらわれずに様々な機能性ユニットを導入することができ、カロえて、望む段階で機能性ュニットをオリゴヌクレオチドから切りはずすことができる。蛍光 in situハイブリダィゼーション法などの蛍光測定を行つた後の蛍光部位の除去、標的配列でのドラッグの放出、使用済み標識オリゴヌクレオチドの分解などが期待される。機能性ユニットを放出させる酸化手法として、リボフラビンなどの色素を用いて光酸化、 (^)ゃ〇3 (111)などの金属酸化剤による酸化反応、西洋わさびペルォキシダーゼなどの酵素酸化反応が可能である。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、本発明の 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)の光の照射による分解生成物の HPLCの結果を示すものである。図 1の（a)は原料の 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)の HPLCであり、図 1の（b)は、光の照射による分解生成物の HPLCの結果を示す。図 1の（c)はイリジウムによる酸化の分解生成物の HPLCの結果を示すものである。

[図 2]図 2は、本発明の 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)の光の照射による分解生成物の MALDI— TOFの結果を示す。図 2中の 2370. 61のピークは、内部標準として用いた原料のオリゴヌクレオチドのピークである。 1967. 68のピークは 5 '側の分解生成物（8)を示し、 1870. 11のピークは 3 '側の分解生成物（9)を示す。

[図 3]図 3は、本発明の 1本鎖のオリゴヌクレオチド（ODN)に光を照射したときの LC一 ESI/MSZMSによる分析結果を示すものである。図 3の上段は、 MS207を含むの溶出物のものであり、中段は MS207のフラグメンテーションを示したものであり、下段は、インタック C— 18カラム（2. O X 50mm)を用いた液体クロマトグラフィーの溶出パターンを示したものである。

[図 4]図 4は、本発明の TAMRA— ^edaGを含有するオリゴヌクレオチドの概要、及びその相補鎖の概要を示すものである。

[図 5]図 5は、本発明の 2本鎖の DNAである、 ODNl/ODN2 (T)及び ODNl/O DN2 (U*)にそれぞれ 312nmの光を照射した結果の蛍光強度（図 5の（A) )及び当該オリゴヌクレオチドの分解率（図 5の（B) )を示す。図 5の（A)は黒丸印（き）は ODN 1/ODN2 (U*)の場合を示し、黒四角印（國）は ODN1/ODN2 (T)の場合を示す。図 5の (A)の縦軸は蛍光強度（a. u. )を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す。図 5の（B)の縦軸は分解率（％)を示し、横軸は光照射からの時間（分）を示す [図 6]図 6は、本発明の 2本鎖の DNAである ODN1/ODN2 (U*)に 312nmの光を照射した結果の蛍光強度の変化を示したものである。図 6の縦軸は蛍光強度（a. u. )を示し、横軸は波長 (nm)を示す。

[図 7]図 7は、本発明の 2本鎖の DNAである ODN1/ODN2 (U*)に 312nmの光を照射したときの分解生成物の PAGE分析の結果を示す。図 7中の Xは TAMRA— ^eda Gを示す。図 7のレーン 1はマキサム—ギルバート法による G+A配列の場合を示し、レーン 2は全長の ODN1を示し、レーン 3は光照射直後のものを示し、レーン 4は光照射 30分のものを示し、レーン 5は光照射 60分のものを示す。

[図 8]図 8は、本発明の 2本鎖の DNAである、 ODNl/ODN2 (T) (図 8の左側）及び ODNl/ODN2 (U*) (図 8の右側）にそれぞれ 312nmの光を照射した結果の蛍光を目視した場合の結果を示す図面に変わる写真である。

[図 9]図 9は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットの放出を模式的に示したものである。

[図 10]図 10は、本発明の方法におけるオリゴヌクレオチドからの機能性ユニットとして染料分子が放出される様子を模式的に示したものである。

[0026] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0027] 化合物 2の製诰

エチレンジァミン（lOOmU中に溶解した 8—ブロモ—5，—Ο— (4, 4，—ジメトキシトリチル)一 2 '—デォキシグアノシン（ィ匕合物（1) )溶液（2. Og， 30. 8mmol)を 130°Cで 7時間、還流攪拌した。濃縮乾燥後、粗生成物 (2)を茶色の油状物として得た。実施例 2

[0028] 化合物 3の製造

実施例 1で得られた化合物（2)をトリフルォロ酢酸ェチル 10mLおよびトリェチルァミン 25mL存在下、メタノーノレ 50mL中で、 0°Cで 2時間攪拌した。濃縮乾燥後、次の段階へ進んだ。

実施例 3 [0029] 8-「 2- (N-トリフルォロァセチルァミノ）ェチル Ίァミノ- 2- (N , N—ジメチルアミノメチリデュル）アミノー 5 ' _〇_ (4, 4'—ジメトキシトリチル) -2 '—デォキシグアノシン（化合物 (4))の製造

実施例 2で濃縮して得られた残渣に N, N -ジメチルホルムアミド（25mL)及び N, N—ジメチルホルムアミドジメチルァセタール（25mL)を添加し、反応液を室温で 2時間攪拌した。濃縮した後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロ口ホルム:メタノール =30:1)で精製し、化合物 4(1. 5g、 63%)を得た。

^XH NMR (CDCl ) δ：

3

9.77 (brs, 1H)， 9.56 (brs，lH), 8.54 (s，lH), 7.34—7.19 (m,8H), 6.83-6.80 (m, 5H), 6.48 (dt， lHJ=8.0,4.0Hz), 5.83 (brs, 1H)， 4.75 (d,lH,J=5.8Hz)， 4.07 (d,lHJ=2.4Hz), 3.765 (s，3H), 3.763 (s，3H), 3.76-3.72 (m,2H), 3.38 (d,lHJ=8.4Hz), 3.10 (s,3H)， 3.02 (s，3H),

3.01-2.95 (m,2H), 2.80-2.60 (m,3H), 2.33 (dd,lH,J=13.3,8.0Hz);

1³C NMR (CDCl ) 5：

3

158.92, 158.91, 158.60， 157.56, 157.19， 156.55, 151.00, 143.55, 139.43, 134.61, 134.57, 130.29， 129.10, 128.42, 128.04, 127.82, 127.73， 127.55, 127.05, 120.27, 117.41, 114.55, 113.30， 113.27, 113.14, 87.01， 85.74,

82.80， 77.21,71.87, 62.87, 55.27， 55.23, 42.65, 41.30, 40.77, 38.73,

35.11;

MS (FAB, NBA/CH CI ) m/z (%) 779 [ (M + H) ⁺]；

2 2

HRMS (FAB) C H N〇 F [ (M + H) ⁺]として、

38 42 8 7 3

計算値 779. 3129,

実測値 779. 3128.

実施例 4

[0030] 3'_(〇—シァノエチルー N, N—ジィソプロピルホスホロアミダイト）_8_「2_(N—トリフルォロアセチルァミノ）ェチル Ίァミノ _2_ (N, N-ジメチノレアミノメチリデニノレ）ァミノ一 5'-〇-(4, 4'ージメトキシトリチル)一 2'-デォキシグアノシン (化合物 5)の製造

実施例 3で得られた化合物（4)の溶液（70mg, 89. 9μΐηο1)に、 2—シァノエチルテトライソプロピルジホスホロアミダイト（31 /i L, 98. 9 μ ΐηο1)及びテトラゾール（7mg , 98. 9 μ ΐηο1)のァセトニトリル（900 /i L)溶液を加え、室温で 2時間攪拌した。析出した塩 (ィ匕合物（5) )を濾別した後、濾液をそのまま次の段階へ用いた。

実施例 5

[0031] オリゴデォキシリボヌクレオチド（〇DN)の合成及びその特性

アプライドバイオシステムズ社 392DNA/RNA合成機を用いて従来のホスホロァミダイト法によりオリゴデォキシリボヌクレオチドを合成した。オリゴデォキシリボヌタレォチドを逆相高速液体クロマトグラフィー [5_ODS_Hカラム（10 X I 50mm)を用い、溶出は 0· 1Mのトリェチルアンモニゥムアセテート（TEAA) (ρΗ7· 0)を含むァセト二トリルの直線勾配（5%— 20%/30分超）、流量 3. OmL/minで行った。 ]に付した。精製した ODN溶液の画分に 50U/mLの子ゥシ小腸（calf intestine)アルカリ性ホスファターゼ（ALP)、 0. 15U/mLのへビ毒ホスホジエステラーゼ（SVPD)及び 50U/mLの P1ヌクレアーゼを加え 37°Cで 3時間、完全に消化されるまで反応させた。酵素分解物を高速液体クロマトグラフィー（HPLC) [Cosmosil 5C—18AR又は CHEMCOBOND 5— ODS— H カラム（4· 6 X 150mm)を用い、溶出は 0· 1Mのトリェチルアンモニゥムアセテート（ΤΕΑΑ)、 (ρΗ7. 0)を含むァセトニトリルの直線勾配（0。/。一 20。/。/20分超）、流速 1. OmL/minで行った。 ]により分析した。各 ODNの濃度を、 dA、 dC、 dG及び dT濃度 0. ImMとした標準溶液のピークとの比較によって、測定した。各 ODNの特性を MALDI— TOF MSにより解析した。

5し d (TATAAT^edaGTAATAT) _3，：

m/z [M_H]_ として計算値 4028. 72

実測値 4027. 33 ；

5'_d (ATTTATAGTGTGGGTTGTT^edaGTTTATTAT)-3' ：

m/z [M-H]" として計算値 8732. 69

実測値 8732. 87

実施例 6

[0032] 実施例 5で得られたオリゴヌクレオチド（6) 60nMを、目的の機能分子のスクシンイミジルエステル体 lmg (例えば安息香酸スクシンィミジルエステルなど）をジメチルスルホキシド lmLに溶かした溶液 50 μ Lを加えた 50mMリン酸緩衝液（ρΗ7· 0) 500 μ L中で、 5度 16時間インキュベーションすることにより、機能化されたオリゴヌクレオチド（7)が得られた。

実施例 7

[0033] 1本鎖のオリゴヌクレオチドの光酸化反応

1本鎖のこの才リゴヌクレオチド（ODN)、

5， -d (TATAAT^edaGTAATAT) _3，：

に、リボフラビンの存在下に 366nmの光を照射した。その結果、このオリゴヌクレオチド（ODN)は速やかに分解した (t = 6. 2分)。

1/2

この結果の HPLCを図 1に示す。この分解生成物を質量分析機で分析した結果を図 2及び図 3に示す。

分解生成物（8) (MALDI-TOF)

5 ' -TATAAT-OPO -CH -CH (OH) -CH = CH-CHO：

3 2

[M— H]_ として計算値 1968. 32

実測値 1967. 68 ；

分解生成物（9) (MALDI-TOF)

O-PO -TAATAT-3 '：

3

[M_H]_ として計算値 1870. 22

実測値 1870. 11 ；

分解生成物（10) (LC-ESI/MS/MS)

[C H 〇N ] + として M+ 207

10 15 4

フラグメント 148， 105, 77, 59

実施例 8

[0034] ベンゾィルー ^edaGの酸化電位（E )の測定

1/2

ベンゾィルー ^edaG (250 μ Μ)の酸化電位 (Ε )を、 ALS電気化学分析機モデル 6

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60— Αを用いて lOOmMの LiCIO溶液中で室温で測定した。スキャン速度は 100m

4

V/秒であり、試料用電極としてガラス炭素電極を、カウンター電極として白金ワイヤ一を、そして対照電極として SCEを用いた。その結果、ベンゾィルー ^edaGの酸化電位（ E )は 0. 59V (VS NHE)であった。

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実施例 9

ODN1/ODN2 (T)及び ODN1/ODN2 (U*)のそれぞれに 312nmの光を照射したときの分解例

塩基濃度 ImMに相当するオリゴヌクレオチドおよび一電子酸化剤リボフラビン 50 μ Μを含む 50mM力コジル酸ナトリウム緩衝液（ρΗ7. 0)に対し 366nmの光をトランスイルミネーターによって照射した。 1分の照射で約 90%、 5分の照射でほぼ全量の分解が認められた。酵素分解によりヌクレオシド単位まで分解し解析を行ったところ、当該修飾ヌクレオシドでのみ分解消失していることが明らかになった。

結果を図 5— 8に示す。